肝纤维化是由多种致病因素导致的慢性肝损伤, 造成胶原在内的细胞外基质过度堆积, 是多数慢性肝病进展过程中常见的病理改变, 然而迄今尚无公认特异有效的药物用于肝纤维化的临床治疗。因此本文研究中药泽泻对胆管结扎(bile duct ligation, BDL) 诱导的肝纤维化的改善作用, 并初步探讨其潜在的药理作用机制。动物实验方案经上海中医药大学实验动物福利与伦理委员会审查(批准号: PZSHUTCM2303280007), 符合实验动物福利与伦理相关规范。对小鼠进行胆管结扎以诱导肝纤维化模型, 并设立假手术组(Sham组)、模型组(BDL组)、泽泻醇提物保护组(BDL+EE)、泽泻水提物保护组(BDL+WE)、奥贝胆酸保护组(BDL+OCA)。结果表明, 泽泻可明显改善胆管结扎诱导的肝纤维化: 泽泻提取物可显著降低肝纤维化小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性、碱性磷酸酶、谷氨酰转移酶及总胆汁酸水平, 改善胆汁淤积、胶原沉积、炎性细胞浸润、肝组织坏死等病理状况, 其中醇提物药效优于水提物。进一步考察泽泻醇提物改善胆管结扎诱导小鼠肝纤维化的量-效关系, 并探讨其作用机制, 发现泽泻醇提物可缓解胆管结扎致肝纤维化小鼠体内血清和肝脏胆汁酸代谢失衡, 调节肝组织内胆汁酸代谢关键核受体法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR) 及其下游靶基因小异二聚体伴侣(small heterodimer partner, SHP)、胆固醇7-羟化酶(cholesterol 7-alpha hydroxylase, CYP7A1)、胆盐输出泵(bile salt export pump, BSEP) 的mRNA表达; 体外进一步证实泽泻醇提物中4种主要三萜可在转录水平激活FXR。本研究表明泽泻在临床上防治肝纤维化的应用提供了理论依据。

现有物理和化学剂量计不能直接反映电离辐射对生物体的影响, 无法直接在体内检测辐射。以工程益生菌为核心的生物传感器安全、稳定, 可用于电离辐射体内检测。本文构建了用于电离辐射检测的口服工程化微生物传感器, 选用益生型大肠杆菌Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) 作为底盘菌株, 通过CRISPR/Cas9基因编辑成功敲除EcN的隐秘质粒并得到ΔEcN。以SOS响应中recA启动子为辐射响应元件, 以荧光蛋白为报告元件设计辐射响应基因线路, 通过丝裂霉素C和γ射线诱导表达, 对不同基因线路的工程菌进行性能表征和优化, 获得优化的候选工程菌株。所有动物实验获得军事科学院军事医学研究院伦理委员会批准且实验均按照相关指导原则和规定进行(批准号: IACUC-DWZX-2022-521)。比较小鼠体内辐射检测性能, 筛选得到灵敏度更高的工程菌EC-8作为口服工程化微生物传感器。本研究利用合成生物学原理设计构建了口服工程益生菌, 虽然目前构建得到的工程益生菌仍存在局限性, 检测特异性及信噪比仍待进一步提高, 但该工程菌可在体内对电离辐射产生响应, 为体内电离辐射剂量检测提供了一种新方法, 有望成为用于辐射损伤精准诊断的活体生物药。

2',4'-二甲氧基查尔酮(DMC) 是卡瓦胡椒素B的结构修饰物, 本课题以胃癌细胞MGC-803和HGC-27为研究对象, 探讨DMC对胃癌细胞的体内外抗肿瘤作用及机制。采用CCK-8法、EdU染色法和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测胃癌细胞活力、增殖率和凋亡率, 发现DMC抑制胃癌细胞活力和增殖, 促进胃癌细胞凋亡; 构建裸鼠胃癌细胞皮下移植瘤模型观察DMC对胃癌移植瘤生长的影响, 发现DMC抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生长, 动物实验获得上海中医药大学动物伦理委员会的批准, 伦理编号为PZSHUTCM2310110002。转录组学研究DMC对MGC-803细胞RNA表达的影响, 发现生物功能富集于糖酵解; 采用2-NBDG探针标记及流式细胞术和乳酸测试盒检测胃癌细胞葡萄糖摄取能力和乳酸生成与外排能力, 发现DMC抑制胃癌细胞的葡萄糖摄取能力和乳酸生成与外排; 通过蛋白印迹实验检测胃癌细胞增殖、凋亡及糖酵解相关蛋白的表达, 发现DMC能上调胃癌细胞促凋亡蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP的表达, 下调胃癌细胞增殖标志物Ki-67的蛋白表达, 并抑制胃癌细胞糖酵解相关蛋白c-Myc、LDHA、GLUT3、PDHK1和MCT1的表达; 通过Seahorse能量代谢分析仪检测实时糖酵解速率, 发现DMC能下调胃癌细胞基础糖酵解速率和代偿糖酵解; 通过c-Myc过表达稳转株MGC-803细胞的翻转实验明确DMC通过抑制c-Myc介导的葡萄糖摄取和糖酵解发挥胃癌抑制作用。综上所述, DMC可能通过调控胃癌细胞c-Myc及其靶基因糖酵解相关蛋白的表达, 抑制胃癌细胞c-Myc介导的葡萄糖摄取功能和糖酵解, 从而抑制胃癌细胞增殖, 促进胃癌细胞凋亡, 最终在体内外抑制胃癌的生长。

全身辐射损伤是指全身遭受电离辐射后引起的多组织器官损伤, 传统辐射防护药物氨磷汀存在较严重不良反应。益生菌有一定辐射损伤防护效果, 但对胃肠道环境不耐受, 难以在结肠滞留和定植, 影响治疗效果。本文制备了壳聚糖/单宁酸双层包衣的罗伊氏乳杆菌, 将其包裹在海藻酸钙微球中, 得到载工程化益生菌的微球制剂。益生菌的双层包衣通过zeta电位两次翻转得到验证。包衣增强了益生菌的黏附和团聚。光学显微镜下载菌微球形态光滑, 激光共聚焦显微镜显示包衣菌在微球内分布均匀, 扫描电镜显示其表面多孔。微球可耐受体外胃肠道环境, 在结肠环境中迅速溶胀, 释放活菌。所有动物实验经军事医学研究院批准且实验均按照相关指导原则和规定进行(批准号: IACUC-DWZX-2024-P510)。建立6.5 Gy全身辐照小鼠模型, 于照前2日开始灌胃载菌微球, 连续给药6日, 与模型组比较, 载菌微球显示造血系统保护作用, 促进红细胞和血小板的恢复, 维持脾脏红髓、白髓形态, 保护骨髓有核细胞增殖能力。工程化益生菌拓展了抗辐射药物种类, 为防治辐射损伤的活体生物药研发提供思路。

放射性肠炎(radiation enteritis, RE) 是放疗最常见的并发症, 缺乏安全有效的防治药物。益生菌具有一定抗辐射作用。合生制剂是益生菌和益生元的组合, 可增强益生菌的作用。本研究利用耐胃酸和结肠滞留的益生元菊粉凝胶(inulin gel, IG) 分别负载蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus, BC)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis, BL) 和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri, LR) 3种不同益生菌后, 对RE进行药效学评价。电镜和共聚焦显微镜均证实IG成功包埋益生菌。与单独益生菌相比, IG可促进益生菌生长。所有动物实验经军事医学研究院伦理委员会批准且实验均按照相关指导原则和规定进行, 批准号: IACUC-DWZX-2024-P510。小鼠腹部用13 Gy γ射线辐照, 构建RE模型。所有益生菌菊粉凝胶合生制剂与相应单独益生菌相比, 在修复肠道屏障、改善隐窝结构、氧化应激、组织炎症和肠道菌群失衡及促进肠绒毛恢复方面均有增强。蜡样芽孢杆菌菊粉凝胶合生制剂对RE有最优的防治效果。本研究为防治RE提供了新的防治药物。

高原睡眠障碍是常见的急性高原疾病, 可引发急性高原反应等生理不适, 临床缺少安全、高效的预防药物。本研究基于肠-脑轴理论, 设计并制备了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus, LGG) -枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP) 合生制剂。首先, 制备并评价LGG-LBP合生制剂, 受试小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药乙酰唑胺组、LGG组、LBP组、LGG-LBP合生制剂组, 连续灌胃7天后, 采用小动物低压氧舱建立高原睡眠障碍小鼠模型。通过睡眠翻正反射实验、旷场实验、新物体识别实验、外周血细胞水平、血清炎症因子、粪便菌群检测及小肠病理切片, 评价合生制剂的药效。在高原睡眠障碍小鼠模型中, 小鼠提前口服合生制剂可明显改善高海拔环境下的相关表现, 包括延长睡眠时间、提高自主探索能力和短期记忆能力、促进血细胞恢复、降低肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 水平。此外, 该合生制剂还能增加肠道菌群丰度, 改善小肠结构, 减少肠道炎症。LGG-LBP合生制剂可能是潜在的预防高原睡眠障碍的有效药物。动物实验经军事科学院军事医学研究院伦理委员会批准, 且实验均按相关指导原则和规定进行, 批准号: IACUC-DWZX-2022-511。

采用聚酰胺柱色谱、硅胶柱色谱、制备薄层色谱以及半制备高效液相色谱等分离技术, 对姜黄的95%乙醇提取物进行了分离纯化。随后, 运用高分辨质谱、红外、核磁共振等波谱技术对化合物进行了结构鉴定并通过计算ECD确定了新化合物的绝对构型。最终, 从姜黄中分离鉴定了2个没药烷型倍半萜, 分别为(7S)-1,3,5,10-没药烷四烯-3-硝基-9-酮(1) 和turmeronol A (2), 其中化合物1为新颖的硝基取代没药烷型倍半萜。

课题组前期发现天然五环三萜路路通酸调控Cullin2的NEDD8修饰, 本研究旨在发现更多的靶向Cullin家族成员的三萜类天然活性分子, 并揭示其作用机制。利用Western blot技术检测能显著改变细胞内总蛋白NEDD8修饰以及特异性Cullin蛋白NEDD8修饰的天然产物; 利用微量热泳动(microscale thermophoresis, MST) 技术检测候选小分子齐墩果酮酸与TRAF家族蛋白的直接结合, 并通过细胞热转移实验(cellular thermal shift assay, CETSA) 验证其在活细胞水平的结合情况; 利用邻位连接技术(proximity ligation assay, PLA) 考察齐墩果酮酸对肿瘤坏死因子受体相关因子1 (TNF receptor-associated factor 1, TRAF1) 与Cullin1的NEDD8修饰复合物间的蛋白互作的调控作用。结果发现了3个显著抑制细胞内NEDD8修饰的五环三萜小分子, 其中齐墩果酮酸阻断NEDD8修饰的作用最强。与前期鉴定的路路通酸调控Cullin2/5不同, 齐墩果酮酸还能特异性诱导NEDD8修饰的Cullin1转变为其无修饰形式。结合实验表明, 齐墩果酮酸能在细胞裂解液及活细胞水平与TRAF1直接结合; 进一步的机制研究发现, 齐墩果酮酸显著改变TRAF1与Cullin1 NEDD8修饰复合物间的蛋白互作。以上结果表明, 齐墩果酮酸靶向TRAF1并调控其与NEDD8修饰复合物互作来抑制Cullin的NEDD8修饰。

为了对IMH020生产工艺过程和质量控制提供重要依据, 建立IMH020中有关物质的高效液相色谱测定法。色谱柱为Waters Symmetry C₁₈ (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) 柱, 流动相A为乙腈, 流动相B为体积分数0.2%的乙酸水溶液, 进行等度洗脱; 流速为1.0 mL·min^-1; 柱温为30 ℃; 检测波长为270和300 nm; 进样量为10 μL。结果表明, IMH020与有关物质I-1、I-2、I-3a、I-3b、I-4、I-5及未知杂质均能良好分离; 各有关物质在考察范围内线性关系良好, r ≥ 0.998 9, 回收率在93.1%~97.8%之间(RSD ≤ 2%, n = 9)。三批样品中已知杂质仅检出I-3a和I-3b, 并低于限度, 最大未知杂质及总杂质含量质量分数均低于限度。建立的HPLC方法简便、灵敏、准确, 可用于IMH020的有关物质检测。