活体生物药(live biotherapeutic product, LBP) 是一类含有活性生物体(如细菌) 的用于预防或治疗人类疾病的生物制品(不包括疫苗)。目前LBP的研发主要聚焦于活细菌。LBP与传统药物相比具有可复制性、靶向性、响应性等特点, 成为多种重大疾病药物研发的热点, 适应症涉及恶性肿瘤、代谢性疾病、炎症性肠病、基因缺陷病等。由于天然细菌存在活性低、不稳定和安全性等问题, 对其进行工程化改造是改良细菌药物学特性、促进细菌向LBP应用转化的关键。本文详细调研了近年来基于工程化细菌的LBP研究进展, 总结了基于化学作用、物理作用、遗传改造的工程化策略, 发现单一途径的工程化细菌疗效、稳定性和安全性问题仍不能完全解决, 因此提出“多工程化细菌”(multi-engineered bacteria) 理念, 即通过物理、化学、生物的组合工程化提高细菌成药性。本文通过对基于工程化细菌的LBP研究进行综述, 为LBP研发提供前瞻性思考和展望。

细菌感染性疾病一直严重威胁着人类健康、动植物养殖产业发展及生态环境稳定。传统抗生素的广泛使用, 导致细菌耐药性问题日益严峻, 开发新型有效的细菌感染防治策略迫在眉睫。蛭弧菌作为一类以捕食细菌为生的寄生型细菌, 对多种致病菌具有裂解作用, 展现出防治细菌感染的潜力。但是, 直接使用蛭弧菌菌液或菌粉, 存在易流失、易被免疫系统清除、蛭弧菌活力难保持、使用顺应性差等问题。近年来, 工程化蛭弧菌技术为更精准、高效地利用蛭弧菌防治细菌感染带来了新的契机。本文调研了近年来工程化蛭弧菌防治细菌感染的研究进展, 重点介绍基于制剂设计、表面修饰、基因编辑的蛭弧菌工程化技术及其治疗应用, 为工程化蛭弧菌的研究发展提供参考。

减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009是一种具有高肿瘤靶向性的新型溶瘤菌, 其抗肿瘤的机制之一是诱导肿瘤细胞凋亡, 但是具体分子机制尚不明确。黑色素瘤是致死率最高的皮肤癌, 现有治疗手段存在不良反应大、易复发等问题。本研究以小鼠黑色素瘤细胞B16F10为研究模型, 深入探究了VNP20009诱导黑色素瘤细胞B16F10凋亡的调控机制。结果表明, VNP20009能够显著诱导B16F10细胞凋亡, 且凋亡诱导效应呈现时间和浓度依赖性。通过转录组测序分析发现, p53信号通路在VNP20009处理组中显著富集, 提示该通路可能介导了VNP20009的促凋亡效应。进一步研究显示, VNP20009可以通过激活p53通路关键基因PUMA及其上下游分子p53、CytC、CASP9和CASP3, 能够形成级联反应, 从而诱导细胞凋亡。本研究阐明了VNP20009通过p53-PUMA轴激活B16F10黑色素瘤细胞内源性凋亡的机制, 为基于减毒沙门氏菌的黑色素瘤治疗提供了新的理论依据。

口服益生菌易受胃肠道环境影响, 到达肠道的益生菌数目很少, 难以定植, 限制了益生菌疗法的应用。本研究选择常见益生菌——鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus, LGG) 作为模型, 制备了鼠李糖乳杆菌聚乳酸多孔微球制剂, 考察其体外性质。采用复乳-溶剂挥发法制备得到左旋聚乳酸多孔微球(poly-L-lactic acid porous microsphere, PLPM), 形态圆整, 大小均匀, 有开放及连通的多孔结构, 平均粒径为138.5 μm。在37 ℃将PLPM与LGG共孵育8 h, 得到高载菌率的鼠李糖乳杆菌多孔微球(LGG-loaded porous microsphere, LPM)。通过静电作用逐层将乙二醇壳聚糖(glycol chitosan, GCS) 和海藻酸钠(sodium alginate, SA) 包裹于LPM表面, 得到乙二醇壳聚糖和海藻酸钠包封的鼠李糖乳杆菌多孔微球制剂(layer-by-layer encapsulated LGG-loaded porous microsphere with GCS and SA, AGLPM)。体外实验证明, AGLPM可以耐受2 h pH 1.2的模拟胃液及pH 7.4的模拟肠液, 稳定性显著强于裸LGG。壳聚糖和海藻酸钠包裹的聚乳酸多孔微球是一种较好的益生菌剂型。

放射性肠损伤(radiation-induced intestinal injury, RIII) 是腹盆腔恶性肿瘤患者放疗常见并发症, 严重影响生活质量, 临床无专门防治药物。菊粉是一种天然水溶性膳食纤维。丁酸梭菌(Clostridium butyricum, Cb) 属严格厌氧革兰阳性芽孢杆菌, 能分泌大量丁酸, 改善肠道屏障功能, 减少条件致病菌生长与定植。菊粉凝胶(inulin gel, IG) 载Cb合生制剂发挥益生元肠道滞留与益生菌的协同作用。本文将口服IG载Cb的合生制剂用于RIII防治并探讨机制。所有动物实验经军事医学研究院伦理委员会批准且实验均按照相关指导原则和规定进行(批准号: IACUC-DWZX-2022-525)。小鼠腹部经13 Gy γ射线照射, 成功建立RIII模型。照前1 h给小鼠灌胃合生制剂, 与模型组比较, 照后第3.5日合生制剂组小肠新生隐窝数量明显增多, 小肠绒毛更长; 结肠长度更长, 紧密连接蛋白表达提升。照后第7日肠道菌群相对丰度显著增加, 特别是多种益生菌数量, 粪便中短链脂肪酸含量增加。照后第14日, 荧光标记法证明合生制剂组小鼠肠黏膜渗透性明显减小, 达到健康水平; 合生制剂组小肠组织中促炎因子包括肿瘤坏死因子-α和白介素-6水平显著降低, 接近正常水平。合生制剂可减轻RIII症状, 促进小肠和结肠损伤组织修复, 效果优于IG与Cb。口服合生制剂是一种安全有效的抗RIII活体生物药。

放射性肠炎(radiation enteritis, RE) 是放疗最常见的并发症, 缺乏安全有效的防治药物。益生菌具有一定抗辐射作用。合生制剂是益生菌和益生元的组合, 可增强益生菌的作用。本研究利用耐胃酸和结肠滞留的益生元菊粉凝胶(inulin gel, IG) 分别负载蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus, BC)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis, BL) 和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri, LR) 3种不同益生菌后, 对RE进行药效学评价。电镜和共聚焦显微镜均证实IG成功包埋益生菌。与单独益生菌相比, IG可促进益生菌生长。所有动物实验经军事医学研究院伦理委员会批准且实验均按照相关指导原则和规定进行, 批准号: IACUC-DWZX-2024-P510。小鼠腹部用13 Gy γ射线辐照, 构建RE模型。所有益生菌菊粉凝胶合生制剂与相应单独益生菌相比, 在修复肠道屏障、改善隐窝结构、氧化应激、组织炎症和肠道菌群失衡及促进肠绒毛恢复方面均有增强。蜡样芽孢杆菌菊粉凝胶合生制剂对RE有最优的防治效果。本研究为防治RE提供了新的防治药物。

全身辐射损伤是指全身遭受电离辐射后引起的多组织器官损伤, 传统辐射防护药物氨磷汀存在较严重不良反应。益生菌有一定辐射损伤防护效果, 但对胃肠道环境不耐受, 难以在结肠滞留和定植, 影响治疗效果。本文制备了壳聚糖/单宁酸双层包衣的罗伊氏乳杆菌, 将其包裹在海藻酸钙微球中, 得到载工程化益生菌的微球制剂。益生菌的双层包衣通过zeta电位两次翻转得到验证。包衣增强了益生菌的黏附和团聚。光学显微镜下载菌微球形态光滑, 激光共聚焦显微镜显示包衣菌在微球内分布均匀, 扫描电镜显示其表面多孔。微球可耐受体外胃肠道环境, 在结肠环境中迅速溶胀, 释放活菌。所有动物实验经军事医学研究院批准且实验均按照相关指导原则和规定进行(批准号: IACUC-DWZX-2024-P510)。建立6.5 Gy全身辐照小鼠模型, 于照前2日开始灌胃载菌微球, 连续给药6日, 与模型组比较, 载菌微球显示造血系统保护作用, 促进红细胞和血小板的恢复, 维持脾脏红髓、白髓形态, 保护骨髓有核细胞增殖能力。工程化益生菌拓展了抗辐射药物种类, 为防治辐射损伤的活体生物药研发提供思路。

高原睡眠障碍是常见的急性高原疾病, 可引发急性高原反应等生理不适, 临床缺少安全、高效的预防药物。本研究基于肠-脑轴理论, 设计并制备了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus, LGG) -枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP) 合生制剂。首先, 制备并评价LGG-LBP合生制剂, 受试小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药乙酰唑胺组、LGG组、LBP组、LGG-LBP合生制剂组, 连续灌胃7天后, 采用小动物低压氧舱建立高原睡眠障碍小鼠模型。通过睡眠翻正反射实验、旷场实验、新物体识别实验、外周血细胞水平、血清炎症因子、粪便菌群检测及小肠病理切片, 评价合生制剂的药效。在高原睡眠障碍小鼠模型中, 小鼠提前口服合生制剂可明显改善高海拔环境下的相关表现, 包括延长睡眠时间、提高自主探索能力和短期记忆能力、促进血细胞恢复、降低肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 水平。此外, 该合生制剂还能增加肠道菌群丰度, 改善小肠结构, 减少肠道炎症。LGG-LBP合生制剂可能是潜在的预防高原睡眠障碍的有效药物。动物实验经军事科学院军事医学研究院伦理委员会批准, 且实验均按相关指导原则和规定进行, 批准号: IACUC-DWZX-2022-511。

电离辐射损伤和皮肤烧伤同时或相继发生可导致放烧复合伤(combined radiation and burn injury, CRBI)。放烧复合伤发生后机体免疫力降低, 易引起耐药细菌感染, 伤口难以愈合。蛭弧菌及其类似物(Bdellovibrio-and-like organisms, BALO) 是天然掠食性细菌, 能进入大多数革兰阴性菌周质空间, 降解宿主细胞内生物大分子。本研究以明胶、海藻酸钙和活化后的蛭弧菌悬液作为生物墨水, 利用3D打印技术制备蛭弧菌水凝胶(three dimensional-printed BALO-loaded hydrogel, TDBG), 用于皮肤CRBI合并耐药鲍曼不动杆菌(multidrug-resistant Acinetobacter baumannii, MRAB) 感染的治疗。3D打印水凝胶冻干后呈三维网状结构, 内部附着明胶薄膜, 具有良好的可打印性和生物黏附性。可打印性使其能根据伤口形状进行适应性打印, 为感染伤口提供个性化治疗; 三维网络结构能为蛭弧菌的生存和游动提供条件, 利于发挥高效掠食活性。所有动物实验经军事科学院军事医学研究院批准且实验均按照相关指导原则和规定进行(批准号: IACUC-DWZX-2022-834)。经TDBG治疗后, CRBI合并MRAB感染小鼠伤口闭合速率加快, 伤口部位炎性细胞因子表达水平降低, 胶原沉积增加, 伤口修复效果好。本研究拓宽了活体生物药的应用范围, 为其研发和临床应用提供参考。

现有物理和化学剂量计不能直接反映电离辐射对生物体的影响, 无法直接在体内检测辐射。以工程益生菌为核心的生物传感器安全、稳定, 可用于电离辐射体内检测。本文构建了用于电离辐射检测的口服工程化微生物传感器, 选用益生型大肠杆菌Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) 作为底盘菌株, 通过CRISPR/Cas9基因编辑成功敲除EcN的隐秘质粒并得到ΔEcN。以SOS响应中recA启动子为辐射响应元件, 以荧光蛋白为报告元件设计辐射响应基因线路, 通过丝裂霉素C和γ射线诱导表达, 对不同基因线路的工程菌进行性能表征和优化, 获得优化的候选工程菌株。所有动物实验获得军事科学院军事医学研究院伦理委员会批准且实验均按照相关指导原则和规定进行(批准号: IACUC-DWZX-2022-521)。比较小鼠体内辐射检测性能, 筛选得到灵敏度更高的工程菌EC-8作为口服工程化微生物传感器。本研究利用合成生物学原理设计构建了口服工程益生菌, 虽然目前构建得到的工程益生菌仍存在局限性, 检测特异性及信噪比仍待进一步提高, 但该工程菌可在体内对电离辐射产生响应, 为体内电离辐射剂量检测提供了一种新方法, 有望成为用于辐射损伤精准诊断的活体生物药。

心肌梗死会严重危害人类和动物健康, 亟待提升其诊断速度和治疗效果。外泌体作为天然的细胞信息载体, 其包含的一些微小RNA (microRNA, miRNA) 能够反映或作用于心肌梗死所致病理变化, 进行有效诊治。本文就不同来源的外泌体miRNA作为心肌梗死诊断物(如miR-4516、miR-203和miR-1915-3p) 的可行性, 以及通过细胞凋亡(如miR-21a-5p、miR-30e和miR-210)、细胞自噬(如miR-125b-5p、miR-301和miR-143-3p)、细胞焦亡(如miR-182-5p、miR-133a和miR-100-5p) 和铁死亡(如miR-26b-5p和miR-23a-3p) 减缓细胞死亡, 促进新生血管的形成(如miR-29b-3p、miR-210-3p和miR-494-3p) 和抑制炎症反应(如miR-25-3p、miR-182-5p和miR-671) 等作用对心肌梗死进行干预治疗的研究进展进行了综述, 旨在为心肌梗死的诊断和治疗提供新策略。

抑郁症是一种常见的精神疾病, 具有高发病、高复发、高致残的特点, 在世界范围内造成了严重的社会和经济负担。其病因较为复杂, 且现有治疗方案较为有限。研究人员已建立了多种动物模型用于筛选和评价抗抑郁药物。本文综述了抑郁症的研究进展和典型的非临床动物模型, 总结了规范化抑郁症动物模型在非临床研究中需要注意的问题, 并对抗抑郁药物的非临床药效学评价体系的系统化和规范化提出建议。

淋巴细胞活化因子-3 (lymphocyte activation gene 3, LAG-3) 是一种重要的T细胞抑制型受体, 在肿瘤免疫逃逸中发挥着重要作用。LAG-3主要表达于活化的T细胞、自然杀伤(natural killer, NK) 细胞、B细胞等, 通过与配体结合, 抑制T细胞的增殖、活化和效应功能。LAG-3已成为继程序性死亡分子-1 (programmed death 1, PD-1)/程序性死亡分子配体-1 (programmed death ligand 1, PD-L1) 和细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4, CTLA-4) 之后第三个应用于临床的免疫检查点蛋白(immune checkpoint protein, ICP)。目前, 至少有20个靶向LAG-3的药物正在进行临床试验。本文主要综述了LAG-3的结构、表达调控、配体、共表达的ICP以及其在肿瘤免疫治疗中的应用, 并展望了LAG-3研究目前面临的挑战。

神经退行性疾病是导致全球致死致残的重要原因之一, 发病机制复杂, 无有效治疗药物。越来越多的研究发现, 神经退行性疾病大都涉及铁稳态的异常以及脑内免疫细胞的激活。小胶质细胞的铁积累可促进铁死亡, 导致细胞功能障碍和死亡; 而抑制铁死亡的发生能缓解神经炎症, 保护神经元, 减缓疾病发展, 提示铁死亡与神经炎症在神经退行性疾病中发挥了关键作用。本文综述了铁死亡与神经炎症在神经退行性疾病中的作用, 进一步讨论了神经退行性疾病中调控铁死亡与神经炎症的相关靶点, 并总结了靶向铁死亡和神经炎症的药物在神经退行性疾病中的治疗潜力。通过本文的综述, 期望为神经退行性疾病的治疗提供新的靶点和治疗药物, 为其临床治疗提供新的思路, 改善神经退行性疾病的症状和预后。

肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF) 是一类预后极差、严重影响患者生存质量的肺部疾病, 其主要病理特征是肺泡壁周围组织瘢痕形成及增厚, 最终导致呼吸衰竭。目前, 美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA) 批准的PF治疗药物包括吡非尼酮和尼达尼布, 然而这两种药物仅能延缓疾病进程, 无法实现PF的逆转, 且二者均因价格昂贵以及多种不良反应导致临床应用受限。PF发病机制至今尚未完全阐明, 研究证明, 免疫细胞的异常激活和调控在PF中扮演着重要角色。本综述旨在探讨近年来免疫细胞在PF进程中的作用研究进展, 以期为新型免疫疗法的开发提供理论参考。

巴豆烷型二萜为巴豆的主要活性成分, 是生物活性多样的大环二萜类化合物。其抗人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV) 活性在艾滋病治疗中具有独特优势和巨大潜力, 有望开发成为抗艾滋病临床试验的候选药物。本文回顾了近年来有关巴豆中巴豆烷型二萜成分及该类化合物抗HIV活性的研究进展, 进行系统的比较, 归纳了目前在巴豆中所发现巴豆烷型二萜类化合物, 总结了该类化合物的化学结构和生物活性关系, 同时简要讨论了巴豆烷型二萜抗HIV活性的作用机制的研究动态, 以期为进一步开发利用该类化合物提供参考, 同时也为巴豆的运用提供新的思路。

抗生素滥用和细菌耐药性形势日益严重, 寻找新型抗菌剂迫在眉睫。中药许多成分具有显著的抗菌、抗炎、抗氧化等药理作用, 可通过多途径发挥作用, 是未来新型抗菌剂的重要来源之一。然而, 中药抗菌成分中存在稳定性差、溶解度低和智能释放水平低等问题, 限制了其抗菌制剂的广泛应用。金属有机框架材料因其具有高比表面积、高孔隙率、孔道可控、响应释放等优势, 成为中药抗菌成分良好的药物载体, 同时, 其不仅能显著改善中药抗菌成分的稳定性和溶解性, 还兼具抗菌、响应释放等能力。本文概述了细菌耐药机制及中药抗菌成分对抗耐药细菌的作用机制, 重点介绍了金属有机框架材料发展现状及其在中药抗菌成分递送系统方面的研究进展, 以期为中药抗菌成分制剂的研发创新提供参考。

组织因子(tissue factor, TF), 是一种在正常组织中表达的跨膜糖蛋白, 其在胚胎发育、止血和非止血途径中具有多种生理学功能。研究发现TF在多种肿瘤组织中过表达且促进肿瘤进展, Kaplan-Meier (K-M) 生存分析显示TF基因的高表达与肾癌和胰腺癌的不良预后有关。因此, TF作为肿瘤免疫治疗靶点受到广泛关注, 已有多款抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADC) 进入临床研究阶段。本文就TF的基因结构、表达、生物学功能以及与肿瘤的相关性进行了系统阐述, 并对新一代TF-ADC药物设计提出方向, 以期为该靶点的药物研发提供理论支持和开发方向。

近几十年来, 药物化学家从自然界或化学合成得到了大量肽类化合物, 这些物质以高生物活性、低不良反应的特点引起了广泛的高度关注。然而, 直链多肽因其易受蛋白酶水解影响及膜通透性不佳等问题, 在药物开发领域面临诸多挑战。环肽凭借稳定的结构、高靶标结合亲和力及较低的毒性, 集天然多肽的高生物活性与小分子药物的良好药代动力学特性于一身, 能够很好地克服以上缺陷, 在新药研发中逐渐发挥着重要作用。本文聚焦于环肽药物的发展历程, 探讨了环肽的来源、获取方法以及近年来在药学领域的具体应用, 并对其未来的发展潜力进行了展望, 旨在为环肽的临床应用提供理论与实践基础。

Nutlin-3是代表性小分子MDM2-p53拮抗剂, 能通过破坏p53和MDM2的相互作用, 稳定p53状态, 从而诱导p53信号通路发挥抗肿瘤作用。本研究以HCT-116、H460、HepG2、MCF-7、A549、SJSA-1六种野生型p53肿瘤细胞系为研究对象, 采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT) 法、平板克隆实验检测nutlin-3对6种不同野生型p53癌细胞增殖的影响; 通过流式细胞术检测nutlin-3对H460细胞周期和细胞凋亡的影响; 通过蛋白印迹实验检测泛素特异蛋白酶7 (ubiquitin-specific protease 7, USP7)、细胞死亡结构域相关蛋白(death domain-associated protein, DAXX)、鼠双微体2 (murine double minute 2, MDM2)、鼠双微体4 (murine double minute 4, MDMX/MDM4)、p53的表达, 探讨nutlin-3的抗肿瘤作用机制; 通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP) 实验检测nutlin-3对MDM2与MDMX、p53相互作用的影响。结果显示, nutlin-3呈时间和浓度依赖性地抑制H460的增殖; 细胞周期和凋亡结果显示, nutlin-3能阻滞H460细胞周期于G0/G1期, 通过激活cleaved-PARP并诱导细胞凋亡; 蛋白印迹结果显示, nutlin-3能够上调H460细胞中USP7、DAXX、MDM2、MDMX、p53蛋白的表达; Co-IP结果表明, nutlin-3抑制MDM2与p53、MDM2与MDMX的蛋白相互作用。综上所述, nutlin-3能够显著抑制野生型p53癌细胞的增殖, 并诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡, 其机制可能与破坏MDM2/MDMX与p53相互作用, 从而激活MDM2-p53信号通路有关。

课题组前期发现天然五环三萜路路通酸调控Cullin2的NEDD8修饰, 本研究旨在发现更多的靶向Cullin家族成员的三萜类天然活性分子, 并揭示其作用机制。利用Western blot技术检测能显著改变细胞内总蛋白NEDD8修饰以及特异性Cullin蛋白NEDD8修饰的天然产物; 利用微量热泳动(microscale thermophoresis, MST) 技术检测候选小分子齐墩果酮酸与TRAF家族蛋白的直接结合, 并通过细胞热转移实验(cellular thermal shift assay, CETSA) 验证其在活细胞水平的结合情况; 利用邻位连接技术(proximity ligation assay, PLA) 考察齐墩果酮酸对肿瘤坏死因子受体相关因子1 (TNF receptor-associated factor 1, TRAF1) 与Cullin1的NEDD8修饰复合物间的蛋白互作的调控作用。结果发现了3个显著抑制细胞内NEDD8修饰的五环三萜小分子, 其中齐墩果酮酸阻断NEDD8修饰的作用最强。与前期鉴定的路路通酸调控Cullin2/5不同, 齐墩果酮酸还能特异性诱导NEDD8修饰的Cullin1转变为其无修饰形式。结合实验表明, 齐墩果酮酸能在细胞裂解液及活细胞水平与TRAF1直接结合; 进一步的机制研究发现, 齐墩果酮酸显著改变TRAF1与Cullin1 NEDD8修饰复合物间的蛋白互作。以上结果表明, 齐墩果酮酸靶向TRAF1并调控其与NEDD8修饰复合物互作来抑制Cullin的NEDD8修饰。

2',4'-二甲氧基查尔酮(DMC) 是卡瓦胡椒素B的结构修饰物, 本课题以胃癌细胞MGC-803和HGC-27为研究对象, 探讨DMC对胃癌细胞的体内外抗肿瘤作用及机制。采用CCK-8法、EdU染色法和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测胃癌细胞活力、增殖率和凋亡率, 发现DMC抑制胃癌细胞活力和增殖, 促进胃癌细胞凋亡; 构建裸鼠胃癌细胞皮下移植瘤模型观察DMC对胃癌移植瘤生长的影响, 发现DMC抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生长, 动物实验获得上海中医药大学动物伦理委员会的批准, 伦理编号为PZSHUTCM2310110002。转录组学研究DMC对MGC-803细胞RNA表达的影响, 发现生物功能富集于糖酵解; 采用2-NBDG探针标记及流式细胞术和乳酸测试盒检测胃癌细胞葡萄糖摄取能力和乳酸生成与外排能力, 发现DMC抑制胃癌细胞的葡萄糖摄取能力和乳酸生成与外排; 通过蛋白印迹实验检测胃癌细胞增殖、凋亡及糖酵解相关蛋白的表达, 发现DMC能上调胃癌细胞促凋亡蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP的表达, 下调胃癌细胞增殖标志物Ki-67的蛋白表达, 并抑制胃癌细胞糖酵解相关蛋白c-Myc、LDHA、GLUT3、PDHK1和MCT1的表达; 通过Seahorse能量代谢分析仪检测实时糖酵解速率, 发现DMC能下调胃癌细胞基础糖酵解速率和代偿糖酵解; 通过c-Myc过表达稳转株MGC-803细胞的翻转实验明确DMC通过抑制c-Myc介导的葡萄糖摄取和糖酵解发挥胃癌抑制作用。综上所述, DMC可能通过调控胃癌细胞c-Myc及其靶基因糖酵解相关蛋白的表达, 抑制胃癌细胞c-Myc介导的葡萄糖摄取功能和糖酵解, 从而抑制胃癌细胞增殖, 促进胃癌细胞凋亡, 最终在体内外抑制胃癌的生长。

奥沙利铂(oxaliplatin, Oxa) 是进展期结直肠癌化疗常用药物, 然而多数患者在接受治疗后出现耐药, 相关耐药机制尚未完全阐明。本研究以结直肠癌细胞HCT116为对象, 通过药物浓度梯度诱导构建奥沙利铂耐药细胞株(HCT116/Oxa)。在此基础上基于蛋白质组学分析HCT116/Oxa细胞表达谱; 采用The Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) 数据库进行基因本体(gene ontolog, GO) 分析; 利用GeneAnalytics数据库通路富集分析; 通过抑制剂、免疫印迹、siRNA技术揭示结直肠癌细胞对奥沙利铂耐药的潜在靶标及其机制。结果显示, HCT116/Oxa细胞对奥沙利铂的耐药指数为10.2。与HCT116相比, HCT116/Oxa对奥沙利铂表现出强的增殖潜能和抗凋亡能力。蛋白质组数据表明, HCT116/Oxa细胞717种基因表达改变, 上调399种, 下调318种。GO分析显示, 差异表达基因与氧化压力反应、铁代谢、脂质代谢、凋亡、细胞周期进展等生物学过程有关。通路富集显示, 细胞代谢、铁死亡、Nrf2-ARE信号、脂肪酸及谷胱甘肽代谢等通路显著变化。定量结果显示, 与铁死亡相关分子, 包括谷胱甘肽过氧化物酶4 (glutathione peroxidase 4, GPX4)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(glutamate-cysteine ligase regulatory subunit, GCLM)、铁蛋白轻链(ferritin light chain, FTL)、铁蛋白重链(ferritin heavy chain, FTH1)、血红素氧合酶1 (heme oxygenase 1, HMOX1)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GSR) 和NADH脱氢酶1 (NADH dehydrogenase 1, NQO1) 的表达显著增加, 而长链脂肪酸-辅酶A连接酶(long chain fatty acid-CoA ligase, ACSL) 4和ACSL1的表达降低。功能研究表明, GPX4特异性抑制剂RSL3降低耐药细胞活力, 提高脂质过氧化水平, 增加亚铁离子和丙二醛含量, 降低谷胱甘肽(glutathione, GSH) 浓度。免疫印迹显示, HCT116/Oxa细胞中GPX4、FTH1、FTL、GSR表达增加, ACSL4降低。RSL3能够逆转GPX4、FTH1、FTL、GSR和ACSL4的水平。进一步发现, 敲低GPX4可降低耐药细胞活力, 提高脂质过氧化水平和降低GSH浓度, 表明GSH/GPX4通路介导的铁死亡抵抗是HCT116/Oxa对奥沙利铂耐药的潜在机制, 抑制GSH/GPX4通路是逆转结直肠癌对奥沙利铂耐药的途径。

虎杖苷(polydatin, PD) 是一种从虎杖根和茎中提取的天然活性单晶化合物, 为白芦藜醇的天然前体。本研究旨在探讨虎杖苷对尿酸钠结晶(monosodium urate, MSU) 诱导的小鼠痛风性关节炎的治疗作用及可能机制。所有动物实验程序均经过南京大学动物伦理委员会的审查与批准(批准号: 2407002)。采用足掌注射20 μL MSU (25 mg·mL^-1) 混悬液以构建小鼠痛风性关节炎模型, 考察虎杖苷对小鼠足掌病理变化的作用效果。给药组小鼠在造模前3天每天通过腹腔注射给予不同剂量(低剂量组: 5 mg·kg^-1; 中剂量组10 mg·kg^-1; 高剂量组20 mg·kg^-1) 虎杖苷处理。在MSU混悬液注射后第3、6、9、12和24 h测量小鼠足掌厚度并拍照记录。通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, H&E) 染色法染色观察小鼠足掌组织损伤情况。利用免疫组化及免疫荧光检测NLRP3及CASP1 p20表达情况以评估足掌组织NLRP3炎症小体活化情况。细胞水平采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 联合三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)/MSU/尼日利亚菌素(nigericin) 构建NLRP3炎症小体细胞活化模型, ELISA检测虎杖苷处理对巨噬细胞内NLRP3炎症小体活化后白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β) 分泌的影响。流式细胞术检测巨噬细胞内CASP1 p20活化情况。免疫荧光检测巨噬细胞内NLRP3炎症小体组装情况。研究结果表明, 与模型组相比, 虎杖苷给药组小鼠足掌肿胀程度显著降低; H&E染色显示小鼠足掌组织损伤显著减轻, 表明虎杖苷对小鼠足掌损伤具有治疗作用。免疫组化及免疫荧光结果显示CASP1 p20及NLRP3表达显著降低, 表明虎杖苷显著抑制NLRP3炎症小体活化, 从而减弱小鼠足掌局部炎症反应。通过提取小鼠骨髓来源巨噬细胞并进行细胞水平相关实验, 发现虎杖苷处理后细胞内由NLRP3炎症小体活化介导的IL-1β分泌及CASP1 p20活化显著降低, NLRP3炎症小体组装受到抑制。综上所述, 虎杖苷可以通过抑制NLRP3炎症小体组装与活化, 减少IL-1β炎性细胞因子的生成与释放以发挥其抗炎作用, 从而减轻小鼠痛风性关节炎的关节损伤, 为痛风的治疗提供了新策略。

肝纤维化是由多种致病因素导致的慢性肝损伤, 造成胶原在内的细胞外基质过度堆积, 是多数慢性肝病进展过程中常见的病理改变, 然而迄今尚无公认特异有效的药物用于肝纤维化的临床治疗。因此本文研究中药泽泻对胆管结扎(bile duct ligation, BDL) 诱导的肝纤维化的改善作用, 并初步探讨其潜在的药理作用机制。动物实验方案经上海中医药大学实验动物福利与伦理委员会审查(批准号: PZSHUTCM2303280007), 符合实验动物福利与伦理相关规范。对小鼠进行胆管结扎以诱导肝纤维化模型, 并设立假手术组(Sham组)、模型组(BDL组)、泽泻醇提物保护组(BDL+EE)、泽泻水提物保护组(BDL+WE)、奥贝胆酸保护组(BDL+OCA)。结果表明, 泽泻可明显改善胆管结扎诱导的肝纤维化: 泽泻提取物可显著降低肝纤维化小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性、碱性磷酸酶、谷氨酰转移酶及总胆汁酸水平, 改善胆汁淤积、胶原沉积、炎性细胞浸润、肝组织坏死等病理状况, 其中醇提物药效优于水提物。进一步考察泽泻醇提物改善胆管结扎诱导小鼠肝纤维化的量-效关系, 并探讨其作用机制, 发现泽泻醇提物可缓解胆管结扎致肝纤维化小鼠体内血清和肝脏胆汁酸代谢失衡, 调节肝组织内胆汁酸代谢关键核受体法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR) 及其下游靶基因小异二聚体伴侣(small heterodimer partner, SHP)、胆固醇7-羟化酶(cholesterol 7-alpha hydroxylase, CYP7A1)、胆盐输出泵(bile salt export pump, BSEP) 的mRNA表达; 体外进一步证实泽泻醇提物中4种主要三萜可在转录水平激活FXR。本研究表明泽泻在临床上防治肝纤维化的应用提供了理论依据。

具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, Fn) 与结直肠癌(colorectal cancer, CRC) 的发生和发展密切相关。因此, 开发针对Fn的特异性抗菌药物对于CRC的预防和治疗至关重要。前期课题组通过表型筛选成功鉴定出二甲硝咪唑为抗Fn苗头化合物。作为初步的结构优化探索, 本研究构建了3种结构类型并初步合成了7个新型硝基咪唑衍生物, 对所有目标化合物开展了抗菌测试。其中, 化合物CL6对Fn显示优良的抗菌活性(MIC = 0.5 μg·mL^-1), 并且对肠道细菌和正常细胞均具有良好的选择性。化合物CL6显著抑制了Fn诱导的CRC细胞(HCT116) 迁移。初步机制研究表明, 化合物CL6破坏了Fn菌体生物膜和细胞壁的完整性, 这为开发新型抗Fn药物提供了一个有前景的先导化合物。

采用聚酰胺柱色谱、硅胶柱色谱、制备薄层色谱以及半制备高效液相色谱等分离技术, 对姜黄的95%乙醇提取物进行了分离纯化。随后, 运用高分辨质谱、红外、核磁共振等波谱技术对化合物进行了结构鉴定并通过计算ECD确定了新化合物的绝对构型。最终, 从姜黄中分离鉴定了2个没药烷型倍半萜, 分别为(7S)-1,3,5,10-没药烷四烯-3-硝基-9-酮(1) 和turmeronol A (2), 其中化合物1为新颖的硝基取代没药烷型倍半萜。

利用多种色谱技术从中药赤芝中分离得到4个化合物。经一维(1D)、二维(2D) 核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) 等方法鉴定其均为新的羊毛脂甾烷型三萜, 并采用量子化学计算方法确定其绝对构型, 命名为baoslingzhines T~W (1~4)。

采用MCI树脂、葡聚糖凝胶Sephadex LH 20、Flash C18制备色谱和半制备液相制备色谱等方法, 对西南凤尾蕨根部甲醇提取物进行较为系统的分离纯化, 通过质谱、红外光谱和核磁共振等方法, 对分离到的化合物进行结构鉴定。从西南凤尾蕨中分离鉴定了5个倍半萜类化合物, 分别为6,7-四氢吡喃环-(2S, 3S)-蕨素C-3-O-β-D-(6′-acetyl)-葡萄糖苷(1)、(2S, 3S)-蕨素C-3-O-β-D葡萄糖苷(2)、(2S)-蕨素A (3)、(2S)-13-羟基蕨素A (4) 和(2R, 3S)-2-羟基蕨素C (5)。其中, 化合物1为新的三环倍半萜, 化合物3~5首次从西南凤尾蕨中分离。体外生物活性实验表明, 化合物1能够抑制4T1和EMT6细胞增殖, 具有显著抗三阴性乳腺癌生物活性。

采用硅胶、MCI Gel CHP-20、Sephadex LH-20、ODS等色谱填料, 运用柱色谱、半制备液相色谱等分离技术, 对青蒿石油醚提取物的中性部位进行分离纯化, 通过高分辨质谱、核磁共振等波谱技术鉴定化合物的结构。从青蒿中分离鉴定了4个萜类化合物, 分别鉴定为(1S,4S,5R,6S,9R,10R)-4-ethoxy-9,10-dimethyloctahydrofuro-(3,2-i)-isochromen-11(4H)-one (1)、3a,4,5,6,6a,7-hexahydro-3,6-dimethyl-9-methyl-2H-naphtho[8a, 1-b]furan-2,8(3H)-dione (2)、kobusone (3) 和1,2-campholide (4)。其中化合物1为新化合物, 利用X-ray单晶衍射技术确定其绝对构型。化合物2为新天然产物, 化合物3和4为首次从蒿属植物中分离得到。

利用各种色谱技术, 从保山产赤芝中得到6个化合物。结合波谱方法鉴定了它们的结构, 分别为baosacid A (1)、baosside A (2)、ethyl-2,5-dihydroxy-γ-oxobenzenebutanoate (3)、australins A (4)、2,5-dihydroxy-γ-oxobenzenebutanoic acid (5) 和methyl 2,5-dihydroxy-γ-oxobenzenebutanoate (6)。其中, 化合物1~3为新的酚类化合物, 化合物5为新天然产物。

绞股蓝属植物资源丰富, 在我国分布广泛。绞股蓝属植物因含有丰富的达玛烷型三萜皂苷且药理活性多样而引起国内外广泛关注。目前对于绞股蓝属植物化学成分及药理活性研究主要集中于绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino] 和长梗绞股蓝(G. longipes C. Y. Wu ex C. Y. Wu & S. K. Chen) 2个种, 对绞股蓝属其他种植物的研究则较少。本文采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术, 系统阐明缅甸绞股蓝(G. burmanicum King ex Chakrav) 中的化学成分。首先对不同来源缅甸绞股蓝进行液质分析, 观察成分组成的一致性; 根据绞股蓝属来源达玛烷型三萜皂苷质谱裂解规律、丙二酰基及乙酰基皂苷成分裂解特点, 结合自建数据库及ChemSipder、SciFinder、PubChem在线数据库, 对表征的各个峰的结构进行鉴定; 通过液质基峰离子(base peak ion, BPI) 色谱图对比缅甸绞股蓝与长梗绞股蓝的成分异同。实验结果显示, 不同来源缅甸绞股蓝样品的成分组成一致性良好, 共从缅甸绞股蓝样品中鉴定化学成分47个, 包括12个黄酮和35个三萜皂苷类成分, 其中6个为新化合物。缅甸绞股蓝中的皂苷普遍存在丙二酰基和乙酰基化现象, 反相C18色谱分析时它们常常在相应的原型皂苷后相继出现。色谱图显示缅甸绞股蓝与长梗绞股蓝皂苷成分一致性良好, 且主要成分绞股蓝皂苷XLIX和绞股蓝皂苷A及其丙二酰基成分在2个种间含量相当。综上, 通过缅甸绞股蓝的液质分析, 明确了缅甸绞股蓝的成分组成及特点, 为缅甸绞股蓝的开发利用提供了实验依据。

为了对IMH020生产工艺过程和质量控制提供重要依据, 建立IMH020中有关物质的高效液相色谱测定法。色谱柱为Waters Symmetry C₁₈ (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) 柱, 流动相A为乙腈, 流动相B为体积分数0.2%的乙酸水溶液, 进行等度洗脱; 流速为1.0 mL·min^-1; 柱温为30 ℃; 检测波长为270和300 nm; 进样量为10 μL。结果表明, IMH020与有关物质I-1、I-2、I-3a、I-3b、I-4、I-5及未知杂质均能良好分离; 各有关物质在考察范围内线性关系良好, r ≥ 0.998 9, 回收率在93.1%~97.8%之间(RSD ≤ 2%, n = 9)。三批样品中已知杂质仅检出I-3a和I-3b, 并低于限度, 最大未知杂质及总杂质含量质量分数均低于限度。建立的HPLC方法简便、灵敏、准确, 可用于IMH020的有关物质检测。

基于质谱成像法研究三七改善糖尿病视网膜病变(DR) 及干预角膜、玻璃体和视网膜代谢物的作用, 揭示三七改善DR作用机制。所有动物实验经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号: BUCM-2023052204-2117)。采用链脲佐菌素(STZ) 诱导糖尿病(DM) 大鼠模型, 检测各组大鼠的空腹血糖(FBG) 和糖化血清蛋白(GSP) 含量, 应用免疫荧光染色法检测大鼠视网膜中闭合蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白-1 (ZO-1) 表达水平; 采用空气动力辅助解吸电喷雾离子化质谱成像(AFADESI-MSI) 检测DM组和三七组大鼠眼球角膜、玻璃体、视网膜微区内源性代谢物, 通过主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA) 筛选DM组和三七组的差异代谢物, 分析各微区中差异代谢物的原位空间信息, 并通过京都基因与基因组百科全书(KEGG) 数据库分析相关代谢通路。结果表明, 与DM组比较, 三七组糖尿病大鼠FBG和GSP均有下降趋势, 视网膜中ZO-1、occludin表达增加(P < 0.001); AFADESI-MSI分析结果显示, 三七组角膜、玻璃体和视网膜微区共有34个差异代谢物, 其中三七回调13种差异代谢物。在视网膜微区, 三七显著回调溶血磷脂酰丝氨酸(18∶0)、磷脂酰乙醇胺(34∶2) 和磷脂酰丝氨酸(40∶7/42∶7); 代谢通路富集结果表明, 三七主要调控甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇合成、烟酸和烟酰胺代谢以及甘油酯代谢途径。综上, 三七改善糖尿病大鼠血视网膜屏障(BRB), 其作用机制可能与甘油磷脂代谢密切相关, 本研究为三七改善DR的作用机制提供了科学依据, 展现了质谱成像技术应用于药理机制研究的潜力。

树突状细胞(dendritic cells, DCs) 在连接先天免疫与适应性免疫中起着关键作用, 尤其在T细胞的活化和肿瘤免疫应答的调控中具有重要功能。然而, 肿瘤微环境中的免疫抑制性细胞因子以及DCs内的脂质过氧化失衡, 极大限制了其有效激活肿瘤特异性T细胞能力。为此, 作者基于人工智能设计了一种纳米仿生药物递送平台, 该平台通过将姜黄素纳米粒装载于细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs) 中, 旨在通过药物递送与免疫激活双重策略增强DCs功能。体外实验结果表明, 姜黄素通过调控IRE1α-XBP1信号通路显著缓解了DCs的脂质过氧化应激, 从而恢复其抗原呈递功能。此外, OMVs不仅作为高效药物载体, 还作为强大的免疫激活剂, 促进了DCs的成熟并增强了其肿瘤特异性免疫应答能力。本研究提出了一种提升抗肿瘤免疫治疗的新策略, 并为人工智能在药物递送系统中的应用提供了新的研究视角。

通过超速离心法提取大鼠血浆外泌体(plasma exosomes, Pla-Exos), 150 000 ×g, 离心2.5 h。比较超速离心法、超滤法、磁珠捕获法对Pla-Exos的纯化效果。使用超声共孵育的方法制备载葛根素外泌体(plasma exosomes carrying puerarin, Pue-Exos), 以包封率为指标采用响应面法筛选最优处方并测定表征、评估稳定性和体外释放情况。纯化的Pla-Exos和Pue-Exos的粒径均在30~150 nm内; 蛋白质免疫印迹法结果显示, 纯化的Pla-Exos和Pue-Exos均含有标志蛋白TSG101、CD63、CD81。透射电镜观察纯化后的Pla-Exos和Pue-Exos均具有良好的双层膜囊泡结构。Pue-Exos制备的最优处方为孵育1 h, 超声功率39 W, 载药比10∶1。制备得到的Pue-Exos有较好的稳定性和缓释作用, 提高了葛根素体外血脑屏障的透过效率(P < 0.01)。本研究经河北北方学院实验动物伦理审查委员会批准, 伦理审批号：HBNV202307012103。

黄精属Polygonatum Mill.是天门冬科Asparagaceae一个具有重要药用价值的草本植物类群, 高度的形态多样性、广泛的地理分布、复杂的物种形成过程以及缺乏高分辨率的分子标记, 导致属下种间划分鉴定长期存在争议。本研究以中国分布的黄精属15种代表药用植物来自32个居群共166个个体为对象, 以黄精属叶绿体全基因组14个种间高变区序列作为候选分子标记, 评估其种间、种内变异情况, 并分别基于建树法(tree-based method) 和距离法(pairwise genetic distance method, PWG-distance method) 分析评估各序列及其组合对黄精属药用植物的种间鉴定分辨率。结果显示, 除trnT-trnL外, 其余13条候选分子标记序列的PCR扩增和测序成功率良好; 序列独立、联合分析的种间、种内遗传距离间均存在不同程度的重叠, 其中, 序列联合分析的种间、种内遗传距离重叠程度显著小于独立分析。14组序列独立分析基于建树法和距离法的物种鉴定分辨率分别为6.67%~40%和20%~60%, 联合分析的物种鉴定分辨率分别提升至40%~73.33%和46.67%~73.33%%。其中, 组合序列C0和C1 (建树法和距离法)、C2和C3 (建树法) 以及C25 (距离法) 的物种鉴定分辨率均为最高, 达到73.33%, 说明多序列联合分析能有效提高物种鉴定分辨率。此外, 序列psaJ-rpl33、rps16-trnQ、trnF-ndhJ、trnT-trnL、trnK-matK和atpF及组合序列psaJ-rpl33+rps16-trnQ+trnF-ndhJ+trnK-matK+atpF均具有相对较高的物种鉴定分辨率, 可作为黄精属药用植物种间鉴定的特异性高分辨率分子标记(组合)。本研究将为黄精属药用植物种质资源保护利用和该属植物来源中药材的准确鉴定及规范黄精药材市场提供理论基础。

L-天冬酰胺酶(L-asparaginase, ASNase) 是一种氨基水解酶, 被广泛应用在医药和食品领域。其中, 来源于Escherichia coli K12的EcASNase已被用作治疗急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL) 的临床药物。但EcASNase较低的催化活性和稳定性限制了其在医药和食品等领域的应用。本研究通过易错PCR构建随机突变文库, 结合偶联菌体生长的高通量筛选策略, 筛选获得了三个活性提高的阳性突变体G38S、Q212Y、S274P, 其活性分别是野生型(WT) 的1.4、1.1和1.2倍。随后对38、212、274位点构建了饱和突变文库并进行了筛选, 获得了活性提高的突变体G38A、G38S、G38Q、G38V, 其k_cat/K_m值分别是WT的1.7、1.5、2.1和2.2倍, 活性最优突变体G38V的T_m值较WT提高8.4 ℃, 对上述突变体进行组合突变, 突变体G38V/Q212F、G38V/S274P的活性未能进一步提高。本研究不仅阐明了关键位点对酶活性和稳定性的贡献, 还为治疗性酶的设计与开发提供了新思路。