随着纳米技术的迅速发展, 纳米药物的研发已成为目前药物创新的发展方向之一。纳米药物由于具有特殊的纳米尺度效应和纳米结构效应等理化特性, 从而具有特殊的生物学特性, 使其吸收和组织分布等药代动力学特征可能发生变化, 并进而影响其安全性和有效性。同时, 由于纳米药物的特殊性, 纳米药物的非临床安全性评价在普通药物非临床安全性评价的基础上, 有许多特别需要关注之处。中国于2021年8月25日发布了《纳米药物非临床安全性评价研究技术指导原则》, 本文对该指导原则进行全面解读, 着重介绍纳米药物非临床安全性评价的关注要点, 并结合案例进行阐述, 旨在为纳米药物的研发者提供参考。

近年来, 随着眼科治疗药物的发展, 玻璃体作为眼科疾病尤其是眼底病药物治疗的通道, 为以湿性年龄相关性黄斑变性(wet age-related macular degeneration, wAMD) 为代表的各种脉络膜新生血管性疾病、眼底病并发的黄斑水肿、葡萄膜炎等疾病的治疗开辟了新的治疗途径。经眼玻璃体给药的药物主要包括眼用抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 类注射剂、微纤溶酶及激素等。对于该类眼科产品, 目前国内外尚无明确的非临床研究技术指导原则和规范可循。本文结合审评实践和已上市产品的研发案例, 梳理了经眼玻璃体给药药物的研究进展及非临床研究评价考虑要点, 以期为该类药物的研究评价提供参考。

核酸作为新一代生物技术药物, 不但可以从本源上治疗疾病, 而且在技术和生产层面均具有显著的平台化特征, 因此在医疗领域具有广阔的应用前景。然而, 核酸在体内外稳定性差, 递送效率低, 极大限制了其成药性。近年来, 以可离子化脂质为基础的脂质纳米粒展示出良好的临床应用潜力, 并在核酸新冠疫苗中得到了验证。脂质纳米粒能够凭借其独特的结构和理化性质特征, 在体内展现出较高的递送效率和较好的安全性, 为未来核酸药物的临床应用提供了更多可能。本文围绕核酸药物自身特点及其临床应用面临的屏障, 结合已获批上市核酸药物, 重点阐述其递送载体脂质纳米粒成功的关键要素, 并对领域内尚待解决的问题进行展望。

脂质体纳米药物制剂是一种被脂双分子层囊泡结构包裹的具有纳米尺度的新型药物制剂。脂质体作为药物递送载体, 具备生物相容性良好、在体内可被生物降解以及定位靶向性强等优点。应用脂质体纳米药物递送系统, 可在一定程度上改善某些药物在人体内的药代动力学行为及药效, 减轻不良反应。脂质体纳米药物进入人体后, 会释放游离型药物, 因而体内会同时存在负载型脂质体纳米药物和游离型药物。负载型药物是药物的贮库, 游离型药物与药物的药效和不良反应有关, 因此, 脂质体药代动力学研究应该同时关注负载型药物和游离型药物。游离药物、脂质体粒子及其材料的精准分析是脂质体体内定量研究的一个难点。本篇综述介绍了脂质体纳米药物的前处理方法, 总结了脂质体纳米药物的生物分析方法及其药代动力学的研究进展, 希望能够为脂质体纳米药物制剂的研究开发提供参考。

聚合物纳米药物制剂因其具有长循环、可降低免疫原性、不良反应小等优点, 得到了越来越多的关注, 已经成为纳米药物制剂研究的热点。然而, 真正成功应用于临床的聚合物纳米药物制剂的数量非常少, 药代动力学行为不理想是导致这一现象的主要原因之一。聚合物纳米制剂作为载药粒子进入体内之后, 会释放出游离药物和聚合物辅料, 游离药物是发挥药效的物质基础, 而聚合物辅料则有可能会引起辅料-药物相互作用, 因此, 聚合物纳米药物制剂药代动力学研究的关注点不应该仅仅局限于游离药物本身, 应该同时关注载药粒子、游离药物、聚合物辅料及其代谢物在体内的动态变化, 这就为聚合物纳米药物制剂的生物分析方法提出了新的要求和挑战。基于此, 本文简要介绍了聚合物纳米药物制剂的常用生物分析方法色谱分析法的特点及适用范围, 概述了聚合物纳米药物制剂在体内的吸收、分布、代谢和排泄, 希望能够为聚合物纳米药物制剂的药代动力学研究、安全性和有效性评价提供借鉴和参考。

纳米生物医学是生物医药领域中最具有应用前景的方向之一, 无机纳米材料由于其优良的物理、化学特性、稳定的化学性质以及高生物相容性, 在众多的纳米材料中脱颖而出。作为一种低成本的无机纳米材料, 铋基纳米材料由于具有带隙可调、低毒性、易于功能化、较大X射线衰减系数、较高光热转换效率和长循环半衰期等优势, 在癌症诊断和治疗方面具有种种潜在的用途和广阔的应用前景。本文综述了铋基纳米材料在肿瘤诊断、治疗和生物安全性方面的最新研究进展, 为新一代铋基纳米药物系统的设计和开发提供理论依据和开发思路。

纳米技术在医药学治疗和诊断领域展现出明显的优势, 通过纳米载体的包裹, 药物不仅能够增强治疗效果, 降低不良反应, 还可通过基团于纳米载体表面的修饰, 成为智能响应型靶向药物体系。然而, 由于在相关的基础研究、生产条件、成本控制和临床试验等方面存在障碍, 各类载药体系的药代动力学研究缺失, 造成转化率低的现状。针对以上问题, 本文就纳米载体在药物递送中的辅助作用及特点、种类及功能、药代动力学、应用前景、面临的挑战等方面进展做出综述分析。

接种新型冠状病毒感染(Corona Virus Disease 2019, COVID-19) 疫苗在阻止COVID-19中起到了关键作用。基于纳米药物递送系统(nano drug delivery system, NDDS)——脂质纳米粒(lipid nanoparticles, LNP) 的mRNA疫苗因其较高的有效性和安全性已实现了广泛应用。尽管已有基于mRNA-LNP的新冠疫苗严重过敏反应的报道, 但目前过敏反应发生的机制和成分尚未完全明确。本文关注BNT162b2和mRNA-1273两种已上市的mRNA-LNP新冠疫苗, 在讨论其结构特点、潜在的过敏原、过敏反应机制、mRNA和LNP的体内药代动力学之后, 还对有过敏史人群的评估方法, 以及各国家、地区对接种疫苗人群的范围进行综述, 以期在一定程度上促进疫苗的安全接种。LNP已成为一种公认的高度可定制的核酸递送载体, 不仅在mRNA疫苗中显示出价值, 在治疗罕见疾病和癌症等广阔领域更有着巨大的潜力。在mRNA-LNP疫苗开启纳米医学的新时代之际, 期望能为更多纳米递送药物研发及评价过程中安全性研究提供一些启发, 助力更多纳米药物成功实现临床转化。

2022年, 是全球经历新冠疫情侵扰的第三个年头, 其对药物研发的影响也逐渐显现。美国FDA药物评价和研究中心(CDER) 在过去一年里共计批准了37款新药, 相比2021年50款新药获批的历史峰值有了明显下降。首创性(first-in-class) 药物仍是新药获批的主力军, 本年度共计有21款, 其中小分子的首创性药物有7款。今年新药获批的总数虽大幅下降, 但其中不乏多款具有重要借鉴意义的首创性小分子药物, 例如首款口服丙酮酸激酶(PK) 激活剂米他匹伐(mitapivat), 首个选择性心肌β肌球蛋白三磷酸腺苷(ATP) 酶变构抑制剂玛伐凯泰(mavacamten), 首个靶向TYK2 (酪氨酸激酶2) 的氘代变构抑制剂氘可来昔替尼(deucravacitinib), 首个靶向HIV衣壳的长效抑制剂来那帕韦(lenacapavir) 等。首创性药物的研究需要聚焦临床难点问题, 通过全新的作用靶标和生物机制实现对特定疾病的治疗效果。在生物机制研究、靶标选择、分子筛选、先导物确定、成药性优化等多方面研究过程中均存在巨大挑战, 成功的首创性药物研发过程具有重要的学习和借鉴意义。本文通过浅析本年度3个首创性小分子药物的研发背景、研发过程和治疗应用, 以期为更多的首创性药物提供研究思路与方法。

心血管疾病是人类卫生健康的重要威胁, 也是药物研发的重要研究领域。类器官是利用干细胞的自我更新和分化能力, 通过体外培养构建的一类与真实器官结构和功能类似的微器官。由于心脏类器官具备人源性、更贴近体内的结构和功能、可实现自组装及遗传稳定性好的特点, 其在心脏发生发育研究、心血管疾病模型构建药物研发领域中的应用受到广泛关注。因此, 本文将对近年来心脏类器官的发展与构建策略、心脏类器官在药物研发领域中的应用及该技术的前景进行讨论。

介绍一氧化碳(CO) 和CO释放分子的杀菌机制及其作为抗感染药物的可行性, 为相关教学和研究工作提供参考。通过查阅文献, 结合自身科研工作, 对CO的杀菌机制及其作为抗感染药物的可行性进行综述。厌氧细菌通常能耐受高浓度CO, 有些甚至能以CO为唯一的碳源或能源生长, 但一些常见的致病菌对CO敏感。鉴于CO气体的剂量和施加部位不易控制, 一批CO释放分子被合成出来。CO释放分子不但安全易控, 杀菌效率比气态CO更高, 对耐药菌株及其生物膜也具有很好的杀灭和抑制作用。CO主要与细胞内的血红素-Fe²⁺结合, 阻断呼吸链电子传递, 进而产生活性氧; CO还通过与金属元素的结合影响胞内离子平衡, 进而触发自由基反应, 破坏DNA等大分子。CO具有作用靶标多样, 不易产生耐药性, 与现有抗生素存在协同效应等优点, 有望成为下一代抗感染药物。

核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2 (nucleotide-binding oligomerization domain containing 2, NOD2) 是一类胞浆内模式识别受体, 其被激活后通过一系列信号级联转导, 诱导炎症因子释放, 从而在固有免疫应答中发挥重要作用。NOD2信号通路异常涉及多种疾病的发生和发展, 尤其是其基因的遗传多态性与自身炎症性疾病(autoinflammatory diseases, AIDs) 密切相关。因此, 靶向NOD2通路的抑制剂在炎症免疫性疾病治疗中具有巨大潜力。基于此, 本文对NOD2受体介导的信号转导通路及其调节机制, NOD2与AIDs的关系以及NOD2通路抑制剂研究的最新进展进行综述。

人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase, hNE) 是一种丝氨酸蛋白水解酶, 主要分布于中性粒细胞中。当体内抗hNE蛋白与hNE的平衡被打破, 过量释放的hNE会导致相关疾病的发生, 因此抑制hNE是一种很有前途的疾病治疗策略。本文简要介绍了hNE的结构、作用机制、生理功能及hNE抑制剂的研发现状, 以期能为相关研究提供参考。

本研究利用全细胞膜片钳技术探索丙泊酚对丘脑室旁核(paraventricular thalamus, PVT) 谷氨酸能神经元活性的影响及作用机制。在8周龄C57BL/6J小鼠急性脑片上, 用单细胞逆转录PCR技术鉴定PVT神经元类型。记录丙泊酚给药前、后和洗脱后PVT神经元的放电频率(firing frequencies before, during, and after, F_B, F_D and F_W) 及给药前、后的膜电位(membrane potential before and during, MP_B and MP_D)。探索木防己苦毒素(picrotoxin, PTX) 阻断γ-氨基丁酸A型(gamma-aminobutyric acid type A, GABA_A) 受体后对丙泊酚作用的影响, 以及丙泊酚对PVT神经元上自发和微小抑制性突触后电流(spontaneous and miniature inhibitory postsynaptic currents, sIPSCs and mIPSCs) 的影响。动物实验已获得复旦大学上海医学院动物实验伦理委员会批准。结果显示, 在脂肪乳组和2 μmol·L^-1丙泊酚组, F_B、F_D、F_W之间无统计学差异。在5、10、20 μmol·L^-1丙泊酚组, F_D与F_B相比显著下降(P < 0.01), F_W与F_D相比显著升高(P < 0.01), 且这3个浓度组之间的抑制程度有显著差异(P < 0.01)。MP_D与MP_B相比仅在20 μmol·L^-1丙泊酚组有显著下降(P < 0.01)。加入PTX后10 μmol·L^-1丙泊酚不能抑制放电频率。10 μmol·L^-1丙泊酚使sIPSCs的衰减时间延长(P < 0.01), 且使mIPSCs的衰减时间延长(P < 0.05), 幅度升高(P < 0.01)。以上结果表明, 丙泊酚呈浓度依赖和可逆性地抑制PVT谷氨酸能神经元活性, 这种作用可能主要由突触后GABA_A受体介导。

达原饮(Dayuanyin, DYY) 在新冠肺炎和肺损伤中都有降低肺部炎症的作用。本实验拟探究DYY预防低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH) 的药效和作用机制, 并对DYY保护肺功能的作用进行评价。动物福利和实验过程均遵循中国医学科学院药物研究所动物伦理委员会的规定并获批准。将雄性C57/BL6J小鼠随机分为正常对照组、模型组、达原饮组(800 mg·kg^-1) 和阳性对照西地那非组(100 mg·kg^-1), 造模前3天灌胃给予对照溶剂或药物, 第4天开始将模型组、达原饮组、西地那非组动物置于含10% ± 0.5%氧气的低氧舱中饲养, 正常对照组动物于正常环境中饲养, 继续连续给予对照溶剂或药物14天。实验终点检测小鼠右心室收缩压、右心室肥厚指数、脏器指数等各项指标, 同时检测小鼠肺组织中炎症因子的表达水平。利用网络药理学对DYY在肺动脉高压上的潜在作用靶点进行预测, 并通过Western blot实验检测细胞核因子κB (nuclear factor kappa B, NF-κB) 信号通路相关蛋白的表达。DYY可显著降低HPH小鼠的右心室收缩压, 减轻小鼠肺脏损伤, 降低炎症因子表达, 还可抑制低氧诱导的NF-κB信号通路的激活。DYY具有保护肺功能的作用, 表现在DYY对HPH具有良好的药效, 预防用药可减缓疾病的发展。作用机制可能与DYY通过降低炎症因子的表达抑制NF-κB及信号转导和转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3) 的激活相关。

乳腺癌已成为女性发病率最高的恶性肿瘤, 严重危害女性的健康。从传统药物中筛选出高效低毒的先导化合物是开发乳腺癌治疗药物的有效途径之一。毛大丁草内酯J是本课题组前期从民族药毛大丁草中分离得到的一种新型香豆素类化合物, 具有显著的抗肿瘤活性, 但关于毛大丁草内酯J对乳腺癌细胞周期和凋亡的影响及作用机制尚不明确。本研究利用CCK-8法、克隆形成实验、PI染色法探讨毛大丁草内酯J对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖及周期的影响。通过DAPI、Annexin V/TO-PRO-3、Rhod-2 AM、TMRM、DCFDA染色法及蛋白免疫印迹法考察毛大丁草内酯J对MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡及线粒体功能的影响。结果表明, 毛大丁草内酯J通过调控P21/CDC25C/CDK-1/cyclin B1通路, 将细胞周期阻滞于G2/M期, 显著抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖。此外, 毛大丁草内酯J能诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞发生线粒体钙超载, 线粒体膜电位降低, 活性氧生成增加, 引发细胞凋亡, 其作用机制与激活线粒体凋亡通路有关。综上, 毛大丁草内酯J可通过调控P21/CDC25C/CDK-1/cyclin B1通路及激活线粒体凋亡通路诱导乳腺癌细胞周期阻滞及凋亡, 为乳腺癌新药研发提供新的候选化合物。

本研究主要探究髓系分化初级反应蛋白88 (myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88) 在肿瘤发生发展中的作用, 发现靶向MyD88的抗肿瘤活性小分子。本研究利用CRISPR/Cas9技术和裸鼠移植瘤模型检测MyD88缺失对肿瘤生长的作用, 实验动物伦理审查编号为PZSHUTCM200828006; 利用微量热泳动技术(microscale thermophoresis technology, MST) 筛选直接结合MyD88的天然产物小分子, 并进一步检测候选小分子对细胞增殖的影响。结果表明, MyD88缺失后显著抑制结肠癌、胰腺癌和皮肤癌的肿瘤生长并且抑制肿瘤细胞的NF-κB信号通路活性; MST结果发现, 去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA) 与MyD88直接结合, 其结合解离常数K_d = 14.61 µmol·L^-1; 去甲二氢愈创木酸阻断NF-κB报告系统的激活, 并抑制NF-κB通路关键因子p65磷酸化; 此外, 克隆形成实验结果发现去甲二氢愈创木酸抑制肿瘤细胞增殖。以上结果表明, MyD88是结肠癌、胰腺癌、皮肤癌潜在治疗靶标, 去甲二氢愈创木酸与MyD88直接结合并且抑制其下游NF-κB信号通路的活性, 从而抑制胰腺癌、皮肤癌及结肠癌细胞增殖。

以程序性死亡配体1/程序性死亡受体1 (programmed cell death ligand 1/programmed cell death protein 1, PD-L1/PD-1) 免疫检查点阻断治疗为代表的肿瘤免疫疗法在临床上取得了令人鼓舞的治疗效果。小分子肿瘤免疫治疗药物与免疫检查点抗体药物的联用, 为肿瘤治疗提供了新策略。因此, 研发能阻断PD-L1/PD-1免疫检查点相互作用的小分子药物是下一代肿瘤免疫疗法的新方向。本研究对丹酚酸B (salvianolic acid B, SAB) 下调肿瘤细胞中PD-L1表达发挥抗肿瘤作用及机制进行了研究。利用Western blot、流式细胞术、PD-1/PD-L1相互作用分析SAB对结肠癌细胞RKO和前列腺癌细胞PC3细胞内和膜表面PD-L1蛋白表达水平的影响; 荧光定量PCR检测SAB对PD-L1 mRNA的影响; 细胞阻抗法和结晶紫法检测SAB对人类外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 杀伤肿瘤细胞的效果; 表面等离子共振技术分析SAB与泛素羧基末端水解酶2 (ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2, USP2) 的直接相互作用; MC38荷瘤小鼠(所有动物实验均遵循中国医学科学院医药生物技术研究所伦理委员会的规定) 检测SAB的体内抑瘤效果。结果表明, SAB能分别以浓度依赖性和时间依赖性方式下调RKO、PC3细胞中以及细胞膜表面PD-L1的水平, 这与SAB抑制肿瘤细胞中去泛素化酶USP2的活性有关。机制研究发现, SAB可与USP2发生直接相互作用并抑制其去泛素化酶活性, 从而促进PD-L1发生泛素-蛋白酶体途径降解。此外, SAB可促进共培养的PBMC对RKO细胞的杀伤作用。小鼠荷瘤实验证实, SAB可显著抑制C57BL/6小鼠中MC38移植瘤的生长。20 mg·kg^-1 SAB处理荷瘤小鼠后, 可使瘤体积减少63.2%。以上结果说明, SAB通过直接结合USP2并抑制其活性, 促进PD-L1发生泛素-蛋白酶体途径降解, 从而发挥抗肿瘤作用。本研究为将SAB研发成靶向USP2-PD-L1轴的小分子肿瘤免疫治疗药物奠定了基础。

采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱和高效液相色谱等方法从火把花内生真菌Trichoderma atroviride B7固体发酵提取物中分离得到9个生物碱类化合物。利用核磁共振谱、高分辨质谱等方法将其分别鉴定为: atroviridanol (1)、3-oxo-3-[(2-phenylethyl) amino]-propanoic acid (2)、N-(2′-phenylethyl)-acetamide (3)、neoechinulin A (4)、echinulin (5)、gancidin W (6)、N-isobutyl-3-methylbutanamide (7)、5-acetamido-1-pentanol (8) 和N-2-methylpropyl-2-methylbutenamide (9)。其中, 化合物1为新化合物, 化合物2~9首次从木霉属真菌中分离得到。

利用中压反相色谱、凝胶柱色谱和HPLC等多种色谱分离方法对两株海洋来源微生物——链霉菌IMB18-531与枝孢菌IMB19-099的共培养发酵物进行分离纯化, 共分离得到9个化合物。根据波谱学数据分析并结合化学方法, 分别鉴定为: 铝草氨菌素E (1)、去铁胺E (2)、铁草氨菌素E (3)、terragine E (4)、卡巴西霉素(5)、环(L-脯氨酰-L-酪氨酸) (6)、邻氨基苯甲酸(7)、(Z)-14-甲基十五烷-9-烯酸(8) 和(Z)-十六烷-8-烯酸(9)。其中, 化合物1为新化合物。活性筛选结果表明, 化合物2显示出抗肝纤维化活性, 能够抑制肝纤维化相关基因COL1A1、MMP2和TIMP2的表达。化合物5、8和9对甲氧西林耐药金葡菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌显出抗菌活性, MIC为16~64 μg·mL^-1。化合物5对人胰腺癌细胞MIA Paca-2和结肠癌细胞HT-29显示出显著的细胞毒活性, IC₅₀分别为2.9和6.3 μmol·L^-1。

通过大孔吸附树脂、MCI树脂、正相硅胶、Sephadex LH-20柱色谱, 结合制备薄层色谱及反相高效液相色谱分离技术, 从“归头”水煎提取物中分离得到拥有不同聚合方式的10个二聚酞类外消旋体(1~10), 经手性HPLC拆分得到(+)-/(-)-1~(+)-/(-)-10。借助波谱数据解析、电子圆二色谱(ECD) 和NMR计算综合分析及单晶X-射线衍射确定了它们的结构和绝对构型, 均为新结构或新天然产物, 分别命名为当归二酞内酯酸A~H (1~8) 和当归二酞内酯醇A和B (9和10)。同时, 对单内酯和双内酯型3.3′a, 8.6′-和3.6′, 8.3′a-连接的二聚酞衍生物及其相对构型确定进行了讨论。

运用大孔吸附树脂、MCI树脂、Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40C、正相硅胶和C18反相硅胶等多种固定相柱色谱, 结合闪式色谱和高效液相色谱分离技术, 从常用中药钩藤水煎液中分离得到17个(1~17) 微量三萜酸类化合物。通过HR-ESI-MS、UV、CD、IR及1D和2D NMR波谱数据解析鉴定了它们的结构, 其中8个为新化合物(1~8), 依次命名为钩藤酸Q~X, 且化合物2和7的结构得到单晶X-射线衍射分析的确证。在初步体外活性筛选中, 在5 μmol·L^-1浓度下, 27-羟基齐墩果酸(17) 对TGF-β诱导的HSC-T6细胞活化有一定抑制作用。

龙葵(Solanum nigrum L.) 全草均可入药。本研究采用UHPLC-Q Exactive高分辨质谱结合GNPS分子网络(global natural products social molecular networking), 对龙葵叶的化学成分进行快速表征。通过与文献报道数据比较, 并结合质谱裂解特征规律分析, 以及GNPS分子网络中已知和未知节点的关联分析, 从龙葵叶中共鉴定157个化合物, 包括甾体生物碱30个, 甾体皂苷61个, 黄酮类35个, 氨基酸、有机酸等其他类型化合物31个。与龙葵果和龙葵茎相比, 龙葵叶中甾体皂苷、甾体生物碱、黄酮类成分的种类均较为丰富, 本研究结果为龙葵药材资源的精准利用奠定了基础。

依据补骨脂“性本大燥”的药性理论, 寻找补骨脂致肝损伤的易感证候及生物标志物。分别构建肾阴虚证、肾阳虚大鼠模型, 所有动物实验操作和福利均遵循河南中医药大学第一附属实验动物伦理与动物福利委员会的规定(批号YFYDW2020017)。结果发现补骨脂可显著降低肾阴虚证大鼠体质量、饮水量、尿量, 并增加其肝、睾丸、肾上腺、脾脏脏器指数及谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT) 表达; 同时, 补骨脂还显著增加了肾阳虚证大鼠尿量, 并降低ALT、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST) 表达; 苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE) 染色显示补骨脂明显加剧肾阴虚证大鼠肝细胞炎症浸润, 并减轻肾阳虚证大鼠肝损伤。超高效液相色谱-质谱(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS) 检测血浆后共鉴定出17个补骨脂共同调控肾阴/阳虚证大鼠的具有显著差异的内源性代谢标志物。其中, 谷氨酰胺、喹啉酸、胆绿素、乳糖基酰基鞘氨醇等8个代谢物呈相反变化趋势, 主要涉及半胱氨酸和蛋氨酸代谢、酪氨酸代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢、鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、谷氨酰胺代谢等通路。因此, 本研究推测肾阴虚证与肾阳虚证可能分别是补骨脂发挥肝损害与肝保护的易感证候, 这可能与其调控体内相关氨基酸代谢和鞘脂代谢等有关, 可为中医临床补骨脂的安全精准使用提供一定的实验数据支撑。

探索西洋参皂苷类成分中抗疲劳关键活性成分。利用斑马鱼模型评价西洋参样本的抗疲劳活性; 运用代谢组学技术分析鉴定不同产地西洋参中主要皂苷类差异成分; 通过构建西洋参皂苷类成分-疾病靶点PPI蛋白互作网络初步筛选出西洋参发挥抗疲劳作用的活性物质和相关靶点, 利用分子对接的方法筛选出关键活性成分; 最后使用斑马鱼模型评价关键活性成分的抗疲劳活性, 动物实验获得山东省医学科学院伦理委员会的批准(SYXK20220005)。斑马鱼活性评价结果显示, 两个产地的西洋参样本的活性存在显著差异, 进一步经过代谢组学检测、模式判别共鉴定出其中10个差异皂苷类成分可能与抗疲劳活性有关。借助成分-疾病靶点的PPI筛选的抗疲劳的核心靶点, 结合类药性参数及分子对接技术发现其中pseudoginsenoside F11与5个靶点均具有较好的结合活性。经斑马鱼模型验证发现拟人皂苷F11具有显著的抗疲劳活性。本研究运用代谢组学和斑马鱼模型筛选出了西洋参发挥抗疲劳的关键活性物质, 为西洋参皂苷类抗疲劳的进一步研究提供参考。

本研究从茯苓残渣中提取得到茯苓碱溶性多糖, 采用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)、X-射线粉末衍射法(XRD)、差示扫描量热法分析(DSC) 等方法对茯苓碱溶性多糖进行了结构表征, 采用电子扫描显微镜(SEM) 考察了茯苓碱溶性多糖和乙基纤维素(EC) 的物理形貌, 并重点考察休止角、松密度、振实密度、卡尔指数、颗粒间孔隙率、内聚力指数、豪斯纳比等指标, 绘制粉末物理指纹图谱, 采用多元分析法进行粉体学性能评价。采用直接压片法, 分别使用茯苓碱溶性多糖和EC为不溶性骨架材料, 制备双氯芬酸钠缓释片, 评价缓释片的基本性能, 考察体外释药行为, 并研究其释放机制。结果表明, 茯苓碱溶性多糖是一种呈光滑片状结构的半结晶聚合物, 堆积性、可压性均强于EC; 体外释放实验表明, 茯苓碱溶性多糖缓释性能强于EC, 其所制备的缓释片释药行为符合Higuchi模型, 释放过程中片剂内部形成了孔隙结构, 释放方式为孔道扩散释药。该研究结果对新型缓释材料的开发和资源的合理利用具有重要意义。

甘露醇-氯化钙金属有机骨架(MOF) 共晶显著改善了β-甘露醇的可压片性, 可开发作为新型片剂填充剂, 但研究者在该辅料放大生产过程中发现产物中含有甘露醇单体, 显著影响辅料的功能特性。本研究拟对甘露醇-氯化钙共晶体系的多组分进行定量研究。实验以MOF共晶辅料甘露醇-氯化钙共晶为模型化合物, 采集红外光谱, 以偏最小二乘回归(PLSR) 为基础, 采用去除异常波段、归一化进行光谱预处理, 采用遗传算法(GA) 和竞争性自适应重加权算法(CARS) 2种不同变量筛选方法筛选关键变量, 建立并比较了共晶辅料制备产物中甘露醇-氯化钙MOF共晶含量的定量校正模型。采用GA法和CARS法2种不同变量筛选方法分别筛选出160、14个变量, CARS-PLSR法建立的甘露醇-氯化钙共晶模型具有最佳性能, 模型的平均相对误差(MRE) 和校正均方根误差(RMSEC) 分别为0.008 8和0.892 5, 与全光谱模型相比, 模型的决定系数(R²) 由0.978 3提升为0.994 4。本研究建立的共晶体系定量方法预测精度高、检测速度快、稳定性好, 对优化此类共晶辅料制备工艺条件及质量控制方法的研究具有重要意义。

通过研制西罗莫司自微乳-介孔硅缓释片, 以期提高难溶性药物西罗莫司的溶出度, 并降低其毒副作用。首先, 制备西罗莫司自微乳, 用介孔硅进行固化。其次, 以外观、硬度、体外释放度为指标筛选适宜的辅料, 采用粉末直接压片法制备以羟丙基甲基纤维素(HPMC) 为骨架材料的缓释片, 以星点设计优化处方, 考察其体外释药情况。最后, 以市售西罗莫司片作为参比制剂, 进行比格犬体内药动学实验(动物实验和福利过程均已获得联勤保障部队第九〇〇医院动物伦理委员会的审核并批准)。结果表明, 缓释片的最终处方[西罗莫司自微乳-介孔硅(1∶1, w/w)] 的用量为162 mg, HPMC K4M为80 mg, 羧甲基淀粉钠为80 mg, 微晶纤维素为168 mg。体外释药实验结果显示, 自制缓释片在12 h内缓慢释药, 符合Ritger-Peppas模型。体内实验结果显示, 与市售西罗莫司片相比, 缓释片的C_max降低了49.47%; T_max延长了5.1倍, 相对生物利用度为105.81%。西罗莫司自微乳-介孔硅缓释片具有良好的体外、体内缓释效果, 为其他难溶性药物的增溶及其缓释制剂的研发提供了参考。

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS) 是甲基赤藓醇磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP) 途径中催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸缩合生成1-脱氧-木酮糖-5-磷酸(DXP) 的第一个关键酶。本研究通过反转录·聚合酶链反应(RT-PCR) 从桔梗根中克隆得到PgDXS1、PgDXS2、PgDXS3基因, 开放阅读框(ORF) 全长分别为2 160、2 208和2 151 bp, 分别编码719、735、716个氨基酸, 同源氨基酸序列分析表明桔梗与橡胶树、曼陀罗及甜菊的DXS基因编码的氨基酸序列具有较高同源性; 进一步构建原核表达载体pET-28a-PgDXSs, 转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 成功诱导3个DXS蛋白的表达。亚细胞定位结果显示, PgDXS1和PgDXS2蛋白主要定位于叶绿体中, PgDXS3蛋白定位于叶绿体、细胞核和细胞质中。运用实时荧光定量PCR检测3个DXS基因在2个产区不同组织中的表达水平, 结果表明3个DXS基因均在太和桔梗叶中高表达。在茉莉酸甲酯(MeJA) 诱导处理下, PgDXS1、PgDXS2、PgDXS3基因表达水平在不同诱导的时间点(3~48 h) 呈现先降低后增高的趋势; 酶活性检测结果显示: 桔梗的3个组织中DXS酶活性在MeJA处理后不同的时间点也呈现先增加后降低的趋势。本研究为进一步阐明桔梗中萜类化合物合成途径PgDXS基因的生物学功能提供参考。

艾(Artemisia argyi) 以叶片入药, 为我国常用大宗中药材, 主要活性成分为挥发油、黄酮等化合物, 具有多种药理活性。目前鉴定到的艾叶黄酮类物质多为氧甲基化修饰, 而类黄酮O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase, FOMT) 是黄酮类化合物氧甲基化修饰的关键酶。为进一步了解FOMT蛋白功能及特性, 本研究对艾中FOMT基因家族进行了全基因组的挖掘和鉴定, 并进行系统发育、染色体定位、基因序列特征、亚细胞定位预测、蛋白结构、基因结构分析及表达模式的分析和验证。结果表明, 在艾的基因组中, 共鉴定得到83个FOMT基因, 系统发育树显示FOMT基因分为CCoAOMT (caffeoyl CoA O-methyltransferase) 亚家族(32个基因) 和COMT (caffeic acid O-methyltransferase) 亚家族(51个基因) 两个亚类。基因序列特征分析显示FOMT编码氨基酸的数目介于70~734 aa, 分子质量为25 296.55~34 241.3 Da, 等电点为4.51~9.99, 与32个CCoAOMT亚家族成员相比, 51个COMT亚家族成员中, 约1/3的FOMT蛋白为疏水性蛋白, 2/3蛋白为亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果显示超过80%的CCoAOMT亚家族成员定位于细胞质, 96%的COMT亚家族成员定位于叶绿体。COMT成员相对CCoAOMT成员motif数较多, 且位于N端的motifs变异相对较大, 位于C端的motifs相对保守; 表达模式分析显示CCoAOMT亚家族成员主要在根中表达, 而COMT成员主要在叶片中高量表达; 实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 验证了部分FOMT在叶片中优势表达, 具有组织表达特异性。本研究对艾叶FOMT基因家族进行鉴定与分析, 为进一步深入研究FOMT功能和甲基化黄酮类化合物的生物合成提供理论依据。

二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR) 是花色素苷生物合成途径的关键酶, 在植物花色调控中发挥重要作用。本研究通过管花肉苁蓉花转录组数据分析, 利用RT-PCR技术克隆出一条DFR基因并命名为CtDFR, 其开放阅读框(ORF) 长1 263 bp, 编码420个氨基酸, 蛋白分子质量为47.5 kDa。序列分析表明CtDFR具有NADPH结合域和底物特异性结合域。实时荧光定量PCR表明CtDFR在管花肉苁蓉的红、紫色花中高表达, 相对表达量分别是白色花的4.04、19.37倍。构建原核表达载体pET-28a-CtDFR, 转入大肠杆菌BL21 (DE3) 菌株中, 成功表达CtDFR蛋白, 纯化得到可溶性重组蛋白。体外酶活性分析表明, 重组蛋白CtDFR能催化二氢山柰酚、二氢槲皮素、二氢杨梅素生成无色天竺葵素、无色矢车菊素、无色飞燕草素。亚细胞定位实验结果表明CtDFR主要定位于细胞质中。本研究结果表明CtDFR在管花肉苁蓉花色调控中起到重要作用, 为进一步探讨管花肉苁蓉花色形成及调控机制研究奠定了基础。