随着人口老龄化的加剧和健康水平的不断提高, 如何预防和延缓皮肤衰老备受人们关注。皮肤衰老与年龄、紫外线辐射、生活方式等有关, 主要表现为皮肤松弛、皱纹、色斑等, 因此亟待寻求中药及相关化妆品解决皮肤衰老问题。中药具有抗氧化、增强人体免疫、促进机体新陈代谢、调节内分泌等作用, 现已成为抗皮肤衰老研究热点。通过综述皮肤衰老机制及中药抗皮肤衰老的研究进展, 以期为今后抗皮肤衰老中药的研究和开发提供参考依据。

血栓诱发的心脑血管疾病的发病率在世界范围内不断增长, 严重威胁人类健康。研究表明, 形成血栓的三个因素分别为血流缓慢、血液高凝状态以及血管损伤。根据血栓形成的机制, 抗血栓药物被分为三类, 包括抗凝剂、血小板抑制剂和纤维蛋白溶解剂。由于凝血系统和抗凝血系统在血栓形成的过程中扮演着重要的作用, 因此受到了越来越多的关注。目前, 具有抗凝活性的新型化合物正不断涌现, 一定程度上缓解了早期获批血栓治疗药物临床应用的一些问题, 如出血风险高、起效慢、治疗窗口窄等。本文首先阐述了凝血机制以及血栓形成的原因和机制, 然后主要总结了近年来研究报道的抗凝血活性化合物及潜在的抗血栓候选物, 并对部分化合物的化学结构-药理活性关系进行了分析, 以期促进开发具有抗凝血生物活性的分子, 用于治疗血栓性疾病。

药物靶点的发现在药物研发中发挥着至关重要的作用, 非标记的药物靶点发现技术因其无需改造药物小分子结构, 能更真实反映小分子药物与靶点互作, 成为药物靶点发现的新途径。中药(traditional Chinese medicines, TCMs) 具有多成分、多靶点的特性, 其作用靶点及机制的研究备受制约, 鉴于非标记的药物靶点发现技术在TCMs化学成分靶点发现研究中的应用潜力, 本文综述了非标记的药物靶点发现新技术及其在TCMs研究中的应用, 为TCMs化学成分靶点的发现提供参考, 为促进TCMs现代化的发展提供新思路。

高效快速地分离和筛选复杂体系中的活性成分是从天然产物中发现先导化合物的关键。近年来, 在线二维液相色谱技术因具有分辨率高、自动化程度高以及集成方式灵活等优势在天然产物活性成分筛选研究中备受青睐。本文简要综述了在线二维液相色谱技术的特点及其在天然产物活性成分筛选领域中的应用研究进展, 主要从柱前、柱上以及柱后三大筛选模式的不同集成方式展开叙述, 并指出其不足, 以期为后续应用研究提供科学参考, 促进该技术在活性成分筛选领域的快速发展。

为了研究芍药甘草汤的镇痛作用, 本文从中药大分子角度探讨其物质基础及作用机制。本实验从中药复方煎煮后汤液浑浊的现象出发, 以芍药甘草汤为研究对象, 研究其煎煮时沉淀物的形成过程, 结果表明汤剂在煎煮过程中会形成具有一定形貌的聚集体, 通过静置离心得到沉淀物。定性、定量分析发现沉淀物主要由芍药苷、芍药内酯苷、甘草酸、甘草苷、异甘草苷和没食子酸6种小分子和蛋白质、多糖类大分子组成, 虽然其成分与芍药甘草汤组成一致, 但去除沉淀物的芍药甘草汤镇痛药效显著降低。在此基础上, 本研究从芍药甘草汤中分离得到小分子化合物、多糖及蛋白质部位, 各部位的含量分别为60.4、700.7和207.2 mg·g^-1, 大分子蛋白质、多糖含量较小分子含量高, 按照多糖: 小分子= 11.6:1、蛋白质: 小分子= 3.4:1的比例在模拟煎煮的状态下制备沉淀物。粒径表征结果表明共同加热后两种沉淀物的粒径会发生明显变化, 含量测定结果表明形成沉淀物后游离的小分子化合物芍药苷、芍药内酯苷、甘草酸、甘草苷、异甘草苷和没食子酸含量均明显降低, 因此推测小分子成分分别与蛋白质、多糖发生了相互作用。醋酸扭体实验证明模拟制备的沉淀物具有很好的镇痛作用, 并能有效降低炎症因子前列腺素E₂和一氧化氮的水平, 提高抗炎因子白介素-10水平。以上结果证明芍药甘草汤中的沉淀物是其发挥镇痛作用的重要物质基础, 而大分子如蛋白质、多糖是构成沉淀物的主要成分, 沉淀物发挥镇痛作用的化学机制是大分子与小分子间发生了相互作用。对于芍药甘草汤沉淀物中大分子的研究, 不仅为阐明芍药甘草汤的药效物质基础提供新的思路和方法, 也为解析传统汤剂起效的科学性提供了参考。

观察积雪草苷(asiaticoside, Ass) 对氧糖剥夺/再复(oxygen and glucose deprivation/reperfusion, OGD/R) 损伤的H9C2心肌细胞的增殖、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B (Akt)/Bcl-2同源结构域蛋白(Beclin-1) 信号通路的干预作用, 探讨其对H9C2心肌细胞的影响。选用H9C2心肌细胞作为研究对象, 采用细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK-8) 法检测H9C2细胞活性。将H9C2细胞分成对照组、OGD/R组、Ass低浓度组(10 μmol·L^-1)、Ass高浓度组(80 μmol·L^-1) 和Ass高浓度+氯喹组(80 μmol·L^-1 + 50 μmol·L^-1)。对照组于正常条件下培养, 其余各组在处理后进行氧糖剥夺4 h/再复2 h。酶联免疫吸附法检测细胞上清液中天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase, AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶(creatine kinase, CK) 的含量; 免疫荧光观察药物对细胞数量的影响; 自噬染色检测试剂盒观察细胞自噬; 分子对接技术确定Ass分子靶点; 蛋白质印迹法检测PI3K、Akt、选择性自噬接头蛋白(P62)、Beclin-1的表达水平。与OGD/R组相比, Ass各组在10~80 μmol·L^-1具有保护作用, AST、LDH和CK的含量均降低, PI3K、Akt、P62和Beclin-1蛋白表达水平降低。与Ass组相比, Ass高浓度+ 氯喹组的AST、LDH和CK的含量均降低, PI3K、Akt、Beclin-1和P62蛋白表达水平均降低。免疫荧光显示抑制剂组、各给药组与模型组相比均具有不同程度的保护作用。综上所述, 积雪草苷能够降低OGD/R诱导的H9C2心肌细胞损伤, 降低AST、LDH、CK含量和P62蛋白水平, 减少细胞自噬, 这可能与其抑制PI3K/Akt/Beclin-1信号通路激活密切相关。

构建原代大鼠脑微血管内皮细胞(rat brain microvascular endothelial cells, BMEC) 和大鼠星状胶质细胞(rat astrocytes, AS) 共培养模型以研究葛根素-白芷香豆素成分联用后对葛根素在大鼠体外血脑屏障(blood-brain barrier, BBB) 模型中转运及大鼠脑组织分布的影响。通过测定模型跨内皮电阻值、苯酚红通透性、BBB相关蛋白表达评价模型屏障功能。通透性实验和Western blot法分别研究了白芷香豆素成分对BMEC、大鼠脑组织通透性及BBB相关蛋白表达的影响。本研究中动物实验方案均获得西安交通大学医学部生物医学伦理委员会的批准(动物伦理号: 2021-1329)。结果表明, 构建的BMEC/AS共培养模型可用于药物体外跨BBB研究; 与白芷香豆素成分联用后, 葛根素在体外共培养模型及大鼠脑组织上的转运量显著提升; 白芷香豆素成分可以增加BBB通透性, 抑制P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、紧密连接重要蛋白闭锁连接蛋白-1 (zonula occludens-1, ZO-1) 和闭合蛋白(occludin) 的表达。白芷香豆素成分可能通过抑制P-gp及紧密连接蛋白表达而增加葛根素在脑组织中的含量。

本研究从唇形科植物黄芩主要活性成分黄芩苷(baicalin, BC) 对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA) 大鼠作用出发, 以类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA) 滑膜炎症关键效应细胞—成纤维样滑膜细胞(fibroblast like synoviocytes, FLSs) 糖代谢重编程角度展开机制探讨。建立CIA大鼠模型和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs) 体内外模型, 观测BC给药后CIA大鼠关节炎指数(arthritis index, AI) 评分及组织病理学变化, 并ELISA法检测血清和细胞上清中炎症因子水平, 免疫组织化学及Western blot法检测G蛋白偶联受体81 (G-protein-coupled receptor 81, GPR81)、丙酮酸脱氢酶激酶1 (pyruvate dehydrogenase kinase 1, PDK1) 蛋白表达。试剂盒测定糖代谢重编程中关键产物水平及酶活性。结果显示, BC (50、100和200 mg·kg^-1) 剂量依赖性减轻CIA大鼠关节炎症状, 抑制滑膜增生, 减轻炎性细胞浸润, 下调促炎因子TNF-α、白细胞介素(interleukin, IL)-1β, 上调抑炎因子IL-10水平, 同时降低乳酸、丙酮酸、乙酰辅酶A、柠檬酸分泌水平和乳酸脱氢酶B (lactate dehydrogenase B, LDH-B) 活性, 并下调GRP81、PDK1表达, 提示BC调节糖代谢重编程过程。而GPR81抑制剂3-OBA抑制乳酸摄取后, LDH-B活性呈现显著升高, 提示BC抑制从糖酵解到氧化磷酸化重编程代谢中的关键酶PDK1表达。本研究所有动物实验操作均按照安徽中医药大学实验动物护理中心伦理标准进行(批准号: AHUCM-rats-2021049)。以上研究揭示黄芩苷通过抑制PDK1蛋白表达, 介导RASFs从糖酵解向氧化磷酸化的代谢重编程, 缓解CIA大鼠关节炎症。

鉴定茵陈蒿汤体外活性成分和体内入血成分, 为探究其对急性肝损伤防护作用和防治机制提供了科学依据。利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS) 技术, 鉴定茵陈蒿汤水煎液及口服预防给药14天后, 刀豆蛋白A (con-A) 所致急性肝损伤小鼠的血清样本(本研究中所有实验动物的使用获得海军军医大学伦理委员会批准, 批号19YF1459400) 中的化学成分。初步鉴定茵陈蒿汤水煎液含90个化合物, 主要为黄酮类、萜类、鞣质类、醌类等, 血清样本中含5个原形成分, 包括大黄酚、脱氧土大黄苷-8-O-没食子酸盐、玉叶金花苷酸、7-甲氧基-香豆素、大黄素。本文所建立的UPLC-QTOF/MS方法能高效灵敏地鉴别茵陈蒿汤的体外成分及其入血成分, 初步阐明茵陈蒿汤保肝作用的药效物质基础, 可为茵陈蒿汤的质量标志物筛选和药理作用研究提供科学依据。

新型冠状病毒感染(coronavirus disease-2019, COVID-19) 给全球公共卫生防控和临床诊疗系统带来了巨大的挑战, 开发有效的抗病毒药物是当前药学研究的一项重要任务。中医药在抗击新冠疫情中发挥了重要作用, 中药中含有的化学成分众多、结构类型多样, 是寻找抗新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 活性先导化合物的天然宝库。本研究根据中药多成分、多靶点的作用特征, 针对新冠病毒入侵细胞过程中两种关键蛋白S蛋白受体结合域(S protein receptor binding domain, SRBD) 和血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2), 构建了一种新型的双靶点表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR) 传感器, 对6种中药的活性成分进行筛选鉴定, 最终从葛根中发现黄豆苷能够与SRBD和ACE2结合。通过SPR亲和力实验测定黄豆苷与ACE2结合的K_D为5.18 μmol·L^-1; 竞争性ELISA结合实验表明, 黄豆苷能够抑制SRBD与ACE2的结合, 20 μmol·L^-1黄豆苷的抑制率为38.6%; 分子对接实验进一步证实黄豆苷在SRBD-ACE2复合物结合区域附近有最佳结合。本研究表明, 双靶点SPR筛选系统的结果准、效率高, 特别适合复杂药物体系的筛选和中药药效物质的研究, 为探究中药活性成分抗新冠病毒作用机制研究提供药效物质基础, 并为抗新冠病毒药物开发提供先导化合物来源。

心梗超急性期是指心梗发生后30 min内, 症状不明显、诊断困难的一段时间, 相关病理生理机制研究关注较少。本研究基于蛋白质组学探讨心梗超急性期蛋白质组改变并针对热休克蛋白B6 (heat shock protein B6, HSPB6) 探讨注射用丹参多酚酸盐的干预作用与相关机制, 为心梗超急性期病理机制及注射用丹参多酚酸盐的临床合理用药提供实验依据。采用基于质谱的非标记蛋白质组学对比评价大鼠心梗模型造模前后蛋白表达变化后, 使用生物信息学方法分析共有表达蛋白及相关通路。接着运用分子对接技术评价注射用丹参多酚酸盐对共有差异蛋白HSPB6的结合作用, 最后通过动物实验进行验证。本实验动物福利和实验过程均遵循中国中医科学院西苑医院实验动物伦理委员会的规定。本实验结果表明, 非标记蛋白质组学结果共定量获得2 166个蛋白质, 其中有194个共有差异蛋白参与心梗超急性期心肌损伤和机体调节, 主要涉及蛋白质同源二聚活性、氧气结合与运输、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性等分子功能。其中, HSPB6蛋白参与心肌功能的调节作用。分子对接结果表明, 注射用丹参多酚酸盐主成分丹参乙酸镁与HSPB6蛋白具有最低的结合能: -14.53 kcal·mol^-1。动物实验表明, 与假手术组相比, 模型组大鼠心功能损伤射血分数和短轴缩短率显著降低(P < 0.001), 心脏血流灌注明显下降(P < 0.001), 存在明显心肌纤维紊乱、心肌细胞水肿、间质内小血管充血等病理形态改变; 给药组大鼠心功能损伤减弱, 其中低剂量短轴缩短率明显改善(P < 0.05), 心肌组织病理性损伤明显减轻, HSPB6蛋白表达不同程度上调(P < 0.01, P < 0.001)。基于上述研究结果, 发现注射用丹参多酚酸盐可一定程度改善大鼠心梗超急性期损伤心功能及病理形态, 其作用机制可能与促进HSPB6表达有关。

尘肺是我国发病人数最多、最常见的职业病, 严重危害人民身体健康。根据吸入空气污染物的不同, 尘肺分为: 煤肺、矽肺、石棉肺等, 其中矽肺最为常见且最严重。矽肺是由于长期暴露于职业环境中游离二氧化硅(silicon dioxide, SiO₂) 含量较高的粉尘引起的以肺组织弥漫性纤维化为主要特点的全身性疾病, 预后较差, 治愈困难。在矽肺发病早期采用及时正确的药物干预对疾病的治疗具有决定性的作用, 但遗憾的是目前缺乏能有效延缓或逆转矽肺纤维化的药物。本综述按照疾病发病机制分类, 总结探讨了可能应用于临床治疗矽肺的药物及部分未成药化合物, 为矽肺临床治疗提供参考。

在代谢性疾病中, 活性氧累积及氧化应激与铁死亡密切相关。糖酵解-脂肪酸代谢失衡作为代谢性疾病关键调控方式, 能够直接或间接参与铁死亡, 影响其发生发展。而铁死亡是一种新型调节性细胞死亡方式, 由铁依赖性脂肪酸过氧化物过度累积引发。其与糖酵解-脂肪酸代谢密切相关, 在代谢性疾病中发挥重要作用。该调节性细胞死亡方式显著区别于其他程序性死亡方式, 在细胞形态、标志性特征及机制等方面均有独特变化。本文首先阐明糖酵解及脂肪酸代谢失衡参与铁死亡发生的主要机制, 并进一步综述铁死亡在肿瘤、2型糖尿病及类风湿关节炎等代谢性疾病中的研究进展, 揭示糖酵解-脂肪酸代谢失衡与铁死亡异常的内在联系及其对代谢性疾病的影响, 以期为代谢性疾病防治提供新策略。

植物次生代谢产物是天然药物的重要来源。桦木属植物具有丰富的药用价值, 药理作用机制复杂, 这与其中的三萜类化合物具有密不可分的关系。桦木属植物三萜类化合物主要分为达玛烷型、奥克梯隆型、齐墩果烷型、羽扇豆烷型和环阿屯烷型; 桦木属植物提取物具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌等多种活性; 桦木属植物三萜类化合物的生物合成途径自2, 3-氧化鲨烯之后根据环氧角鲨烯环化酶的不同分为达玛烯二醇Ⅱ、羽扇豆醇、环阿屯醇和香树酯四个分支。本文对桦木属植物三萜类化学成分、药理活性和生物合成途径解析三个方面进行了综述, 以期为利用桦木属植物三萜类化合物进行新药研发及利用合成生物学方法在微生物细胞工厂中生产这类化合物提供参考。

结核分枝杆菌所引起的传染性疾病结核病仍然是当前对人类生命安全的重大威胁之一。近年来以贝达喹啉为代表的小分子抑制剂的不断探索为结核病领域注入新的活力。但小分子抑制剂在临床用药过程中, 不可避免地都会发生获得性耐药, 靶向蛋白降解(TPD) 作为一种新的药理学机制, 通过降解而不是抑制蛋白质靶点来实现药效, 利用TPD理念发展抗结核药物对于解决耐药性可能会是一个优秀的策略。本文综述了结核分枝杆菌自身的蛋白降解途径如Pup-蛋白酶体系统、ClpP-ClpC1复合酶系统等, 并对上述策略未来进一步发展成TPD药物进行了归纳与展望。

人体激素以微量水平参与体内多种功能和系统的调节, 在人体内发挥着至关重要的作用, 而激素水平的失衡则会导致各种疾病的产生和发展。因此, 开发可靠的样品前处理方法和灵敏、准确的人体激素检测分析方法, 将有助于疾病的预防、诊断和治疗, 为人体健康提供重要保障。通常用以检测激素的人体样品, 如血液、唾液、尿液等基质较为复杂, 因此样本的前处理是保证激素检测准确、可靠的重要环节。本文对固相萃取、液-液萃取和蛋白质沉淀法3种常见样本前处理技术, 液/气相色谱法、液/气相色谱-质谱联用法等常规检测方法, 以及免疫分析技术(如化学发光、侧向流动和时间分辨荧光免疫分析法)、传感器技术(如电化学、荧光和表面增强拉曼散射传感器)、微流控芯片技术等人体激素检测的新型快速分析方法的研究进展进行了综述, 并展望其发展前景, 以期为相关研究提供参考。

口腔黏膜给药具有药物吸收迅速、无首过效应、患者依从性好等优点。但药物溶解少、唾液携带药物进入胃肠、黏膜存在生理屏障等因素可能影响药物的黏膜渗透和生物利用度。纳米技术应用于药物口腔黏膜给药, 可克服上述不利因素, 获得高效吸收效果。本综述阐述了口腔黏膜生理结构及影响药物口腔黏膜吸收的因素, 汇总了脂质体、固体脂质纳米粒、纳米结构脂质载体、纳米乳、聚合物纳米粒、聚合物胶束、纳米混悬剂等纳米技术在口腔黏膜给药中的应用及促进药物吸收机制, 总结了目前研究存在的主要问题, 对纳米口腔黏膜给药系统应用前景进行了展望。

探究西黄丸含药血清调控低氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)/血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)/血管内皮生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2) 信号通路, 抑制脑胶质瘤细胞血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM) 形成的作用及机制。采用对雄性SD大鼠连续灌胃给药7天，制备西黄丸含药血清(动物实验伦理审批号: 202105A051)。采用200 μmol·L^-1 CoCl₂构建U251细胞低氧模型, 给予西黄丸含药血清后, CCK-8法、细胞克隆实验检测U251细胞活力和增殖情况; 流式细胞术检测U251细胞凋亡及周期; 细胞划痕愈合、Transwell侵袭实验检测U251细胞的迁移与侵袭能力; 3D细胞培养检测U251细胞VM的形成情况; Western blot法检测U251细胞HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、磷酸化VEGFR2 (phosphorylated-VEGFR2, p-VEGFR2)、血管内皮钙黏着蛋白(vascular endothelial-cadherin, VE-cadherin)、Eph受体酪氨酸激酶A2 (Eph receptor tyrosine kinases A2, EphA2)、基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2, MMP2)、基质金属蛋白酶14 (matrix metalloproteinase 14, MMP14) 和层黏连蛋白γ2 (laminin γ2) 等蛋白表达水平。结果显示, 低氧状态下, 10%西黄丸含药血清对U251细胞活力、增殖、凋亡和细胞周期影响较小。与低氧模型组相比, 10% 1.0、1.5和2.0 h组西黄丸含药血清均显著减慢U251细胞的迁移速率(P < 0.01), 显著减少侵袭的U251细胞数量(P < 0.01)。10% 2.0 h组西黄丸含药血清显著抑制低氧状态下U251细胞的VM管状结构形成(P < 0.01)。Western blot实验显示, 10%西黄丸含药血清显著下调HIF-1α、VEGFA、phospho-VEGFR2、VE-cadherin、EphA2、MMP14等蛋白表达(P < 0.05)。综上所述, 西黄丸可通过下调HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路, 抑制脑胶质瘤U251细胞VM形成, 发挥抗血管生成的作用。

本文以β2-肾上腺素能受体(beta-2 adrenergic receptor, β2-AR)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、血管紧张素Ⅱ-1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R) 为例, 建立可快速预测G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs) N端、C端、胞内环、胞外环、跨膜(transmembrane, TM) 区氨基酸起始位置的方法, 并通过此方法预测Mas相关基因G蛋白偶联受体X3 (Mas-related G protein-coupled receptors X3, MRGPRX3) 的结构。具体操作为利用不依赖序列和连接的克隆方法(sequence and ligation-independent cloning, Slic) 将纳米荧光素酶(nanoluciferase, NLuc) 插入GPCRs的不同位点, 在同一受体表达水平相同的条件下, 检测NLuc插入GPCRs不同位点对于发光值的影响。结果显示, 当NLuc插入GPCRs不同位点时, 检测到的NLuc发光值不同。当NLuc插入N端、C端、胞内环、胞外环等柔性区域时, 发光值在100万以上; 插入TM区域(刚性区域) 时, 发光值在10万以下, 甚至在1万以下; 插在柔性区域与刚性区域的交界处时, 发光值在10万~50万之间, 一般在10万左右。本研究建立了一种可快速确定GPCRs结构的生化方法, 并用此方法成功预测MRGPRX3的结构。此方法能够为配体的虚拟筛选提供有效信息, 为结构药理学提供一定的实验依据。

基于前期工作基础, 本研究采用药效团拼合原理, 尝试将GPR119激动剂和DPP-4抑制剂的药效片段拼接到嘌呤环的6位和9位, 设计合成了12个嘌呤类衍生物作为GPR119与DPP-4双调节剂。体外降血糖活性结果显示, 化合物11含有2-氟-4-甲砜基苯胺片段和氰基吡咯烷片段, 表现出最强的GPR119激动活性(EC₅₀ = 0.33 μmol·L^-1, IA = 71.1%) 与DPP-4抑制活性(58.4%抑制浓度为10 μmol·L^-1, 21.2%抑制浓度为1 μmol·L^-1)。对化合物进行构效关系讨论与分子对接研究, 为下一步化合物的设计提供指导。

运用MCI Gel、Sephadex LH-20、ODS和硅胶等柱色谱, 结合半制备液相、TLC等分离方法, 从益智仁正丁醇部位中分离纯化得到4个萜苷类化合物。运用现代波谱学方法(1D、2D NMR、UV、IR、MS等) 对所分离得到的化合物进行结构鉴定, 并运用计算ECD和酸水解的方法确定了新化合物的绝对构型, 其中化合物1和2为新化合物, 化合物3和4为首次从益智仁中分离得到。

运用ODS、Sephadex LH-20柱色谱, 结合HPLC、半制备高效液相色谱方法从山桃仁乙酸乙酯部位中分离得到5个化合物。结合1D-NMR、2D-NMR、HR-ESI-MS、UV、IR、圆二色谱(CD) 和计算ECD等方法, 鉴定其分别为(2R, 3R)-5, 7, 4′-trihydroxy-3′-methoxy-3-formylflavan-3-ol-5-O-β-D-glucopyranoside (1)、(7R, 8S)-dihydrodehydrodiconiferyl 6″-benzoyl alcohol-9-O-β-D-glucopyranoside (2)、(7R, 8S)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-9-O-β-D-glucopyranosid (3)、2-methoxy-4-(2-propenyl)-phenyl-O-β-D-glucopyranoside (4)、2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenoxy]-propane-1, 3-diol (5)。其中, 化合物1和2为新化合物, 化合物3~5为首次从该植物中分离得到。

采用亲水作用色谱-串联质谱的动态多重反应监测模式建立瓜蒌皮注射液中35种化合物的同时定量分析方法。采用ACQUITY XBridge Amide色谱柱分离, 以20 mmol·L^-1甲酸铵水溶液(pH 3.0) 为流动相A, 20 mmol·L^-1甲酸铵溶液(pH 3.0)∶乙腈(1∶9) 混合溶液为流动相B, 进行梯度洗脱, 采用外标法定量。结果表明, 35种化合物在各自浓度范围内具有良好的线性关系, 相关系数(R²) > 0.998 0, 方法回收率范围为77.6%~118.5%。采用建立好的方法测定了10批样品, 结果表明瓜蒌皮注射液中γ-氨基丁酸、葫芦巴碱、丙氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、瓜氨酸、亮氨酸等成分含量较高, 而烟酰胺、甲基琥珀酸、胞嘧啶、胆碱等成分含量较低。本研究为瓜蒌皮注射液的药效物质基础和质量标准提升研究提供了重要参考。

建立柱前衍生-超高效液相色谱同时测定高表达程序性死亡蛋白-1 (programmed death protein-1, PD-1)抗体的细胞株培养液中17种游离氨基酸浓度的方法, 根据浓度检测结果, 对表达抗PD-1抗体的细胞株进行氨基酸代谢分析。使用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(6-aminoquinoline-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, AQC)作为衍生剂, 将不同浓度的氨基酸标准品或细胞株培养液中的游离氨基酸转化为稳定的紫外衍生物, 采用ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.7 µm)色谱柱梯度洗脱分离, 流速为0.7 mL·min^-1, 柱温55 ℃, 进样量为1 µL, 在紫外检测器检测波长为260 nm的条件下进行检测, 使用外标法计算氨基酸浓度, 并对高表达抗PD-1抗体的细胞株培养液中游离氨基酸浓度进行测定, 根据细胞培养周期内氨基酸浓度变化进行代谢分析。结果表明, 柱前衍生-超高效液相色谱法能在11 min内将17种氨基酸进行完全分离, 在0.75~500 µmol·L^-1浓度范围内线性关系良好(相关系数R² ≥ 0.999 3), 检测限为0.1~0.3 µmol·L^-1, 定量限为0.3~1 µmol·L^-1, 建立的方法具有快速、重现性高的优点, 氨基酸代谢分析显示, 蛋氨酸、异亮氨酸和亮氨酸可能为细胞株生长和表达限制性成分。建立的柱前衍生-超高效液相色谱法快速、准确, 可用于同时检测细胞培养液中17种游离氨基酸浓度的变化。

筛选白芍抗抑郁组分, 并对其主要化学成分进行鉴定。本文采用皮质酮诱导的PC12神经细胞损伤模型和小鼠行为绝望模型对白芍醇提物(Bai-Shao ethanol extract, BS-E) 及其大孔树脂不同洗脱组分(BS-10E, BS-60E, BS-95E) 的抗抑郁作用进行评价, 筛选获得白芍抗抑郁组分。动物实验经过中国医学科学院药用植物研究所动物伦理委员会批准(批准号: SLXD-20210618051)。结果发现, BS-E、BS-10E和BS-60E对皮质酮诱导的PC12细胞损伤具有保护作用, 其中组分BS-60E的保护作用最强; 行为绝望小鼠行为学结果表明, BS-60E可显著缩短小鼠强迫游泳和悬尾不动时间, 为白芍抗抑郁活性组分。采用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS) 联用系统对BS-60E的化学成分进行鉴定, 并对其可能的质谱裂解规律进行推导。从BS-60E中共鉴定出79个化学成分, 主要包括单萜类成分36个, 多酚类成分34个, 寡糖类成分6个, 其他类成分3个, 表明单萜类及多酚类成分可能是其主要的药效成分。

苦参是我国的传统中药, 富含黄酮类化合物, 在药品开发和临床上具有广泛的应用前景。本研究首先基于广泛靶向代谢组学技术, 在苦参开花期五个组织中共检测到227种黄酮类化合物。其中137种在不同组织部位均存在, 18种在根部特异性积累。与根组织相比, 苦参的茎、叶、花和幼嫩的豆荚中分别有156、155、156和150种差异积累代谢物。然后, 利用PubChem和SwissADME数据库确定了苦参中有47种黄酮类潜在药效成分, 并通过SwissTargetPrediction和GeneCards数据库预测了这些潜在活性成分参与治疗2型糖尿病(T2DM) 的潜在靶点(58个)。通过STRING数据库将这些靶点构建蛋白互作关系网络, 并对其进行GO和KEGG功能富集分析。最后, 基于“成分-靶点-通路”网络多层次系统地挖掘苦参黄酮治疗T2DM的作用机制, 筛选到10种关键的潜在药效成分。它们主要分布于根、花和豆荚中, 但在不同组织中含量存在显著差异。研究结果表明苦参黄酮治疗T2DM的作用机制可能是以AKT1、ESR1、EGFR、PIK3R1、TNF以及PTGS2等为关键靶点, 通过调节AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、胰岛素抵抗、内分泌抵抗以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗等信号通路发挥降糖的作用。通过对苦参中黄酮类成分的组织分布与网络药理学分析, 可为今后开展苦参代谢物的深入研究以及苦参地上部分资源的合理开发和利用提供理论依据, 也为全面探索苦参治疗T2DM的作用机制提供参考。

建立过程可控、智能化程度高的生产线, 有助于提升微波炮附子的品质及生产效率, 促进微波炮附子的转化与应用。本研究根据附子减毒原理及工业化微波设备特点, 以双酯型生物碱及单酯型生物碱为指标, 建立微波炮附子工业化生产线, 并进行中试生产。同时与附子主流炮制品生附片、白附片以及黑顺片的有效成分含量及药效进行对比。结果表明, 微波炮附子工业化生产主要分为“液封减毒-干燥膨化”两阶段。中试生产10批微波炮附子的单酯型生物碱含量为0.071%~0.166%;双酯型生物碱含量为0.004%~0.016%, 均符合2020年版《中华人民共和国药典》相关要求。与黑顺片和白附片相比, 微波炮附子的有效成分保留率更高。药理实验表明, 微波炮附子不仅保留了黑顺片、白附片的抗炎、镇痛活性, 同时可显著提高肝癌化疗小鼠的白细胞、淋巴细胞的水平, 增强小鼠脾脏细胞中CD4/CD8比值(P < 0.05), 调节机体免疫, 而白附片的这种作用较弱, 黑顺片和生附片则无该作用。通过以上研究, 建立了过程可控、智能化程度高的微波炮附子生产线, 并用优化工艺生产出了毒性低、质量稳定、疗效确切的微波炮附子, 为微波炮附子的工业化连续生产和临床应用奠定了基础, 为微波技术在中医药领域的发展和应用提供了科学支撑。本研究中所有动物实验在开展前经过成都中医药大学实验动物伦理委员会审查批准(批准号: 2020-28)。

将免疫细胞重定向至肿瘤部位并增强抗肿瘤免疫反应是一种有前景的癌症治疗策略。AS1411适配体对高表达核仁素的恶性肿瘤有高亲和结合力, 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4) 适配体可特异性结合T细胞表达的免疫检查点CTLA-4。本研究基于AS1411适配体和CTLA-4适配体构建了一种可同时靶向肿瘤细胞和T细胞的双亲和性适配体靶向脂质体(dual-affinity aptamer targeted liposome, Dat. Lipo), 并在细胞水平研究其促T细胞免疫治疗效果。将适配体修饰上胆固醇后, 用滴入法制备Dat. Lipo; 用成像系统检测其T细胞重定向作用, CCK8 (cell counting kit-8) 评价其促T细胞免疫治疗作用, 用肿瘤球评价其促T细胞渗透作用。结果表明, 与只负载一种适配体的脂质体相比, Dat. Lipo可有效促进T细胞重定向至肿瘤细胞; 对MCF-7和HepG2细胞具有良好的促免疫治疗作用, 且呈浓度依赖性, 具有良好的生物安全性; Dat. Lipo还能促进T细胞渗透到肿瘤球内部, 在不同维度增强T细胞免疫治疗作用。综上, Dat. Lipo可利用适配体对靶标的高亲和性将T细胞重定向至肿瘤细胞, 增强免疫疗法效果, 在肿瘤治疗方面具有一定的应用前景。本研究获得了湖南省肿瘤医院中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院审查委员会的伦理批准。

采用粉体改性技术, 设计了一种基于乳糖-青黛复合粒子的青黛干混悬剂, 实现润湿性与沉降性的平衡, 满足青黛饮片临床用药需求。以接触角为评价指标, 考察改性剂乳糖研磨时间、乳糖用量以及乳糖青黛共研时间对亲水改性效果的影响, 并通过粒径、扫描电镜、红外光谱、表面自由能、多重光散射技术等对比改性前后青黛的差异。结果表明乳糖-青黛复合粒子最优工艺为: 乳糖单独研磨2 min后, 以1∶1的比例与青黛共研6 min。青黛改性后粒径d_0.9由112.75 μm降至87.30 μm。BET和Langmuir比表面积分别下降8.661和12.512 m²·g^-1。SEM显示改性青黛表面附着有乳糖; 表面元素分析显示改性青黛的Si、Ca、Mg元素小于普通青黛, O元素大于普通青黛; 红外光谱显示改性青黛同时拥有青黛和乳糖的特征峰。亲水性考察结果显示改性青黛接触角和非极性分量较未改性青黛分别降低35.1°和9.975 mJ·m^-2, 极性分量和表面自由能分别增加36.956和26.950 mJ·m^-2。多重光散射结果显示改性青黛透光度较未改性青黛降低35%, 背散射光强增加约25%。本研究仅使用一种辅料成功制备了润湿性与混悬性良好的青黛干混悬剂, 为青黛饮片的临床应用提供了便利。

作为MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog) 转录因子家族的一大类, R1-MYB (MYB-related) 家族在植物生长发育、环境胁迫及激素信号转导等方面发挥重要的调节作用。本研究基于全长转录组测序分析, 系统筛选掌叶大黄R1-MYB家族基因, 分析其编码蛋白的理化、结构域及分子进化等特性, 利用RNA-seq进行基因组织表达分析, 并检测RpMYB24响应激素、非生物胁迫的表达模式。结果表明, 共鉴定到掌叶大黄49个R1-MYB家族基因, 主要编码热稳定的亲水蛋白, 大部分定位于细胞核。各蛋白无规卷曲和α螺旋所占比例较大, 存在MYB家族标志性的W型保守氨基酸。掌叶大黄R1-MYB家族成员分布于CCA1 (circadian clock associated 1)-like、I-box (GATAAG)-like、CPC (CAPRICE)-like、TRF (telomere repeat binding factor)-like和TBP (TATA binding protein)-like 5个亚组, 且CCA1-like数量居多。RNA-seq揭示49个R1-MYBs基因在掌叶大黄根、根茎及叶中差异表达, 根及根茎中分别有15、23个基因表达量高于叶中。发现RpMYB24基因受脱落酸(abscisic acid, ABA)、水杨酸(salicylic acid, SA) 和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA) 的诱导, 且能显著应答损伤、低温或高温胁迫, 但对干旱胁迫响应不显著。本研究系统鉴定了掌叶大黄R1-MYB家族基因及其分子特征, 为下一步开展基因功能验证提供基础, 进而为大黄药材品质形成的转录调控机制研究提供科学依据。

本研究通过Illumina高通量测序技术对细辛属药用植物尾花细辛(Asarum caudigerum Hance) 和花叶细辛(A. cardiophyllum Franchet) 进行了叶绿体基因组测序, 利用生物信息学分析方法进行组装、注释和结构特征分析, 并与已发表的12个马兜铃科植物叶绿体基因组进行了系统发育分析。结果显示, 尾花细辛和花叶细辛叶绿体基因组全长为186 215~186 985 bp, 大单拷贝区(LSC) 长度为89 445~90 169 bp, 两个反向互补重复区(IRs) 长48 387~48 408 bp。两者叶绿体基因组中的GC含量为37.4%~37.5%, 共注释到144个基因, 包括98个蛋白编码基因(PCGs), 38个tRNA基因和8个rRNA基因。此外, 在细辛属叶绿体基因组中检测到复杂的基因组重排现象; 同时, 对序列的离散型进行可视化评估表明, 非编码区变异水平高于编码区。系统发育结果显示, 尾花细辛与长毛细辛聚为一支, 花叶细辛、汉城细辛、A. misandrum和A. maculatum则聚为一支, 且这两支互为姊妹关系。本研究为细辛属物种分子鉴定、系统发育及分子植物育种等研究提供科学依据。

O-甲基转移酶(O-methyltransferases, OMTs) 是许多天然产物生物合成途径中的关键后修饰酶之一, O-甲基化不仅可降低化合物的化学反应活性, 而且能显著改善其溶解性、稳定性等理化性质和生物活性等。本研究根据紫金牛转录组测序结果, 首次从紫金牛中克隆获得1条OMT基因(命名为AjOMT1), 并成功进行了大肠杆菌异源表达, 体外酶催化活性结果表明重组AjOMT1能高效催化槲皮素发生O-甲基化反应。底物谱考察结果表明, AjOMT1能催化黄酮类、茋类、香豆素类、生物碱类、苯丙素类等不同结构类型的化合物进行甲基化反应, 具有非常宽泛的底物谱; AjOMT1偏好于具邻二酚羟基的化合物, 并表现出位置选择性。本研究结果表明, AjOMT1可用作O-甲基化工具酶实现不同类型化合物的O-甲基化、获取多样化的活性甲基化产物, 可为药物发现提供新方法, 并可为天然产物合成生物学研究提供普适性元件。

糖原合成激酶3 (glycogen synthase kinase 3/SHAGGY-like kinase, GSK3) 在调节植物生长发育和胁迫响应方面发挥重要作用。为揭示药用植物决明(Senna tora L.) GSK家族成员特性, 本研究基于其全基因组数据, 结合生物信息学及基因表达研究方法, 开展决明GSKs基因鉴定及表达分析。共鉴定到9个StoSKs基因家族成员, 均具有GSK特征激酶结构域, 9个成员分布在6条染色体上, 编码氨基酸长度为465~943 aa, 蛋白分子质量介于33.57~88.83 kDa, 平均等电点为8.2。StoSKs基因家族分为4个进化分支, 同一进化分支中的StoSKs之间具有相同的外显子/内含子结构及保守基序。StoSKs家族成员扩张主要源于片段重复事件, 与大豆(Glycine max)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa) 分别存在17、11、8和7对共线基因对。StoSKs启动子区域多含有与胁迫刺激、生长发育、激素诱导相关的响应元件。转录组数据分析发现StoSKs在不同组织中均有表达, 在根中表达水平最高。qRT-PCR (quantitative real-time PCR) 分析表明, 不同进化分支的StoSKs表现出协同响应光照的表达模式, 多数StoSKs能快速响应NaCl胁迫处理, 表达显著上调。研究结果为下一步进行决明GSK基因家族的生物学功能分析提供基础。