稳定同位素示踪代谢组学通过示踪标记的原子对整个机体代谢过程进行追踪分析, 属于生物医药领域前沿技术。该技术对于阐释疾病发生机制、发现疾病的生物标志物和药物作用靶点具有重要意义与价值。本文以抑郁症葡萄糖分解代谢障碍机制解析为例, 系统地阐述稳定同位素示踪代谢组学技术及其应用。提出了在非标记代谢组学基础上的稳定同位素示踪代谢组学研究思路, 给出了从代谢物同位素丰度、关键代谢酶、代谢物流向和代谢物流量四个维度展开生物学意义阐释的研究策略, 突破了基于整体动物实验的稳定同位素示踪代谢组学研究技术瓶颈, 为该技术的推广应用提供科学依据。

抑郁症(depression) 是一种常见的情感障碍类疾病, 在全世界范围内严重影响着人们的生命健康。抑郁症发病机制复杂, 抗抑郁中药因其多成分、多途径、多靶点的作用方式, 具有良好的治疗效果。目前, 中药抗抑郁机制尚未完全阐明, 但可以明确的是, 抑郁症与代谢健康有着十分紧密的联系。因此, 为深入挖掘中药抗抑郁机制, 本文从代谢角度出发, 提出了基于功能代谢组学策略的中药抗抑郁机制研究思路, 即借助多组学联合分析技术探析抑郁症潜在生物标志物, 同时开展抗抑郁中药功能性分子的研究, 利用分子生物学技术精确捕获抑郁症特征代谢分子和抗抑郁中药功能性分子之间的分子相互作用, 确定有效的药物靶点, 进一步阐明抑郁症代谢紊乱所涉及的生化功能和相关机制。本文系统综述了功能代谢组学在中药抗抑郁机制中的研究策略及应用, 阐述了功能代谢组学的核心价值, 整理了近几年抗抑郁中药的研究现状和热点问题, 以期借助功能代谢组学, 为中药抗抑郁机制研究提供新方法、新思路。

中药药效物质是中药作用机制和质量控制研究的基础, 也是中医药传承和创新发展的关键科学问题。然而中药多组分、多靶点、整体性的复杂特点, 以及现代科学研究技术方法的限制, 为中药药效物质研究带来了极大挑战。中药与肠道菌群的相互作用提供了一种新思路。基于肠道代谢组的中药药效物质基础与作用机制研究, 多以中药的有效作用以及肠道菌群与疾病的相关性假设为基础, 探究微生物群和宿主表型之间的关系, 逐步深入, 最终聚焦肠道菌株和肠道代谢物在分子水平的联系。本文对该模式的研究策略及关键技术进行了归纳总结, 以期为本模式的应用提供参考。

比较评价恒山黄芪的抗疲劳药效并初步揭示其通过调控牛磺酸代谢发挥抗疲劳的分子机制。本研究首先比较评价了广灵黄芪与浑源黄芪的药效差异, 其次采用¹H NMR代谢组学技术并结合统计学的方法对不同组小鼠腓肠肌组织代谢产物进行分析与指认, 找出受黄芪调控的差异代谢物, 并借助Metscape预测其上游靶标。通过整合课题组前期基于网络药理学的黄芪抗疲劳潜在靶点, 采用Cytoscape软件构建黄芪潜在抗疲劳靶点-共有靶点-差异代谢物相关靶点网络图, 通过度值(degree) 筛选关键靶点。最后依据共有靶点反推确定关键差异代谢物, 并将其输入Metaboanalyst网站中进行通路富集分析, 初步阐明分子机制。结果显示, 黄芪干预能够明显改善小鼠力竭游泳时间, 升高肝糖原并降低尿素氮水平, 且广灵黄芪与浑源黄芪药效差异较小, 即同属恒山山脉所产的黄芪质量较均一。进一步小鼠腓肠肌组织提取物指纹共指认34种代谢物, 统计结果表明19个差异代谢物在恒山黄芪干预后发生显著回调。结合网络药理学最终明确恒山黄芪主要通过调控GAD1干预牛磺酸及次牛磺酸代谢来发挥抗疲劳作用。本研究结合¹H NMR代谢组学技术与网络药理学比较评价了恒山黄芪的抗疲劳药效, 并初步揭示了其调控牛磺酸代谢抗疲劳的分子机制, 为恒山黄芪的资源利用以及抗疲劳相关产品研发提供理论依据。本文涉及的动物实验操作均遵循山西大学动物伦理委员会的规定并通过动物实验伦理审查(批准号: SXULL2021028)。

本研究采用代谢组学技术探究生、炙甘草对急性肾损伤(acute kidney injury, AKI) 大鼠改善作用。所有动物实验均经过山东省中医药研究院动物伦理委员会批准(批准号: SDZYY20200101001)。随机将SD大鼠分为对照组、模型组、生甘草组(0.9 g·kg^-1)、炙甘草组(0.9 g·kg^-1), 每组6只。采用单次腹腔注射顺铂(cisplatin, CP) 构建急性肾损伤模型, 给予生、炙甘草治疗, 苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosin, HE)、PAS染色评估肾组织病理变化, 检测血清中肌酐(creatinine, Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN) 和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD) 含量。UPLC-Q-TOF/MS进行组织代谢组学研究, 筛选生、炙甘草干预的生物标志物, 并进行代谢通路进行分析。结果表明, 与模型组相比, 生、炙甘草可改善肾组织病理变化, 降低血清中Cr、BUN含量, 升高SOD活性, 此外炙甘草还可以显著降低肾脏指数。组织代谢组学分析筛选得到45种与AKI相关的生物标志物, 生、炙甘草可以同时回调其中的11种差异代谢物, 参与调控甘油磷脂代谢, 色氨酸代谢, 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和谷胱甘肽代谢, 此外生甘草还参与调控甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢与嘧啶代谢。综上, 生甘草和炙甘草可参与调控不同的代谢通路, 通过调节氨基酸、脂质代谢、能量代谢及氧化应激发挥对AKI大鼠的改善作用。

在至宝三鞭丸的定性“制剂质量标志物”的基础上, 筛选出其定量“制剂质量标志物”, 并评价至宝三鞭丸多个批次制剂间的含量一致性。建立同时测定至宝三鞭丸中34种化学成分的HPLC-MS/MS方法, 分析16批次制剂中各成分含量的一致性, 并采用一法通用策略分析各成分在中药制剂-血浆-脑组织-脑脊液的移行情况。方法经线性范围、加样回收率、精密度、稳定性和重复性等考察确证适合至宝三鞭丸中以上成分的测定。加样回收率为85.10%~105.07%, 精密度RSD为1.37%~4.58%, 重复性RSD为3.00%~12.45%。至宝三鞭丸中各成分含量均低于1 mg·g^-1, 含量和日用剂量耐斯糖最高, 其次为松果菊苷、芍药苷、蛇床子素和丹皮酚; 系统聚类分析结果显示至宝三鞭丸普通制剂之间的含量一致性较好; 松果菊苷、毛蕊花糖苷、远志山酮Ⅲ、β-蜕皮甾酮、蛇床子素、23-乙酰泽泻醇B、甘草苷和甘草酸等的含量在批次间的差异较小。主成分分析结果显示, 小檗碱、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、松脂醇二葡萄糖苷、细叶远志皂苷等的含量是影响批次间分组的主要因素。动物实验结果显示, 蛇床子素、丹皮酚、甘草苷可被吸收入血, 并通过血脑屏障进入脑组织。本研究的动物实验得到中国中医科学院中药研究所伦理委员会的批准(编号: 2020B071)。研究确定以上31种成分是至宝三鞭丸中定量“制剂质量标志物”的基本组成。本研究建立的HPLC-MS/MS分析方法灵敏、准确和快速, 可用于至宝三鞭丸的34种化学成分同时定量和多批次制剂的含量一致性评价, 为至宝三鞭丸定量“制剂质量标志物”的筛选及质量控制研究提供了方法基础。

本研究基于UPLC-Q-Exactive HF X-MS的代谢组学技术探讨黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi, SG) 对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV) 感染模型小鼠的改善作用, 寻找可协助RSV肺炎诊断的生物标记物, 分析黄芩发挥抗RSV活性的代谢途径。采用滴鼻感染RSV方法建立RSV肺炎小鼠模型, 评价小鼠体重变化、肛温变化以及肺组织病理损伤。采集各组小鼠的肺组织样品, 进行UPLC-Q-Exactive HF X-MS分析, 通过代谢组学技术挖掘黄芩药物干预的差异性代谢物, 并对黄芩调控的代谢通路进行分析。结果表明, 黄芩能显著改善模型小鼠肺组织病理状态, 使模型小鼠体重、肛温趋于正常; 肺组织样本中, 筛选出RSV模型小鼠疾病发展的生物标志物鸟嘌呤、L-天冬酰胺、花生四烯酸等46个, 黄芩通过回调其中的尿酸、花生四烯酸、丙氨酸等22个潜在生物标志物发挥改善RSV感染作用, 22个潜在标志物主要涉及11条异常代谢通路, 其中与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成, 花生四烯酸代谢, 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等5条代谢通路密切相关。黄芩主要通过调节氨基酸类、脂类、辅因子和维生素以及核苷酸类代谢物发挥改善RSV感染小鼠的作用。所有动物实验均在山东中医药大学动物伦理审查委员会的指导和批准下进行(批准号: SDUTCM20210311001)。

本研究利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合血浆代谢组学方法分析柴胡和白芍醋炙及配伍前后抗肝纤维化的作用机制, 并通过谱效相关方法筛选潜在的药效物质。通过皮下注射CCl₄橄榄油溶液复制肝纤维化大鼠模型, 分别灌胃给予柴胡、醋柴胡、白芍、醋白芍、“柴胡-白芍”药对及“醋柴胡-醋白芍”药对水煎液, 持续给药六周后收集血样和组织样品用于药效指标检测及血浆代谢组学分析。本实验获得南京中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号: 202103A002)。药效学结果表明, 各给药组均能降低丙氨酸氨基转移酶(ALT, P < 0.01)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST, P < 0.01) 和羟脯氨酸(HYP, P < 0.01) 水平, 显著提升谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px, P < 0.05) 水平。通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术对内源性代谢物进行分析, 在正、负离子模式下共鉴定出20种与肝纤维化发病机制相关的差异性代谢物, 主要涉及到视黄醇代谢、甘油磷脂代谢、甘油酯代谢、脂肪酸生物合成和花生四烯酸代谢5条代谢通路。同时, 引入成分矫正率的概念用以评估各给药组对差异性代谢物的回调作用, 各给药组对其中10种差异性代谢物均有矫正作用, 且醋炙品组的矫正作用优于生品组, 药对组的矫正作用优于单味药组, 其中, 以“醋柴胡-醋白芍”药对组的回调作用最佳, 进一步验证了醋炙及配伍对药效的提升。对入血成分及代谢产物进行鉴定后, 采用偏最小二乘法及VIP分析, 并借助谱效相关确定了与ALT、AST、HYP和GSH-Px四个经典药效指标具有较高关联度的38种成分作为柴胡和白芍醋炙及配伍前后抗肝纤维化作用的药效标志物。研究结果不仅可为阐明柴胡和白芍醋炙及配伍治疗肝纤维化的药效物质及作用机制奠定基础, 为阐明炮制与配伍的科学内涵提供理论依据, 而且可进一步为柴胡和白芍的临床用药设计与开发提供参考。

本研究采用代谢组学和网络药理学相结合的方法研究薏苡附子散(Yiyi Fuzi powder, YYFZ) 对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA) 大鼠的药效物质及作用机制。动物实验过程均遵循天津中医药大学实验动物伦理委员会要求(批准号: TCM-LAEC2021241)。采用UPLC-Q-TOF/MS技术进行代谢组学分析发现花生四烯酸、色氨酸、亚油酸、苯丙氨酸等22个代谢物为YYFZ治疗RA的生物标志物, 并在YYFZ治疗后显著回调。同时对YYFZ入血成分分析发现次乌头碱、苯甲酰次乌头碱、脱氧乌头碱等11个入血成分可能是YYFZ体内直接发挥药效的成分, 进一步将入血成分进行网络药理学分析获得YYFZ可能通过作用于PI3K/Akt信号通路、雌激素信号通路、血管内皮细胞生长因子(VEGF)信号通路表现出抗炎作用。本研究结果为YYFZ的临床应用提供了借鉴。

基于UHPLC-Q-Exactive-MS代谢组学技术研究大海马对果蝇寿命的影响, 探究大海马干预后果蝇衰老进程中内源性代谢物的变化规律, 阐明大海马的抗衰老作用机制。采用果蝇自然衰老模型, 给予不同剂量的生品大海马与酥油炙大海马, 观察对果蝇寿命、攀爬能力、性活力及抗氧化酶活性的影响, 应用代谢组学技术对衰老果蝇的代谢轮廓分析, 探究大海马延缓果蝇衰老的作用机制。结果表明, 生品大海马、酥油炙大海马(1、4 mg·mL^-1) 均能显著延长雄性果蝇的平均寿命、中位寿命和最高寿命, 可显著提高果蝇的攀爬能力与性活力, 提高过氧化氢酶(catalase, CAT) 的含量和降低丙二醛(malonaldehyde, MDA) 的含量。通过代谢组学技术指认出大海马可以显著回调16种代谢物, 参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、酪氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、组氨酸代谢5条代谢通路。结果提示, 大海马可延缓果蝇衰老, 炮制后药效加强, 抗衰老机制与氨基酸代谢和糖代谢有关。本研究旨在为大海马的开发利用和阐明其在老年性疾病发挥作用提供充实的科学依据。本研究动物实验获得山西大学伦理委员会的批准(批准号: SXULL2021028)。

通过血清代谢组学分析半夏白术天麻汤(Banxia Baizhu Tianma decoction, BBT) 干预正常高值血压(prehypertension, PHT) 痰湿壅盛证大鼠血清生物内源性物质的变化, 明确BBT的代谢调控途径。复制正常高值血痰湿壅盛证大鼠模型, 采集大鼠的血压、行为学指标、血清生化指标, 评估BBT的调节血压和血脂的药效, 利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用(UPLC-Q-orbitrap-MS) 代谢组学技术, 测定大鼠血清中内源性小分子物质变化, 寻找潜在的生物标志物。结果显示, BBT可以对其中9个代谢物进行调控, 主要包括花生四烯酸、胆酸、甘脱氧胆酸、N-腺苷酪氨酸、精氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺(20:0/0:0)、溶血磷脂(P-18:0)、溶血磷脂(18:0)、溶血磷脂[22:5(7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)]。通过MetaboAnalyst进行代谢通路分析, 共有7条代谢通路与大鼠血压的改变密切相关, 其中花生四烯酸代谢通路最为关键。模型大鼠体内代谢差异物有向正常水平回调的趋势, 从代谢组学角度为BBT的作用机制提供了研究依据。本研究已获得山东中医药大学实验动物福利伦理审查委员会批准(批准号: SDUTCM20211103001)。

肾病综合征发病机制复杂, 病理类型多样, 早期症状轻微不易发觉。肾穿刺活检作为肾病病理及进程诊断的金指标, 但患者接受程度低, 常常延误最佳治疗时间。因此, 发现可用于肾病早期诊断以及能够用于反映疾病进程的生物标志物对于临床具有重要意义。本研究以多柔比星损伤的足细胞模型模拟人类不同进展时期的肾病, 采用基于LC-MS的代谢组学技术结合统计学方法筛选并鉴定体外反映肾病足细胞早期损伤以及损伤进程的潜在生物标志物。细胞活力、凋亡测试以及足细胞结构蛋白分析结果显示, 模型复制成功, 且两种造模方式下足细胞损伤程度明显不同。依据正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA) 模型VIP > 1和P < 0.05分别筛选出9个反映肾病足细胞早期损伤以及12个反映损伤进程的差异代谢物。进一步经ROC分析聚焦可用于反映肾病足细胞早期损伤的潜在生物标志物为L-色氨酸、三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate, GTP)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(5′-thymidylic acid, dTMP)、胸苷, 及用于监测足细胞损伤进程的潜在生物标志物为L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、二磷酸尿苷(uridine 5′-diphosphate, UDP)、二磷酸鸟苷(guanosine 5′-diphosphate, GDP) AUC均大于0.85, 表明这8种代谢物可能具有较高的敏感性及诊断能力, 这一研究为进展性疾病相关生物标志物的研究提供参考。

潞党参为中药党参的传统道地药材, 主产于山西上党(今长治) 地区, 与其同基原的白条党主产于甘肃地区。党参含有苯丙素类、聚炔类、生物碱类、萜类、脂肪酸类、黄酮类等多种小分子化学成分, 产地对其化学成分的影响目前尚未发现系统报道。本研究基于四级杆-静电场轨道肼高分辨质谱联用(UPLC-Q-Exactive) 技术, 通过非靶向代谢组学方法分析不同产地党参之间的差异代谢物。采用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA) 的方法, 结合在线和本地数据库(Thermo mzcloud) 进行化学成分鉴定, 根据数据库(HMDB、PubChem、Chemspider、KEGG) 中的信息检索, 进一步筛选差异代谢物并分析其代谢通路。研究筛选得到72种差异代谢物, 产于山西省的潞党参相对甘肃省的白条党含量增加的差异代谢物有15种, 含量降低的差异代谢物有57种。KEGG富集分析到排名前30的代谢通路, 富集程度最高的代谢通路为苯丙素生物合成, 提示苯丙素生物合成途径以及相关中间代谢物可以作为区分潞党参和不同产地党参的特征。本研究为分析产地对党参化学成分的影响及合理评价党参质量提供了依据, 也为阐述潞党参的道地性提供新思路。

探究蕨麻水提物对环磷酰胺诱导骨髓抑制小鼠的影响及其代谢组学机制。采用环磷酰胺建立骨髓抑制小鼠模型并给予蕨麻水提物治疗, 计算各组小鼠胸腺与脾指数, 检测血常规变化, 测定骨髓有核细胞数, 并采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE) 染色进行骨髓病理学分析。测定小鼠血清中白细胞介素3 (interleukin 3, IL-3)、白细胞介素6 (interleukin 6, IL-6)、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 及过氧化氢酶(catalase, CAT)水平。借助UPLC-Q-TOF/MS进行血清非靶向代谢组学分析, 探析生物标志物变化及所涉及的代谢通路。动物实验操作遵循西南民族大学实验动物伦理委员会规定。蕨麻高剂量组可显著改善环磷酰胺诱导的小鼠外周血中白细胞(white blood cell, WBC)、红细胞(red blood cell, RBC) 计数及血红蛋白(hemoglobin, HGB) 水平下降(P < 0.05), 显著增加股骨骨髓中有核细胞数目及造血组织面积。蕨麻中、高剂量可显著改善小鼠血清中SOD、CAT、MDA、IL-6及GM-CSF水平(P < 0.05), 对IL-3及EPO表达无显著影响(P > 0.05)。血清代谢组学分析表明蕨麻水提物可通过调控缬氨酸、亮氨酸、L-天冬酰胺及羟基异己酸等13个差异代谢物介导的氨酰基-tRNA生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成等通路改善骨髓抑制。蕨麻可改善环磷酰胺诱导的小鼠骨髓造血功能抑制, 其作用机制可能与抗氧化、促进造血相关细胞因子的表达及调节相关代谢通路有关。

根腐病是制约黄芪产业可持续发展的重要因素。选育抗性品种作为防治病害最为经济有效且安全的措施, 其关键在于抗病性状指标的获得。本研究采用基于LC-MS的靶向代谢组学与实时荧光定量PCR技术, 分析苯丙烷途经代谢物响应根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani, FS) 侵染的动态变化, 结合多元统计分析指认差异代谢物, 以期精准挖掘抗病相关(resistance-related, RR) 代谢物, 为黄芪抗病性状指标的筛选提供依据。研究建立的LC-MS测定方法灵敏度高, 各组分在各自浓度范围内, 线性关系良好(R² ≥ 0.968 9), 回收率在70%~107%, 相对标准偏差(n = 6) 在1.2%~9.9%。研究发现, FS侵染对目标代谢物变化造成了明显扰动, 使其含量随时间序列与模拟接种组相比呈不同程度的上调或下调, 指认的差异代谢物毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素, 都属于黄酮类化合物。前3种化合物与FS在黄芪根中的含量显著负相关(r ≤ -0.97, P < 0.05), 作为潜在RR代谢物, 可为研究获得有实际应用前景的黄芪抗根腐病指标提供参考。

本研究整合植物代谢组学和靶标定量分析方法, 系统分析山西不同产地间黄芩叶化学成分的差异, 为合理有效利用黄芩叶资源提供理论依据。基于植物代谢组学的思路, 采用UPLC-QTOF-MS对山西省8个不同产地共53批黄芩叶进行液质分析, 并通过多元统计分析方法, 筛选山西不同产地间的差异化学成分。同时, 优化并建立一种可以同时测定黄芩叶中7种黄酮类成分和3种有机酸类成分的含量测定方法, 以定量分析山西不同产地黄芩叶化学成分差异。植物代谢组学结果显示, 晋北(大同、忻州)、晋中(阳泉、吕梁) 和晋南(长治、运城、晋城、临汾) 三个区域的黄芩叶化学成分组成具有差异性: 晋北和晋中地区间存在14个显著差异化学成分; 晋南和晋中之间存在18个显著差异化学成分; 晋北和晋南之间存在15个显著差异化学成分。其中, 野黄芩苷和异红花素-7-O-葡萄糖醛酸苷是三个地区间的共有差异成分, 野黄芩苷在晋南地区含量最高, 在晋北地区含量最低; 异红花素-7-O-葡萄糖醛酸苷在晋中地区含量最高, 在晋北地区含量最低。定量分析结果进一步证实, 晋北地区芹菜素、柚皮素和柠檬酸的平均含量最高, 晋南地区野黄芩苷、咖啡酸、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、苹果酸和汉黄芩苷的平均含量最高, 晋中地区汉黄芩素和黄芩苷的平均含量最高。该研究对于黄芩叶资源的质量控制具有重要意义, 为合理有效利用黄芩叶资源提供理论依据。

本研究采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS) 非靶向代谢组学技术, 分析鉴定圆柏药材的整体化学成分, 并结合主成分分析和偏最小二乘判别分析筛选不同基原圆柏品种鉴别的化学标志物。结果共检测出58个化学成分, 鉴定了其中46个化学成分, 包括26个黄酮类、8个有机酸类及其衍生物、4个苯丙素类、3个萜类、5个其他类成分, 其中methylsyringin和ekersenin为首次在圆柏中鉴定的成分。在正离子模式下筛选出12个品种鉴别的化学标志物, 在负离子模式下筛选出13个品种鉴别的化学标志物。结果表明, UPLC-Q-TOF-MS/MS代谢组学技术结合化学计量学方法, 可有效揭示不同基原圆柏药材的化学成分差异, 为其品种鉴别和质量控制提供参考。

本研究基于斑马鱼模型结合代谢组学技术探究西洋参提取物抗骨质疏松活性及其作用机制。采用泼尼松龙诱导的骨质疏松斑马鱼模型, 以骨骼荧光面积和荧光密度为评价指标, 开展西洋参的抗骨质疏松活性研究, 实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 检测西洋参对斑马鱼成骨细胞相关基因及破骨细胞相关基因表达的影响, 基于超高效液相色谱-质谱联用法(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-MS) 的代谢组学技术探讨其生物标志物的变化规律和影响的代谢通路。结果表明, 与模型组相比, 中国吉林、加拿大、中国文登、美国产的西洋参50%乙醇提取物均可显著提高斑马鱼骨骼荧光面积, 除美国产西洋参外, 其余产地西洋参50%乙醇提取物均可显著提高斑马鱼骨骼荧光密度。PCR结果表明, 西洋参可显著上调vitamin D receptor b (vdrb)、collagen type I α2 (col1a2)、cysteine-rich acidic secreted protein (sparc), 下调matrix metalloproteinase 9 (mmp9)、anti-tartrase acid phosphatase (trap)、cathepsin K (ctsk) 基因的表达。代谢组学分析鉴定出24个关键差异代谢物, 通路分析表明西洋参可通过参与嘌呤代谢、三羧酸循环、磷酸戊糖代谢途径, 回调10个关键生物质量标志物含量, 从而改善斑马鱼骨质疏松状态。本研究初步揭示了西洋参50%醇提物通过多靶点、多通路发挥抗骨质疏松活性, 为西洋参抗骨质疏松产品的开发利用提供理论基础。本实验获得山东省科学院生物研究所实验动物福利伦理委员会批准(批准号: SWS20181002)。

基于血小板蛋白质组学技术研究分析痰瘀互结证冠心病的关键调节蛋白和发病机制。基于前期实验室研究基础复制小型猪痰瘀互结证冠心病动物模型, 通过血脂及心肌组织特征变化进行模型判断, 进一步通过定量蛋白质组学技术对血小板蛋白进行研究, 筛选得到差异蛋白, 并通过生物信息学分析痰瘀互结证冠心病的关键调节蛋白及生物途径。动物实验已获得中国中医科学院西苑医院伦理委员会的批准(伦理号2021XLC037)。研究结果表明, 模型组在造模10周后总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL-C)、甘油三酯(triglyceride, TG) 及肌酸激酶(creatine kinase, CK) 和肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB, CK-MB) 水平均明显升高, 反映模型组出现血脂升高、凝血功能异常及心肌缺血等病理变化特征。此外, 相比于假手术组, 模型组血小板中有26个上调蛋白, 8个下调蛋白。生物信息学分析发现, 差异蛋白主要参与糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、脂质与动脉粥样硬化、Ras蛋白信号转导等。其中乳酸脱氢酶B (lactate dehydrogenase B, LDHB)、乙醇脱氢酶5 (alcohol dehydrogenase 5, ADH5)、神经母细胞瘤病毒癌基因RAS同系物(neuroblastoma ratsarcoma viral oncogene homolog, NRAS) 和Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog, KRAS) 与其他蛋白质相互作用时起到中枢作用, 并同时参与多条作用通路。结果显示, LDHB、ADH5、NRAS和KRAS可能是痰瘀互结证冠心病中的标志性蛋白, 通过调节糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、脂质与动脉粥样硬化、Ras蛋白信号转导等生物过程, 从而导致痰瘀互结证冠心病的发生。

桔梗汤作为治疗肺部疾病的经典方剂之一, 其化学组成与作用机制尚不明确。本研究采用高分辨质谱技术检测桔梗汤中的化学成分, 通过代谢组学技术探究桔梗汤对急性肺损伤(acute lung injury, ALI) 模型小鼠肺组织代谢物的影响。以差异倍数(fold change, FC) > 1.5或FC < 0.67, 并且P < 0.05为条件筛选潜在生物标志物并进行代谢通路富集分析。桔梗汤经质谱分析共鉴定出40个化合物, 包括三萜皂苷类成分、黄酮类成分、糖苷类成分等。动物实验经天津中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号: TCM-LAEC2021106)。研究发现, 桔梗汤可改善ALI模型小鼠的肺系数及肺组织形态, 降低肺泡灌洗液中丙二醛、肿瘤坏死因子-α、白介素-6的含量, 减少肺组织中髓过氧化物酶含量。代谢组学结果表明, 桔梗汤可调节与ALI相关的22个代谢物, 其中白三烯D4、二十二碳五烯酸、次黄嘌呤、L-5-羟脯氨酸等代谢物主要与机体炎症反应和氧化应激相关, 且被富集于谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和初级胆汁酸生物合成等通路。本研究通过代谢组学分析桔梗汤治疗ALI的潜在作用机制, 为桔梗汤的临床应用提供了重要的理论依据。

本文旨在基于¹H NMR代谢组学技术, 考察黄芩醇提物(ethanol extract of Scutellaria baicalensis Georgi, SGE) 对完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant, CFA) 诱导的炎性疼痛大鼠足趾中内源性代谢物的影响, 为揭示SGE改善炎性疼痛的作用及机制提供依据。本实验获得山西大学伦理委员会的批准(批准号: SXULL2022062)。通过大鼠足底皮下注射CFA (0.1 mL) 造成炎性疼痛模型, 考察低、中、高剂量SGE (1.5、3、6 g·kg^-1) 改善炎性疼痛的作用和机制。通过测定机械压痛阈值(mechanical nociceptive thresholds, MNTs) 评价SGE改善炎性疼痛的药效; 采用Western blot检测SGE对环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)、核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB) 和磷酸化NF-κB (phospho-NF-κB, p-NF-κB) 蛋白表达的影响; 采用¹H NMR代谢组学技术分析SGE对炎性疼痛大鼠足趾中内源性代谢物的调节作用。结果显示SGE (6 g·kg^-1) 能显著缓解CFA诱导的炎性疼痛, 显著抑制COX-2、NF-κB和p-NF-κB蛋白表达, 并能显著回调8种差异代谢物的改变, 如甘氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、磷酸胆碱等; 共涉及7条代谢通路如甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢, 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢, 乙醛酸和二羧酸代谢, 谷胱甘肽代谢, 甘油磷脂代谢等。结果表明, SGE可能通过调控NF-κB信号通路和代谢异常缓解炎性疼痛。

运用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field obitrap high-resolution mass spectrometry, UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS) 及宏基因组学技术, 探讨风湿宁粪菌移植干预类风湿关节炎的作用机制。所有动物福利和实验过程均遵循山西中医药大学医学伦理委员会的规定。将大鼠随机分为空白组、模型组、粪菌移植组、雷公藤多苷组, 建立大鼠胶原诱导关节炎(collagen induced arthritis, CIA) 模型。评估大鼠体重变化、足跖病变情况, 采用液质联用、宏基因组技术对各组大鼠血清进行差异代谢物、菌群分析, Western blot检测Toll样受体4 (Toll-like receptors, TLR4)、TLR4启动髓系分化初级反应蛋白88 (myeloid differentiation factor88, MyD88) 和核因子-κB p65 (nuclear factor of kappa B, NF-κB p65) 的蛋白表达量。从大鼠血清中共筛选出13种差异代谢物: 花生四烯酸、二十二碳六烯酸、13S-羟基十八碳二烯酸和L-苯丙氨酸等, 经通路富集筛选出3条代谢通路: 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢, 花生四烯酸代谢。宏基因组分析发现CIA组g_Bacteroides、g_Prevotella、p_Actinobacteria丰度较高; FMT-F组c_Clostridia、g_Akkermansia、s_Akkermansia_muciniphila丰度较高。层次聚类热图显示, 阿克曼菌(Akkermansia) 与L-苯丙氨酸呈负相关, 与二十二碳六烯酸呈正相关; 普雷沃菌(Prevotella) 与L-苯丙氨酸呈正相关。FMT-F能够明显抑制大鼠滑膜TLR4、MyD88和p65蛋白的表达(P < 0.01)。风湿宁粪菌移植治疗类风湿关节炎可能与其通过Akkermansia、Prevotella等微生物干预苯丙氨酸、花生四烯酸代谢, 抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路, 发挥抗炎效应有关。

本研究整合代谢组学技术和肠道菌群分析, 探讨生、炒酸枣仁(Ziziphi Spinosae Seme, ZSS; Fried Ziziphi Spinosae Semen, FZSS) 对失眠小鼠内源性代谢物及肠道菌群结构的影响。动物实验获得山西中医药大学伦理委员会的批准(批准号: 2021DW172)。通过腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA) 复制小鼠失眠模型, 分别给予ZSS、FZSS治疗5天, 开展戊巴比妥钠诱导睡眠实验, 考察ZSS、FZSS协同助眠作用。采用UPLC-Q-Orbitrap MS对失眠小鼠血清进行代谢轮廓分析, 结合多元统计分析, 筛选差异代谢物, 并借助MetaboAnalyst 5.0构建相关代谢通路与网络。利用16S rRNA分析肠道菌群结构及筛选差异性菌群。结果显示, 戊巴比妥钠诱导睡眠实验中, 与模型组相比, ZSS、FZSS均可降低睡眠潜伏期并延长睡眠时间; 血清代谢组学结果显示, 共鉴定36种与失眠相关的潜在生物标志物。与模型组相比, ZSS和FZSS组分别鉴定25和27种差异代谢物, 其中ZSS、FZSS均可显著回调共有的20种差异代谢物。共涉及10条与氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢调控机制密切相关通路。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成, 半胱氨酸和甲硫氨酸等5条代谢通路是ZSS组、FZSS组共有调控途径; 而花生四烯酸代谢是ZSS改善睡眠的独有代谢途径; 谷氨酸和谷氨酰胺等3条代谢通路是FZSS改善睡眠独有的调控途径。PCoA分析表明ZSS组、FZSS组菌群结构均有向空白组恢复的趋势; ZSS、FZSS均可促进普沃菌属丰度下降, 而上调乳酸菌属丰度。LEfSe和相关性分析表明血清差异代谢物犬尿喹啉酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸与ZSS组差异菌γ-变形菌纲呈显著正相关; 5-羟色胺、乙酰胆碱、L-甲硫氨酸与FZSS组差异菌乳酸菌属呈显著正相关。综上, ZSS与FZSS均可影响氨基酸、能量及脂质等代谢通路并调控肠道菌群结构, 从而发挥治疗失眠作用, 但在具体的代谢通路及肠道菌群各有特点。本研究结果为阐明ZSS、FZSS治疗失眠作用机制提供了实验基础, 为指导临床合理用药提供科学依据。

利用超高效液相色谱串联四极杆‒静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap-MS) 代谢组学技术分析酸枣仁汤(Suanzaoren decoction, SZRD) 对慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress, CUMS) 抑郁模型大鼠血清内源性代谢物代谢紊乱的调控作用, 明确酸枣仁汤发挥抗抑郁作用的代谢调控途径。将大鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性药文拉法辛组以及酸枣仁汤高(24 g·kg^-1)、低剂量(12 g·kg^-1) 组。分别对大鼠实施热刺激、冰水游泳、超声刺激、夹尾、昼夜颠倒、足底电击等刺激, 复制CUMS模型, 造模同时给予药物, 持续28天后, 观察各组大鼠行为学指标并收集大鼠海马组织以及血清样本。与CUMS模型组大鼠相比, 酸枣仁汤低剂量和高剂量组能显著降低强迫游泳不动时间(P < 0.001, P < 0.001)、提高糖水偏爱率(P < 0.01, P < 0.05)、旷场实验穿越格数(P < 0.05, P < 0.01) 和直立次数(P < 0.05, P < 0.01), 并能明显降低血清中IL-6、IL-1β以及TNF-α等炎性因子水平而发挥抗抑郁作用。能显著改善CUMS模型组大鼠抑郁样行为。共鉴定与指认出血清中与抑郁相关的21个差异代谢物, 酸枣仁汤低剂量组能显著回调8种, 酸枣仁汤高剂量组能显著回调其中11种。代谢通路分析显示丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、色氨酸代谢通路和花生四烯酸代谢是酸枣仁汤发挥抗抑郁作用的主要代谢途径。本研究为扩大酸枣仁汤临床适应证提供了科学依据。本实验获得山西大学动物伦理委员会批准(批准号: SXULL2020028)。

柴胡是中医临床常用中药材, 皂苷是其重要的活性成分。本研究首先利用超高效液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱(UHPLC-QTrap-MS) 在智能化分时间段-多反应选择离子监测(scheduled multiple reaction monitoring, sMRM) 模式下建立了25种柴胡皂苷的拟靶向相对定量方法, 所建立的方法具有良好的精密度、线性、重复性和稳定性。将该方法应用于37批不同产地北柴胡样本的比较, 结果显示山西不同产地北柴胡皂苷差异不大, 表明北柴胡生长适应力强, 受产地环境因素影响小, 适合广泛种植。夏季采收的柴胡与传统的春秋采收期采收的柴胡的皂苷类成分存在一定差异, 说明传统采收经验的合理性。相关性分析表明, 柴胡皂苷a和d与部分皂苷类成分存在显著的正相关, 通过变异系数分析确定了clinoposaponin Ⅻ等4种波动较大的皂苷类成分。本研究建立的LC-MS拟靶向代谢组学方法, 可以应用于柴胡皂苷类成分的全面检测, 为柴胡的质量评价研究提供新的方法。

黄芪是中医临床常用中药材, 随着近年来种植面积的增加, 黄芪根腐病危害逐年加重, 严重影响其质量和产量。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) 是引起黄芪根腐病的主要病原菌之一。本研究采用基于UPLC-Q-TOF-MS的代谢组学技术结合多元统计分析, 解析黄芪响应尖孢镰刀菌侵染的代谢产物变化。结果表明, 黄芪接种尖孢镰刀菌后, 有62种代谢物发生显著的变化。极性代谢物包括40个黄酮、8个皂苷、2个核苷、1个维生素、1个有机酸、1个氨基酸; 脂质代谢物包括3个脂肪酸、1个甘油二酯、2个溶血磷脂酰胆碱、1个溶血磷脂甘油、1个磷脂酰肌醇、1个固醇脂。尖孢镰刀菌接种组和对照组的差异代谢物中, 黄酮类以及维生素B₂、色氨酸、水杨酸的相对含量增加, 而皂苷类的相对含量减少。相关性分析表明, 黄酮类差异代谢物之间都互为正相关, 且与大部分脂类物质也呈正相关, 但与大部分的皂苷类物质呈负相关。另外, 研究显示尖孢镰刀菌侵染不是黄酮类化合物丙二酰取代发生的影响因子。本研究从植物代谢角度, 阐释根腐病菌尖孢镰刀菌侵染对黄芪代谢的影响, 为探索二者的互作机制, 辅助分子抗病育种提供依据。