药学学报

Compd.	K_i/nmol·L^-1		IC₅₀/nmol·L^-1	log D^c	LipE^d	MDR BA/AB^e (ratio)
1	0.74/8.2		80/843	2.0	4.1	12.5/0.28 (44.5)
4	< 0.1/0.2	0.76/6.6	2.9	5.3	30.6/2.6 (10.9)
5	4.0/38	95/3200	2.4	3.1	16.3/20.0 (0.82)
6	9.0/70	249/2650	2.4	3.2	27.5/11.0 (2.5)
7	< 0.2/2.6	14/176	3.4	3.4	16.5/10.9 (1.5)
8	2.8/35	116/1 665	2.1	3.7	12.6/0.74 (17.0)
9	22/310	-	2.1	-	18.8/2.5 (7.6)
10	< 0.2/0.7	9.7/53	4.0	3.3	5.1/3.2 (1.6)
11	0.85/8.2	16/312	3.6	3.5	33.8/7.7 (4.4)
12	< 0.2/1.4	4.6/54	3.4	3.9	15.6/11.4 (1.4)

Compd.

Structure

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

log D^c

LipE^d

MDR BA/AB^e
(ratio)

ALK/Mu-ALK^a

ALK cell/Mu-ALK cell^b

0.74/8.2

80/843

2.0

4.1

12.5/0.28
(44.5)

< 0.1/0.2

0.76/6.6

2.9

5.3

30.6/2.6
(10.9)

4.0/38

95/3200

2.4

3.1

16.3/20.0
(0.82)

9.0/70

249/2650

2.4

3.2

27.5/11.0
(2.5)

< 0.2/2.6

14/176

3.4

16.5/10.9
(1.5)

2.8/35

116/1 665

2.1

3.7

12.6/0.74
(17.0)

22/310

2.1

18.8/2.5
(7.6)

< 0.2/0.7

9.7/53

4.0

3.3

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(1.6)

0.85/8.2

16/312

3.6

3.5

33.8/7.7
(4.4)

< 0.2/1.4

4.6/54

3.4

3.9

15.6/11.4
(1.4)

Compd.	K_i/nmol·L^-1		IC₅₀/nmol·L^-1	log D^c	LipE^d	MDR BA/AB^e (ratio)
1	0.74/8.2		80/843	2.0	4.1	12.5/0.28 (44.5)
4	< 0.1/0.2	0.76/6.6	2.9	5.3	30.6/2.6 (10.9)
5	4.0/38	95/3200	2.4	3.1	16.3/20.0 (0.82)
6	9.0/70	249/2650	2.4	3.2	27.5/11.0 (2.5)
7	< 0.2/2.6	14/176	3.4	3.4	16.5/10.9 (1.5)
8	2.8/35	116/1 665	2.1	3.7	12.6/0.74 (17.0)
9	22/310	-	2.1	-	18.8/2.5 (7.6)
10	< 0.2/0.7	9.7/53	4.0	3.3	5.1/3.2 (1.6)
11	0.85/8.2	16/312	3.6	3.5	33.8/7.7 (4.4)
12	< 0.2/1.4	4.6/54	3.4	3.9	15.6/11.4 (1.4)

Compd.

Structure

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

log D^c

LipE^d

MDR BA/AB^e
(ratio)

ALK/Mu-ALK^a

ALK cell/Mu-ALK cell^b

0.74/8.2

80/843

2.0

4.1

12.5/0.28
(44.5)

< 0.1/0.2

0.76/6.6

2.9

5.3

30.6/2.6
(10.9)

4.0/38

95/3200

2.4

3.1

16.3/20.0
(0.82)

9.0/70

249/2650

2.4

3.2

27.5/11.0
(2.5)

< 0.2/2.6

14/176

3.4

16.5/10.9
(1.5)

2.8/35

116/1 665

2.1

3.7

12.6/0.74
(17.0)

22/310

2.1

18.8/2.5
(7.6)

< 0.2/0.7

9.7/53

4.0

3.3

5.1/3.2
(1.6)

0.85/8.2

16/312

3.6

3.5

33.8/7.7
(4.4)

< 0.2/1.4

4.6/54

3.4

3.9

15.6/11.4
(1.4)


13	2	H	H	0.36/1.6		22/101	3.0	4.0
14	3	H	H	0.22/ < 0.1	215/112	3.6	3.4
15	2	CH₃	CH₃	< 0.1/0.57	1.0/20	3.3	4.4
16	3	CH₃	CH₃	< 0.1/0.62	0.9/21	3.8	3.9
17	-	3.8/29	86/854	3.4	2.8
18	-	5.0/36	524/3 655	3.1	2.3

Compd.

R₁

R₃

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

logD

LipE

ALK/Mu-ALK

ALK cell/Mu-ALK cell

0.36/1.6

22/101

3.0

4.0

0.22/ < 0.1

215/112

3.6

3.4

CH₃

< 0.1/0.57

1.0/20

3.3

4.4

CH₃

< 0.1/0.62

0.9/21

3.8

3.9

3.8/29

86/854

3.4

2.8

5.0/36

524/3 655

3.1

2.3


13	2	H	H	0.36/1.6		22/101	3.0	4.0
14	3	H	H	0.22/ < 0.1	215/112	3.6	3.4
15	2	CH₃	CH₃	< 0.1/0.57	1.0/20	3.3	4.4
16	3	CH₃	CH₃	< 0.1/0.62	0.9/21	3.8	3.9
17	-	3.8/29	86/854	3.4	2.8
18	-	5.0/36	524/3 655	3.1	2.3

Compd.

R₁

R₃

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

logD

LipE

ALK/Mu-ALK

ALK cell/Mu-ALK cell

0.36/1.6

22/101

3.0

4.0

0.22/ < 0.1

215/112

3.6

3.4

CH₃

< 0.1/0.57

1.0/20

3.3

4.4

CH₃

< 0.1/0.62

0.9/21

3.8

3.9

3.8/29

86/854

3.4

2.8

5.0/36

524/3 655

3.1

2.3


19	CH		CH₃	< 0.2/0.29	0.70/14	2.2	5.7	28.3/8.1 (4.2)
20	CH		CH₃	1.7/6.1	-	2.2	-	34.6/5.8 (6.0)
21	CH	H	CH₃	< 0.2/1.9	6.4/97	2.0	5.0	25.4/4.6 (5.5)
22	N		CH₃	< 0.2/0.10	0.21/1.4	2.5	6.4	26.5/11.9 (2.2)
23	N		CH₃	17/61	156/1 230	2.5	3.4	29.6/9.6 (3.1)
24	CH		OCH₃	< 0.2/0.10	0.18/2.1	2.4	6.3	19.9/7.2 (2.8)
25	N		OCH₃	< 0.08/ < 0.02	0.11/0.75	2.7	6.4	40.3/20.1 (2.0)
26	-	0.07/0.40	1.3/21	1.8	5.9	22.1/2.4 (9.2)
27	-	< 0.1/0.12	0.34/1.9	2.2	6.5	8.0/1.2 (6.7)

Compd.

R₁

R₂

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

logD

LipE

MDR BA/AB
(ratio)

ALK/Mu-ALK

ALK cell/Mu-ALK cell

CH₃

< 0.2/0.29

0.70/14

2.2

5.7

28.3/8.1
(4.2)

CH₃

1.7/6.1

2.2

34.6/5.8
(6.0)

CH₃

< 0.2/1.9

6.4/97

2.0

5.0

25.4/4.6
(5.5)

CH₃

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0.21/1.4

2.5

6.4

26.5/11.9
(2.2)

CH₃

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156/1 230

2.5

3.4

29.6/9.6
(3.1)

OCH₃

< 0.2/0.10

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2.4

6.3

19.9/7.2
(2.8)

OCH₃

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0.11/0.75

2.7

6.4

40.3/20.1
(2.0)

0.07/0.40

1.3/21

1.8

5.9

22.1/2.4
(9.2)

< 0.1/0.12

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2.2

6.5

8.0/1.2
(6.7)


19	CH		CH₃	< 0.2/0.29	0.70/14	2.2	5.7	28.3/8.1 (4.2)
20	CH		CH₃	1.7/6.1	-	2.2	-	34.6/5.8 (6.0)
21	CH	H	CH₃	< 0.2/1.9	6.4/97	2.0	5.0	25.4/4.6 (5.5)
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24	CH		OCH₃	< 0.2/0.10	0.18/2.1	2.4	6.3	19.9/7.2 (2.8)
25	N		OCH₃	< 0.08/ < 0.02	0.11/0.75	2.7	6.4	40.3/20.1 (2.0)
26	-	0.07/0.40	1.3/21	1.8	5.9	22.1/2.4 (9.2)
27	-	< 0.1/0.12	0.34/1.9	2.2	6.5	8.0/1.2 (6.7)

Compd.

R₁

R₂

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

logD

LipE

MDR BA/AB
(ratio)

ALK/Mu-ALK

ALK cell/Mu-ALK cell

CH₃

< 0.2/0.29

0.70/14

2.2

5.7

28.3/8.1
(4.2)

CH₃

1.7/6.1

2.2

34.6/5.8
(6.0)

CH₃

< 0.2/1.9

6.4/97

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5.0

25.4/4.6
(5.5)

CH₃

< 0.2/0.10

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2.5

6.4

26.5/11.9
(2.2)

CH₃

17/61

156/1 230

2.5

3.4

29.6/9.6
(3.1)

OCH₃

< 0.2/0.10

0.18/2.1

2.4

6.3

19.9/7.2
(2.8)

OCH₃

< 0.08/ < 0.02

0.11/0.75

2.7

6.4

40.3/20.1
(2.0)

0.07/0.40

1.3/21

1.8

5.9

22.1/2.4
(9.2)

< 0.1/0.12

0.34/1.9

2.2

6.5

8.0/1.2
(6.7)

Compd.	Mu-ALK K_i/nmol·L^-1	Mu-ALK cell IC₅₀/nmol·L^-1	logD	MDR BA/AB (ratio)	TrkB K_i/nmol·L^-1 (selectivity)
19	2.9	14	2.2	28.3/8.1 (4.2)	0.5 (1.7%)
28	< 0.1	5.8	2.9	16.3/8.0 (2.0)	0.4 (2.0%)
29	0.70	21	2.3	28.0/19.3 (1.5)	23 (38x)
30	2.0	365	1.7	32.4/17.4 (20.2)	77 (39x)
31	0.56	45	2.4	22.1/3.8 (5.8)	65 (93x)

Compd.

Structure

Mu-ALK K_i/nmol·L^-1

Mu-ALK cell IC₅₀/nmol·L^-1

logD

MDR BA/AB
(ratio)

TrkB K_i/nmol·L^-1
(selectivity)

2.9

2.2

28.3/8.1
(4.2)

0.5
(1.7%)

< 0.1

5.8

2.9

16.3/8.0
(2.0)

0.4
(2.0%)

0.70

2.3

28.0/19.3
(1.5)

23
(38x)

2.0

365

1.7

32.4/17.4
(20.2)

77
(39x)

0.56

2.4

22.1/3.8
(5.8)

65
(93x)

Compd.	Mu-ALK K_i/nmol·L^-1	Mu-ALK cell IC₅₀/nmol·L^-1	logD	MDR BA/AB (ratio)	TrkB K_i/nmol·L^-1 (selectivity)
19	2.9	14	2.2	28.3/8.1 (4.2)	0.5 (1.7%)
28	< 0.1	5.8	2.9	16.3/8.0 (2.0)	0.4 (2.0%)
29	0.70	21	2.3	28.0/19.3 (1.5)	23 (38x)
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31	0.56	45	2.4	22.1/3.8 (5.8)	65 (93x)

Compd.

Structure

Mu-ALK K_i/nmol·L^-1

Mu-ALK cell IC₅₀/nmol·L^-1

logD

MDR BA/AB
(ratio)

TrkB K_i/nmol·L^-1
(selectivity)

2.9

2.2

28.3/8.1
(4.2)

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(1.7%)

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2.9

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(39x)

0.56

2.4

22.1/3.8
(5.8)

65
(93x)

Compd.	ALK in 3T3-EML4-ALK engineering cell lines/IC₅₀/nmol·L^-1
29	1.3	0.2	1.6	15	4.2	21	9.0	77
15	80	165	478	605	626	843	1 026	1 148

Compd.

ALK in 3T3-EML4-ALK engineering cell lines/IC₅₀/nmol·L^-1

ALK

F1174L

C1156Y

G1269A

S1206Y

L1196M

L1152R

G1202R

1.3

0.2

1.6

4.2

9.0

165

478

605

626

843

1 026

1 148

Compd.	ALK in 3T3-EML4-ALK engineering cell lines/IC₅₀/nmol·L^-1
29	1.3	0.2	1.6	15	4.2	21	9.0	77
15	80	165	478	605	626	843	1 026	1 148

Compd.

ALK in 3T3-EML4-ALK engineering cell lines/IC₅₀/nmol·L^-1

ALK

F1174L

C1156Y

G1269A

S1206Y

L1196M

L1152R

G1202R

1.3

0.2

1.6

4.2

9.0

165

478

605

626

843

1 026

1 148

治疗间质性淋巴瘤激酶变异和脑转移的大环类药物劳拉替尼的研制

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郭宗儒

药学学报 | 新药发现与研究实例简析 2023,58(5): 1395-1400

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药学学报 | 新药发现与研究实例简析 2023, 58(5): 1395-1400

治疗间质性淋巴瘤激酶变异和脑转移的大环类药物劳拉替尼的研制

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郭宗儒

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

Affiliations

出版时间: 2023-05-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-0352

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引用本文

郭宗儒. 治疗间质性淋巴瘤激酶变异和脑转移的大环类药物劳拉替尼的研制. 药学学报, 2023 , 58 (5) : 1395 -1400 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0352

. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (5) : 1395 -1400 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0352

正文

收起

新药创制是复杂的智力活动, 涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物都有自身的研发轨迹, 而构建化学结构是最重要的环节, 因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等多维性质。本栏目以药物化学视角, 对有代表性的药物的成功构建, 加以剖析和解读。

本刊在2016, 51 (4): 672-676介绍了辉瑞研发的克唑替尼, 是第一代治疗间质性淋巴瘤激酶(ALK) 呈阳性的非小细胞肺癌的首创性药物, 时隔7年后辉瑞上市劳拉替尼, 是治疗ALK发生变异和脑转移的患者。作为第三代药物, 其结构特征是大环分子, 研制目标针对ALK发生变异的细胞, 以及可进入中枢, 治疗脑转移患者, 为此, 在药物化学上, 注意调整分子尺寸、氢键数目和亲脂性效率; 在药理学上, 针对耐药的ALK细胞、穿越中枢和避免P-糖蛋白的外排作用, 实现了药物化学的设计合成和药理学的多维评价的密切配合。(编者按)

1 背景

收起

1.1 靶标

间质性淋巴瘤激酶(ALK) 属于胰岛素受体家族酪氨酸激酶的一个成员, 主要表达于成人的脑组织中, 维持中枢神经的发育和功能。ALK名称的来源是在间质性大细胞淋巴瘤(ALCL, 一种非何杰金淋巴瘤) 的发生中ALK起重要作用。ALCL基因发生t(2;5)(p32;q35) 染色体易位, 这种易位导致核磷蛋白(NMP) 与截短的ALK发生融合, 成为构成胞浆中有活性的酪氨酸激酶, 具有促进癌变的功能。

迄今已证实染色体易位可生成10多种ALK融合蛋白, 表达于多种肿瘤细胞中, 神经母细胞瘤、炎性乳腺癌和卵巢癌发生ALK的扩增以及全长蛋白的活化点突变。ALK是研发治疗这些肿瘤的药物靶标。

1.2 ALK靶标的已有药物

第一个作用于ALK靶标的药物是2011年辉瑞上市的克唑替尼(1, crizotinib), 治疗NPM-ALK瘤源性融合基因的非小细胞肺癌。诺华研发的色瑞替尼(2, ceritinib) 和武田研发的布加替尼(3, brigatinib) 分别在2014和2017年上市, 认为是作用于ALK的第二代药物。

克唑替尼治疗非小细胞肺癌出现耐药性, 本品旨在研发针对已耐药的患者。此外肺癌和乳腺癌患者常发生脑转移而克唑替尼难以穿越血脑屏障进入中枢, 药物在脑脊髓液与血浆浓度比为0.03, 因而辉瑞公司设定研制针对ALK第三代药物的目标是对耐药ALK的有效性和在脑中的有效分布。从药物分子的理化性质上要求化合物在高活性和选择性前提下, 分子尺寸尽可能小, 以有利于吸收和穿越血脑屏障; 保持分子的适度亲脂性, 以免亲脂性过强引起氧化代谢, 不利于药效的持续性。为此, 用亲脂性效率(LipE) 量度化合物的质量。LipE的定义是LipE = pIC₅₀ - logD, pIC₅₀是活性的负对数, logD是化合物的分布系数, LipE是联系化合物亲脂性和与受体结合效率的量度, 数值越大越趋近成药性。

2 活性评价

收起

2.1 受试物对ALK激酶活性的生化测定

用杆状病毒表达人体重组野生型和变异的ALK蛋白的激酶域(氨基酸序列为1 093~1 411), 用MgATP处理使自磷酸化而预活化, 微流体的凝胶滞缓实验测定受试物竞争ATP结合的动力学数据, 计算受试物的K_i值。

2.2 受试物对细胞内磷酸-ALK作用的ELISA测定

96孔板每孔加入20 000细胞, 加入血清温孵过夜。加入不同量的受试物, 温孵1 h。除去培养液, 溶解细胞, 用ELISA试剂盒测定溶解液中磷酸化的ALK (Tyr1604) 含量, 根据拟合量效曲线计算IC₅₀。

2.3 激酶的选择性评价

基于荧光共振能量转移(FRET) 的Z′-LYTE分析方法, 测定受试物对其他207个激酶的活性, 以评价化合物的脱靶作用。

3 以克唑替尼为起始物的优化

收起

3.1 变换不同部位的取代基

辉瑞公司为克服克唑替尼(1) 对ALK发生变异的癌细胞缺乏活性, 这与被P-糖蛋白的外排作用相一致[MDR BA/AB ratio (> 2.5)], 同时, 中枢内水平因而很低。以1为起始物, 变换环上的取代基或者变换吡啶为哌嗪, 合成的代表性化合物及其活性和药代/理化参数列于表 1。

构效关系解析: ①化合物4是用亲水的双羟基片段替换哌啶环, 这是优化理化性质常用的策略。分子中两个大体积和疏水的氯原子用三唑替换等, 4无论在酶或细胞水平, 对野生型和ALK^L1196M变异型(门户氨基酸由Leu变异成Met) 的活性分别提高了105和128倍, 这是引入极性基团的结果。然而尽管LipE显著提高, 但仍有较强的外排作用, 4在大鼠的脑脊髓液(CSF) 水平也低。②化合物5和6的外排作用显著降低, MDR的比值在2.5或以下, 预示进入中枢的能力增强, 但由于减少了极性基团, 与野生型和变异型的ALK结合力都减弱, 体现了药效与药代之间的纠结, 这是优化中常见的。7也有类似的趋势。③化合物8、9和11是将苯环上的三唑换成酰胺, 部分维持了sp²杂化态、平面性和极性, 降低了亲脂性, 提高了亲脂性效率(8比7的分布系数降低1.1对数单位)。9比8多一个N-甲基, 活性显著降低。④甲砜基化合物12的活性虽强但选择性不高(数据省略)。

综上, 这些开链化合物未能同时满足对ALK^L1196M变异型的活性(对ALK^L1196M IC₅₀ < 25 nmol·L^-1), 以及阻止外排的能力(MDR BA/AB比值< 2.5), 因而预示难以穿越血脑屏障进入中枢。然而它们的结构生物学信息提供了进一步优化的依据。

3.2 化合物与ALK的结合特征

研究者分别制备了化合物11和12与野生型ALK活性部位的复合物晶体结构并进行了解析, 图 1是将两个分子叠合图, 青色为11, 绿色是12。揭示出的信息如下: ①两个分子的构象均呈U型弯曲状, 拐点在甲氧基的连接处。②氨基吡啶与酶铰链处的Leu1122和Gly1123形成氢键, 键长分别是1.9 Å和2.9 Å。③ 11的末端吡啶氮原子也形成氢键(2.8 Å); ④苯环相连的三唑或酰胺的氮原子形成氢键(2.80 Å); ⑤酰胺与三唑片段未能叠合在一起, 平面相差20°, 以致N-甲基未能参与疏水相互作用。

上面提供的重要启示是弯曲的U形构象, 化合物10、5和12也是U形构象, 使得两端的苯基与吡啶相互靠近, 若用片段将两端连接成大环化合物, 则可固定U型构象, 从而降低分子柔性, 对结合的熵效应是有利的, 也为在疏水腔内提供更有利的疏水-疏水相互作用, 提供了结合力和选择性, 推测也有利于药代和向中枢的分布。

4 大环化合物的设计

收起

4.1 含醚键的大环

开始设计的大环化合物是将化合物5苯环上的甲氧基经亚烷基与三唑环相连接, 形成含有醚键的12~14元环, 其活性和物化性质列于表 2。化合物13和15是两个较小的12元环化合物, 亲脂性效率LipE最高, 强于其他另外4个环较大的化合物。尤其是15的LipE达到4.4, 而且对酶和细胞、野生和ALK变异的活性都优胜于其他化合物, 更优于5, 不过, 15的亲脂性仍过强, 距离活性强度、ADME和向中枢的分布等综合目标仍有不足。

4.2 含有内酰胺的大环

这一步的优化目的是降低含醚键的12元环化合物的亲脂性, 仍保持或提高化合物的亲脂性效率LipE, 最容易实现的变换是将醚键换作酰胺键, 并减少环中的亚甲基, 仍保持12元环, 以维持环上基团的空间位置, 首先设计了化合物19, 经分子模拟发现19与ALK的结合没有引起环的张力变化。酰胺的N-甲基靠近Leu1122、Gly1123和Val1130构成的环套区, 羰基经结构水(structural water) 的介导与Lys1150形成氢键网络而稳定化。因而合成了环状内酰胺化合物, 表 3列出代表性化合物的结构和生物学参数。

表 3显示内酰胺类12元大环的活性可与环醚系列相当, 而效率显著高于醚环, 是因为降低亲脂性提高了LipE的缘故。分析内酰胺类的构效关系如下: ①连接甲基的手性碳构型对活性影响显著, R构型强于S对映体, 例如优映体19和22对ALK变异的酶和细胞抑制活性强于劣映体20和23, 活性分别高210和610倍。②去甲基化合物21的活性显著低于19, 提示R-CH₃对活性贡献显著, 因而后来的设计都保持R-CH₃。③氨基吡啶与对应的氨基哌嗪化合物做比较(19/22; 24/25; 26/27) 表明, 哌嗪环的活性强于相应的吡啶化合物, 但是LipE反而下降了, 原因是环上多一个氮原子, 亲脂性不仅没有下降反而增加了。这是因为新增加的氮原子未被水合, 而且拉电子效应还降低了氨基哌嗪碱性, 因而logD大于相应的氨基哌啶化合物, 致使效率降低。④含甲砜基化合物26和27的活性与19和22相当, 但效率更高, 是因为甲磺酰基的极性增加了溶剂化, 降低了logD的缘故。

4.3 提高选择性

4.3.1 化合物设计

利用ALK的ATP结合腔的特异性氨基酸组成, 是分子设计提高选择性的切入点。ALK的ATP结合腔由27个氨基酸残基组成, 其中的Leu1198在整个激酶组学中只占26%, 大多数激酶的这个位置是Phe或Tyr。Leu的体积小于Phe或Tyr, 这样, 设计的化合物的基团应适配于Leu结合, 而同Phe或Tyr发生碰撞阻碍作用。由于TrkB激酶含有Tyr635相当于ALK的Leu1198, 因而用对TrkB激酶的抑制作为评价受试物的脱靶作用。

合成的代表性化合物列于表 4, 测定了ALK发生变异的激酶(L1196M) 和细胞活性以及对TrkB激酶的抑制作用, 对后者的活性越弱, 比值越大, 提示对ALK选择性抑制越强。结果表明化合物19 (3-甲基吡唑) 和28 (3-环丙基吡唑) 对TrkB激酶抑制作用很强, 没有显示出对ALK-L1196M的选择性作用。而3-氰基吡唑(29) 和甲基咪唑并嘧啶(30) 对TrkB激酶的活性弱于ALK-L1196M大约40倍, 具有选择性作用, 化合物31 (氰基咪唑并吡啶) 的选择性甚至高达93倍。

其实, 这些化合物在合成之前曾进行了分子模拟, 预示了这些化合物的活性和选择性, 合成后对代表性的分子与ALK-L1196M的复合物制备了单晶, 通过解析和对TrkB激酶的分子模拟, 证实了基团对TrkB激酶的Tyr635空间距离引起的碰撞与选择性有密切相关性。

4.3.2 结合模式

化合物19与ALK的复合物单晶衍射结构表明(图 2a), 吡唑环上甲基与TrkB激酶的Tyr635的环上C3(CE)、C4(CZ) 和OH的距离为3.2~4.1 Å, 化合物28的环丙基与上述三点的距离是3.2~3.7 Å, 在空间上是可以实现的, 这个距离在能量上是允许结合的。然而29的氰基距离Tyr635的三点为2.1~3.1 Å。30的甲基移动距离更小, 为2.1~2.3 Å。31的氰基距离只有1.0~1.8 Å, 这些距离使得化合物29~31的氰基或甲基与TrkB激酶的Tyr635基团过近而发生碰撞(图 2b), 能量上的不利难以与TrkB激酶结合, 这与实验数据是完全关联的。

4.3.3 大环与链状化合物的活性再检讨

前述的表 1~4列出的分子只是代表性的化合物, 其实, 合成的数量很多, 还测定了活性和分布系数。对众多的大环和链状分子作分布性分析, 进一步揭示了两类化合物的区别: 环状化合物有更高的活性效率。图 3是以化合物对变异的ALK酶IC₅₀负对数和logD为坐标, 标出环状和链状分子的分布, 浅蓝色代表大环分子, 灰色是链状分子。显示出高活性效率的大都是大环分子, 而且logD集中在2~3范围内, 而链状分子活性弱, logD较高。

5 评价中枢系统的生物利用度

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研发ALK激酶抑制剂的另一个目标, 是药物可穿越血脑屏障以治疗脑转移肿瘤。MDCK-MDR1细胞是一种高表达P-糖蛋白的细胞系, 已经证明若降低化合物在该细胞系的外排作用, 则可提高在脑脊髓液或脑中浓度与血药浓度的比值(He H, Lyons KA, Shen X, et al. Utility of unbound plasma drug levels and P-glycoprotein transport data in prediction of central nervous system exposure. Xenobiotica, 2009, 39: 687-693)。MDR BA/AB对化合物的外排作用比值(ERs) 若低于2.5, 预示血脑屏障的外排作用较低, 从而脑中与血浆中药物水平的比值较大。辉瑞对公司的近12万个化合物的物化性质(相对分子质量、氢键数和实验测定的logD等) 分析了与过膜性和外排性的相关性, 表明降低外排作用的化合物性质限制在一个小范围内, 即相对分子质量不能过高, 氢键数不超过两个, logD在2~3的范围内, 所以避免外排作用是由多维参数所决定的综合效应, 可用于研发ALK抑制剂的研究中。

表 4中多数化合物的MDR BA/AB比值大于2.5, 提示它们是P-糖蛋白的底物, 不易穿越血脑屏障, 只有28和29的比值低于2.5, 预示可进入中枢神经系统。

6 候选物的确定和劳拉替尼的上市

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综合评价对ALK和ALK^L1196M的活性强度、选择性、清除率和外排性, 确定了29为候选化合物, 29对临床上出现的ALK突变的癌细胞仍保持较强的抑制活性, 表 5列出了化合物29与链状分子15对变异株细胞的抑制活性, 提示29显著优于15。进而评价了29对206个重组激酶的抑制活性, 除10个激酶处于边缘活性(强度低于变异的ALK活性100倍) 外, 其余都没有活性(Johnson TW, Richardson PF, Bailey S, et al. Discovery of (10R)-7-amino-12-fluoro-2, 10, 16-trimethyl-15-oxo-10, 15, 16, 17-tetrahydro-2H-8, 4-(metheno)pyrazolo[4, 3-h][2, 5, 11]-benzoxadiazacyclotetradecine-3-carbonitrile (PF-06463922), a macrocyclic inhibitor of anaplastic lymphoma kinase (ALK) and c-ros oncogene 1 (ROS1) with preclinical brain exposure and broad-spectrum potency against ALK-resistant mutations. J Med Chem, 2014, 57: 4720-4744)。

化合物29的大鼠药代动力学实验表明, 静脉注射的血浆消除半衰期t_1/2 2.7 h, 清除率Cl_p为15.5 mL·min^-1·kg^-1, 分布容积V_ss为2.7 L·kg^-1, 口服生物利用度F = 100%。灌胃大鼠10 mg·kg^-1评价29进入脑和脑脊髓液(CFS) 的能力, 采集并测定不同时间段的血浆、脑和CFS的药物量, 表明CFS与血浆的比值为0.31, 脑与血浆的比值为0.21, 提示29可穿越血脑屏障, 较小P-糖蛋白泵出作用。

综上, 确定化合物29为候选化合物, 定名为劳拉替尼(lorlatinib), 经3期临床研究, 表明对非小细胞肺癌发生脑转移、对克唑替尼(第一代) 和第二代ALK抑制剂布加替尼耐受的患者有显著效果, 于2018年批准上市。

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2023年第58卷第5期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-0352

首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-05-12

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中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Compd.	K_i/nmol·L^-1		IC₅₀/nmol·L^-1	log D^c	LipE^d	MDR BA/AB^e (ratio)
1	0.74/8.2		80/843	2.0	4.1	12.5/0.28 (44.5)
4	< 0.1/0.2	0.76/6.6	2.9	5.3	30.6/2.6 (10.9)
5	4.0/38	95/3200	2.4	3.1	16.3/20.0 (0.82)
6	9.0/70	249/2650	2.4	3.2	27.5/11.0 (2.5)
7	< 0.2/2.6	14/176	3.4	3.4	16.5/10.9 (1.5)
8	2.8/35	116/1 665	2.1	3.7	12.6/0.74 (17.0)
9	22/310	-	2.1	-	18.8/2.5 (7.6)
10	< 0.2/0.7	9.7/53	4.0	3.3	5.1/3.2 (1.6)
11	0.85/8.2	16/312	3.6	3.5	33.8/7.7 (4.4)
12	< 0.2/1.4	4.6/54	3.4	3.9	15.6/11.4 (1.4)

Compd.

Structure

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

log D^c

LipE^d

MDR BA/AB^e
(ratio)

ALK/Mu-ALK^a

ALK cell/Mu-ALK cell^b

0.74/8.2

80/843

2.0

4.1

12.5/0.28
(44.5)

< 0.1/0.2

0.76/6.6

2.9

5.3

30.6/2.6
(10.9)

4.0/38

95/3200

2.4

3.1

16.3/20.0
(0.82)

9.0/70

249/2650

2.4

3.2

27.5/11.0
(2.5)

< 0.2/2.6

14/176

3.4

16.5/10.9
(1.5)

2.8/35

116/1 665

2.1

3.7

12.6/0.74
(17.0)

22/310

2.1

18.8/2.5
(7.6)

< 0.2/0.7

9.7/53

4.0

3.3

5.1/3.2
(1.6)

0.85/8.2

16/312

3.6

3.5

33.8/7.7
(4.4)

< 0.2/1.4

4.6/54

3.4

3.9

15.6/11.4
(1.4)


13	2	H	H	0.36/1.6		22/101	3.0	4.0
14	3	H	H	0.22/ < 0.1	215/112	3.6	3.4
15	2	CH₃	CH₃	< 0.1/0.57	1.0/20	3.3	4.4
16	3	CH₃	CH₃	< 0.1/0.62	0.9/21	3.8	3.9
17	-	3.8/29	86/854	3.4	2.8
18	-	5.0/36	524/3 655	3.1	2.3

Compd.

R₁

R₃

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

logD

LipE

ALK/Mu-ALK

ALK cell/Mu-ALK cell

0.36/1.6

22/101

3.0

4.0

0.22/ < 0.1

215/112

3.6

3.4

CH₃

< 0.1/0.57

1.0/20

3.3

4.4

CH₃

< 0.1/0.62

0.9/21

3.8

3.9

3.8/29

86/854

3.4

2.8

5.0/36

524/3 655

3.1

2.3


19	CH		CH₃	< 0.2/0.29	0.70/14	2.2	5.7	28.3/8.1 (4.2)
20	CH		CH₃	1.7/6.1	-	2.2	-	34.6/5.8 (6.0)
21	CH	H	CH₃	< 0.2/1.9	6.4/97	2.0	5.0	25.4/4.6 (5.5)
22	N		CH₃	< 0.2/0.10	0.21/1.4	2.5	6.4	26.5/11.9 (2.2)
23	N		CH₃	17/61	156/1 230	2.5	3.4	29.6/9.6 (3.1)
24	CH		OCH₃	< 0.2/0.10	0.18/2.1	2.4	6.3	19.9/7.2 (2.8)
25	N		OCH₃	< 0.08/ < 0.02	0.11/0.75	2.7	6.4	40.3/20.1 (2.0)
26	-	0.07/0.40	1.3/21	1.8	5.9	22.1/2.4 (9.2)
27	-	< 0.1/0.12	0.34/1.9	2.2	6.5	8.0/1.2 (6.7)

Compd.

R₁

R₂

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

logD

LipE

MDR BA/AB
(ratio)

ALK/Mu-ALK

ALK cell/Mu-ALK cell

CH₃

< 0.2/0.29

0.70/14

2.2

5.7

28.3/8.1
(4.2)

CH₃

1.7/6.1

2.2

34.6/5.8
(6.0)

CH₃

< 0.2/1.9

6.4/97

2.0

5.0

25.4/4.6
(5.5)

CH₃

< 0.2/0.10

0.21/1.4

2.5

6.4

26.5/11.9
(2.2)

CH₃

17/61

156/1 230

2.5

3.4

29.6/9.6
(3.1)

OCH₃

< 0.2/0.10

0.18/2.1

2.4

6.3

19.9/7.2
(2.8)

OCH₃

< 0.08/ < 0.02

0.11/0.75

2.7

6.4

40.3/20.1
(2.0)

0.07/0.40

1.3/21

1.8

5.9

22.1/2.4
(9.2)

< 0.1/0.12

0.34/1.9

2.2

6.5

8.0/1.2
(6.7)

Compd.	Mu-ALK K_i/nmol·L^-1	Mu-ALK cell IC₅₀/nmol·L^-1	logD	MDR BA/AB (ratio)	TrkB K_i/nmol·L^-1 (selectivity)
19	2.9	14	2.2	28.3/8.1 (4.2)	0.5 (1.7%)
28	< 0.1	5.8	2.9	16.3/8.0 (2.0)	0.4 (2.0%)
29	0.70	21	2.3	28.0/19.3 (1.5)	23 (38x)
30	2.0	365	1.7	32.4/17.4 (20.2)	77 (39x)
31	0.56	45	2.4	22.1/3.8 (5.8)	65 (93x)

Compd.

Structure

Mu-ALK K_i/nmol·L^-1

Mu-ALK cell IC₅₀/nmol·L^-1

logD

MDR BA/AB
(ratio)

TrkB K_i/nmol·L^-1
(selectivity)

2.9

2.2

28.3/8.1
(4.2)

0.5
(1.7%)

< 0.1

5.8

2.9

16.3/8.0
(2.0)

0.4
(2.0%)

0.70

2.3

28.0/19.3
(1.5)

23
(38x)

2.0

365

1.7

32.4/17.4
(20.2)

77
(39x)

0.56

2.4

22.1/3.8
(5.8)

65
(93x)

Compd.	ALK in 3T3-EML4-ALK engineering cell lines/IC₅₀/nmol·L^-1
29	1.3	0.2	1.6	15	4.2	21	9.0	77
15	80	165	478	605	626	843	1 026	1 148

Compd.

ALK in 3T3-EML4-ALK engineering cell lines/IC₅₀/nmol·L^-1

ALK

F1174L

C1156Y

G1269A

S1206Y

L1196M

L1152R

G1202R

1.3

0.2

1.6

4.2

9.0

165

478

605

626

843

1 026

1 148