药学学报

西黄丸下调HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路抑制脑胶质瘤细胞血管生成拟态形成的作用及其机制

PDF下载

张其海 ¹^,^# , 余卓伦 ¹^,^# , 樊昊雯 ¹ , 潘晶 ¹ , 王霞 ²^,^* , 徐宏彬 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(5): 1256-1266

收起

药学学报 | 研究论文 2023, 58(5): 1256-1266

西黄丸下调HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路抑制脑胶质瘤细胞血管生成拟态形成的作用及其机制

全屏

张其海¹^,^#, 余卓伦¹^,^#, 樊昊雯¹, 潘晶¹, 王霞²^,^*, 徐宏彬¹^,^*

作者信息

1.南京中医药大学第二附属医院, 江苏南京 210017

2.南京中医药大学第二附属医院 (江苏省第二中医院)

通讯作者:

*王霞,Tel: 86-25-83291119, E-mail: 20113065@njucm.edu.cn;

徐宏彬,Tel: 86-25-83292443, E-mail: jiang_rh@126.com

The effect and mechanism of Xihuang pill inhibits the formation of vasculogenic mimicry in human glioblastoma cells by down-regulating HIF-1α/VEGFA/VEGFR2 signaling pathway

Qi-hai ZHANG¹, Zhuo-lun YU¹, Hao-wen FAN¹, Jing PAN¹, Xia WANG²^,^*, Hong-bin XU¹^,^*

Affiliations

1. The Second Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210017, China

2. The Second Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine (Jiangsu Second Chinese Medicine Hospital), Nanjing 210017, China

出版时间: 2023-05-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1016

文章导航

摘要

收起

探究西黄丸含药血清调控低氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)/血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)/血管内皮生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2) 信号通路, 抑制脑胶质瘤细胞血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM) 形成的作用及机制。采用对雄性SD大鼠连续灌胃给药7天，制备西黄丸含药血清(动物实验伦理审批号: 202105A051)。采用200 μmol·L^-1 CoCl₂构建U251细胞低氧模型, 给予西黄丸含药血清后, CCK-8法、细胞克隆实验检测U251细胞活力和增殖情况; 流式细胞术检测U251细胞凋亡及周期; 细胞划痕愈合、Transwell侵袭实验检测U251细胞的迁移与侵袭能力; 3D细胞培养检测U251细胞VM的形成情况; Western blot法检测U251细胞HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、磷酸化VEGFR2 (phosphorylated-VEGFR2, p-VEGFR2)、血管内皮钙黏着蛋白(vascular endothelial-cadherin, VE-cadherin)、Eph受体酪氨酸激酶A2 (Eph receptor tyrosine kinases A2, EphA2)、基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2, MMP2)、基质金属蛋白酶14 (matrix metalloproteinase 14, MMP14) 和层黏连蛋白γ2 (laminin γ2) 等蛋白表达水平。结果显示, 低氧状态下, 10%西黄丸含药血清对U251细胞活力、增殖、凋亡和细胞周期影响较小。与低氧模型组相比, 10% 1.0、1.5和2.0 h组西黄丸含药血清均显著减慢U251细胞的迁移速率(P < 0.01), 显著减少侵袭的U251细胞数量(P < 0.01)。10% 2.0 h组西黄丸含药血清显著抑制低氧状态下U251细胞的VM管状结构形成(P < 0.01)。Western blot实验显示, 10%西黄丸含药血清显著下调HIF-1α、VEGFA、phospho-VEGFR2、VE-cadherin、EphA2、MMP14等蛋白表达(P < 0.05)。综上所述, 西黄丸可通过下调HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路, 抑制脑胶质瘤U251细胞VM形成, 发挥抗血管生成的作用。

关键词

西黄丸 / 含药血清 / 脑胶质瘤 / U251细胞 / 血管生成拟态

Abstract

收起

Our studies were aimed to explore the effect and mechanism of the inhibition of the formation of vasculogenic mimicry (VM) in human glioblastoma cells by Xihuang pill (XHP) medicated serum through regulating the hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α)/vascular endothelial growth factor A (VEGFA)/vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) signaling pathway. The medicated serum of XHP was prepared by gavage for 7 days to male SD rats (approval number of animal experiment ethics: 202105A051). The hypoxia model of U251 cells was established using 200 μmol·L^-1 of CoCl₂. After treatment with XHP-medicated serum, cell viability and proliferation of U251 cells were detected by CCK-8 and cell cloning experiment. Cell apoptosis and cell cycle of U251 cells were determined by flow cytometry. Cell migration and invasion were evaluated by wound healing and Transwell invasion assay. The formation of VM was assessed by three-dimensional cell culture of U251 cells. The protein expression levels of HIF-1α, VEGFA, VEGFR2, phosphorylated-VEGFR2 (p-VEGFR2), vascular endothelial-cadherin (VE-cadherin), Eph receptor tyrosine kinases A2 (EphA2), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), matrix metalloproteinase 14 (MMP14) and laminin γ2 in U251 cells were detected by Western blot. The results showed that 10% XHP-medicated serum had little effect on the cell viability, proliferation, apoptosis and cell cycle of U251 cells under hypoxia. Compared with the model group, 10% XHP-medicated serum at 1.0, 1.5 and 2.0 h significantly decreased the migration rate (P < 0.01) and the number of invading U251 cells (P < 0.01). 10% XHP-medicated serum at 2.0 h significantly suppressed the formation of VM tubular structures in U251 cells under the condition of hypoxia (P < 0.01). Western blot experiment showed that 10% XHP-medicated serum significantly down-regulated the expression of HIF-1α, VEGFA, phospho-VEGFR2, VE-cadherin, EphA2 and MMP14 proteins (P < 0.05). In conclusion, XHP could inhibit the formation of VM in human glioblastoma U251 cells to suppress the angiogenesis by down-regulating the HIF-1α/VEGFA/VEGFR2 signaling pathway.

Key words

Xihuang pill / medicated serum / glioma / human glioblastoma U251 cell / vasculogenic mimicry

引用本文

张其海, 余卓伦, 樊昊雯, 潘晶, 王霞, 徐宏彬. 西黄丸下调HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路抑制脑胶质瘤细胞血管生成拟态形成的作用及其机制. 药学学报, 2023 , 58 (5) : 1256 -1266 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1016

Qi-hai ZHANG, Zhuo-lun YU, Hao-wen FAN, Jing PAN, Xia WANG, Hong-bin XU. The effect and mechanism of Xihuang pill inhibits the formation of vasculogenic mimicry in human glioblastoma cells by down-regulating HIF-1α/VEGFA/VEGFR2 signaling pathway[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (5) : 1256 -1266 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1016

正文

收起

脑胶质瘤起源于神经胶质细胞, 是较常见的高度侵袭性恶性脑肿瘤, 具有发展迅速、预后差、死亡率高等特点。临床上, 脑胶质瘤治疗主要为手术和术后辅助放化疗, 但是多数患者对传统治疗方法不敏感, 预后较差^[1-3]。目前, 脑胶质瘤的治疗策略主要包括诱导细胞凋亡和抗血管生成, 进而抑制肿瘤增殖和转移两方面。血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM) 是恶性肿瘤早期适应缺氧, 不依赖于传统血管内皮细胞的肿瘤细胞自身形态改变, 结合细胞外基质重塑形成的新型血管样结构, 这标志着肿瘤血管形成的开始。脑胶质瘤恶化过程中存在着VM形成现象, 且肿瘤恶性程度越高, VM进展越快、现象越显著^{[4, 5]}。研究表明, 低氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)/血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)/血管内皮生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2) 信号通路在促进脑胶质瘤VM形成中起重要作用, 低氧环境可上调胶质瘤细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达, 诱导VM形成^[5-11]。

西黄丸始载于《外科证治全生集》, 由牛黄、麝香、乳香、没药组成, 具有清热解毒、活血祛瘀和化结散痈之功, 临床上常用于恶性肿瘤的辅助治疗^[12]。西黄丸可改善脑胶质瘤患者的临床症状, 提高生活质量^[13]。研究表明, 西黄丸通过抑制U87细胞中丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(protein kinase B, PKB, Akt)/哺乳类动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin, mTOR)/头框转录因子O亚族1 (FOXO1) 信号通路从而促进细胞凋亡^[14]。亦有研究证明, 西黄丸及主要药味麝香和牛黄通过抑制人前列腺癌PC-3细胞中异常激活的磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt/mTOR信号通路, 促进细胞凋亡, 抑制PC-3荷瘤小鼠的皮下移植瘤生长的作用^[15]。此外, 西黄丸含药血清显著促进乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435和MCF-7细胞凋亡, 抑制细胞增殖和迁移^{[16, 17]}。

本课题组前期研究发现, 西黄丸可显著诱导U251和U87细胞凋亡, 抑制裸鼠异位移植瘤生长, 协同增强替莫唑胺的抗胶质瘤作用^[18]。然而, 西黄丸是否可通过调控HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路, 抑制脑胶质瘤细胞VM形成尚不清晰。故本文拟构建U251细胞低氧模型, 研究西黄丸含药血清调控HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路对VM形成的影响, 旨在探究西黄丸对脑胶质瘤抗血管生成治疗的作用及其机制, 为临床中西药联合抗胶质瘤血管生成提供依据。

材料与方法

收起

实验材料 西黄丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂, 批号: 19041288); CoCl₂ (美国Sigma-Aldrich公司, BCBX0741); DMEM培养基(美国Gibco公司, 8121211); 胎牛血清(中国ExCell Bio公司, 12A028); CCK-8试剂盒(上海点创生物, DC12988); 0.25%胰蛋白酶-EDTA (040921210609)、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(090921220209)、BCA试剂盒(122120210621)、钙黄绿素AM染料(01122220415)、结晶紫溶液(111621220209)、D-PBS (050122220505)、RIPA裂解液(062422220721)、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(030922220713)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(012422220623) 均购自上海碧云天生物技术有限公司; Matrigel Matrix基质胶(0281002)、Transwell小室(00721067) 均购自美国Corning公司; FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(美国BD Biosciences公司, 1324995); 预染蛋白Marker (美国Thermo公司, 01061725); Immobilon-NC转印膜(德国Millipore公司, R1NB70185); 血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA) 抗体(#ab52917)、血管内皮生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2) 抗体(#ab134191)、基质金属蛋白酶14 (matrix metalloproteinase 14, MMP14) 抗体(#ab51074)、基质金属蛋白酶2 (matrix metalloprotei-nase 2, MMP2) 抗体(#ab92536) 购自英国Abcam公司; 磷酸化血管内皮生长因子受体2 (phosphorylated-VEGFR2, p-VEGFR2) 抗体(#2478T)、血管内皮钙黏着蛋白(vascular endothelial-cadherin, VE-cadherin) 抗体(#2500T)、Eph受体酪氨酸激酶A2 (Eph receptor tyrosine kinases A2, EphA2) 抗体(#6997T)、β-肌动蛋白(beta actin, β-actin) 抗体(#3700S) 均购自美国Cell Signaling Technology公司; HIF-1α抗体(成都正能生物技术有限责任公司, #340462); 层黏连蛋白γ2 (laminin γ2) 抗体(美国Santa Cruz公司, #sc-28330); HRP goat anti-rabbit IgG (#AS014) 和HRP goat anti-mouse IgG (#AS013) 均购自武汉Abclonal公司。

Forma 3111二氧化碳培养箱、MSC-advantage 12生物安全柜(美国ThermoFisher公司); DMi8倒置荧光显微镜(德国Leica公司); HYQ-3110涡旋混匀器(美国Crystal公司); TDL-80-2B低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂); HH-ZK1电热恒温水浴锅(上海科升仪器有限公司); Infinite 200 PRO多功能酶标仪(瑞士Tecan功能); Gallios流式细胞仪(美国Beckman功能); 5200全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)。

西黄丸含药血清的制备 取西黄丸适量, 置于研钵中研磨成粉末, 加0.5% 羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium, CMC-Na) 溶液溶解成浓度为0.216 g·mL^-1西黄丸混悬液。

SPF级雄性SD大鼠(6~8周龄, 200~240 g) 购自于南京市江宁区青龙山动物繁殖场, 动物许可证号: SCXK (浙) 2019-0002, 动物实验伦理审批号: 202105A051。所有动物均分笼饲养于南京中医药大学实验动物中心SPF级饲养室, 饲养条件为: 12 h光照和12 h黑夜循环, 恒温恒湿。取36只雄性SD大鼠适应性饲养5天后, 随机分为4组, 即对照组、1.0、1.5、2.0 h组。空白组灌胃给予0.5% CMC-Na混悬液, 其余各组灌胃给予0.216 g·mL^-1的西黄丸混悬液, 给药体积为5 mL·kg^-1, 即给药剂量为1.08 g·kg^-1, 4倍临床剂量(每次3 g, 1天2次)。连续灌胃7天, 给药频率为12 h。第7天首次灌胃后, 禁食且自由饮水12 h, 分别于末次给药后0、1、1.5、2 h, 戊巴比妥钠麻醉, 打开腹腔, 腹主动脉取血, 室温静置15 min, 4 ℃、12 000 ×g离心10 min, 吸取上层血清转移至1.5 mL EP管中。将血清置于56 ℃水浴锅中灭活30 min, 0.22 μm微孔滤膜滤过, 分装保存于-80 ℃冰箱中。

细胞培养与CCK-8检测U251细胞活力 U251细胞以含有10%胎牛血清、青霉素(100 u·mL^-1)和链霉素(100 mg·mL^-1)的DMEM培养液, 培养于37 ℃、5% CO₂的培养箱中。

取对数生长期的U251细胞, 以5 000个/孔接种于96孔板中, 待细胞贴壁后, 给予含有CoCl₂ (200 μmol·L^-1) 和5%、10%、20%及40%不同时间点组含药血清(control、1.0、1.5、2.0 h) 的DMEM培养液, 作用48 h, 每孔加入CCK8溶液10 μL, 孵育1 h, 采用酶标仪记录450 nm波长处的A值, 计算相对抑制率。

细胞克隆实验 取对数生长期的U251细胞, 以1 000个/孔接种于6孔板中。待细胞贴壁后, 给予含有200μmol·L^-1 CoCl₂和10%不同时间点组含药血清(control、1.0、1.5、2.0 h) 的DMEM培养液, 另取含10%含药血清(control组) 的DMEM培养液作为空白组, 处理48 h, 更换为完全培养液继续培养14天, 每隔3天更换新鲜的培养基并观察细胞状态。吸弃旧培养基, PBS洗涤2次, 加入4%多聚甲醛溶液700 μL, 于4 ℃中固定细胞60 min。吸弃固定液, PBS洗涤2次, 每孔加入结晶紫染色液500 μL, 染色1 h, 吸弃结晶紫染色液, 超纯水洗涤3次, 晾干后计数。

细胞凋亡测定 取对数生长期的U251细胞, 以8×10⁴个/孔接种于6孔板中, 待细胞贴壁后, 同“细胞克隆实验”给药, 作用48 h。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化以收集细胞, 用旧的细胞培养液终止消化。1 000 ×g离心3 min, PBS洗涤细胞, 将细胞沉淀用1× binding buffer 200 μL重悬, 依次加入Annexin V-FITC和PI各5 μL, 混合均匀, 在室温下避光孵育15 min, 应用Gallios流式细胞仪对其进行测定, 并使用Kaluza Analysis软件分析数据。每个组设置3个复孔。

细胞周期测定 同“细胞凋亡测定”接种、给药、收集细胞。1 000 ×g离心3 min, 轻轻吸弃上清, 加入预冷的PBS 1 mL洗涤细胞, 1 000 ×g离心3 min, 轻轻吸弃上清, 用预冷的70%乙醇固定24 h。1 000 ×g离心3 min以去除固定液, 用预冷的PBS洗涤, 加入含RNase A和PI的染色液0.3 mL, 避光37 ℃孵育30 min, 应用Gallios流式细胞仪对其进行测定, 并使用Kaluza Analysis软件分析数据。每个组平行3个复孔。

细胞划痕实验 取对数生长期的U251细胞, 以1.5×10⁵个/孔接种于底部标记2条标识线的24孔板中。待细胞贴壁后, 用200 μL枪头沿直尺与标识线垂直划痕2道, PBS洗涤2次以去除脱落细胞, 同“细胞克隆实验”给药。于划痕给药后0、12、24、48 h用钙黄绿素AM染料染色标记, 采用Leica显微镜采集同一位置划痕图像, 用Image J软件测量划痕宽度。

Transwell侵袭实验 取45 μL matrigel基质胶插入碎冰中于4 ℃冰箱解冻, 用DMEM以1∶8比例稀释基质胶, 吸取稀释后基质胶50 μL均匀铺于Transwell小室上室, 置于培养箱中凝胶30 min。取对数生长期的U251细胞, 饥饿培养24 h, 用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化以收集细胞, 1 000 ×g离心3 min, 用DMEM培养液重悬细胞, 调整细胞数至每毫升6×10⁵个。吸取该细胞悬液100 μL加入Transwell小室。同“细胞克隆实验”给药, 作用48 h。取出Transwell小室, 吸弃培养液, D-PBS洗涤2次, 加入4%多聚甲醛溶液800 μL, 室温固定30 min, 将小室适当晾干, 加入结晶紫染色液800 μL, 室温染色30 min, 再用D-PBS洗涤3次, 用棉签轻轻擦去上层未迁移细胞并晾干, 采用Leica显微镜于100倍镜下随机采集5个视野观察细胞并计数。

3D细胞培养下血管生成拟态 将Matrigel基质胶插入碎冰中于4 ℃冰箱解冻, 以每孔250 μL均匀铺于24孔板中, 于培养箱中凝胶30 min。收集对数生长期细胞, 用含200 μmol·L^-1 CoCl₂的DMEM培养液重悬细胞, 调整细胞密度至每毫升1.6×10⁵个细胞, 吸取该细胞悬液500 μL加入24孔板中。另取含10%含药血清(control组) 的DMEM培养液替换作为常氧对照组。待培养24 h后, 24孔板中用含200 μmol·L^-1 CoCl₂及10%不同时间点含药血清(control和2.0 h) 的DMEM培养液500 μL替换。于给药后0、1、3、6、12 h, 采用Leica显微镜于50倍镜下随机采集5个视野下的VM结构并计数。

蛋白印迹法检测蛋白表达 取对数生长期的U251细胞, 以3×10⁵个/孔接种于6孔板中, 待细胞贴壁后, 同“细胞克隆实验”给药, 处理48 h。用PBS溶液洗涤3次, 加入适量细胞裂解液(含1 mmol·L^-1蛋白酶抑制剂和1 mmol·L^-1磷酸酶抑制剂), 冰上裂解30 min, 于4 ℃下13 000 ×g离心10 min, 吸取上清溶液转移至1.5 mL离心管中, BCA法测定蛋白浓度并加入适量loading buffer, 混合均匀, 95 ℃加热10 min, 放冷后, 分装保存于-20 ℃冰箱中。

使用8%~12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) 恒压电泳分离上清液中的蛋白, 采用湿转法恒流将其转印到硝酸纤维素(NC) 膜上, 5% BSA封闭1 h后, 分别以HIF-1α (1∶1 000)、VEGFA (1∶5 000)、VEGFR2 (1∶2 000)、p-VEGFR2 (1∶1 000)、VE-cadherin (1∶1 000)、EphA2 (1∶1 000)、MMP14 (1∶5 000)、MMP2 (1∶2 000)、laminin γ2 (1∶100)、β-actin (1∶1 000) 抗体于4 ℃孵育过夜, 再与相对应的二抗(1∶5 000) 室温孵育1 h。应用超敏ECL化学发光液于Tanon-5200成像系统中可视化印迹条带, 并运用Image J软件进行量化。

统计学分析 采用GraphPad 8.0统计学软件对实验结果进行统计学分析。计量资料以x± s表示。各组分别与低氧对照组进行单因素方差分析, 以P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

收起

1 西黄丸含药血清对U251细胞活力及增殖的影响

低氧状态下, 不同时间点西黄丸含药血清及其不同百分比含量作用U251细胞48 h的细胞活力测定结果如图 1A所示。结果显示, 当含药血清浓度为5%时, 1.0 h组西黄丸含药血清可以抑制U251细胞活力(P < 0.05）。当含药血清浓度为10%时, 1.5和2.0 h西黄丸含药血清可以抑制U251细胞活力(P < 0.01); 其中, 2.0 h西黄丸含药血清对U251细胞的抑制作用最强, 为93.2% ± 3.6%。故选用10%含药血清作用U251细胞48 h为条件进一步探究其作用机制。

低氧状态下, 10%不同时间点西黄丸含药血清作用U251细胞48 h的克隆增殖测定结果如图 1B、C所示。结果显示, 与对照组相比, 低氧对U251细胞增殖有抑制作用(P < 0.01); 与低氧模型组相比, 1.5和2.0 h西黄丸含药血清对U251细胞增殖呈下调趋势, 但无统计学差异。结果表明, 西黄丸含药血清对U251细胞活力及增殖影响作用较小。

2 西黄丸含药血清对U251细胞凋亡及周期的影响

低氧状态下, 不同时间点西黄丸含药血清对U251细胞凋亡和细胞周期的影响结果如图 2所示。结果显示, 对照组细胞形态正常, 几乎无凋亡和坏死细胞。CoCl₂低氧对U251细胞凋亡及细胞周期几无影响。给予浓度为10%的1.0、1.5和2.0 h时间点西黄丸含药血清处理48 h后, U251细胞的总凋亡率分别为2.23%、2.69%和3.94%, 且G1期的细胞数量分别从46.2%增加到47.0%、48.8%和52.9%。与低氧模型组相比, 1.5和2.0 h组西黄丸含药血清能提高U251细胞总凋亡率(P < 0.01)。其中, 2.0 h组西黄丸含药血清能提高细胞晚期凋亡水平(P < 0.01), 并使细胞增殖阻滞在G1期(P < 0.01)。结果表明, 西黄丸含药血清对U251细胞凋亡及细胞周期影响较小。

3 西黄丸含药血清对U251细胞迁移及侵袭能力的影响

低氧状态下, 10%不同时间点西黄丸含药血清作用U251细胞48 h的细胞迁移能力测定结果如图 3A、B所示。结果显示, 与对照组相比, 当划痕48 h时, 低氧对U251细胞迁移能力有显著的诱导作用(P < 0.01)。与低氧模型组相比, 当划痕24 h时, 1.5和2.0 h西黄丸含药血清显著抑制了U251细胞的迁移能力(P < 0.01); 当划痕48 h时, 1.0、1.5和2.0 h西黄丸含药血清均对U251细胞的迁移能力有显著的抑制作用(P < 0.01)。

低氧状态下, 10%不同时间点西黄丸含药血清作用U251细胞48 h的细胞侵袭能力测定结果如图 3A、C所示。结果显示, 与对照组相比, 低氧对U251细胞侵袭能力有显著的抑制作用(P < 0.01); 与低氧模型组相比, 1.0、1.5和2.0 h西黄丸含药血清均显著抑制了U251的侵袭能力(P < 0.01)。

结果表明, 西黄丸含药血清可显著抑制U251细胞的迁移与侵袭能力, 抑制U251细胞转移。

4 西黄丸含药血清对U251细胞VM形成的影响

低氧状态下, 10% 2.0 h西黄丸含药血清对U251细胞中VM形成影响结果如图 4所示。结果显示, 与常氧对照组相比, 低氧模型组所形成的VM结构数量显著增加(P < 0.01), 表明低氧环境能显著促进U251细胞中VM形成。与低氧模型组相比, 2.0 h西黄丸含药血清作用1、3、6和12 h后均显著抑制了U251细胞VM形成(P < 0.01), 促使基质胶中已形成的VM管网样结构断裂溃散并使形成VM结构的U251细胞皱缩成团直至死亡。结果表明, 西黄丸含药血清可显著抑制U251细胞中VM形成。

5 西黄丸含药血清对U251细胞中HIF-1α/VEGFA/VEGFR2通路相关蛋白的影响

如图 5所示, 低氧显著上调U251细胞中HIF-1α和VEGF蛋白表达(P < 0.01)。给予10%不同时间点西黄丸含药血清处理48 h后, 细胞中HIF-1α和VEGFA蛋白表达显著下调。

如图 6所示, 低氧对U251细胞中VEGFR2和p-VEGFR2蛋白表达无明显影响。给予10%不同时间点西黄丸含药血清处理48 h后, 含药血清对细胞中VEGFR2蛋白表达无明显影响; 1.5和2.0 h组西黄丸含药血清显著下调细胞中p-VEGFR2蛋白的表达(P < 0.05)。

如图 7所示, 低氧显著上调U251细胞中VE-cadherin、MMP14、laminin γ2蛋白表达(P < 0.05)。给予10%不同时间点西黄丸含药血清处理48 h后, 1.0 h组西黄丸含药血清显著上调细胞中EphA2蛋白的表达(P < 0.05); 1.5 h组西黄丸含药血清显著下调细胞中VE-cadherin (P < 0.01)、EphA2 (P < 0.05)、MMP14 (P < 0.05) 蛋白的表达; 2.0 h组西黄丸含药血清显著下调了细胞中MMP14蛋白的表达(P < 0.05); 而与低氧模型组相比, 西黄丸含药血清对细胞中active-MMP2/pro-MMP2比值和laminin γ2表达无明显影响。结果表明, 西黄丸含药血清可能通过调节U251细胞中HIF-1α/VEGFA/VEGFR2通路相关蛋白, 抑制VM形成从而发挥抗胶质瘤作用。

讨论

收起

在前期研究结果基础上, 本研究确定西黄丸含药血清作用48 h为后续给药时间。CCK-8、细胞克隆、细胞凋亡和细胞周期测定结果显示, 西黄丸含药血清对U251细胞的活力、增殖、凋亡与周期影响较小。

划痕愈合与Transwell侵袭实验结果表明, 西黄丸含药血清对U251细胞的迁移与侵袭能力有显著抑制作用; 3D细胞培养下血管生成拟态实验结果表明2.0 h组西黄丸含药血清对U251细胞VM形成有显著抑制作用, 能破坏基质胶中已形成VM结构并促使形成VM的U251细胞皱缩成团; 可见西黄丸含药血清对脑胶质瘤的转移与侵袭能力有一定的抑制作用。研究^{[19, 20]}表明低氧环境下, 肿瘤细胞侵袭和运动性增强。然而本研究中, CoCl₂诱导的低氧环境下U251细胞的侵袭能力相较于常氧环境低, 侵袭细胞数减少, 推测其原因可能为本研究选用化学诱导剂CoCl₂诱导低氧, 短时间内对细胞产生一定的损伤(预实验选取了200μmol·L^-1 CoCl₂, 细胞增殖抑制率为7.56%), 在低氧初期细胞侵袭能力有所降低。后续将采用低氧工作站对此进行进一步验证。

Western blot实验结果表明, 西黄丸含药血清对U251细胞中VM形成的抑制作用与下调HIF-1α、VEGFA、p-VEGFR2、VE-cadherin、EphA2、MMP14等蛋白表达存在密切关系。研究表明, HIF-1α/VEGF通路可以介导VM形成, 是导致脑胶质瘤患者治疗过程中抗血管生成方面治疗效果不佳的重要机制^{[5, 21, 22]}。Duan^[5]研究中发现低氧增加人脑胶质瘤U87细胞中HIF-1α、VEGF表达和诱导VM形成。Jiang等^[6]研究也证明低氧增加人脑胶质瘤T98G细胞和原代培养人脑胶质瘤干细胞中HIF-1、VEGFA、p-VEGFR2表达和诱导VM形成。HIF-1是介导肿瘤细胞对低氧微环境进行适应性反应的关键性转录调控因子, 是肿瘤微血管形成机制中的“中枢”。HIF-1由一个α和β亚单位组成; 低氧微环境下, 细胞内低氧感应器脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase, PHD) 活性降低, HIF-1α羟基化受阻, 允许HIF-1α逃避p-VHL蛋白(von Hippel-Lindau protein) 介导的泛素化降解, 胞浆内HIF-1α积聚并转移入核, 与HIF-1β结合形成异二聚体, 随后与靶基因缺氧反应元件结合, 激活靶基因。VEGF是促进肿瘤VM和血管生成的关键调节因子, 也是HIF-1调控的重要靶基因。VEGF家族主要分为VEGFA、-B、-C、-D以及胎盘生长因子(placenta growth factor, PIGF) 等亚型; 其中, VEGFA在血管形成中发挥重要作用。VEGFs通过与其受体VEGFRs结合后, 胞内激酶区构象改变, 产生激酶活性催化底物蛋白磷酸化, 最终通过信号级联反应产生生物效应; 其中, HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路在促进脑胶质瘤VM形成中起重要作用^[6-11]。Yao等^[7]研究发现, 脑胶质瘤干细胞样细胞中VEGFR2、VE-cadherin、EphA2表达增高, VM形成明显增加。有研究表明, VE-cadherin、EphA2、MMP14、MMP2及laminin5γ2与VM形成密切相关^[22-25]。VE-cadherin激活MMPs是VM形成的关键通路^[22]。MMPs涉及多种促进肿瘤进展的机制, MMP2和MMP14被发现与肿瘤VM形成密切相关, MMP2对细胞外基质有强烈的蛋白水解作用, MMP14通过与金属蛋白酶组织抑制因子2形成复合体, 激活前体MMP2促进IV胶原降解。VM形成起始阶段, 侵袭的癌细胞可能失去细胞间黏附, 其运动性增加并分泌MMPs溶解基底膜^{[26, 27]}。同时, MMPs将laminin5γ2分割成γ2′和γ2x, 是VM形成的最终步骤^[22]。在本研究中, 西黄丸含药血清对细胞中VEGFR2、lamininγ2蛋白表达和active-MMP2/pro-MMP2比值有一定下调作用, 但无统计学差异, 研究结果与以上研究结果相符。

低氧模型组部分通路蛋白相较于常氧对照组未能上调, 其可能原因为文献^{[4, 6, 25]}采用低氧工作站造模, 本研究选择化学诱导剂CoCl₂ (200 μmol·L^-1) 建立低氧模型, 两种造模方法不同。CoCl₂造模条件下, 低氧环境显著上调HIF-1α、VEGFA、VE-cadherin、MMP14及laminin γ2等蛋白表达, VEGFR2和EphA2蛋白表达有一定上调趋势, 但对p-VEGFR2和active-MMP2/pro-MMP2比例几无影响。Yao等^[7]研究发现, 低氧状态下, 胶质瘤细胞VEGFR2蛋白表达显著上调, 促进VM形成。Jiang等^[6]研究进一步发现人脑胶质瘤T98G细胞在低氧环境中, p-VEGFR2蛋白表达显著增加。然而, 近期McClellan等^[28]研究表明与常氧组相比, 低氧组p-VEGFR2蛋白表达量无明显变化。本研究中, 低氧状态上调VEGFR2蛋白表达, 促进VM形成, 但未上调p-VEGFR2蛋白, 与文献^[28]报道相一致, 推测在化学诱导剂CoCl₂建立的低氧模型中, VEGFR2蛋白表达上调, 但对p-VEGFR2蛋白表达影响较小, 其具体作用机制仍需要进一步研究。Zhang等^[29]研究中探究了不同浓度CoCl₂模拟缺氧对HK2、786-0和HMEC-1细胞中MMPs表达水平的影响, HMEC-1细胞中MMP2表达量随CoCl₂浓度增加呈剂量依赖性降低。在本研究中, 低氧状态仅轻微下调active-MMP2/pro-MMP2比例, 无统计学差异, 与文献^[29]报道存在差异, 推测在化学诱导剂CoCl₂建立的低氧模型中, MMP2表达量变化与具体细胞系相关, 后续将在脑胶质瘤U87细胞系中进一步探究。

综上所述, 西黄丸含药血清可以抑制HIF-1α/VEGFA/VEGFR2通路, 下调该通路主要活性蛋白表达, 抑制U251细胞的迁移与侵袭能力从而发挥抗脑胶质瘤VM形成的作用。本文是基于体外实验研究西黄丸抗脑胶质瘤VM形成的作用及其机制, 存在一定的局限性, 后续将继续开展体内实验, 为该作用机制提供更可靠的支撑。同时, 本研究将对西黄丸含药血清中具体发挥药理作用的成分及含量进行测定, 丰富其物质理论基础。目前, 已完成其主要成分没药中单体成分没药甾酮对VM形成影响的探究。

作者贡献: 徐宏彬、王霞负责实验设计、论文修改, 提供了方法理论支持和建议; 张其海完成实验数据、论文写作与修改; 余卓伦、樊昊雯、潘晶帮助完成实验数据及分析。

利益冲突: 本文作者均声明不存在利益冲突。

基金

收起

江苏省卫生健康委医学科研重点项目(ZD2021031)
2021年江苏省研究生培养创新工程研究生科研与实践创新计划(SJCX21_0671)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

, Wang

, Wan

, et al . Effects of tetrandrine on prolife-ration, migration, and invasion of glioblastoma cells[J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2021, 46: 6520-6529.

[2]

Moen

. Bevacizumab: in previously treated glioblastoma[J]. Drugs, 2010, 70: 181-189.

https://doi.org/10.2165/11203890-000000000-00000

[3]

Jiang

, Nam

, Ram

, et al . Clinical practice guidelines for the management of adult diffuse gliomas[J]. Cancer Lett, 2021, 499: 60-72.

https://doi.org/10.1016/j.canlet.2020.10.050

[4]

Huang

, Ke

, Sun

, et al . Mammalian target of rapamycin signaling is involved in the vasculogenic mimicry of glioma via hypoxia-inducible factor-1α[J]. Oncol Rep, 2014, 32: 1973-1980.

https://doi.org/10.3892/or.2014.3454

[5]

Duan

. Silencing the autophagy-specific gene Beclin-1 contri-butes to attenuated hypoxia-induced vasculogenic mimicry formation in glioma[J]. Cancer Biomark, 2018, 21: 565-574.

https://doi.org/10.3233/CBM-170444

[6]

Jiang

, Zhou

, Zou

, et al . Overexpression of Limb-Budand heart (LBH) promotes angiogenesis in human glioma via VEGFA-mediated ERK signaling under hypoxia[J]. EBioMedicine, 2019, 48: 36-48.

https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.09.037

[7]

Yao

, Ping

, Liu

, et al . Vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) plays a key role in vasculogenic mimicry formation, neovascularization and tumor initiation by glioma stem-like cells[J]. PLoS One, 2013, 8: e57188.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057188

[8]

Wechman

, Emdad

, Sarkar

, et al . Vascular mimicry: triggers, molecular interactions and in vivo models[J]. Adv Cancer Res, 2020, 148: 27-67. http://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32723566/

[9]

Masoud

, Li

. HIF-1α pathway: role, regulation and intervention for cancer therapy[J]. Acta Pharm Sin B, 2015, 5: 378-389.

https://doi.org/10.1016/j.apsb.2015.05.007

[10]

Gonzalez

, Xie

, Jiang

. The role of hypoxia-inducible factors in metabolic diseases[J]. Nat Rev Endocrinol, 2018, 15: 21-32. http://www.onacademic.com/detail/journal_1000040865042510_0708.html

[11]

Shi

, Liu

, Qu

, et al . Research progress of anti-tumor components of traditional Chinese medicine inhibiting the expression of HIF-1alpha[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2021, 56: 2689-2719.

[12]

Yang

, Zeng

, Chen

, et al . Anti-tumor application and pharmacological mechanism of Xihuangwan: a review[J]. Chin J Exp Tradit Med Form (中国实验方剂学杂志), 2022, 28: 250-258.

[13]

Fan

. One case of brain stem glioma treated by syndrome differentiation of TCM and Xihuangwan[J]. China J Tradit Chin Med Pharm (中华中医药杂志), 2010, 25: 245-248. http://www.cabdirect.org/abstracts/20103064440.html

[14]

Meng

, He

, Yin

, et al . Xihuang pill induces apoptosis of human glioblastoma U-87 MG cells via targeting ROS-mediated Akt/mTOR/FOXO1 pathway[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2018, 2018: 6049498. http://www.socolar.com/Article/Index?aid=100035927364&jid=100000008482

[15]

Long

, Wu

, Guo

, et al . Xihuang pills and its main components inhibit PI3K/Akt/mTOR signaling pathways and promote the apoptosis of prostate cancer cells in PC-3 tumor-bearing mice[J]. Natl J Androl (中华男科学杂志), 2021, 27: 340-346.

[16]

, Wang

, Zhang

, et al . Effects of Xihuang pills containing serum on the proliferation, apoptosis and migration of triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231[J]. China J Tradit Chin Med Pharm (中华中医药杂志), 2021, 36: 463-466.

[17]

, Li

, Chen

, et al . Effect of serum containing Xihuang pill on proliferation of human breast cancer cell line MDA-MB-435 and MCF-7 cells[J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43: 2784-2788. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30111032

[18]

, Zhu

, Xu

, et al . Xihuang pill potentiates the anti-tumor effects of temozolomide in glioblastoma xenografts through the Akt/mTOR-dependent pathway[J]. J Ethnopharmacol, 2020, 261: 113071.

https://doi.org/10.1016/j.jep.2020.113071

[19]

Muoz-Nájar

, Neurath

, Vumbaca

, et al . Hypoxia stimulates breast carcinoma cell invasion through MT1-MMP and MMP-2 activation[J]. Oncogene, 2006, 25: 2379-2392.

https://doi.org/10.1038/sj.onc.1209273

[20]

Monteiro

, Hill

, Pilkington

, et al . The role of hypoxia in glioblastoma invasion[J]. Cells, 2017, 6: 45.

https://doi.org/10.3390/cells6040045

[21]

Yang

, Liao

, Mai

, et al . Tumor vasculogenic mimicry predicts poor prognosis in cancer patients: a meta-analysis: a meta-analysis[J]. Angiogenesis, 2016, 19: 191-200.

https://doi.org/10.1007/s10456-016-9500-2

[22]

Wei

, Chen

, Jiang

, et al . Mechanisms of vasculogenic mimicry in hypoxic tumor microenvironments[J]. Mol Cancer, 2021, 20: 7.

https://doi.org/10.1186/s12943-020-01288-1

[23]

Zhang

, Nong

, Chen

, et al . Baicalein suppresses vasculogenic mimicry through inhibiting RhoA/ROCK expression in lung cancer A549 cell line[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2020, 52: 1007-1015.

https://doi.org/10.1093/abbs/gmaa075

[24]

Xiang

, Lin

, Ma

, et al . Vasculogenic mimicry formation in EBV-associated epithelial malignancies[J]. Nat Commun, 2018, 9: 5009.

https://doi.org/10.1038/s41467-018-07308-5

[25]

Pulford

, Mcevoy

, Hocking

, et al . The effect of aquaporin 1-inhibition on vasculogenic mimicry in malignant mesothelioma[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18: e2293.

https://doi.org/10.3390/ijms18112293

[26]

, Wu

, Zhou

, et al . Canstatin represses glioma growth by inhibiting formation of VM-like structures[J]. Transl Neurosci, 2021, 12: 309-319.

https://doi.org/10.1515/tnsci-2020-0176

[27]

Cheng

, Wang

, Cai

, et al . CD276 promotes vasculogenic mimicry formation in hepatocellular carcinoma via the PI3K/Akt/MMPs pathway[J]. Onco Targets Ther, 2020, 13: 11485-11498.

https://doi.org/10.2147/OTT.S271891

[28]

McClellan

, Wang

, Albertine

, et al . l-Citrulline treatment alters the structure of the pulmonary circulation in hypoxic newborn pigs[J]. Pediatr Pulmonol, 2020, 55: 2762-2772.

https://doi.org/10.1002/ppul.24960

[29]

Zhang

, Chen

. Effects of CoCl₂-simulated hypoxia on the expression levels of matrix metalloproteinases in renal adenocarcinoma cells and renal tubular epithelial cells[J]. Exp Ther Med, 2018, 16: 1454-1460. http://www.researchgate.net/publication/325906939_Effects_of_CoCl2-simulated_hypoxia_on_the_expression_levels_of_matrix_metalloproteinases_in_renal_adenocarcinoma_cells_and_renal_tubular_epithelial_cells

2023年第58卷第5期

PDF下载

142

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1016

接收时间：2022-08-24
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-05-12

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2022-08-24
修回日期：2022-12-29

基金

江苏省卫生健康委医学科研重点项目(ZD2021031)

2021年江苏省研究生培养创新工程研究生科研与实践创新计划(SJCX21_0671)

作者信息

1.南京中医药大学第二附属医院, 江苏南京 210017

2.南京中医药大学第二附属医院 (江苏省第二中医院)

通讯作者:

*王霞,Tel: 86-25-83291119, E-mail: 20113065@njucm.edu.cn;

徐宏彬,Tel: 86-25-83292443, E-mail: jiang_rh@126.com

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2022-1016

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT