药学学报

预防高原睡眠障碍的鼠李糖乳杆菌-枸杞多糖合生制剂研究

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牛红 ¹^,² , 吴艳萍 ¹^,² , 杜丽娜 ¹^,²^,^* , 金义光 ²

药学学报 | 专题报道: 基于工程化细菌的活体生物药 2025,60(5): 1252-1261

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药学学报 | 专题报道: 基于工程化细菌的活体生物药 2025, 60(5): 1252-1261

预防高原睡眠障碍的鼠李糖乳杆菌-枸杞多糖合生制剂研究

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牛红¹^,², 吴艳萍¹^,², 杜丽娜¹^,²^,^*, 金义光²

作者信息

1.山东中医药大学药学院, 山东济南 250355

2.军事科学院军事医学研究院, 北京 100850

通讯作者:

^*杜丽娜, Tel: 86-10-66930216, E-mail: dulina@188.com

Synbiotics formulation of Lactobacillus rhamnosus-Lycium barbarum polysaccharide for the prevention of high-altitude sleep disturbance

Hong NIU¹^,², Yan-ping WU¹^,², Li-na DU¹^,²^,^*, Yi-guang JIN²

Affiliations

1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

2. Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Science, Beijing 100850, China

出版时间: 2025-05-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0722

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摘要

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高原睡眠障碍是常见的急性高原疾病, 可引发急性高原反应等生理不适, 临床缺少安全、高效的预防药物。本研究基于肠-脑轴理论, 设计并制备了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus, LGG) -枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP) 合生制剂。首先, 制备并评价LGG-LBP合生制剂, 受试小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药乙酰唑胺组、LGG组、LBP组、LGG-LBP合生制剂组, 连续灌胃7天后, 采用小动物低压氧舱建立高原睡眠障碍小鼠模型。通过睡眠翻正反射实验、旷场实验、新物体识别实验、外周血细胞水平、血清炎症因子、粪便菌群检测及小肠病理切片, 评价合生制剂的药效。在高原睡眠障碍小鼠模型中, 小鼠提前口服合生制剂可明显改善高海拔环境下的相关表现, 包括延长睡眠时间、提高自主探索能力和短期记忆能力、促进血细胞恢复、降低肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 水平。此外, 该合生制剂还能增加肠道菌群丰度, 改善小肠结构, 减少肠道炎症。LGG-LBP合生制剂可能是潜在的预防高原睡眠障碍的有效药物。动物实验经军事科学院军事医学研究院伦理委员会批准, 且实验均按相关指导原则和规定进行, 批准号: IACUC-DWZX-2022-511。

关键词

高原睡眠障碍 / 鼠李糖乳杆菌 / 枸杞多糖 / 合生制剂 / 肠-脑轴

Abstract

收起

High-altitude sleep disturbance is a common acute high-altitude disease that can trigger physiological discomfort such as acute high-altitude reactions, with a lack of safe and effective preventive medications in clinical practice. Based on the gut-brain axis theory, this study designed and prepared a synbiotics combining Lactobacillus rhamnosus (LGG)-Lycium barbarum polysaccharide (LBP). First, the LGG-LBP synbiotics was prepared and evaluated. The mice were randomly divided into healthy, model, positive control (acetazolamide), LBP, LGG and LGG-LBP synbiotics group. After 7 days of administration, the mouse model of high-altitude sleep disturbance was established, the treating effects were evaluated through sleep duration, behavioral, hemogram test, and the content of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in blood. 16S rRNA sequencing was used to analyze the changes of gut microbiota, and the pathological changes of small intestine were observed. The LGG-LBP synbiotics prolonged sleep duration, improved exploratory ability and short-term memory, promoted blood cell recovery. Moreover, LGG-LBP synbiotics enhanced the abundance of probiotics in the gut, and reduced intestinal inflammation. LGG-LBP synbiotics may be a potential prophylactic drug for high-altitude sleep disturbance. The animal operation was approved by the Ethics Committee of the Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Science (Approval number: IACUC-DWZX-2022-511). All experiments were conducted in accordance with relevant guidelines and regulations.

Key words

high-altitude sleep disturbance / Lactobacillus rhamnosus / Lycium barbarum polysaccharide / synbiotics / gut-brain axis

引用本文

牛红, 吴艳萍, 杜丽娜, 金义光. 预防高原睡眠障碍的鼠李糖乳杆菌-枸杞多糖合生制剂研究. 药学学报, 2025 , 60 (5) : 1252 -1261 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0722

Hong NIU, Yan-ping WU, Li-na DU, Yi-guang JIN. Synbiotics formulation of Lactobacillus rhamnosus-Lycium barbarum polysaccharide for the prevention of high-altitude sleep disturbance[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2025 , 60 (5) : 1252 -1261 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0722

正文

收起

高原是陆地重要组成部分, 我国约1/3国土面积为高原地区。随着越来越多人群在高海拔地区开展科研、旅游、军事等活动, 低氧、低压等高原极端环境对人体机能的影响引起广泛关注, 包括呼吸功能^[1]、睡眠障碍等^[2]。其中睡眠障碍已成为急进高原人群的常见问题, 也是导致急性高原反应的直接诱因^{[3, 4]}。由于低氧导致的低质量睡眠会加剧急性高原疾病的发病, 并加重焦虑、抑郁和其他负面情绪^[5], 导致感知、学习、记忆、警觉能力衰退, 甚至认知功能障碍^[6-8], 严重影响工作、学习、生活。目前, 防治高原睡眠障碍的主要手段是药物防治, 但现有药物不良反应较大。如乙酰唑胺具有头痛、恶心、过敏等不良反应, 且有引发Stevens-Johnson综合症的风险^{[9, 10]}。对睡眠障碍而言, 预防比治疗更有意义, 因此亟需研发新的高效、安全高原睡眠障碍预防用药。

脑和肠道环境之间存在着密切联系^{[11, 12]}, 涉及免疫系统、内分泌系统、神经系统和肠道微生物^[13-15]。肠-脑轴的双向调节可能是睡眠和肠道微生物群相互作用的基础, 可直接或间接地参与调节睡眠行为, 并可能在睡眠障碍的病因和发病机制中发挥关键作用^{[16, 17]}。短睡眠者的肠道微生物组成与正常睡眠者不同^[18], 因此, 肠道微生物群可能是防治高原睡眠障碍的一个重要靶点。

益生菌是有益于宿主健康的活性微生物, 具有维持肠道内环境稳态、抑制有害菌生长、调节肠道微生物组成、增强机体免疫力等作用^{[19, 20]}。高原特殊低氧环境可以改变肠道微生物群落的组成^{[21, 22]}。本课题组前期研究发现, 高原低氧条件下发生睡眠障碍的小鼠肠道内乳杆菌属水平降低^[23]。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus, LGG) 是研究较为广泛的益生菌菌株之一, 是能产生短链脂肪酸的益生菌, 可进入人体肠道, 维持肠道健康, 改善机体免疫功能和抗氧化能力, 对抑郁、焦虑等精神疾病有一定治疗作用^[24]。

多糖作为一种丰富的天然产物, 是影响肠道菌群丰度和代谢的益生元, 主要通过促进肠道益生菌增殖、增加益生菌丰度对肠道菌群产生影响^[25]。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP) 是从枸杞成熟果实中提取的活性成分, 是良好的益生元, 可以被肠道菌群代谢产生短链脂肪酸等益生物质, 调节肠道菌群^[26], 刺激有益菌生长, 提高有益菌水平, 丰富肠道菌群多样性, 改善肠道生态失调^[27], 且具有抗炎、抗氧化作用等多种药理学功效^[28-30]。海藻酸钠(sodium alginate, SA) 是一种从海藻中提取的天然多糖, 将其与CaCl₂反应生成凝胶包裹LGG, 可增加LGG对胃液的耐受性, 有利于LGG到达肠道, 调节肠道菌群, 增强肠道菌群丰度。本研究以肠道菌群作为治疗靶点将LBP与LGG联合制备成合生制剂口服凝胶, LBP可以为LGG提供营养物质, 二者协同通过改善肠道, 调节肠道菌群, 发挥预防高原睡眠障碍的作用, 具有安全、高效的特点。因此, 本研究将LGG-LBP联合制备得到合生制剂, 在高原睡眠障碍小鼠模型上评价了其对高原睡眠障碍的预防作用(图 1)。

材料与方法

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菌株鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillus rhamnosus, BNCC 134266), 购于北京北纳创联生物技术研究院。

实验动物 C57BL/6J小鼠, SPF级, 健康雄性, 体重21~23 g, 购于北京维通利华实验动物技术有限公司, 许可证号: SCXK (京) 2021-006。动物实验经军事科学院军事医学研究院伦理委员会批准, 且实验均按相关指导原则和规定进行, 批准号: IACUC-DWZX-2022-511。

药物与试剂 MRS培养基(批号: 715J031)、枸杞多糖(批号: 2230815002)、维生素B₁ (批号: 827S036) 和酪蛋氨基酸(批号: 1029M032) 购于北京索莱宝科技有限公司; 琼脂(批号: EZ7890D190) 购于赛国生物科技有限公司; 磷酸二氢钾(批号: 20210418)、磷酸氢二钾(批号: 20150828)、磷酸二氢铵(批号: F20080314)、硫酸镁(批号: 20140822)、葡萄糖(glucose, GLU, 批号: 20131025) 购于国药集团化学试剂有限公司; 海藻酸钠(批号: C13225218) 购于上海麦克林生化科技股份有限公司; 氯化钙(批号: 1911272) 购于西陇科学股份有限公司; 乙酰唑胺(批号: L07562) 购于Alfa试剂有限公司; 小鼠诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 检测试剂盒(批号: 221486B)、小鼠肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 检测试剂盒(批号: 220852B) 购于南京博研生物科技有限公司。

仪器超净台(YT-CJ-2D, 北京亚太科隆仪器技术有限公司); 倒置光学显微镜(BDS400, 重庆奥特光学有限公司); 旷场实验箱(ZS-Lab Maz-Ⅲ)、旷场视频分析系统(ZS-001) 北京众实迪创科技发展有限责任公司); 冷冻干燥机(LGJ-30F, 北京松源华兴科技有限公司); 酶标仪(Biotek EL×800, 美国Biotek instruments公司); 全自动血细胞分析仪(MEK-7222K, 日本光电株式会社); 扫描电镜(Hatachi SU 8010, 日本日立株式会社); 小动物低压氧舱(Pro Ox-830, 上海塔望智能科技有限公司); 细菌培养箱(MF250A, 浙江华盛源仪器有限公司)。

LGG培养及生长曲线的建立 配制MRS肉汤培养基(每100 mL中含有MRS肉汤4.83 g), 121 ℃高压灭菌20 min, 冷却待用。LGG菌种从-80 ℃取出后在37 ℃下融化, 振摇均匀后取菌液200 μL加入含有10 mL液体培养基的无菌离心管中, 转移至厌氧培养袋, 37 ℃恒温静置培养48 h。

将培养后的LGG菌液用PBS分别按照1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9 (v/v) 进行稀释, 稀释好的样品分别取200 μL置于96孔板中, 测定其在600 nm处的光密度(optical density, OD) 值。此外, 稀释好的样品分别利用细菌计数仪进行计数, 依据所测OD值与细菌数绘制LGG生长曲线。

LGG在不同培养基中的生长 取28 mmol·L^-1磷酸二氢钾、28 mmol·L^-1磷酸氢二钾、16 mmol·L^-1磷酸二氢铵、1 mmol·L^-1硫酸镁、0.1%酪蛋白氨基酸(w/v)、1%维生素(w/v)、1%矿物质溶液(v/v) 混合均匀, 配制无碳源培养基, 灭菌备用。取无碳源培养基分别加入GLU和LBP, 配制2%葡萄糖培养基(w/v)、2% LBP培养基(w/v), 除菌备用。3组培养基分别加入定量的LGG菌液, 置于厌氧培养袋内, 37 ℃恒温培养, 分别于12、24、36 h取菌液测定其在600 nm处的OD值, 计算细菌数, 通过检测LGG在不同培养基中的生长数目, 考察LBP对LGG的益生作用。

合生制剂的制备 取50 mL LGG菌液, 用PBS重悬至10 mL, 0.1 g SA、0.2 g LBP溶于其中, 搅拌下缓慢滴入1 mL 1% CaCl₂溶液(w/v) 中, 搅拌均匀至形成凝胶状, 备用。采用1.0 mL注射器考察SA凝胶的可注射性。

SA凝胶合生制剂对胃肠环境的耐受实验 口服益生菌的一大难题在于无法耐受胃肠道环境, 极大限制了益生菌的活菌数量, 从而影响了治疗效果。将载LGG的合生制剂与人工胃液(simulated gastric fluids, SGF) 和人工小肠液(simulated intestine fluids, SIF) 共孵育, 评价合生制剂对益生菌的保护作用。分别取A、B、C共3管各加200 μL菌液离心, A管中LGG用SA凝胶包裹(LGG@SA gel, LSG), B、C管用无菌PBS重悬。分别取A、B管中各100 μL悬液, 置于SGF中, 同时将A、B放入37 ℃培养箱厌氧孵育1.5 h, 无菌PBS洗涤2次; 转移到SIF中孵育3 h, 孵育结束后离心洗涤; 无菌PBS重悬, 各取200 μL菌液涂布于MRS固体培养板中; 取C管悬液加入PBS作平行对照。通过平板菌落生长情况评价合生制剂对胃酸的耐受性。

SA凝胶合生制剂体外释放模拟实验 将凝胶分别置于SGF、SIF和人工结肠液(simulated colon fluids, SCF) 中(v/v = 1∶10), 在37 ℃培养箱中以80 r·min^-1的速度振荡培养, 每隔0.5 h取样200 μL, 测定其在600 nm处的OD值。

合生制剂的内部形态表征 将合生制剂在液氮中进行脆断, 切出横截面样品, 冷冻干燥; 将样品用黑色导电胶带固定在样品台上, 喷金后, 采用扫描电镜在5 kV条件下观察凝胶内部形态。

分组和建模 C57BL/6J小鼠适应性饲养4天后随机分为6组, 正常组(Healthy, 生理盐水0.2 mL·d^-1)、模型组(Model, 生理盐水0.2 mL·d^-1)、合生制剂组(Synbiotics, 0.2 mL·d^-1) 每组8只, 阳性药组(Acetazolamide, 50 mg·kg^-1·d^-1)、LBP组(LBP溶液, 160 mg·kg^-1·d^-1)、LGG组(LGG混悬液, 10⁹ CFU·d^-1) 每组5只, 连续给药7天。最后一次给药后, 除正常组外, 其余小鼠放入小动物低压氧舱建立高原睡眠障碍模型。设置氧舱海拔高度为6 000 m, 温度24 ℃, 湿度56%, 换气频率每小时6次, 每次持续时间5 min, 进气量10 atmNI·min^-1, 抽气量30 atmNI·min^-1, 氧浓度维持20%, 氧分压8.5 kPa, 舱内压力-58 kPa, 并调节仪器海拔上升速度, 使仪器在30 min内升至目标高度, 该条件保持71 h后, 以相同速度在30 min后下降至正常海拔高度, 恢复常压常氧。小鼠在舱内自由饮食, 光照明暗各12 h, 造模结束后立即开展评价(图 2)。

血细胞计数检测 小鼠出舱后, 立即尾静脉取血, 用手术刀片快速划破小鼠尾部静脉, 用尾静脉采血管迅速吸取20 μL注入备好的血细胞稀释液中, 吹打均匀, 使血液均匀分散在稀释液中, 避免出现凝血现象。使用全自动血细胞分析仪检测小鼠血液中白细胞(white blood cell, WBC)、红细胞(red blood cell, RBC)、血红蛋白(hemoglobin, HGB) 和红细胞压积(hematocrit, HCT) 水平。

睡眠持续时间评价 小鼠腹腔注射1% (w/v) 戊巴比妥钠溶液(50 mg·kg^-1), 观察小鼠是否出现睡眠现象, 记录药物注射时间、睡眠潜伏时间与睡眠持续时间, 比较各组睡眠时长的差异。

行为学实验 旷场实验可评价小鼠自主探索能力, 将小鼠置于旷场实验箱中心点位置, 记录小鼠自由活动5 min内轨迹, 对小鼠活动总路程、活动时长等进行记录, 统计并进行分析。新物体识别测试可检测短期记忆能力, 在实验箱内放置两个相同物体, 小鼠自由活动10 min, 使其熟悉两个物体, 间隔1 h后, 将其中一个物体换成新物体, 让小鼠自由活动5 min。利用视频分析系统记录小鼠测试期内识别新物体的次数, 并计算识别指数:

识别指数=识别新物体的次数/(识别新物体的次数+识别旧物体的次数)

iNOS、TNF-α水平检测 小鼠摘眼球取血, 血样4 ℃静置过夜, 于3 500 ×g转速下离心15 min后取上清, 按照试剂盒说明书检测iNOS、TNF-α含量。

肠道内容物收集与16S rRNA高通量测序 造模结束后, 正常组、模型组、合生制剂组各取3只小鼠小心且快速将肠道内容物取出, 放入无菌冻存管置于液氮中保存, 全部采集结束后转移至-80 ℃冰箱保存, 进行肠道菌群16S rRNA高通量测序实验。

肠道组织病理切片 解剖取出距胃部下端5 cm处的长度为1 cm的小肠组织, 生理盐水冲洗, 于中性福尔马林溶液中固定, 进行脱水、石蜡包埋、切片处理, 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE) 染色后在显微镜下观察组织病理形态, 并拍照。

数据分析 以上数据均以平均数±标准差(x±s) 表示, 采用SPSS 19.0软件通过单因素方差分析进行统计学分析, 以P < 0.05表示有统计意义。

结果

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1 LBP促进LGG生长

以LGG数(CFU·mL^-1) 对OD_{600 nm}值作图, 绘制标准曲线(图 3A)。LGG在OD_{600 nm}值0.25~1.25范围内线性方程为y = 178 692 637 x + 35 235 207 (r = 0.995 6), 线性关系良好, 可用于定量检测。

厌氧培养后, LGG在无碳源培养基中36 h生长状况无明显变化, 2% GLU培养基和2% LBP培养基内LGG生长状态较好。GLU作为阳性对照, 对LGG的生长具有促进作用, 说明糖类可以促进LGG的生长繁殖。LBP对LGG的生长具有明显的促进作用, 其在12 h后的生长速度远远高于无碳源培养基组和GLU组, 且在36 h内持续生长(图 3B)。LBP可在体外促进有益菌的生长, 是良好的益生元。

2 SA凝胶的成胶性及可注射性

将CaCl₂溶液滴入SA溶液, CaCl₂中的Ca²⁺会与SA中的Na⁺产生离子交换, Ca²⁺与SA分子中的羧基发生交联反应, 生成凝胶。本研究制备的凝胶其外观如图 3C所示, 可以长时间倒置且不向下流动(图 3D), 形成凝胶。凝胶可注射, 可以在培养皿中写出“LGG”字样, 表明SA凝胶具有良好的可注射性(图E、F)。以上结果表明, SA凝胶适合注射使用, 有较好的可注射性, 以便后续动物实验进行灌胃给药。

3 SA凝胶合生制剂的胃肠道环境耐受性

根据平板菌落生长情况(图 3G), 未包裹SA凝胶的LGG经过SGF和SIF孵育后, 在培养板上培养24 h后没有长出菌落, 表明LGG可能被胃酸杀死, 菌株活性下降, 难以生长繁殖。而LSG经过SGF和SIF连续孵育, 培养24 h后仍有大量活菌能生长繁殖, 表明SA凝胶可有效保护LGG不受胃肠道破坏。

4 SA凝胶合生制剂体外释放

SA凝胶具有良好的耐胃酸性。LSG置于pH 1.2的SGF中1 h后, 几乎没有LGG释放。将它们转移至pH 6.6的SIF中2 h后, LGG得到释放。此外, 当它们被转移到pH 7.8的SCF中时, LGG释放量较大(图 3H)。表明LGG在胃酸中得到了较好的保护, 能够靶向到肠道环境进行释放。

5 SA凝胶合生制剂微观形貌

扫描电镜是在微观水平上研究凝胶结构最常用的技术。本研究中, SA与Ca²⁺反应具有良好的胶凝特性, 制备的益生元凝胶具有松散的孔隙结构, 能有效负载LGG, 有助于LGG在其中生长繁殖(图 4A)。通过扫描电镜观察SA凝胶载LGG的形貌(图 4B), 红色箭头指示LGG, 有杆状益生菌, SA凝胶可较好负载LGG。

6 合生制剂延长睡眠持续时间

在本研究中, 与正常组相比, 模型组小鼠睡眠时长显著缩短(P < 0.001), 易清醒, 证明高原睡眠障碍模型建立成功(图 5A)。与模型组相比, 给药组小鼠睡眠状况均有改善, 睡眠时间延长, 尤其乙酰唑胺组(P < 0.001) 和合生制剂组(P < 0.001) 小鼠的睡眠时长显著增加。上述结果证明, 合生制剂组可以改善高原睡眠障碍, 延长模型小鼠的持续睡眠时长, 并且改善效果优于单一的LBP组和LGG组, 说明合生制剂可以改善小鼠的高原睡眠障碍。

7 合生制剂改善小鼠探索能力和短期记忆能力

利用旷场实验记录小鼠的自由活动轨迹, 可以反映小鼠的自主探索能力。低压缺氧模型组小鼠的活跃程度不如正常组, 旷场活动的总路程显著减少(图 5B, P < 0.001), 小鼠更倾向于在旷场周边活动, 中心区域活动距离较少(图 5C), 显示低氧环境会导致小鼠自主探索能力降低。合生制剂给药后, 小鼠活动距离显著改善(P < 0.05), 说明合生制剂可以增强小鼠的自主探索能力。新物体识别实验可以评估小鼠的短期学习记忆能力。本研究中模型组小鼠的识别指数较低(图 5D, P < 0.001), 证明低压缺氧会导致小鼠的学习记忆能力下降。与模型组相比, 给药组识别指数显著增大(图 5D), 倾向于探索新物体(图 5E), 说明学习记忆能力显著升高, 且合生制剂组改善效果最佳(P < 0.001)。上述结果证明, 合生制剂可以提高小鼠的自主探索能力和短期记忆能力。

8 合生制剂改善小鼠血细胞水平

采用血细胞分析仪分析各组小鼠血象变化。WBC与炎症反应密切相关, RBC、HCT、HGB可综合反映血液的携氧能力, 低氧条件下RBC、HCT、HGB会出现代偿性升高, 因此本研究选择以WBC、RBC、HGB、HCT为主要检测指标。与正常组相比, 低压缺氧环境下模型组小鼠的WBC (P < 0.001)、RBC (P < 0.001)、HGB (P < 0.001)、HCT (P < 0.001) 均有显著升高(图 6A~D), 说明模型组小鼠在缺氧条件下, 可能发生了炎症反应及代偿反应。给药后, 合生制剂能显著降低机体WBC水平(图 6A, P < 0.001), 对RBC (P < 0.01)、HGB (P < 0.01) 及HGB (P < 0.05) 的代偿性升高也有一定的缓解作用(图 6B~D)。该合生制剂能促进低氧条件下小鼠血细胞恢复到正常水平。

9 合生制剂降低iNOS、TNF-α水平

iNOS可能是高原睡眠障碍的致病机制之一, TNF-α可能与缺氧引起的炎症损伤有关。缺氧条件下, 模型组小鼠的iNOS和TNF-α表达升高(P < 0.001)。给药后各组小鼠iNOS和TNF-α水平显著降低, 且合生制剂组(P < 0.001) 效果最佳, 表明合生制剂可以缓解机体缺氧损伤(图 6E、F)。

10 合生制剂调节肠道菌群

肠道菌群的相对丰度与菌株丰富度与人的健康息息相关。高原缺氧改变了肠道微生物群的门和属水平, 肠道拟杆菌门丰度升高, 厚壁菌门丰度降低(图 7A), 乳杆菌属丰度明显降低(图 7B)。合生制剂预防给药后, 肠道菌群丰度得到改善, 厚壁菌门增加, 拟杆菌门丰度降低, 趋于正常水平(图 7A)。在属水平上, 相较正常组, 模型组乳杆菌属丰度明显降低, 合生制剂组可以改善肠道内乳杆菌属水平, 使其恢复到正常水平(图 7B、C, P < 0.05)。Chao指数(图 7D)、Shannon指数(图 7E) 和Venn图(图 7F) 表明模型组小鼠肠道微生物群落的丰度和多样性显著低于正常组。与模型组相比, 合生制剂可增加小鼠肠道菌群的丰富度和多样性, 明显升高肠道益生菌乳杆菌属的相对丰度, 具有调节肠道菌群, 保护肠道菌群多样性的作用。

11 合生制剂减轻小肠组织损伤

益生菌可用于治疗神经性疾病作用方式包括调节免疫系统、产生短链脂肪酸或支持肠道屏障完整性^[31]。健康的肠道环境是由肠道微生物群对大脑进行调节的基础, 肠道上皮细胞和肠黏膜在肠-脑轴中发挥重要作用。小肠病理切片可显示肠道结构和屏障的完整性。小肠组织HE染色结果表明(图 7G), 缺氧条件下模型组小肠组织的肠壁变薄, 小肠隐窝变形, 排列松散, 有明显的炎症浸润。合生制剂改善了肠道环境, 修复了小肠损伤, 合生制剂组小鼠的小肠隐窝与健康小鼠更接近, 炎症浸润减少。

讨论

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高原低压、低氧、辐射强、温度低等特殊环境对高原作业人员的健康及体能都带来极大的影响。高原睡眠障碍主要是高海拔地区的特殊环境因素导致的人体睡眠质量下降或失眠等问题的状况, 其发生发展机制非常复杂, 包括缺氧导致的CO₂分压下降、一氧化氮分泌减少、大脑神经递质释放水平降低、昼夜节律基因表达改变等^{[32, 33]}。长期低质量的睡眠状态, 会对人类神经系统造成损伤, 降低大脑灵敏度、记忆力和分析能力^[34]; 增加心理压力出现焦虑、抑郁等不良情绪, 加重睡眠障碍, 形成恶性循环^[8]; 也会对消化系统产生损害, 导致胃肠功能紊乱^[35]。高原睡眠障碍常用的干预手段主要有物理干预(生活方式干预、音乐疗法等) 及药物治疗。乙酰唑胺是美国食品药品监督管理局批准的唯一针对急性高原病的药物, 但不良反应较多, 包括多尿、头痛、恶心、疲劳等^[9]。因此, 寻找有效的高原睡眠障碍意义重大。

高原环境可影响肠道菌群的丰度, 肠道菌群不仅可以影响胃肠功能, 还可以通过神经、代谢等通路调节中枢神经体统活动, 菌群失调可以导致睡眠障碍^[36]。因此, 肠道菌群可能是防治高原睡眠障碍的一个重要靶点。本课题组前期研究发现, 高原睡眠障碍模型动物体内肠道乳杆菌属的丰度明显降低^[23], 在此基础上, 本研究以肠道菌群作为治疗靶点, 通过体内补充LGG、调节肠道菌群丰度改善小鼠的高原睡眠障碍。

LBP是一种新型益生元, 可以为益生菌提供营养来源, 促进其生长繁殖。本研究通过比较不同培养基对LGG促生作用的影响, 验证了LBP具有较好的促益生菌生长的作用。水凝胶柔软、含水量高, 具有良好的生物相容性和生物可降解等特性, 是一种具有优良性能的生物材料, 在生物工程领域、药物输送领域具有重要的作用。SA是一种天然多糖, 是常用于制备水凝胶的高分子材料, 具有稳定性、黏膜黏附性、凝胶性和生物安全性; 同时具有明显的生物活性。SA与CaCl₂交联可生成具有均匀松散的孔隙结构, 可以良好的负载LGG的凝胶。用SA凝胶包载LGG的合生制剂, 具有良好成胶性和可注射性, SA作为益生元可耐受胃酸、消化酶, 制备成凝胶后, 通过耐胃酸实验及体外消化液释放模拟实验验证, SA凝胶能保护益生菌不受胃酸环境的破坏, 提高益生菌存活率, 用于益生菌的口服递送, 为后续体内药效评价奠定了基础。

进入高原后, 血细胞缺氧会刺激低氧诱导因子表达增加, 增加下游红细胞生成素的合成和分泌, 促进红细胞生成增加, 这是机体在低氧环境下的代偿性反应, 有利于改善组织供氧。但是红细胞过度增加和累积, 可增加血液的黏滞性, 影响血流速度, 加重组织缺氧甚至导致高原疾病的发生^[37]。正常情况下血液测量范围为WBC: 2.6~13×10⁹/L, RBC: 6~12.5×10¹²/L, HGB: 100~190 g·L^-1, HCT: 40%~48%。本实验中血细胞水平检测显示, 预防给药合生制剂7天可使机体缺氧程度减轻, 维持小鼠血细胞趋于正常水平, 且与阳性对照药乙酰唑胺的药效相当。iNOS和TNF-α可能是高原睡眠障碍的致病机制之一。TNF-α是一种炎性因子, 暴露在缺氧环境下会增加多种炎症因子的产生, 炎症因子可以减少促睡眠细胞因子, 产生抗睡眠作用^{[38, 39]}。一氧化氮由一氧化氮合酶催化, 能通过增加脑血流量来改善氧气的输送, iNOS是一氧化氮合酶的三种亚型之一。本实验以iNOS为评价指标, 当机体缺氧时, iNOS表达增加^[40]。口服合生制剂后, 小鼠iNOS表达明显低于模型组, 说明机体缺氧反应明显缓解, 体内氧含量不足以触发iNOS响应机制。

肠道微生物作为肠道环境的重要参与者, 直接刺激肠壁细胞活性因子的分泌, 且肠道微生物产生的短链脂肪酸对大脑的调节有着重要意义^{[41, 42]}。本课题组前期研究发现^[23], 高原低氧在门和属水平上改变了主要肠道菌群的相对丰度, 乳酸杆菌丰度明显降低, 短链脂肪酸产生代谢减少。结合本实验结果, 模型组小鼠肠道菌群丰度明显降低, 通过预防给予本合生制剂, 可增加小鼠肠道菌群丰度和多样性, 具有保护肠道菌群多样性的作用。而且该合生制剂可修复高原低氧导致的小肠结构损伤, 并降低了炎症浸润现象, 为肠道菌群提供趋于健康的肠道环境, 同时对睡眠相关指标有明显改善。因此合生制剂可能通过改善肠道环境、调节肠道微生物群、维护肠道组织结构完整来预防高原睡眠障碍。

综上, 本研究以肠道菌群作为治疗靶点, 制备了LGG-LBP合生制剂, 通过调节肠道菌群, 改善肠道微生物丰度, 预防高原环境导致的睡眠障碍, 有望成为预防原睡眠障碍的有效口服制剂。

作者贡献: 牛红负责实验操作、数据处理及论文初稿撰写; 吴艳萍负责实验操作; 杜丽娜、金义光负责课题设计、实验指导、数据分析、文章写作与修改。

利益冲突: 本文所有作者声明不存在利益冲突关系。

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国家自然科学基金青年科学基金项目(82404486)

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2025年第60卷第5期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0722

接收时间：2024-07-29
首发时间：2025-10-29
出版时间：2025-05-12

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出版历史

收稿日期：2024-07-29
修回日期：2024-11-06

基金

国家自然科学基金青年科学基金项目(82404486)

作者信息

1.山东中医药大学药学院, 山东济南 250355

2.军事科学院军事医学研究院, 北京 100850

通讯作者:

^*杜丽娜, Tel: 86-10-66930216, E-mail: dulina@188.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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