药学学报

Group	Climbing index (CI)
Control	0.40 ± 0.05
RHL	0.54 ± 0.04
RHM	0.61 ± 0.04^*
PBHL	0.61 ± 0.03^**
PBHM	0.57 ± 0.02^*

Group	Climbing index (CI)
Control	0.40 ± 0.05
RHL	0.54 ± 0.04
RHM	0.61 ± 0.04^*
PBHL	0.61 ± 0.03^**
PBHM	0.57 ± 0.02^*

Group	Mating logarithmic	Mating rate/%	Mating time/min
Control	15	16	14.93 ± 1.15
RHL	20	20	17.45 ± 0.84
RHM	28	32	19.61 ± 0.80^**
PBHL	26	28	20.08 ± 1.05^**
PBHM	30	36	22.00 ± 0.78^**

Group	Mating logarithmic	Mating rate/%	Mating time/min
Control	15	16	14.93 ± 1.15
RHL	20	20	17.45 ± 0.84
RHM	28	32	19.61 ± 0.80^**
PBHL	26	28	20.08 ± 1.05^**
PBHM	30	36	22.00 ± 0.78^**

No.	Metabolite	m/z	t_R/min	Formula	Ion	VIP	RHL/ Con	RHM/ Con	PBHL/Con	PBHM/Con
1	N-Acetylhistamine	153.090 33	1.052	C₇H₁₁N₃O	[M+H]⁺	1.10	↓^*	↓^**	↓^**	↓^**
2	Adenine	135.054 46	1.056	C₅H₅N₅	[M+H]⁺	1.70	↑	↑^**	↑^**	↑^**
3	L-Acetylcarnitine	203.115 98	1.059	C₉H₁₇NO₄	[M-H]^-	1.30	↑	↑	↑	↑^**
4	Uric acid	168.028 36	1.059	C₅H₄N₄O₃	[M+H]⁺	1.11	↓	↓	↓^*	↓^*
5	L-Isoleucine	131.094 83	1.075	C₆H₁₃NO₂	[M-H]^-	1.44	↑	↑	↑	↑^**
6	L-Methionine	149.051 13	1.076	C₅H₁₁NO₂S	[M+H]⁺	1.26	↑	↑	↑	↑^**
7	L-Histidine	155.069 67	1.293	C₆H₉N₃O₂	[M+H]⁺	1.45	↑^**	↑^**	↑^**	↑^**
8	D-Maltose	342.116 16	1.355	C₁₂H₂₂O₁₁	[M+H]⁺	1.24	↑^*	↑^**	↑	↑^*
9	Adenosine monophosphate	347.063 3	1.645	C₁₀H14N₅O₇P	[M+H]⁺	1.40	↑^**	↑^**	↑^**	↑^**
10	L-Valine	117.079 21	1.646	C₅H₁₁NO₂	[M-H]^-	1.56	↑	↑^**	↑^**	↑^**
11	D-Glucose	180.063 41	1.798	C₆H₁₂O₆	[M-H]^-	1.28	↑^**	↑^**	↑^**	↑^**
12	D-Proline	115.063 64	1.799	C₅H₉NO₂	[M-H]^-	1.67	↓	↓^*	↓^**	↓^**
13	L-Tyrosine	181.074 06	1.983	C₉H₁₁NO₃	[M+H]⁺	1.20	↑	↑^*	↑^*	↑^*
14	Inosine	268.080 94	2.568	C₁₀H₁₂N₄O₅	[M-H]^-	1.01	↑^*	↑	↑	↑
15	D-Tryptophan	204.090 01	5.042	C₁₁H₁₂N₂O₂	[M+H]⁺	1.32	↑	↑^*	↑^*	↑^*
16	LysoPC(18:3(9Z, 12Z, 15Z))	517.317 43	9.925	C₂₆H₄₈NO₇P	[M-H]^-	1.39	↓	↓	↓^**	↓^**
17	LysoPC(16:0/0:0)	495.333 16	11.311	C₂₄H₅₀NO₇P	[M-H]^-	1.73	↓	↓^**	↓^**	↓^**

No.	Metabolite	m/z	t_R/min	Formula	Ion	VIP	RHL/ Con	RHM/ Con	PBHL/Con	PBHM/Con
1	N-Acetylhistamine	153.090 33	1.052	C₇H₁₁N₃O	[M+H]⁺	1.10	↓^*	↓^**	↓^**	↓^**
2	Adenine	135.054 46	1.056	C₅H₅N₅	[M+H]⁺	1.70	↑	↑^**	↑^**	↑^**
3	L-Acetylcarnitine	203.115 98	1.059	C₉H₁₇NO₄	[M-H]^-	1.30	↑	↑	↑	↑^**
4	Uric acid	168.028 36	1.059	C₅H₄N₄O₃	[M+H]⁺	1.11	↓	↓	↓^*	↓^*
5	L-Isoleucine	131.094 83	1.075	C₆H₁₃NO₂	[M-H]^-	1.44	↑	↑	↑	↑^**
6	L-Methionine	149.051 13	1.076	C₅H₁₁NO₂S	[M+H]⁺	1.26	↑	↑	↑	↑^**
7	L-Histidine	155.069 67	1.293	C₆H₉N₃O₂	[M+H]⁺	1.45	↑^**	↑^**	↑^**	↑^**
8	D-Maltose	342.116 16	1.355	C₁₂H₂₂O₁₁	[M+H]⁺	1.24	↑^*	↑^**	↑	↑^*
9	Adenosine monophosphate	347.063 3	1.645	C₁₀H14N₅O₇P	[M+H]⁺	1.40	↑^**	↑^**	↑^**	↑^**
10	L-Valine	117.079 21	1.646	C₅H₁₁NO₂	[M-H]^-	1.56	↑	↑^**	↑^**	↑^**
11	D-Glucose	180.063 41	1.798	C₆H₁₂O₆	[M-H]^-	1.28	↑^**	↑^**	↑^**	↑^**
12	D-Proline	115.063 64	1.799	C₅H₉NO₂	[M-H]^-	1.67	↓	↓^*	↓^**	↓^**
13	L-Tyrosine	181.074 06	1.983	C₉H₁₁NO₃	[M+H]⁺	1.20	↑	↑^*	↑^*	↑^*
14	Inosine	268.080 94	2.568	C₁₀H₁₂N₄O₅	[M-H]^-	1.01	↑^*	↑	↑	↑
15	D-Tryptophan	204.090 01	5.042	C₁₁H₁₂N₂O₂	[M+H]⁺	1.32	↑	↑^*	↑^*	↑^*
16	LysoPC(18:3(9Z, 12Z, 15Z))	517.317 43	9.925	C₂₆H₄₈NO₇P	[M-H]^-	1.39	↓	↓	↓^**	↓^**
17	LysoPC(16:0/0:0)	495.333 16	11.311	C₂₄H₅₀NO₇P	[M-H]^-	1.73	↓	↓^**	↓^**	↓^**

基于UHPLC-Q-Exactive-MS大海马延缓果蝇衰老的代谢机制研究

PDF下载

王玉昆 ¹^,² , 周添慧 ¹^,² , 段丽娟 ¹^,² , 张爱荣 ³ , 秦雪梅 ¹^,² , 高晓霞 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(7): 1812-1821

收起

药学学报 | 研究论文 2023, 58(7): 1812-1821

基于UHPLC-Q-Exactive-MS大海马延缓果蝇衰老的代谢机制研究

全屏

王玉昆¹^,², 周添慧¹^,², 段丽娟¹^,², 张爱荣³, 秦雪梅¹^,², 高晓霞¹^,²^,^*

作者信息

1.山西大学中医药现代研究中心, 山西太原 030006

2.山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室, 山西太原 030006

3.山西广誉远国药有限公司, 山西太谷 030800

通讯作者:

*高晓霞, Tel: 86-351-7019297, E-mail: gaoxiaoxia@sxu.edu.cn

Based on the metabolic mechanism of UHPLC-Q-Exactive-MS Hippocampus to delay the aging of Drosophila melanogaster

Yu-kun WANG¹^,², Tian-hui ZHOU¹^,², Li-juan DUAN¹^,², Ai-rong ZHANG³, Xue-mei QIN¹^,², Xiao-xia GAO¹^,²^,^*

Affiliations

1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

2. The Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

3. Shanxi Guangyuyuan Traditional Chinese Medicine Co., Ltd., Taigu 030800, China

出版时间: 2023-07-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1178

文章导航

摘要

收起

基于UHPLC-Q-Exactive-MS代谢组学技术研究大海马对果蝇寿命的影响, 探究大海马干预后果蝇衰老进程中内源性代谢物的变化规律, 阐明大海马的抗衰老作用机制。采用果蝇自然衰老模型, 给予不同剂量的生品大海马与酥油炙大海马, 观察对果蝇寿命、攀爬能力、性活力及抗氧化酶活性的影响, 应用代谢组学技术对衰老果蝇的代谢轮廓分析, 探究大海马延缓果蝇衰老的作用机制。结果表明, 生品大海马、酥油炙大海马(1、4 mg·mL^-1) 均能显著延长雄性果蝇的平均寿命、中位寿命和最高寿命, 可显著提高果蝇的攀爬能力与性活力, 提高过氧化氢酶(catalase, CAT) 的含量和降低丙二醛(malonaldehyde, MDA) 的含量。通过代谢组学技术指认出大海马可以显著回调16种代谢物, 参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、酪氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、组氨酸代谢5条代谢通路。结果提示, 大海马可延缓果蝇衰老, 炮制后药效加强, 抗衰老机制与氨基酸代谢和糖代谢有关。本研究旨在为大海马的开发利用和阐明其在老年性疾病发挥作用提供充实的科学依据。本研究动物实验获得山西大学伦理委员会的批准(批准号: SXULL2021028)。

关键词

大海马 / 酥油炙 / 果蝇 / 延缓衰老 / 代谢组学

Abstract

收起

Based on the UHPLC-Q-Exactive-MS metabonomics technology, the effect of Hippocampus kuda Bleeker on the life span of Drosophila melanogaster was studied, and the change rule of endogenous metabolites in the aging process of Drosophila melanogaster after the intervention of Hippocampus kuda Bleeker japonicus was explored to clarify the anti-aging mechanism of Hippocampus. The natural aging model of Drosophila melanogaster was used. Different doses of raw Hippocampus and fried Hippocampus were given to observe the effects on the life span, climbing ability, sexual activity, and antioxidant enzyme activity of Drosophila melanogaster. Based on UHPLC-Q-Exactive-MS metabolomics technology, the metabolic profile of the aging Drosophila melanogaster was analyzed using metabonomics technology to explore the mechanism of Hippocampus kuda Bleeker delaying the aging of Drosophila melanogaster. The results showed that raw Hippocampus and crispy Hippocampus (1, 4 mg·mL^-1) could significantly prolong the average life span, median life span and maximum life span of male fruit flies, and significantly improve the climbing ability and sexual vitality of fruit flies. Catalase (CAT) and aldehyde content were increased, while malonaldehyde (MDA) content was decreased. Through metabonomics technology, it was identified that the Hippocampus can significantly recall 16 metabolites and participate in the biosynthesis of phenylalanine, tyrosine and tryptophan, starch and sucrose metabolism, tyrosine metabolism, cysteine and methionine metabolism, and histidine metabolism. The anti-aging mechanism is related to amino acid metabolism and sugar metabolism, which provides a substantial scientific basis for the development and utilization of Hippocampus and clarifying its role in senile diseases. The animal experiment of this study was approved by the Ethics Committee of Shanxi University (approval number: SXULL2021028).

Key words

Hippocampus kuda Bleeker / processed with butter / Drosophila melanogaster / anti-aging / metabolomics

引用本文

王玉昆, 周添慧, 段丽娟, 张爱荣, 秦雪梅, 高晓霞. 基于UHPLC-Q-Exactive-MS大海马延缓果蝇衰老的代谢机制研究. 药学学报, 2023 , 58 (7) : 1812 -1821 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1178

Yu-kun WANG, Tian-hui ZHOU, Li-juan DUAN, Ai-rong ZHANG, Xue-mei QIN, Xiao-xia GAO. Based on the metabolic mechanism of UHPLC-Q-Exactive-MS Hippocampus to delay the aging of Drosophila melanogaster[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (7) : 1812 -1821 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1178

正文

收起

衰老是生命体在增龄过程中发生的退行性变化, 随着时间推移, 机体细胞、组织、器官功能均会逐渐衰退^[1]。衰老是许多人类疾病的危险因素, 诸如心血管疾病、神经退行疾病、生殖功能减退^[2]。中医药在衰老理论方面有诸多论述, 如肾虚衰老、脾虚衰老、阴阳虚损等, 认为肾精虚衰是衰老根本, 元气亏虚是衰老关键^[3]。随着我国人口老龄化的发展及老年医学逐步从以治疗为中心向以康养为中心的转变, 在充分挖掘古老的中医药理论瑰宝的基础上, 明确中医药干预衰老的科学优势和科学内涵, 开展科学性、系统性、安全性和有效性的研究, 提高老年人生活质量已经成为人们研究的重点和方向。

大海马(Hippocampus kuda Bleeker) 来源于海龙科动物, 其形态具有马头蛇尾瓦楞身的特征, 最早记载于《本草拾遗》, 具有强身健体、温肾壮阳、舒筋活络等功效, 临床中被广泛应用在肾阳不足及肾虚衰老相关的疾病治疗中, 是补肾阳、延缓衰老的名贵中药材, 素有“南方人参”的别称^[4]。现代研究表明, 大海马具有性激素样作用、延缓衰老、抗氧化、增强学习功能、降血压、降血脂、抗疲劳等作用^[5]。在临床使用中海马大多经炮制后入药, 主要炮制方法有酒炙、滑石粉炙、酥油炙等, 研究发现经炮制后的效果颇佳^[6]。本课题组前期有应用¹H-NMR和GC-MS代谢组学技术针对不同品种海马及酥油炙炮前后的化学成分进行系统表征和分析, 发现酥油前后多种化学成分发生显著变化, 并且炮制后海马个体间含量稳定, 并且在复方中的均一性良好^[7]。但是针对大海马发挥抗衰老的作用机制尚不清晰, 亟待进一步系统化探索和深入研究。

代谢组学强调把机体作为一个完整系统进行研究, 通过监测生命系统中代谢网络的动态变化, 从机体代谢角度研究疾病或药物干预导致的机体变化规律, 可用于发现疾病生物标志物以及探索生命系统与药物之间复杂效应关系的有效工具^[8]。果蝇具有寿命周期短, 繁殖快的特点, 并且在代谢途径与生理功能类似于哺乳动物, 被广泛应用于研究衰老、神经退行疾病、毒理学模型等研究中^{[9, 10]}。因此, 本研究基于果蝇为模式生物, 旨在通过观察海马炮制前后对果蝇寿命的影响来评价海马抗衰老的活性, 并以果蝇生殖能力、攀爬能力、性活力以及抗氧化为指标多层次、多角度分析大海马的抗衰老活性及其炮制前后的延缓衰老作用比较。进一步通过研究大海马对果蝇内源性代谢产物的影响, 探索大海马炮制前后延缓果蝇衰老的作用机制, 以期能够为海马药材的充分开发利用提供科学依据。

材料与方法

收起

实验动物 果蝇品系: W¹¹¹⁸系白眼黑腹果蝇, 山西大学应用生物学研究所提供, 在25 ℃、75 %相对湿度, 自然昼夜节律光照的智能人工气候箱中培养。将CO₂气体通入果蝇培养瓶中将其致晕, 在通有CO₂的脱脂棉上, 分取雄性并收集。动物实验遵循山西大学动物伦理委员会的规定并通过动物实验伦理审查(批准号: SXULL2021028)。

仪器与主要试剂 UHPLC-Q Exactive Orbitrap-MS (Thermo-Fisher Scientific美国); 电子天平(型号: FA2004, 上海良平仪器仪表有限公司); 人工气候箱(型号: MGC-HP, 上海一恒科技有限公司); 立式压力蒸汽灭菌器(型号: LDZX-30KBS, 上海申安医疗器械厂); 高通量组织研磨仪(型号: DHFSTPRP-24, 宁波洛尚智能科技有限公司); 高速冷冻离心机(型号: Neofuge 13R, 上海立申科学仪器有限公司); 多功能酶标仪(型号: Infinite M200 Pro, 瑞士Tecan公司); Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司); 果蝇培养管(高9.4 cm, 内径2.6 cm, 北京中创宏达科技有限公司); HPLC级乙腈、HPLC级甲酸(美国Thermo Fisher Scientific公司)。蔗糖与丙酸, 分析纯, 购自天津市风船化学试剂科技有限公司; 市售玉米粉; 琼脂, 分析纯, 购自北京索莱宝科技有限公司; 食品级酵母粉, 购自安琪酵母股份有限公司; 过氧化氢酶试剂盒(CAT, A007-1-1)、丙二醛试剂盒(MDA, A003-1-2), 购自南京建成生物工程研究所。

大海马生品, 炮制大海马(酥油炙) 均由山西广誉远国药有限公司提供, 大海马经山西大学中医药现代研究中心主任秦雪梅鉴定为2020版《中国药典》所收录的正品大海马(Hippocampus kuda Bleeker) 的干燥体, 保存于山西大学中医药现代研究中心。将生品、炮制大海马研磨, 过药典5号筛, 得大海马药材粉末。

培养基的制备 将10 g琼脂、70 g蔗糖、85 g玉米粉加适量蒸馏水溶解煮沸, 并加入18 g酵母粉搅拌煮沸, 并加入5 mL丙酸制成1 000 mL基础培养基。在基础培养基中分别添加生品大海马低剂量(raw Hippocampus, RHL, 1 mg·mL^-1)、中剂量(RHM, 4 mg·mL^-1)、高剂量(RHH, 16 mg·mL^-1) 和酥油炙大海马低剂量(processed with butter Hippocampus, PBHL, 1 mg·mL^-1)、中剂量(PBHM, 4 mg·mL^-1)、高剂量(PBHH, 16 mg·mL^-1) 制成含药培养基。

果蝇寿命实验 收集3 d内羽化的雄性果蝇, 使用基础培养基培养至30天龄时随机分组, 即对照组(control)、生品大海马低剂量组(RHL, 1 mg·mL^-1)、生品大海马中剂量组(RHM, 4 mg·mL^-1)、生品大海马高剂量组(RHH, 16 mg·mL^-1)、炮制大海马低剂量组(PBHL, 1 mg·mL^-1)、炮制大海马中剂量组(PBHM, 4 mg·mL^-1)、炮制大海马高剂量组(PBHL, 16 mg·mL^-1)。对照组使用空白培养基培养, 给药组在各给药培养基中培养。每组果蝇约200只, 隔3天为果蝇更换一次新鲜培养基, 每日记录果蝇死亡状况直至全部死亡, 意外死亡果蝇不作统计。每组果蝇的平均存活天数计为平均寿命, 每组最后剩余10%果蝇的存活天数算术平均数计为最高寿命。

攀爬实验 收集3天内羽化的雄性果蝇, 平均分为5组, 即对照组(Control)、RH低剂量组(RHL, 1 mg·mL^-1)、RH中剂量组(RHM, 4 mg·mL^-1)、PBH低剂量组(PBHL, 1 mg·mL^-1)、PBH中剂量组(PBHM, 4 mg·mL^-1)。每组果蝇100只。在各自培养基培养15天后, 将待测果蝇平均装入高22 cm、内径3.2 cm的测定管中, 饥饿2 h后轻晃管, 使果蝇置于底部。统计20 s内果蝇垂直爬行距离大于15 cm的果蝇数量(A), 计算攀附指数(climbing index, CI) = A/总数^[11]。实验分别进行3次, 每次间隔20 min。

性活力实验 收集8 h内羽化的果蝇, 分为5组, 分组同攀爬实验。雌雄果蝇各50只, 每组50对, 在各自培养基中连续培养15天后做性活力测定。将同一实验组果蝇平均分为5管, 每管10对果蝇, 雌雄果蝇各10只置于同一测定管中, 记录60 min内交配的果蝇对数、交配时间。如果60 min后交尾果蝇没有分开, 则等其自然分开并记录交尾时长^[12]。

大海马抗氧化酶活性测定实验 收集3天内羽化的雄性果蝇, 平均分为5组, 分组同攀爬实验。每组果蝇约为100只, 在各自培养基培养15天后分别放入干净灭菌的培养管中饥饿, 2 h后使用液氮速冻, 收集果蝇样本并保存在-80 ℃冰箱。将20只果蝇样本转入2 mL EP管中, 称重后按比例加入生理盐水, 加入在冰箱预冷的钢珠, 使用组织研磨仪快速匀至均质。迅速放入高速冷冻离心机中离心(4 ℃, 3 500 r·min^-1, 10 min), 吸取上清液备用, 即为10%组织匀浆液。按照各试剂盒说明书进行果蝇体内测定过氧化氢酶和丙二醛的含量。

果蝇代谢组学实验

分组及给药收集72 h内羽化的雄果蝇成虫, 随机分为15天衰老组对照组(control)、15天衰老果蝇+ 1 mg·mL^-1 RHL、15天衰老果蝇+ 4 mg·mL^-1 RHM、15天衰老果蝇+ 1 mg·mL^-1 PBHL、15天衰老果蝇+ 4 mg·mL^-1 PBHM。以基础培养基喂养15天衰老组, 以含海马药物的培养基喂养的15天果蝇为衰老给药组。

果蝇样本收集取果蝇样本10只, 加入200 μL的提取溶剂(甲醇∶水= 4∶1), 放入冰箱预冷的钢珠, 使用组织研磨仪充分研磨, 高速离心(4 ℃, 13 000 ×g, 20 min) 后取上清转移至新的EP管中, 于4 ℃冰箱静置过夜, 再次离心(4 ℃, 3 500 r·min^-1, 20 min) 后取上清待测。从每个待测样品中吸取10 μL混匀, 即为QC样本。

色谱条件采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) 色谱柱, 流动相: A (水, 含0.1%甲酸)、B (乙腈, 含0.1%甲酸), 流动相梯度为0~1.5 min, 3% B; 1.5~5 min, 4%~49% B; 5~8 min, 49%~65 % B; 8~10 min, 65%~70% B; 10~15 min, 70%~75% B; 15~17 min, 75%~98% B; 17~20 min, 98% B; 20~24 min, 98%~3% B。流速为0.2 mL·min^-1, 进样量为5 μL, 柱温为40 ℃。

质谱条件采用电喷雾离子源(ESI), 采集模式为正离子模式与负离子模式, 离子源温度550 ℃; 雾化气体N₂, 辅助气Gas1为55 kPa, 辅助气Gas2为55 kPa, 气帘气Cur Gas为30 kPa; 裂解电压为±60 V, 碰撞能量为±35 eV, 碰撞能量扩展均为15 eV, 质量扫描范围: m/z 100~1 500。

LC-MS数据处理将获得的LC-MS/MS原始数据导入Compound Discoverer 3.0软件(Thermo公司, 美国) 以获得匹配和对齐的峰值数据。主要参数为质量范围100~1 500 Da; 质量偏差5 ppm; 信噪比阔3。将从Compound Discoverer 3.0软件导出的数据在Excel 2016中进行总峰面积归一化处理, 并将归一化后的数据导入SIMCA-P 14.1软件(Umetrics公司, 瑞典) 进行主成分分析(PCA), 偏最小二乘法判别分析(PLS-DA) 和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。结合S-plot图中VIP > 1及t检验(P < 0.05) 筛选大海马给药组与模型组之间显著改变的差异变量。根据在线数据库并结合二级碎片离子对筛选出的差异变量进行指认鉴定: Metlin(http://metlin.scripps.edu), HMDB(http://www.hmdb.ca), Massbank(http://www.massbank.jp), Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), Lipid Maps(http://www.silvermaps.org), 使用Met PA(http://metpa.metabolomics.ca) 进行代谢通路富集分析, 并使用KEGG(http://www.kegg.jp) 及相关文献报道对生物标志物所涉及的代谢通路进行分析。

统计分析 本实验数据使用SPSS statistics 16.0、Graphpad Prism 7.0、Excel 2016等软件处理。结果以均值±标准误($\bar{x}$ ± s) 表示。空白对照组与给药组间生存率比较采用Log-rank检验, 两组间比较采用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 以P < 0.05为差异具有统计学意义。

结果

收起

1 寿命实验

大海马炮制前后对果蝇寿命的影响结果如图 1所示。结果显示, 1和4 mg·mL^-1的生品大海马与炮制大海马均可显著延长果蝇的平均寿命和最高寿命(P < 0.05)。16 mg·mL^-1的生品大海马与炮制大海马对果蝇寿命无延长作用。与对照组相比, 1 mg·mL^-1的生品大海马可提高果蝇的平均寿命7.28%, 提高中位寿命4.26%, 提高最高寿命6.10% (P < 0.05); 4 mg·mL^-1的生品大海马可提高果蝇的平均寿命15.42%, 提高中位寿命10.64%, 提高最高寿命10.99% (P < 0.01); 1 mg·mL^-1的炮制大海马可提高果蝇的平均寿命16.65%, 提高中位寿命10.64%, 提高最高寿命10.01% (P < 0.01); 4 mg·mL^-1的炮制大海马可提高果蝇的平均寿命8.46%, 提高中位寿命4.26%, 提高最高寿命3.04% (P < 0.05)。实验结果显示, 中、低剂量的生品大海马与炮制大海马均可显著延长果蝇寿命, 故低剂量与中剂量为有效剂量, 后续实验对低、中剂量进行考察。中剂量的生品大海马与低剂量的炮制大海马延长寿命效果更佳, 提示大海马在炮制后药效可能增强。

2 大海马炮制前后对果蝇攀爬能力的影响

大海马炮制前后对15天果蝇攀爬能力的影响结果如表 1所示。结果显示, 与对照组相比, 4 mg·mL^-1的生品大海马与1、4 mg·mL^-1的炮制大海马均可提高果蝇的攀爬能力, 且差异具有统计学意义(P < 0.05), 中剂量生品大海马与低剂量炮制大海马提高果蝇的攀爬能力效果相当。

3 大海马炮制前后对果蝇性活力的影响

大海马炮制前后对果蝇性活力的影响结果如表 2所示。与对照组相比, 中低剂量的生品大海马与炮制大海马均可不同程度地提高果蝇的交配率。与对照组相比, 中剂量生品大海马与低剂量、中剂量炮制大海马均可延长果蝇的交配时间, 且差异具有统计学意义(P < 0.01)。

4 大海马炮制前后对果蝇体内抗氧化酶活性的影响

大海马炮制前后对15天果蝇体内CAT活力与MDA含量的影响如图 2所示。与对照组相比, 中剂量(4 mg·mL^-1) 的生品大海马与炮制大海马均可提高果蝇体内CAT的活力(P < 0.01), 低剂量(1 mg·mL^-1) 组果蝇的CAT活力有上调趋势而差异无统计学意义。与对照组相比, 中剂量生品大海马与低、中剂量的炮制大海马均可降低果蝇体内MDA的含量, 且差异具有显著性(P < 0.05)。实验结果表明, 大海马具有抗氧化的作用。

5 UHPLC-Q-Exactive-MS大海马延缓果蝇衰老的代谢组学

5.1 仪器系统稳定性监测

果蝇样本的离子流色谱图通过UPLC-MS/MS的正、负离子模式获得。在批量样本进样分析过程中, 每随机进6针样品进一针QC, 以监测LC-MS稳定性。从6针QC样品分别提取10个离子, 分别计算10个离子的保留时间和相对峰面积的RSD值, 用来监督LC-MS系统的稳定性。结果显示, 10个提取离子t_R的RSD为0.06%~0.26%, 相对峰面积的RSD为4.56%~12.04%, 结果表明本研究所建立的分析方法的重复性和稳定性符合大批量血清样本代谢组学的分析要求。

5.2 多元统计分析

UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS获得代谢组学数据后, 通过PLS-DA分析确定各组果蝇代谢物轮廓的差异。结果表明, 给予大海马生品及炮制品后果蝇代谢轮廓发生了显著变化。在PLS-DA模型评分图上观察到各组果蝇中代谢轮廓发生的明显分离。

为了更加直观反映大海马对果蝇衰老代谢物的调节作用, 通过分别构建大海马炮制前后的PLS-DA模型验证实验对各组进行代谢轮廓分析, 通过参数R²、Q²分析模型的可靠性和过度拟合程度。图 3A、C为大海马炮制前后给予衰老果蝇样本的PLS-DA图, 清晰地看到给予大海马后与原衰老组果蝇显著分开, 表明代谢轮廓发生明显变化, 如图 3B、D所示, 炮制前大海马给予果蝇PLS-DA模型的R² = 0.917, Q² = 0.757, 大海马炮制后PLS-DA模型的R² = 0.991, Q² = 0.881, 且Q²交与Y轴负轴, 表明模型稳定良好, 不存在过拟合现象。上述结果表明, 大海马能够调节衰老果蝇体内代谢轮廓, 发挥改善衰老的作用。并结合VIP > 1, 及t检验(P < 0.05) 筛选进一步对大海马炮制前后对体内代谢物的显著差异变量。

5.3 大海马延缓果蝇衰老差异代谢物筛选

根据果蝇代谢物的质荷比、分子式、二级碎片离子、保留时间, 并结合在线数据库对各组之间显著变化的代谢物进行鉴定, 共指认出17个大海马延缓果蝇衰老潜在的差异代谢物(表 3)。生品大海马能够显著调节衰老果蝇体内10种代谢物, 包括肌苷、L-缬氨酸、D-葡萄糖、N-乙酰组胺、腺嘌呤、组氨酸、D-麦芽糖、磷酸腺苷、脯氨酸、LysoPC(16:0/0:0) 等代谢物。炮制后大海马能够显著回调衰老果蝇体内16代谢物, 包括L-缬氨酸、D-葡萄糖、N-乙酰组胺、腺嘌呤、组氨酸、D-麦芽糖、磷酸腺苷、脯氨酸、尿酸、L-乙酰基肉碱、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-酪氨酸、D-色氨酸、LysoPC(18:3(9Z、12Z、15Z))、LysoPC(16:0/0:0) 等。结果表明, 给予大海马药物后, 衰老果蝇的代谢物可以被明显调节, 代谢紊乱的情况可以得到改善(图 4)。在差异代谢物的相对含量热图(图 5), 可以清楚观察到各组之间的代谢物变化水平, 这一结果也反映了给予衰老果蝇大海马药物后, 可以显著调节其中氨基酸、脂质类代谢物的水平。但是炮制前的低剂量组改善回调代谢物相对不明显, 而大海马炮制前(4 mg·mL^-1) 和炮制后(1和4 mg·mL^-1) 都显示出较好的调节作用, 提示海马炮制后可能具有增效的作用。与此同时, 炮制后回调的衰老果蝇体内代谢物相对增加(图 6), 主要包括尿酸、L-乙酰基肉碱、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-酪氨酸、D-色氨酸、LysoPC(18:3(9Z、12Z、15Z)) 等代谢物。

5.4 代谢通路分析

将通过代谢组学技术找到的大海马显著回调果蝇衰老的17种生物标志物导入Metaboanalyst 5.0数据库中进行代谢通路分析。代谢通路影响值(impact value) > 0.1的通路被视为贡献值较大的通路, 最终发现涉及6条代谢通路。大海马炮制后改善果蝇衰老的代谢通路如图 7A, 主要包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、酪氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、组氨酸代谢等5条代谢通路。大海马炮制前改善果蝇衰老的代谢物涉及组氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢2条代谢通路。以上结果提示大海马炮制后可能通过更多途径改善果蝇机体的衰老, 总的来说, 大海马炮制后改善果蝇衰老涉及代谢通路更全面。

讨论

收起

衰老是涉及多系统、多组织的复杂退化过程, 中医上认为肾虚是衰老发生的生理基础和根本原因, 肾主生长发育和生殖通过肾精和肾气的生理功能体现^[13]。研究表明, 肾功能下降和氨基酸代谢紊乱是衰老的主要特征^[14]。大海马作为临床上常用的温补肾阳的中药, 可以增强机体免疫能力, 发挥延缓衰老、改善性活力的作用^[15]。本研究基于果蝇自然衰老的生物模型, 发现给予大海马药物后其可延长果蝇的平均寿命, 提高最高寿命, 并且大海马可以显著提升果蝇攀爬能力、延长交配时间, 增强果蝇机体力量和提高性活力, 同时显著提高果蝇的CAT活力, 显著降低MDA含量, 通过提高果蝇清除自由基的能力来延缓衰老。在寿命实验和行为学研究中发现生品大海马中剂量(4 mg·mL^-1) 与炮制后大海马低剂量(1 mg·mL^-1) 对果蝇机能的抗衰老效果几近相当, 从多层次、多角度提示海马炮制后药效增强。

在衰老过程中, 不同的代谢途径发挥着不同的作用, 通过一些中间产物的联系, 各种代谢通路之间形成相互联系、相互协调和相互制约的代谢网络, 共同调节生理机能^[16]。为了进一步探究大海马炮制前后延缓果蝇衰老的作用机制, 本研究采用UHPLC-Q-Exactive-MS技术和多元统计分析方法, 基于代谢组学系统比较大海马炮制前后延缓果蝇衰老的生物代谢物, 结果发现大海马延缓果蝇衰老的16种生物标志物, 并且衰老影响果蝇的代谢通路有5条, 分别是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、组氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、酪氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢。

氨基酸作为蛋白质合成基本组成单位, 参与人体生长、繁殖和免疫所必需的关键代谢途径, 当机体衰老时体内氨基酸代谢紊乱^[17]。异亮氨酸和缬氨酸同为支链氨基酸, 在调节机体能量代谢平衡方面起着重要的作用^[18]。苯丙氨酸作为一种必需氨基酸, 能去除氧自由基, 在体内大部分经由羟化酶生成酪氨酸, 并且可以跟酪氨酸一起合成重要的激素和神经递质, 参与机体糖脂代谢^[19]。色氨酸在多种与衰老相关的生物系统中起着重要作用, 含量与年龄呈负相关, 并且研究也发现在肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化和其他年龄相关性代谢性疾病中的色氨酸水平也有所降低^[20-22]。研究表明, 因衰老生物体内蛋白质和激素等合成速度降低, 肠道菌群代谢活动紊乱, 所以可能吸收缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸等必需氨基酸用于自身合成蛋白, 进而导致这些氨基酸的含量下降, 影响机体正常代谢循环, 加剧组织及器官的衰老^[23]。本研究中, 衰老果蝇机体内的异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸等果蝇机内的氨基酸代谢紊乱。给予生品大海马后, 能够显著回调缬氨酸、色氨酸的水平, 而经炮制后的大海马可以显著回调酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的水平, 表明炮制后大海马发挥延缓衰老作用更为全面, 同时异亮氨酸、酪氨酸代谢可能是大海马炮制后增强延缓衰老作用的潜在机制之一。

蛋氨酸是构成人体的必需氨基酸之一, 因其不能在体内自身生成, 所以必须由外部获得^[24]。如果蛋氨酸缺乏就会导致体内蛋白质合成受阻, 造成机体损害。体内氧自由基造成的膜脂质过度氧化是导致机体多种损害的原因, 而蛋氨酸通过多种途径来抗击这些损害^[25]。本研究发现给予经炮制后大海马后, 可以显著回调蛋氨酸的水平, 然而生品大海马能够回调但没有显著性差异, 提示大海马炮制后通过调节果蝇机体的蛋氨酸代谢途径发挥延缓衰老, 可以作为炮制增效的潜在药效标志物之一。

葡萄糖是维持人体活动能量的重要来源, 参与淀粉和蔗糖的代谢^[18], 同时由于机体的衰老引起体内能量代谢的功能出现失调^[26]。本研究中衰老果蝇体内淀粉和蔗糖代谢出现明显异常, 给予大海马炮制前后的药物可以显著调节衰老果蝇体内的葡萄糖, 与此同时, 在行为学实验中发现大海马能够提升果蝇的攀附指数, 具有增强机体力量的作用, 二者结合提示大海马可以调节衰老果蝇的糖代谢紊乱, 发挥增强衰老机体的作用。

基于以上, 本研究将延缓衰老、性活力、抗氧化三者系统地联系起来, 并进一步利用代谢组学技术全面系统表征大海马延缓果蝇衰老的代谢机制, 从整体观角度来考察大海马干预果蝇机体衰老的代谢变化的规律, 充分体现中医药整体调节的特点。本研究只是基于果蝇生物模型进行研究, 在未来的研究中可以选取更多的生物模型进行系统性、多层次、全方位进行研究, 进一步探讨大海马延缓衰老的作用机制, 运用符合中医药发展规律的现代科学技术, 阐明中医药在老年性疾病中的优势作用, 为大海马的开发利用提供充实的科学依据。

作者贡献: 高晓霞、秦雪梅、张爱荣负责实验思路设计; 王玉昆、段丽娟负责完成主要的实验部分; 王玉昆、周添慧、段丽娟负责完成实验数据及文章撰写; 高晓霞负责指导论文撰写与修改。

利益冲突: 本文研究内容无任何利益冲突。

基金

收起

山西省中央引导地方科技发展资金项目(YDZJSX2021C033)
名优晋药再开发山西省重点实验室(202104010910001)
地产中药功效物质研究与利用山西省重点实验室(201605D111004)
山西中医药大学科技创新团队(2022TD2007)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Liu

, Qin

, Gao

. Potential role of brain cell senescence in the pathogenesis of Alzheimer's disease[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2022, 57: 1946-1953. http://www.yxxb.com.cn/aps/cn/article/doi/10.16438/j.0513-4870.2021-1869

[2]

Perna

, Zhang

, Mons

, et al . Epigenetic age acceleration predicts cancer, cardiovascular, and all-cause mortality in a German case cohort[J]. Clin Epigenetics, 2016, 8: 64.

https://doi.org/10.1186/s13148-016-0228-z

[3]

Zhang M. Study on the Rule of Ancient Anti-Aging Prescriptions (古代抗衰老方剂用药规律研究)[D]. Beijing: China Academy of Chinese Medical Sciences, 2018.

[4]

Jiang

, Shan

, Yuan

, et al . Exploration and thoughts about zoological origin and macroscopical identification of Chinese material medica "Haima" in China Pharmacopoeia[J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2017, 42: 3836-3842

[5]

Chen

, Chen

, Ge

, et al . Research progress on chemical constituents and pharmacological activities of hippocampus[J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2017, 48: 4089-4099

[6]

Chen

. Function and processing method of hippocampus in medicinal diet[J]. China Food Drug Regul (中国食品药品监管), 2010 7 71-72

[7]

Zhao XZ. Study on the Otherness of Chemical Constituents in Hippocampus of Different Commodity Medicinal Materials by Metabolomics Approach (基于代谢组学技术研究不同海马商品药材化学成分差异性)[D]. Taiyuan: Shanxi University, 2018.

[8]

Wishart

. Emerging applications of metabolomics in drug discovery and precision medicine[J]. Nat Rev Drug Discov, 2016, 15: 473-484.

https://doi.org/10.1038/nrd.2016.32

[9]

Davie

, Janssens

, Koldere

, et al . A single-cell transcriptome atlas of the aging Drosophila brain[J]. Cell, 2018, 174: 982-998.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.057

[10]

Duan

, Gao

, Qin

, et al . Application of Drosophila melanogaster in pharmacological research[J]. Chin Pharm J (中国药学杂志), 2016, 51: 1638-1642

[11]

, Yin

, Xie

. On the impact of fructus schisandrae alcohol armour on fruit flies climbing ability effects of and study on the relationship between the aging[J]. Acta Chin Med Pharmacol (中医药学报), 2015, 43: 57-58

[12]

Zhou

, Luan

, Liu

, et al . Effects of polysaccharide of maca on sexual vitality and fertility of Drosophila melanogaster[J]. China Food Addit (中国食品添加剂), 2016 8 86-90

[13]

Shen

. A review of studies on the essence of kidney in integrated traditional Chinese and Western medicine[J]. Chin J Integr Tradit West Med (中国中西医结合杂志), 2012, 32: 304-306

[14]

Sun

, Jiao

, Ma

, et al . Anti-ageing effect of red ginseng revealed by urinary metabonomics using RRLC-Q-TOF-MS[J]. Phytochem Anal, 2018, 29: 387-397.

https://doi.org/10.1002/pca.2758

[15]

Duan LJ. Preliminary Study on the Anti-Aging Effect and Mechanism of Processed with Butter Hippocampus kuda Bleeker on Drosophila melanogaster (酥油炙大海马延缓果蝇衰老作用与机制初探)[D]. Taiyuan: Shanxi University, 2021.

[16]

López-Otín

, Galluzzi

, Freije

JMP

, et al . Metabolic control of longevity[J]. Cell, 2016, 166: 802-821.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.07.031

[17]

Feng

, Zhou

, Chai

, et al . Scutellaria baicalensis Georgi leaf and tea extracts prolong lifespan and alter the metabolomic aging profile in a Drosophila melanogaster aging model[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2020, 55: 1214-1221

[18]

Yan

, Zhou

, Li

, et al . Metabonomic study of alcohol extract from Scutellariae Radix in prolonging lifespan of Drosophila melanogaster based on ¹H-NMR[J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2016, 47: 1714-1722

[19]

Che

, Fan

, Gu

, et al . Effects of L-phenylalanine on serum levels of NO, ET and SOD in spontaneously hypertensive rats[J]. Chin J Pathophysiol (中国病理生理杂志), 2007, 23: 389-390

[20]

Davidson

, Rashidi

, Nurgali

, et al . The role of tryptophan metabolites in neuropsychiatric disorders[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23: 9968.

https://doi.org/10.3390/ijms23179968

[21]

, Gao

, Zhou

, et al . Research advances in brain monoamine neurotransmitters in the aging-associated memory decline[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2017, 52: 1639-1646. http://www.yxxb.com.cn/aps/cn/article/doi/10.16438/j.0513-4870.2017-0471

[22]

Mallmann

, Lima

, Lalwani

. Dysregulation of tryptophan catabolism in metabolic syndrome[J]. Metab Syndr Relat Disord, 2018, 16: 135-142

[23]

, Zhou

, Du

, et al . Research progress about the anti-aging effect and mechanism of flavonoids from traditional Chinese medicine[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2019, 54: 1382-1391. http://www.yxxb.com.cn/aps/cn/article/doi/10.16438/j.0513-4870.2019-0283

[24]

Cabreiro

, Au

, Leung

, et al . Metformin retards aging in C. elegans by altering microbial folate and methionine metabolism[J]. Cell, 2013, 153: 228-239

[25]

Höhn

, Weber

, Jung

, et al . Happily (n)ever after: aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence[J]. Redox Biol, 2017, 11: 482-501

[26]

Azzu

, Valencak

. Energy metabolism and ageing in the mouse: a mini-review[J]. Gerontology, 2017, 63: 327

2023年第58卷第7期

PDF下载

205

100

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1178

接收时间：2022-11-03
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-07-12

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2022-11-03
修回日期：2023-02-02

基金

山西省中央引导地方科技发展资金项目(YDZJSX2021C033)

名优晋药再开发山西省重点实验室(202104010910001)

地产中药功效物质研究与利用山西省重点实验室(201605D111004)

山西中医药大学科技创新团队(2022TD2007)

作者信息

1.山西大学中医药现代研究中心, 山西太原 030006

2.山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室, 山西太原 030006

3.山西广誉远国药有限公司, 山西太谷 030800

通讯作者:

*高晓霞, Tel: 86-351-7019297, E-mail: gaoxiaoxia@sxu.edu.cn

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2022-1178

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT

Group	Climbing index (CI)
Control	0.40 ± 0.05
RHL	0.54 ± 0.04
RHM	0.61 ± 0.04^*
PBHL	0.61 ± 0.03^**
PBHM	0.57 ± 0.02^*

Group

Climbing index (CI)

Control

0.40 ± 0.05

RHL

0.54 ± 0.04

RHM

0.61 ± 0.04^*

PBHL

0.61 ± 0.03^**

PBHM

0.57 ± 0.02^*

Group	Mating logarithmic	Mating rate/%	Mating time/min
Control	15	16	14.93 ± 1.15
RHL	20	20	17.45 ± 0.84
RHM	28	32	19.61 ± 0.80^**
PBHL	26	28	20.08 ± 1.05^**
PBHM	30	36	22.00 ± 0.78^**

Group

Mating logarithmic

Mating rate/%

Mating time/min

Control

14.93 ± 1.15

RHL

17.45 ± 0.84

RHM

19.61 ± 0.80^**

PBHL

20.08 ± 1.05^**

PBHM

22.00 ± 0.78^**

No.	Metabolite	m/z	t_R/min	Formula	Ion	VIP	RHL/ Con	RHM/ Con	PBHL/Con	PBHM/Con
1	N-Acetylhistamine	153.090 33	1.052	C₇H₁₁N₃O	[M+H]⁺	1.10	↓^*	↓^**	↓^**	↓^**
2	Adenine	135.054 46	1.056	C₅H₅N₅	[M+H]⁺	1.70	↑	↑^**	↑^**	↑^**
3	L-Acetylcarnitine	203.115 98	1.059	C₉H₁₇NO₄	[M-H]^-	1.30	↑	↑	↑	↑^**
4	Uric acid	168.028 36	1.059	C₅H₄N₄O₃	[M+H]⁺	1.11	↓	↓	↓^*	↓^*
5	L-Isoleucine	131.094 83	1.075	C₆H₁₃NO₂	[M-H]^-	1.44	↑	↑	↑	↑^**
6	L-Methionine	149.051 13	1.076	C₅H₁₁NO₂S	[M+H]⁺	1.26	↑	↑	↑	↑^**
7	L-Histidine	155.069 67	1.293	C₆H₉N₃O₂	[M+H]⁺	1.45	↑^**	↑^**	↑^**	↑^**
8	D-Maltose	342.116 16	1.355	C₁₂H₂₂O₁₁	[M+H]⁺	1.24	↑^*	↑^**	↑	↑^*
9	Adenosine monophosphate	347.063 3	1.645	C₁₀H14N₅O₇P	[M+H]⁺	1.40	↑^**	↑^**	↑^**	↑^**
10	L-Valine	117.079 21	1.646	C₅H₁₁NO₂	[M-H]^-	1.56	↑	↑^**	↑^**	↑^**
11	D-Glucose	180.063 41	1.798	C₆H₁₂O₆	[M-H]^-	1.28	↑^**	↑^**	↑^**	↑^**
12	D-Proline	115.063 64	1.799	C₅H₉NO₂	[M-H]^-	1.67	↓	↓^*	↓^**	↓^**
13	L-Tyrosine	181.074 06	1.983	C₉H₁₁NO₃	[M+H]⁺	1.20	↑	↑^*	↑^*	↑^*
14	Inosine	268.080 94	2.568	C₁₀H₁₂N₄O₅	[M-H]^-	1.01	↑^*	↑	↑	↑
15	D-Tryptophan	204.090 01	5.042	C₁₁H₁₂N₂O₂	[M+H]⁺	1.32	↑	↑^*	↑^*	↑^*
16	LysoPC(18:3(9Z, 12Z, 15Z))	517.317 43	9.925	C₂₆H₄₈NO₇P	[M-H]^-	1.39	↓	↓	↓^**	↓^**
17	LysoPC(16:0/0:0)	495.333 16	11.311	C₂₄H₅₀NO₇P	[M-H]^-	1.73	↓	↓^**	↓^**	↓^**

No.

Metabolite

m/z

t_R/min

Formula

Ion

VIP

RHL/
Con

RHM/
Con

PBHL/Con

PBHM/Con

N-Acetylhistamine

153.090 33

1.052

C₇H₁₁N₃O

[M+H]⁺

1.10

↓^*

↓^**

Adenine

135.054 46

1.056

C₅H₅N₅

[M+H]⁺

1.70

↑

↑^**

L-Acetylcarnitine

203.115 98

1.059

C₉H₁₇NO₄

[M-H]^-

1.30

↑

↑^**

Uric acid

168.028 36

1.059

C₅H₄N₄O₃

[M+H]⁺

1.11

↓

↓^*

L-Isoleucine

131.094 83

1.075

C₆H₁₃NO₂

[M-H]^-

1.44

↑

↑^**

L-Methionine

149.051 13

1.076

C₅H₁₁NO₂S

[M+H]⁺

1.26

↑

↑^**

L-Histidine

155.069 67

1.293

C₆H₉N₃O₂

[M+H]⁺

1.45

↑^**

D-Maltose

342.116 16

1.355

C₁₂H₂₂O₁₁

[M+H]⁺

1.24

↑^*

↑^**

↑

↑^*

Adenosine monophosphate

347.063 3

1.645

C₁₀H14N₅O₇P

[M+H]⁺

1.40

↑^**

L-Valine

117.079 21

1.646

C₅H₁₁NO₂

[M-H]^-

1.56

↑

↑^**

D-Glucose

180.063 41

1.798

C₆H₁₂O₆

[M-H]^-

1.28

↑^**

D-Proline

115.063 64

1.799

C₅H₉NO₂

[M-H]^-

1.67

↓

↓^*

↓^**

L-Tyrosine

181.074 06

1.983

C₉H₁₁NO₃

[M+H]⁺

1.20

↑

↑^*

Inosine

268.080 94

2.568

C₁₀H₁₂N₄O₅

[M-H]^-

1.01

↑^*

↑

D-Tryptophan

204.090 01

5.042

C₁₁H₁₂N₂O₂

[M+H]⁺

1.32

↑

↑^*

LysoPC(18:3(9Z, 12Z, 15Z))

517.317 43

9.925

C₂₆H₄₈NO₇P

[M-H]^-

1.39

↓

↓^**

LysoPC(16:0/0:0)

495.333 16

11.311

C₂₄H₅₀NO₇P

[M-H]^-

1.73

↓

↓^**