自体骨或人工骨移植在临床上已广泛应用于颌面骨缺损修复，但这些方法仍存在成骨效果不佳等问题。骨髓间充质干细胞在骨形成过程中发挥关键作用，其中，外胚层来源的颌骨骨髓间充质干细胞与中胚层来源的髂骨骨髓间充质干细胞相比，具有更强的增殖和成骨分化能力，阐明其中的关键机制，有望为颅颌面骨缺损修复提供新策略。

比较人颌骨骨髓间充质干细胞与髂骨骨髓间充质干细胞的生物学差异，并找出其中的关键调节基因。

①收集3例牙槽突裂患者的颌骨和髂骨，分离培养出原代骨髓间充质干细胞，通过集落形成实验检测细胞增殖能力，β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况，Western blot检测衰老和成骨相关蛋白表达，成骨诱导液处理后茜素红染色检测成骨能力；②对颌骨骨髓间充质干细胞和髂骨骨髓间充质干细胞进行转录组和差异基因表达分析，找到差异表达最大的20个基因，鉴定出关键调控因子；③在髂骨骨髓间充质干细胞中敲低HOXA10基因，比较分析髂骨骨髓间充质干细胞自我更新、抗衰老和成骨能力变化；④将基因编辑的髂骨骨髓间充质干细胞装入β-磷酸三钙支架中，并植入裸鼠背部皮下，8周后对植入物进行Masson染色和免疫荧光染色，观察成骨能力差异。

①与髂骨骨髓间充质干细胞相比，颌骨骨髓间充质干细胞具有更强的增殖、抗衰老和成骨分化能力；②通过转录组分析，鉴定出HOXA10是髂骨骨髓间充质干细胞中高度上调的核心转录因子；③在髂骨骨髓间充质干细胞中敲低HOXA10后，细胞增殖、抗衰老和成骨分化能力显著增强；④HOXA10敲低的髂骨骨髓间充质干细胞/β-磷酸三钙植入裸鼠背部皮下后，成骨形成能力更强；⑤上述结果表明，HOXA10是决定骨髓间充质干细胞增殖、抗衰老和成骨分化能力的关键调节基因。HOXA10基因修饰的髂骨骨髓间充质干细胞移植可作为颌面骨缺损修复的潜在应用策略。

骨髓间充质干细胞是骨形成的主要效应细胞，随着年龄的增加，骨髓间充质干细胞的再生能力减弱、分化功能受损，导致骨质疏松。因此，恢复老龄骨髓间充质干细胞的再生能力和细胞功能对骨质疏松的有效治疗至关重要。

探究年轻大鼠第3，11代骨髓间充质干细胞来源外泌体对老年大鼠骨髓间充质干细胞衰老的影响。

分离培养6-8周龄雌性SD大鼠骨髓间充质干细胞，分别传代至第3代和第11代，随后提取第3，11代骨髓间充质干细胞来源外泌体。分离培养18月龄雌性SD大鼠骨髓间充质干细胞，传代至第3代，分为3组：对照组为常规培养，其他2组用第3，11代骨髓间充质干细胞来源外泌体干预。外泌体干预48 h后，利用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞核内β-半乳糖苷酶的表达，qRT-PCR检测衰老相关基因的表达。通过Small RNA测序，比较第3，11代骨髓间充质干细胞来源外泌体内miRNA的表达差异。

①与对照组和第11代骨髓间充质干细胞来源外泌体组相比，第3代骨髓间充质干细胞来源外泌体组老龄大鼠骨髓间充质干细胞的β-半乳糖苷酶活性显著降低；②与对照组相比，第3代骨髓间充质干细胞来源外泌体组衰老相关基因p21和p16的表达显著降低（P < 0.05），而第11代骨髓间充质干细胞来源外泌体组衰老相关基因p21和p16的表达无显著差异；③测序结果表明，两种外泌体内miRNA的表达存在显著差异，其中表达差异最显著的miRNA是let-7c-5p、let-7b-5p、miR-320-3p和miR-26a-5p，KEGG分析结果显示显著性差异miRNA富集通路包含mTOR、AMPK等衰老相关信号通路。上述结果表明，第3代骨髓间充质干细胞来源外泌体具有逆转老龄大鼠骨髓间充质干细胞衰老的能力。

随着年龄增长，骨髓间充质干细胞的再生能力和分化功能逐渐下降，导致骨组织修复效果减弱。因此，探索成骨潜能更高的骨髓间充质干细胞亚群对骨组织工程的发展具有重要意义。

评估STRO-1阳性和阴性骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养条件下的成骨分化能力差异。

分离并培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，采用流式细胞术和免疫荧光鉴定CD29、CD45、CD90和STRO-1的表达；利用免疫磁细胞分选技术分离STRO-1阳性和阴性骨髓间充质干细胞，将两组细胞分别进行成骨诱导7，14 d，采用qRT-PCR和Western blot分析两组细胞成骨相关基因（Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子2、骨保护素、骨钙素）及蛋白表达水平差异，采用茜素红染色和碱性磷酸酶染色观察钙结节形成情况。

流式细胞术显示CD29和CD90高表达，CD45低表达，STRO-1的阳性表达率为12.8%，免疫荧光结果与流式细胞术一致。磁细胞分选后发现STRO-1阳性细胞的集落形成率高于STRO-1阴性细胞；STRO-1阳性细胞在第14天的成骨分化能力显著高于第7天，且在第14天时成骨相关标志物的表达水平显著高于STRO-1阴性细胞，差异有显著性意义（P < 0.01）。结果表明：STRO-1阳性骨髓间充质干细胞在成骨能力上具有显著优势，为骨组织工程中理想种子细胞的筛选提供了理论依据，未来在骨缺损修复中有望成为一种潜在的治疗手段。

骨关节炎是一种以软骨基质持续性破坏为特征的退行性关节病，目前仍无有效的药物治疗方案，二甲双胍预处理骨髓间充质干细胞来源外泌体因避免了口服药物不良反应及免疫原性等特点，可能成为治疗骨关节炎的新方法。

探讨二甲双胍预处理骨髓间充质干细胞来源外泌体对软骨细胞的调节作用。

体外培养乳兔骨髓间充质干细胞和软骨细胞。使用超速离心法收集正常骨髓间充质干细胞源性外泌体和经过二甲双胍预处理的骨髓间充质干细胞源性外泌体，分别用含外泌体的培养基培养软骨细胞24 h，再用100 μmol/L H₂O₂干预24 h。采用CCK-8法和划痕愈合实验检测软骨细胞增殖和迁移能力变化；采用Western blot和RT-qPCR检测软骨细胞中Ⅱ型胶原、P16蛋白及mRNA的表达变化，以及采用Western blot检测MKK7/JNK通路蛋白的表达变化；使用ELISA试剂盒检测软骨细胞中超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平。

①在氧化应激环境下，软骨细胞的增殖和迁移能力减弱，两种外泌体能够一定程度恢复软骨细胞的增殖和迁移能力，二甲双胍预处理骨髓间充质干细胞来源外泌体的改善效果更显著（P < 0.05）；②与正常骨髓间充质干细胞来源外泌体相比，二甲双胍预处理骨髓间充质干细胞来源外泌体更能有效提高Ⅱ型胶原表达和超氧化物歧化酶活性（P < 0.05），同时也更能有效降低P16表达和丙二醛水平（P < 0.05）；③两种外泌体能够一定程度抑制MKK7和p-JNK蛋白表达，二甲双胍预处理骨髓间充质干细胞来源外泌体的抑制效果更显著（P < 0.05）。结果表明，在氧化应激环境下，二甲双胍预处理骨髓间充质干细胞来源外泌体通过抑制MKK7/JNK通路对抗软骨细胞衰老并促进软骨细胞增殖。

既往研究表明经验方剂活髓方对骨髓增生异常综合征患者的免疫及造血调节起到增效减毒的协同作用，但具体机制尚未明确。

探讨活髓方对骨髓增生异常综合征模型大鼠骨髓造血的影响及机制。

70只SD大鼠采用随机数字表法分为正常对照组10只、模型组15只、西药组15只、活髓方低剂量组15只、活髓方高剂量组15只。除正常对照组外，其余4组采用尾静脉注射二甲基苯蒽诱导建立大鼠骨髓增生异常综合征模型，造模后正常对照组、模型组给予生理盐水，西药组给予沙利度胺胶囊10 mg/kg、维A酸片4 mg/kg，活髓方低、高剂量组分别给予活髓方1.5，6 g/kg，每天灌胃1次，连续给药28 d，取外周血和股骨骨髓组织，检测外周血常规、骨髓活检造血增殖情况，采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群及T淋巴细胞上CTLA-4和PD-1的表达。

①与正常对照组相比，模型组外周血白细胞、中性粒细胞、血红蛋白、血小板和CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺水平显著下降（P < 0.05），CD4⁺PD-1⁺、CD8⁺PD-1⁺、CD4⁺CTLA-4⁺和CD8⁺CTLA-4⁺表达显著上调（P < 0.05）；②与模型组相比，各给药组的骨髓增生程度均有改善，但组间无统计学差异（P > 0.05）；③与模型组相比，活髓方高剂量组白细胞、血红蛋白、血小板和CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺水平显著升高（P < 0.05），CD8⁺水平显著降低（P < 0.05），CD4⁺PD-1⁺、CD8⁺PD-1⁺、CD4⁺CTLA-4⁺和CD8⁺CTLA-4⁺表达水平下降但无统计意义（P > 0.05）；④西药组与活髓方高剂量组显示出相似的疗效；活髓方高剂量组较低剂量组各指标改善均有优势。结果表明，活髓方可改善骨髓增生异常综合征模型大鼠的骨髓造血，提高CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺水平，下调CD4⁺PD-1⁺、CD8⁺PD-1⁺、CD4⁺CTLA-4⁺和CD8⁺CTLA-4⁺表达，可能与免疫负调控机制相关。

研究发现，人脐带间充质干细胞来源外泌体可以有效促进脊髓损伤的神经修复。

探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体是否可以通过促进小胶质细胞向M2型极化减轻神经炎症促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复。

将48只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和外泌体组（n=16），采用改良Allen法建立大鼠脊髓损伤模型。外泌体组在损伤后24 h通过神经内镜鞘内注射20 μL人脐带间充质干细胞来源外泌体。在造模后3，7，14，21 d，采用BBB评分法结合Rivlin斜板实验评估大鼠后肢运动功能的恢复情况，采用苏木精-伊红染色和尼氏染色检测脊髓组织损伤情况，Western blot检测脊髓组织中脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子A蛋白表达水平，免疫荧光法检测脊髓组织中M1型标志物（诱导型一氧化氮合酶）与M2型标志物（精氨酸酶1）的表达比例，qRT-PCR和Western blot检测脊髓组织中诱导型一氧化氮合酶与精氨酸酶1的表达水平，ELISA法检测脊髓组织中促炎因子（肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6）和抑炎因子（白细胞介素10）水平。

①术后3，7，14 d，外泌体组BBB评分均高于模型组（P < 0.05），术后7，14 d时外泌体组Rivlin斜板实验角度均显著高于模型组（P < 0.05），苏木精-伊红染色和尼氏染色结果显示外泌体组相比于模型组脊髓组织的神经损伤减轻，术后7 d时外泌体组脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子A表达较模型组增加（P < 0.05）；②免疫荧光实验结果显示，与模型组相比，外泌体组术后第7天病变区域的诱导型一氧化氮合酶阳性小胶质细胞明显减少，而精氨酸酶1阳性小胶质细胞明显增多（P < 0.05）；qRT-PCR和Western blot也证实了免疫荧光实验结果；③外泌体组脊髓组织中促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6分泌量较模型组减少（P < 0.05），而抑炎因子白细胞介素10分泌量较模型组增加（P < 0.05）。结果表明：人脐带间充质干细胞来源外泌体可以促进小胶质细胞M1型向M2型极化，减少了促炎因子的释放，从而减轻脊髓损伤中神经炎症的继发性损害。

长链非编码RNA（LncRNA）在神经系统发育及神经性疾病中扮演着重要角色，课题组前期研究证明了缺血缺氧环境下过表达促红细胞生成素的人脐带间充质干细胞（EPO-MSCs）具有更好的神经保护功能，且显著激活了LncRNA XIST的表达。研究表明XIST与缺血缺氧脑病的发病机制有关，但其受EPO-MSCs调控进而保护缺血缺氧神经元的作用和机制尚不清楚。

探讨LncRNA XIST响应EPO-MSCs信号对缺血缺氧SH-SY5Y细胞凋亡影响的新机制。

①通过慢病毒转染构建敲低LncRNA XIST（sh-XIST）和阴性对照（NC-XIST）SH-SY5Y细胞株，采用氧-葡萄糖剥夺诱导细胞缺氧缺血损伤，使用Transwell小室构建EPO-MSCs和sh-XIST、NC-XIST缺血缺氧SH-SY5Y细胞非接触共培养体系，使用CCK-8方法检测SH-SY5Y细胞的增殖能力，使用细胞划痕实验检测SH-SY5Y细胞的迁移能力，使用流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞凋亡情况。②RNA-seq生信分析筛选sh-XIST与NC-XIST细胞株差异表达基因和通路，利用双荧光素酶实验验证miR-124-3p与靶基因XIST和GRIN1之间的关系，通过qRT-PCR验证下游miR-124-3p、GRIN1基因的表达水平。③加入miR-124-3p抑制剂和模拟物验证缺血缺氧并与EPO-MSCs共培养后SH-SY5Y的表型变化。

①与NC-XIST组相比，sh-XIST组SH-SY5Y细胞缺血缺氧损伤并与EPO-MSCs共培养后的增殖和迁移能力下降，细胞凋亡增加。②双荧光素酶实验结果显示，miR-124-3p与其靶基因XIST之间存在相互作用。在缺血缺氧条件下，转染miR-124-3p mimics的SH-SY5Y细胞在与EPO-MSCs共培养后表现出细胞凋亡减少的情况；相反，当SH-SY5Y细胞转染miR-124-3p inhibitor时，在相同的缺血缺氧条件及与EPO-MSCs共培养的情况下，细胞凋亡则显著增加。③通过对sh-XIST进行转录组测序和生物信息学分析筛选得到显著下调的神经活性配体-受体通路及中枢神经系统发育关键受体基因GRIN1。④双荧光素酶实验结果显示，miR-124-3p与GRIN1相互作用，与NC-XIST组相比，缺血缺氧后sh-XIST组SH-SY5Y细胞GRIN1表达显著下调。结果表明，LncRNA XIST通过上调miR-124-3p从而促进GRIN1表达，进而减少缺血缺氧并与EPO-MSCs共培养SH-SY5Y细胞凋亡，增强其增殖、迁移能力；sh-XIST可以阻断这一保护功能。

促红细胞生成素/促红细胞生成素受体信号通路除了参与骨髓造血，也参与调节非造血组织，如脑、心脏、骨骼肌、脂肪组织等的代谢反应。同时，激活此信号通路能加速牙周膜干细胞的生物矿化过程，减轻细胞氧化应激损伤，但促进牙周膜干细胞成骨分化的机制尚不清楚。

探究促红细胞生成素/促红细胞生成素受体信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响及作用机制。

采用酶消化法分离、培养牙周疾病患者及健康人群的牙周膜干细胞，采用qRT-PCR和免疫印迹法检测两种牙周膜干细胞中促红细胞生成素受体的mRNA和蛋白表达水平。使用小干扰RNA沉默促红细胞生成素受体，或使用促红细胞生成素诱导促红细胞生成素受体表达激活，然后采用qRT-PCR、免疫印迹法检测促红细胞生成素受体、成骨标志基因Runt相关转录因子2、骨钙素、骨桥素、骨唾液蛋白的表达水平，采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色检测牙周膜干细胞成骨分化能力，采用免疫印迹法检测信号转导及转录激活因子5的磷酸化水平。

①qRT-PCR和免疫印迹法结果显示，疾病组牙周膜干细胞中促红细胞生成素受体的mRNA和蛋白水平显著低于健康组牙周膜干细胞；②碱性磷酸酶染色以及茜素红染色显示，敲低促红细胞生成素受体能抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力；qRT-PCR结果显示，与对照组相比，敲低促红细胞生成素受体组Runt相关转录因子2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著降低（P < 0.05）；③qRT-PCR结果显示，促红细胞生成素处理后，牙周膜干细胞中促红细胞生成素受体表达恢复，沉默促红细胞生成素受体后再给予促红细胞生成素处理，逆转了促红细胞生成素受体的表达水平；促红细胞生成素处理后提高了疾病组牙周膜干细胞的成骨分化能力以及成骨标志基因Runt相关转录因子2的表达水平（P < 0.05），沉默信号转导及转录激活因子5表达后，抑制了促红细胞生成素的这种作用；④免疫印迹结果显示，随着促红细胞生成素处理时间的延长，疾病组牙周膜干细胞中信号转导及转录激活因子5磷酸化水平增加（P < 0.05）。上述结果表明，促红细胞生成素通过诱导信号转导及转录激活因子5的磷酸化，恢复病理性牙周膜干细胞的成骨分化能力。

人脱落乳牙牙髓干细胞广泛应用于组织修复再生领域，但组织再生效果在实际应用中存在局限性。利用miRNA干预人脱落乳牙牙髓干细胞的定向分化是未来组织修复再生的重要发展方向。

探讨miR-26b对乳牙牙髓干细胞成神经及成血管分化能力的影响。

从人脱落乳牙中分离提取乳牙牙髓干细胞，并将其向神经及血管方向诱导分化，分别检测成神经标志物Nestin、NSE、βⅢ- Tubulin和成血管标志物CD31、VEGFR2、ANG-1及miR-26b的表达。然后将乳牙牙髓干细胞分为空白对照组、miR-26过表达组和阴性对照组，RT-qPCR、细胞免疫荧光染色及Western blot检测各组乳牙牙髓干细胞成神经及成血管诱导后相关标志物的表达变化。

①乳牙牙髓干细胞具有多向分化潜能，能向成骨、成脂、成神经及成血管方向分化；②在乳牙牙髓干细胞成神经及成血管分化过程中miR-26b表达水平升高；③相较于空白对照组和阴性对照组，miR-26b过表达组乳牙牙髓干细胞成神经相关基因βⅢ-Tubulin、Nestin、NSE及成血管相关基因CD31、VEGFR2、ANG-1的mRNA表达显著升高（P < 0.01），βⅢ-Tubulin、Nestin及CD31、VEGFR2蛋白表达显著升高（P < 0.01）。以上结果表明，miR-26b过表达能促进人脱落乳牙牙髓干细胞成神经和成血管诱导分化。

长链非编码RNA TP53TG1（lncRNA TP53TG1）参与调控多种癌症细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡，但在其他细胞中的作用报道甚少。

探讨lncRNA TP53TG1对人根尖牙乳头干细胞增殖和分化的影响及途径。

分离、培养人根尖牙乳头干细胞，转染lncRNA TP53TG1过表达慢病毒，RT-qPCR检测lncRNA TP53TG1的过表达效率，Western blot检测PI3K、AKT、ERK、P38、Smad3及其磷酸化蛋白的相对表达量。将人根尖牙乳头干细胞分为慢病毒空载体组和过表达lncRNA TP53TG1组，采用CCK-8法检测细胞增殖情况；成骨诱导第5天采用碱性磷酸酶染色检测碱性磷酸酶活性，成骨诱导第21天采用茜素红染色检测矿化结节形成情况；成骨诱导第3，7，14天采用RT-qPCR检测牙本质涎磷蛋白、Runt相关转录因子2、牙本质基质蛋白1、骨涎蛋白的mRNA表达水平；成骨诱导第3，7，14天采用Western blot检测牙本质涎磷蛋白和Runt相关转录因子2的蛋白表达水平。

①RT-qPCR检测结果显示慢病毒成功整合到根尖牙乳头干细胞基因组中，Western blot检测结果显示，过表达lncRNA TP53TG1上调了p-PI3K、p-AKT的蛋白水平而不影响其他通路磷酸化蛋白的表达；②从细胞培养第3天开始，过表达lncRNA TP53TG1显著促进根尖牙乳头干细胞的增殖；③在诱导根尖牙乳头干细胞牙源性分化过程中，过表达lncRNA TP53TG1促进成牙本质及成骨分化相关基因和蛋白的表达，碱性磷酸酶活性和矿化结节形成显著增加；④结果表明：lncRNA TP53TG1可能通过激活PI3K/AKT信号通路促进根尖牙乳头干细胞成牙本质及成骨分化。