中华中医药学刊

反溶剂/溶剂体积比	包封率/（%）	粒径/（nm）
4∶1	47.05±0.06	241.86±0.01
8∶1	76.38±0.32	248.43±0.02
12∶1	86.38±0.03	274.37±0.01
16∶1	81.97±0.02	287.00±0.02
20∶1	78.99±0.01	288.87±0.02

反溶剂/溶剂体积比	包封率/（%）	粒径/（nm）
4∶1	47.05±0.06	241.86±0.01
8∶1	76.38±0.32	248.43±0.02
12∶1	86.38±0.03	274.37±0.01
16∶1	81.97±0.02	287.00±0.02
20∶1	78.99±0.01	288.87±0.02

分离乳清蛋白/厚朴酚投料比	包封率/（%）	粒径/（nm）
8∶1	53.63±0.03	248.80±0.04
10∶1	58.73±0.00	275.63±0.02
12∶1	92.50±0.05	260.57±0.03
14∶1	92.61±0.89	290.57±0.01
16∶1	91.01±0.04	359.93±0.03

分离乳清蛋白/厚朴酚投料比	包封率/（%）	粒径/（nm）
8∶1	53.63±0.03	248.80±0.04
10∶1	58.73±0.00	275.63±0.02
12∶1	92.50±0.05	260.57±0.03
14∶1	92.61±0.89	290.57±0.01
16∶1	91.01±0.04	359.93±0.03

探超时间/（min）	包封率/（%）	粒径/（nm）
0	92.53±0.08	380.80±0.09
1	99.67±0.11	276.43±0.04
3	91.15±0.02	262.57±0.71
5	91.20±0.08	239.60±0.02
7	91.11±0.02	239.27±0.01

探超时间/（min）	包封率/（%）	粒径/（nm）
0	92.53±0.08	380.80±0.09
1	99.67±0.11	276.43±0.04
3	91.15±0.02	262.57±0.71
5	91.20±0.08	239.60±0.02
7	91.11±0.02	239.27±0.01

磁搅转速/（r/min）	包封率/（%）	粒径/（nm）
200	93.21±0.03	269.97±0.01
400	95.51±0.04	262.53±0.05
600	94.84±0.01	263.40±0.05

磁搅转速/（r/min）	包封率/（%）	粒径/（nm）
200	93.21±0.03	269.97±0.01
400	95.51±0.04	262.53±0.05
600	94.84±0.01	263.40±0.05

超声功率/（W）	包封率/（%）	粒径/（nm）
0	90.28±0.04	281.27±0.03
10	95.19±0.01	240.20±0.02
30	91.58±0.07	247.00±0.03
50	90.89±0.08	270.73±0.02

超声功率/（W）	包封率/（%）	粒径/（nm）
0	90.28±0.04	281.27±0.03
10	95.19±0.01	240.20±0.02
30	91.58±0.07	247.00±0.03
50	90.89±0.08	270.73±0.02

水平		因素
-1	8	10	0
0	12	12	1
1	16	14	3

水平		因素
-1	8	10	0
0	12	12	1
1	16	14	3

实验号	X₁/（%）	X₂值	X₃/（%）	包封率/（%）
1	8	12	1.5	92.26
2	16	12	1.5	91.51
3	8	16	1.5	92.47
4	16	16	1.5	90.60
5	8	14	0	85.03
6	16	14	0	77.29
7	8	14	3.0	82.06
8	16	14	3.0	90.13
9	12	12	0	93.51
10	12	16	0	91.53
11	12	12	3.0	95.77
12	12	16	3.0	94.22
13	12	14	1.5	98.56
14	12	14	1.5	97.58
15	12	14	1.5	98.25
16	12	14	1.5	97.37
17	12	14	1.5	97.56

实验号	X₁/（%）	X₂值	X₃/（%）	包封率/（%）
1	8	12	1.5	92.26
2	16	12	1.5	91.51
3	8	16	1.5	92.47
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7	8	14	3.0	82.06
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9	12	12	0	93.51
10	12	16	0	91.53
11	12	12	3.0	95.77
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13	12	14	1.5	98.56
14	12	14	1.5	97.58
15	12	14	1.5	98.25
16	12	14	1.5	97.37
17	12	14	1.5	97.56

方差来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
Model	558.04	9	62.00	70.4	<0.000 1	**
A-溶剂比	0.655 5	1	0.655 5	0.744 3	0.416 9
B-投药比	2.24	1	2.24	2.54	0.155 1
C-探超时间	27.45	1	27.45	31.17	0.000 8	**
AB	0.313 6	1	0.313 6	0.356 1	0.569 5
AC	62.49	1	62.49	70.95	<0.000 1	**
BC	0.046 2	1	0.046 2	0.052 5	0.825 3
A2	279.12	1	279.12	316.92	<0.000 1	**
B2	16.64	1	16.64	18.89	0.003 4	**
C2	156.39	1	156.39	177.57	<0.000 1	**
残差	6.17	7	0.880 7
失拟项	5.11	3	1.70	6.49	0.051 2
净误差	1.05	4	0.262 6
总和	564.21	16

方差来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
Model	558.04	9	62.00	70.4	<0.000 1	**
A-溶剂比	0.655 5	1	0.655 5	0.744 3	0.416 9
B-投药比	2.24	1	2.24	2.54	0.155 1
C-探超时间	27.45	1	27.45	31.17	0.000 8	**
AB	0.313 6	1	0.313 6	0.356 1	0.569 5
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BC	0.046 2	1	0.046 2	0.052 5	0.825 3
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C2	156.39	1	156.39	177.57	<0.000 1	**
残差	6.17	7	0.880 7
失拟项	5.11	3	1.70	6.49	0.051 2
净误差	1.05	4	0.262 6
总和	564.21	16

批次	包封率	实测值	预测值	偏差
1	97.92	98.57±0.46	98.99	0.99%
2	98.99
3	98.80

批次	包封率	实测值	预测值	偏差
1	97.92	98.57±0.46	98.99	0.99%
2	98.99
3	98.80

t/（d）	室温/25℃	t/（d）	4℃
0	221.77±0.37	10.13±0.32	0	226.67±0.01	16.83±0.22
3	233.57±0.02	4.47±1.15	7	254.70±0.04	19.43±0.09
6	258.93±0.02	12.43±0.13	15	259.70±0.01	15.87±0.21
7	310.33±0.04	21.70±0.18	25	257.03±0.05	17.77±0.31
35	367.33±0.08	25.10±0.06	35	261.83±0.05	21.60±0.14

t/（d）	室温/25℃	t/（d）	4℃
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35	367.33±0.08	25.10±0.06	35	261.83±0.05	21.60±0.14

Box-Behnken响应面优化厚朴酚-分离乳清蛋白自组装纳米粒制备工艺及体外评价

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邓鸿丹 ¹ , 张倩 ¹ , 刘芳 ¹ , 杨璐萍 ¹ , 吴学渊 ² , 张芮苑 ¹

中华中医药学刊 | 国家项目点击 2025,43(9): 77-82

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中华中医药学刊 |国家项目点击 2025 , 43 (9) : 77 -82

Box-Behnken响应面优化厚朴酚-分离乳清蛋白自组装纳米粒制备工艺及体外评价

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邓鸿丹¹, 张倩¹, 刘芳¹, 杨璐萍¹, 吴学渊², 张芮苑¹

作者信息

^1.成都中医药大学药学院西南特色中药资源国家重点实验室，四川成都 611137

^2.成都农业科技职业学院，四川成都 611130

通讯作者:

刘芳（1986-），女，四川成都人，高级实验师，硕士研究生导师，研究方向：中药炮制与中药制剂。E-mail：bittercaffe1@126.com。

作者简介:

邓鸿丹（2000-），女，四川绵阳人，硕士在读，研究方向：中药炮制与中药制剂。

Box-Behnken Response Surface Optimization of Self-Assembled Magnolol Separated Whey Protein Nanoparticles Preparation Process and In Vitro Evaluation

Hongdan DENG¹, Qian ZHANG¹, Fang LIU¹, Luping YANG¹, Xueyuan WU², Ruiyuan ZHANG¹

Affiliations

^1.State Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Resources with Southwest Characteristics，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，Sichuan，China

^2.Chengdu Agricultural College，Chengdu 611130，Sichuan，China

出版时间: 2025-09-10 doi: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.09.013

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摘要

收起

目的

运用Box-Behnken设计-效应面法优化厚朴酚-分离乳清蛋白自组装纳米粒（magnolol whey protein isolate nanoparticles，MAG-WPI-NPs）的制备工艺参数，对其进行制剂表征及抗氧化、抗菌作用评价。

方法

采用去溶剂化法制备MAG-WPI-NPs，以包封率为评价指标，运用单因素结合Box-Behnken设计-效应面法优化其制备工艺参数，对优化出的MAG-WPI-NPs进行形貌、粒径、电位等理化性质表征，并评价其1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、抑制大肠杆菌性能。

结果

优化出的最佳制备工艺参数为反溶剂/溶剂体积比12∶1、乳清蛋白/厚朴酚投料比12∶1、探超时间1.5 min；所制得的MAG-WPI-NPs外观澄清、透明、微泛蓝光，透射电镜下观察纳米粒呈球形，平均粒径为（227.33±0.02）nm，ζ电位为（-23.6±0.02）mV，包封率为（98.57±0.46）%，载药量为（8.57±0.001）%，多分散指数（poly dispersity index，PDI）为（0.1369±0.26）%；MAGWPI-NPs具有DPPH自由基清除作用、大肠杆菌抑制作用，且较游离药物作用强。

结论

研究制备了一种天然食品级自组装MAG-WPI-NPs，该制剂制备方法简单、安全无毒，明显改善厚朴酚水溶性差、生物利用度低的缺点，为临床厚朴酚应用奠定制剂基础。

关键词

厚朴酚 / 分离乳清蛋白 / Box-Behnken设计-效应面法 / 制备工艺筛选 / 抗氧化 / 抗大肠杆菌

Abstract

收起

Objective

Using Box-Behnken design response surfacemethodology to optimize the preparation process parameters of magnololwhey protein isolate nanoparticles（MAG-WPINPs），and to characterize their formulation and evaluate their antioxidant and antibacterialeffects.

Methods

MAG-WPI-NPswere prepared using a desolvation method，with encapsulation efficiency as the evaluation index. The preparation process parameters were optimized using a single factor combined with Box-Behnken design response surface methodology. The optimized MAG-WPI-NPs were characterized by their morphology，particle size，potential and other physicochemical properties. The free radical scavenging ability of 1，1-diphenyl-2-trinitrophenyl hydrazine（DPPH）and its ability to inhibit Escherichia coli were evaluated.

Results

The optimal preparation process parameters included a volume ratio of12：1 for anti solvent/solvent，a feed ratio of12：1 for whey protein/magnolol，and a probe time of 1.5 minutes. The prepared MAG-WPI-NPs had a clear，transparent and slightly bluish appearance. Under transmission electron microscopy，the nanoparticles appear spherical with an average particle size of（227.33±0.02）nm. The potential was（-23.6±0.02）mV，the encapsulation efficiency was（98.57±0.46）%，the drug loading was（8.57±0.001）%，and the polydispersity index（PDI）was（0.1369±0.26）%. MAG-WPI-NPs had DPPH radical scavenging effects，Escherichia coli inhibitory effects，and were more potent than free drugs.

Conclusion

This study prepared a natural food grade self-assembled MAG-WPI-NPs. The preparation method was simple，safe and non-toxic，significantly improving the poorwater solubility and low bioavailability of magnolol and laying the foundation for the clinical application of magnolol.

Key words

magnolol / whey protein isolate nanoparticles / Box-Behnken design-effect surface methodology / preparation process screening / antioxidant / anti Escherichia coli

引用本文

邓鸿丹, 张倩, 刘芳, 杨璐萍, 吴学渊, 张芮苑. Box-Behnken响应面优化厚朴酚-分离乳清蛋白自组装纳米粒制备工艺及体外评价. 中华中医药学刊, 2025 , 43 (9) : 77 -82 . DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.09.013

Hongdan DENG, Qian ZHANG, Fang LIU, Luping YANG, Xueyuan WU, Ruiyuan ZHANG. Box-Behnken Response Surface Optimization of Self-Assembled Magnolol Separated Whey Protein Nanoparticles Preparation Process and In Vitro Evaluation[J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2025 , 43 (9) : 77 -82 . DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.09.013

正文

收起

中药厚朴是木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd. et Wils.或凹叶厚朴M. officinalis Rehd. et Wils. var. biloba Rehd. et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮，具有下气除满、燥湿消痰之功^[1]，被广泛用于临床。厚朴酚（magnolol，MAG）是厚朴主要有效成分之一，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性^[2]，但MAG系疏水性联苯酚类化合物^[3]，难溶于水，水中溶解度仅为11.6 μg·m L^-1，限制了其在疾病防控中的应用。目前，厚朴酚常被制备成固体分散体^[4]、固体脂质体纳米粒^[5]、脂质体^[6]等剂型以提高其生物利用度。

随着纳米技术的兴起，自组装纳米粒（self-assembled nanoparticle，SAN）因其对疏水性药物包封率高、药物泄漏少，且通过分子间非共价键形成的纳米微粒粒径小、结构稳定等优点^[7]，已成为目前研究热点之一^[8]。近年来，以蛋白作为SAN载体的纳米载药技术为难溶性药物递送提供了一系列研发策略，能有效提高药物生物利用度^[9]。分离乳清蛋白（whey protein isolates，WPI）作为一种天然自组装动物蛋白^[10]，营养价值高、易于消化并表现出良好的生物相容性和功能特性^[11]，被广泛用作载体材料。与其他蛋白质相比，WPI还具有良好的乳化性能，以WPI为载体包封疏水性化合物形成的纳米粒，具有更小的粒径、更高的包封率、稳定性和物理化学性质等^[12]。本研究利用WPI的药理活性和结构特性优势，将MAG结合到WPI的疏水区域，无需引入其他交联剂或有毒试剂，制备厚朴酚-分离乳清蛋白自组装纳米粒（magnolol-whey isolated proteinnanoparticles，MAG-WPI-NPs），通过Box-Behnken设计-效应面法筛选提供了一种简单安全的处方工艺，制备出包封率较高、水溶性好的天然食品级MAG-WPI-NPs，以提高厚朴酚生物利用度，并利用WPI载体的药辅合一特性，实现协同增效作用，为临床上广泛开发应用难溶性药物MAG奠定基础。

1　仪器与试药

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1.1　仪器

Essentia LC-16高效液相色谱仪和Prominence-i LC-2030C 3D（日本SHIMADZU公司）；CPA225D型电子天平（美国奥豪斯仪器有限公司）；Spectra MAX Plus384型酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；UPH-Ⅱ-10T型优普超纯水制造系统（成都超纯科技有限公司）；JEM-1400plus型透射电子显微镜（日本电子株式会社）；WH620型加热磁力搅拌器（WIGGENS公司）；SCIENTZ-10N真空冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Biosafer900-92型超声波细胞破碎仪（南京赛飞生物科技有限公司）；SCIENTZ-10N型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Nano Brook 90 Plus-PALS粒度仪（美国Brookhaven公司）；HT7800型透射电子显微镜（日立公司）。

1.2　试剂与试药

厚朴酚（纯度：98%，成都德思特生物技术有限公司，批号P1936050）；厚朴酚对照品（纯度：98%，成都德思特生物技术有限公司，批号DST200701-035）；分离乳清蛋白（纯度：80%，上海源叶生物科技有限公司，批号SO9HS193941）；DPPH（纯度：80%，西安道生化工科技有限公司，批号R051727），临床分离大肠杆菌由成都农业科技职业学院实验室提供，乙腈和甲醇为HPLC级，无水乙醇为AR级，购自成都科隆化学品有限公司。

2　方法与结果

收起

2.1　MAG-WPI-NPs的制备

参考ZHOU等^[13]报道的去溶剂化法制备MAG-WPINPs。称取48 mg分离乳清蛋白超声溶于16 mL超纯水中，完全溶解后冰箱放置过夜以充分水化，为反溶剂相；将4 mg厚朴酚充分溶于1 mL无水乙醇中，为溶剂相。在缓慢搅拌的同时，使用注射器将厚朴酚乙醇溶液以1 mL·min^-1的速率缓慢滴入分离乳清蛋白溶液中，恒温磁力搅拌至乙醇完全除去后，在探针超声仪上匀化（功率900W，振幅10%，开2 s、关3 s，循环2min），最后过0.22 μm微孔滤膜以分离游离厚朴酚，即得MAG-WPINPs溶液。同法制备未载厚朴酚的空白WPI-NPs。

2.2　包封率、载药量的测定

2.2.1　包封率的测定

厚朴酚难溶于水，未包封的厚朴酚常以游离药物的形式存在于纳米制剂中，故通过滤过的方式除去游离厚朴酚。具体操作方法为取过膜前MAG-WPI-NPs共100 μL，加入900 μL甲醇超声30 min破坏纳米粒，采用HPLC测得的药物质量浓度为加入药物总量（W_t）；取过0.22 μm微孔滤膜后的MAG-WPI-NPs溶液100 μL，同上法处理后测得的质量浓度为被包封药物的量（W_e），包封率按下列公式求得。

2.2.2　载药量的测定

将MAG-WPI-NPs溶液冷冻干燥成粉末后，储存于干燥器中备用。取MAG-WPI-NPs冻干粉（W_总）适量，加入甲醇超声破坏纳米粒，冷却后加甲醇定容，采用HPLC测得的质量浓度为冻干粉中药物的量（W_药），载药量按下列公式求得。

2.2.3　厚朴酚HPLC含量测定

（1）色谱条件：色谱柱为Hypersil GOLD 5UM柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水-乙腈（50∶20∶30）；检测波长294 nm；柱温30℃；进样体积10 μL；保留时间15 min；体积流量为1.0 mL/min。

（2）对照品溶液的制备：取厚朴酚对照品2.00 mg，精密称定，置于容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得质量浓度为1 mg/mL的厚朴酚对照品母液。

（3）供试品溶液的制备：取MAG-WPI-NPs溶液100 μL，加入900 μL甲醇超声30 min以破坏纳米粒，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液，空白溶液同法制备。

（4）方法学考察：①专属性考察：分别取空白WPI-NPs供试品溶液、MAG-WPI-NPs供试品溶液和厚朴酚对照品溶液按2.2.3（1）项下色谱条件进行测定，色谱图见图1。结果空白WPI-NPs供试品溶液未出现干扰峰，且厚朴酚色谱峰峰型良好，供试品与对照品溶液出峰时间一致，表明该色谱方法专属性良好。

②线性关系考察：精密吸取2.2.3（2）项下配制的对照品溶液适量，用甲醇稀释配制成质量浓度分别为1000、500、250、125、62.50、31.25、15.63 μg/mL一系列对照品溶液，按2.2.3（1）项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），对应的峰面积为纵坐标（Y），得厚朴酚线性回归方程Y＝12 578X-65 027，R²＝0.999 1，表明厚朴酚在15.63～1000 μg/mL线性关系良好。

③精密度实验：取质量浓度为125 μg/mL的对照品溶液，连续测定6次，厚朴酚峰面积的RSD为0.04%，表明仪器精密度良好。

④重复性实验：按2.2.3（3）项下方法平行制得6份供试品溶液，再按2.2.3（1）项下色谱条件进样分析，结果显示厚朴酚质量分数的RSD为0.07%，表明该方法重复性良好。

⑤稳定性实验：取2.2.3.4项下供试品溶液适量，在室温下放置0、6、12、24、48 h，按2.2.3.1项下色谱条件进样测定厚朴酚含量，计算厚朴酚峰面积RSD为0.13%，结果显示供试品溶液在48 h内稳定性良好。

⑥加样回收率实验：取2.2.3（3）项下供试品溶液适量，分别加入浓度为15.63、125、500 μg/mL厚朴酚对照品溶液，按2.2.3（1）项下色谱条件进样测定，计算厚朴酚的加样回收率，结果显示厚朴酚的平均回收率为99.26%，RSD为0.59%，可见本实验回收率良好。

2.3　单因素实验考察MAG-WPI-NPs制备工艺

2.3.1　反溶剂/溶剂体积比

根据前期预实验结果，首先固定分离乳清蛋白/厚朴酚投料比10∶1，磁搅转速400 r/min、探超（45W、2 min）。考察反溶剂/溶剂体积比为4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1时对MAG-WPI-NPs包封率和粒径的影响，结果见表1。由表1可知，当反溶剂/溶剂体积比小于4∶1时，体系中含有较大比例的乙醇，包封率较低；随着反溶剂/溶剂体积比增加至8∶1及以上时，包封率显著增大；当反溶剂/溶剂比超过16∶1时，体系中较低的乙醇含量不能提供足够的去溶剂化能，即无法较好地排出蛋白结合空腔中的水使更多的厚朴酚进入其内，故包封率出现降低。本实验结果表明，反溶剂/溶剂体积比对MAG-WPI-NPs包封率影响较大，选择反溶剂/溶剂体积比为8∶1～16∶1进行后续Box-Behnken设计优化实验。

2.3.2　分离乳清蛋白/厚朴酚投料比

固定反溶剂/溶剂体积比12∶1、磁搅转速为400 r/min、探超（45 W、2 min）。考察分离乳清蛋白/厚朴酚投料比为6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1对MAG-WPI-NPs包封率和粒径的影响，结果见表2。随着分离乳清蛋白/厚朴酚投料比不断增大，纳米粒包封率呈增加的趋势，粒径无明显变化。当投料比为12∶1～16∶1时，纳米粒包封率趋向平稳，包封率在91.01%～92.50%，但粒径逐渐变大，同时考虑到乳清蛋白/厚朴酚投料比影响纳米粒的载药量，故选择乳清蛋白/厚朴酚投料比为10∶1～14∶1进行后续Box-Behnken设计优化实验。

2.3.3　探超时间

固定反溶剂/溶剂体积比12∶1、分离乳清蛋白/厚朴酚投料比10∶1、磁搅转速400 r/min、探超功率为45 W。考察探超时间0、1、3、5、7 min对MAG-WPI-NPs包封率和粒径的影响，结果见表3。探超1 min与不超声相比，包封率略降低，粒径因为超声强烈的剪切作用而变小；但探超3 min时，较长的探超时间破坏了纳米体系的稳定性使药物泄漏，导致包封率明显降低，故选择探超时间0～3 min进行进一步优化。

2.3.4　磁搅转速

固定反溶剂/溶剂体积比12∶1、分离乳清蛋白/厚朴酚投料比10∶1、探超（45W、2min）。考察磁搅转速200、400、600、800 r·min^-1对MAG-WPI-NPs包封率和粒径的影响，结果见表4。磁搅转速对包封率和粒径影响相对较小，故选择磁搅速度为400 r/min。

2.3.5　超声功率

固定反溶剂/溶剂体积比12∶1、分离乳清蛋白/厚朴酚投料比10∶1、磁搅转速400 r/min、探针超声时间2 min。考察超声功率45、90、180 W对MAG-WPI-NPs包封率和粒径的影响，结果见表5。超声功率在10 W时得到最优包封率和粒径，故选择超声功率为10 W。

2.4　Box-Behnken设计优化MAG-WPI-NPs制备工艺

2.4.1　Box-Behnken设计试验

基于单因素试验结果，选择对MAG-WPI-NPs制备过程中影响较大的3个参数作为考察因素，分别为反溶剂/溶剂体积比（X₁）、分离乳清蛋白/厚朴酚投料比（X₂）和探超时间（X₃），因单因素试验发现各因素对粒径影响较小，且粒径均符合标准，故以包封率（Y）作为评价指标，每个因素设置3水平，以代码值表示：-1（低水平）、0（中水平）、+1（高水平）。因素与水平及试验安排与结果见表6。

2.4.2　回归模型建立及方差分析

经Design Expert 10拟合后设计结果见表7，符合2次多项回归方程：Y＝97.86-0.286 2A-0.528 7B+1.85C-0.280 0AB+3.95AC+0.107 5BC-8.14A²+1.99B²-6.09C²，其显著性检验结果见表8，结果显示该模型F＝70.4，P<0.000 1（极显著），表明此方程的回归模型拟合良好，具有统计学意义；且模型的变异系数为1.02，失拟项P=0.051 2>0.05（不显著），表明该模型具有较好实验稳定性；决定系数和校正决定系数分别为0.9891、0.9750，表明模型具有良好的拟合程度；以上数据表明，该模型可用于预测和分析MAG-WPI-NPs的最佳制备工艺。

2.4.3　响应面优化与预测

根据拟合结果，绘制三维效应曲线图，各因素交互作用的三维效应面图和二维等高线图如插页ⅩⅩⅤ图2所示，其中固定1个因素，绘制另外2个因素的交互作用对包封率的影响情况。响应面图能直观反映交互作用对响应值的影响程度，由图中可知，反溶剂/溶剂体积比与探超时间的响应面陡峭，表明二者对MAG-WPI-NPs包封率的影响明显（P<0.05）。

2.4.4　处方验证

根据软件预测得到最佳制备工艺为反溶剂/溶剂体积比为12∶1、分离乳清蛋白/厚朴酚投料比为12∶1、探超时间为1.5 min，平行制备3批MAG-WPI-NPs，测定最佳制备工艺条件下的3个批次的包封率、粒径和PDI，与预测值相比较，计算实际值与预测值之间的偏差，结果见表9。3个批次的平均相对偏差为0.99%，可知实测值与预测值的结果相近且验证实验的重复性较好，证明使用Box-Behnken设计-效应面法优化MAG-WPI-NPs制备工艺结果可靠。

2.5　MAG-WPI-NPs制剂表征

2.5.1　纳米粒形态观察

由插页ⅩⅩⅤ图3可知，优化后的纳米粒外观澄清透明，微泛蓝光。使用TEM观察纳米粒的微观形貌，用滴管吸取少量MAG-WPI-NPs并滴加于专用铜网上，使用2.0%磷钨酸钠负染色，自然挥干后观察，TEM图显示纳米粒呈规则圆球状。

2.5.2　粒径、ζ电位的测定

按最优处方制备的MAGWPI-NPs，对其进行粒径和电位测定，结果见插页ⅩⅩⅥ图4、插页ⅩⅩⅥ图5。平行3组实验后MAG-WPI-NPs的平均粒径为（227.33±0.02）nm；多分散指数PDI为（0.136 9±0.26）%；ζ电位值为（-23.60±0.02）mV。结果表明，优化后的纳米粒直径在200 nm左右，且分布均一，体系带负电荷，呈现良好的稳定性。

2.5.3　纳米粒红外光谱分析

采用傅里叶变换红外吸收光谱仪（fourier transform infrared spectrometer，FTIR）进行红外光谱表征^[14]，研究其红外吸收特性，扫描范围为500～4500 cm^-1。记录数据，通过解析MAG、WPI、MAG-WPI-NPs以及MAGWPI复合物红外光谱的差异，判断厚朴酚是否成功负载在WPI上。结果如插页ⅩⅩⅥ图6，MAG-WPI-NPs与WPI存在相似的FTIR光谱，表明WPI和MAG之间没有形成新的共价键。MAG结构中存在酚羟基，在FT-IR图中3 153.54 cm^-1和1 230.16 cm^-1分别是-OH和C-O的伸缩振动峰，1 636.54 cm^-1是苯环骨架C＝C的伸缩振动峰；WPI主要成分有α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白，FT-IR图中在3 003.11 cm^-1处观察到，由于脂族基团的C-H拉伸引起的几个特征峰，证实了其存在；由于O-H键的伸缩，在3200～3600 cm^-1范围内的WPI光谱中出现了一个强峰，当MAG被包封到WPI后，3 288.66 cm^-1处的这种O-H拉伸振动略微移动到3 291.21 cm^-1，这表明WPI和MAG之间形成了氢键；图中C-O基团的拉伸振动在1600～1700 cm^-1区域出现酰胺I吸收带轨，并且在添加MAG后，该吸收带没有显著移动，同时随着MAG的加入，1500～1600 cm^-1区域的酰胺Ⅱ吸收带从1 541.56移动到1 539.66 cm^-1，表明WPI和MAG的C-N和N-H基团之间存在相互作用，此外，还发现添加MAG后酰胺Ⅰ和Ⅱ带的相对强度发生了变化，这表明WPI和MAG的结合之间可能存在静电排斥或疏水相互作用，证明通过自组装形成了纳米粒。综上，可以得出结论，纳米粒的成功制备是通过MAG和WPI分子间的非共价作用力自组装形成。

2.5.4　储存稳定性

将MAG-WPI-NPs分别置于室温25℃（35 d）和冰箱4℃（35 d）条件下，记录粒径和PDI值随储存时间的变化情况，结果见表10。可知纳米粒在室温6 d内粒径、PDI几乎无变化，从第7天开始粒径和PDI的增长变化速率明显加快但肉眼未见纳米粒团聚现象，到第7天开始出现不溶性微粒。纳米粒在4℃冰箱内放置35 d内粒径和PDI较稳定。

2.6　1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法测定MAG-WPI-NPs抗氧化活性

参考谢小丽等^[15]方法并根据实验稍作修改，称取39.4 mg DPPH加入10 mL无水乙醇中，超声2 min使其完全溶解，制备成10 mmol/L的DPPH母液并避光密封保存于4℃冰箱。用无水乙醇将DPPH母液稀释成0.1 mmol/L，分别吸取2 mL 0.5、1、2、4、8、16、32 mg/mL质量浓度的各样品溶液加入到2 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L）中，充分混匀，室温避光静置30 min，采用紫外可见分光光度计在517 nm处测定吸光值（A₁）。以2 mL无水乙醇替代样品溶液测定吸光度A₀，再以2 mL无水乙醇替代DPPH溶液并测定吸光度A₂，以Vc作为阳性对照，每个质量浓度的各样品和对照均重复3次，取平均值。

DPPH自由基清除率按以下公式计算。

结果见图7，MAG-WPI-NPs有一定清除DPPH自由基的能力，在0～1 mg/mL质量浓度范围内，MAG-WPI-NPs对DPPH自由基清除能力均随着质量浓度的增加而提高，清除率可达到82.58%，远高于游离药物，但低于VC。

2.7　MAG-WPI-NPs抗大肠杆菌作用研究

2.7.1　牛津杯扩散法测MAG-WPI-NPs抑菌活性

活化大肠杆菌并制成菌悬液，利用细胞计数板计算菌悬液浓度，并校正至10⁶ CFU/mL备用。在无菌条件下，用已灭菌的培养基制成平板，待冷却凝固后，分别加入200 μL菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀，冷却干燥待用。设MAG-WPI-NPs组（1 mg/mL）、MAG组（1 mg/mL），以去离子水为空白对照组。在制备好的平板中均匀放置3只无菌牛津杯，每只加入对应组溶液100 μL，每组平行3次，置于恒温培养箱中37℃条件下培养24 h，测量记录抑菌圈直径大小。结果如插页ⅩⅩⅥ图8所示，MAG-WPI-NPs（1 mg/mL）抑菌圈直径为（1.95±0.01）cm，MAG（1 mg/mL）抑菌圈直径为（1.41±0.01）cm，空白对照组抑菌圈直径为（0.5±0.01）cm，表明MAG-WPI-NPs较游离MAG有明显抑菌效果。

2.7.2　MAG-WPI-NPs抗菌MIC值测定

参考周蕙祯等^[16]并根据实验稍作修改，用试管2倍稀释法，测定MAGWPI-NPs对临床分离大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）^[17]。采用牛津杯抑菌法，方法同2.7.1，制备MAG-WPI-NPs（1 mg/mL），2倍稀释，将载有不同浓度的MAG-WPI-NPs溶液100 μL，分别加入牛津杯中，置于恒温培养箱中37℃条件下培养24 h，测定抑菌圈直径。结果表示，抑菌圈直径与MAG-WPINPs的质量浓度呈正相关，测得结果MIC浓度为0.25 mg/mL。

3　讨论

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厚朴的主要活性成分之一厚朴酚，是一种具有广泛药理活性的多酚类化合物，研究表明厚朴酚可以抗菌^[18]、抗癌^[19]、抗炎^[20]、抗氧化^[21]等，对神经^[22]、心血管^[23]和呼吸系统等^[24]均有明显的药理作用，极具开发价值，但厚朴酚水溶性差、生物利用度低等缺点严重限制了其临床应用^[25]。在本研究中，创新性设计了一种新型自组装纳米粒，以期促进厚朴酚开发应用。SAN区别于普通纳米粒的突出优点是对疏水性药物包封率高、药物泄漏少，能使难溶性药物的溶解度增加，且提高药物的包封率和载药量^[26]。SAN是在选择性溶剂中通过非共价键作用，如氢键、范德华力以及弱离子键作用，自发缔结成热力学稳定的纳米微粒。在体内环境中，SAN拥有比其他微粒分散体系更稳定，粒径更小、体内滞留时间更长等特点^[27]。在初步实验中，选择了天然食品级自组装材料分离乳清蛋白（WPI）作为载体，WPI是从蛋白质含量高于90%的奶酪中获得的一种重要副产品，其拥有良好的乳化性和优越的结构性能，已被广泛用作包封的载体材料^[28]。

在本研究中，采用去溶剂化法制备MAG-WPI-NPs，利用单因素考察结合Box-Behnken设计-效应面法成功优化了其制备工艺参数，以期将MAG更好包裹在WPI中来提高其水溶性和生物利用度。在体外药效研究发现，MAG与WPI形成的自组装纳米粒在抗氧化、抗大肠杆菌方面都具有明显的抑制作用，且与游离MAG相比具有显著性差异，这可能与本研究选用的WPI载体有关，研究表明，多酚可以通过共价键和非共价键与蛋白质相互作用，促进蛋白质之间的交联，从而改善其抗菌、抗氧化等性能^[29]。WPI还因其具有抗菌、抗炎和免疫调节等广泛的药理活性^[30]可与厚朴酚起到协同增效作用。NEAGU C等^[31]利用WPI为载体制备了蛋白-多酚复合物，发现多酚与WPI的主要结合力为疏水作用，且在自组装过程中采用探针超声可以促进多酚进入WPI内部，使之结合更加紧密，并表现出更好的抗氧化性和防降解能力。本实验响应面结果中亦发现探超时间与溶剂比的交互因素突出；在TEM下观察到MAG-WPI-NPs呈球形或类球形分布，证实了MAG与WPI自组装成功，此外图中观察到其外侧可能为双层结构，MAG可能经过层层扩散渗透，具有缓释效果和一定的防降解能力；同时FT-IR数据证实了MAG和WPI的疏水作用，WPI内核通过疏水性相互作用在特定条件下形成具有cross-β-折叠结构的有序聚合物，以达增溶、提高生物利用度的目的，且MAG作为疏水化合物，通过强疏水相互作用与WPI契合，从而使纳米颗粒结构更加紧凑。

综上，本实验创新性将厚朴酚与分离乳清蛋白自组装，通过单因素实验结合Box-Behnken设计-效应面法筛选制备了一种绿色安全、无毒无害的MAG-WPI-NPs，制备简单、工艺成熟，不仅解决厚朴酚溶解性差、生物利用度低的制剂难题，同时与分离乳清蛋白载体相辅相成、协同增效，充分发挥厚朴酚的治疗活性作用，在广泛应用治疗多种疾病上有巨大的应用前景，为厚朴酚综合利用和临床应用开发奠定基础。

基金

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国家自然科学基金青年科学基金项目(81603300)
四川省自然科学基金项目(2023NSFSC0661)

参考文献

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2025年第43卷第9期

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doi: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.09.013

首发时间：2026-10-30
出版时间：2025-09-10

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^1.成都中医药大学药学院西南特色中药资源国家重点实验室，四川成都 611137

^2.成都农业科技职业学院，四川成都 611130

通讯作者:

刘芳（1986-），女，四川成都人，高级实验师，硕士研究生导师，研究方向：中药炮制与中药制剂。E-mail：bittercaffe1@126.com。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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反溶剂/溶剂体积比	包封率/（%）	粒径/（nm）
4∶1	47.05±0.06	241.86±0.01
8∶1	76.38±0.32	248.43±0.02
12∶1	86.38±0.03	274.37±0.01
16∶1	81.97±0.02	287.00±0.02
20∶1	78.99±0.01	288.87±0.02

反溶剂/溶剂体积比

包封率/（%）

粒径/（nm）

4∶1

47.05±0.06

241.86±0.01

8∶1

76.38±0.32

248.43±0.02

12∶1

86.38±0.03

274.37±0.01

16∶1

81.97±0.02

287.00±0.02

20∶1

78.99±0.01

288.87±0.02

分离乳清蛋白/厚朴酚投料比	包封率/（%）	粒径/（nm）
8∶1	53.63±0.03	248.80±0.04
10∶1	58.73±0.00	275.63±0.02
12∶1	92.50±0.05	260.57±0.03
14∶1	92.61±0.89	290.57±0.01
16∶1	91.01±0.04	359.93±0.03

分离乳清蛋白/厚朴酚投料比

包封率/（%）

粒径/（nm）

8∶1

53.63±0.03

248.80±0.04

10∶1

58.73±0.00

275.63±0.02

12∶1

92.50±0.05

260.57±0.03

14∶1

92.61±0.89

290.57±0.01

16∶1

91.01±0.04

359.93±0.03

探超时间/（min）	包封率/（%）	粒径/（nm）
0	92.53±0.08	380.80±0.09
1	99.67±0.11	276.43±0.04
3	91.15±0.02	262.57±0.71
5	91.20±0.08	239.60±0.02
7	91.11±0.02	239.27±0.01

探超时间/（min）

包封率/（%）

粒径/（nm）

92.53±0.08

380.80±0.09

99.67±0.11

276.43±0.04

91.15±0.02

262.57±0.71

91.20±0.08

239.60±0.02

91.11±0.02

239.27±0.01

磁搅转速/（r/min）	包封率/（%）	粒径/（nm）
200	93.21±0.03	269.97±0.01
400	95.51±0.04	262.53±0.05
600	94.84±0.01	263.40±0.05

磁搅转速/（r/min）

包封率/（%）

粒径/（nm）

200

93.21±0.03

269.97±0.01

400

95.51±0.04

262.53±0.05

600

94.84±0.01

263.40±0.05

超声功率/（W）	包封率/（%）	粒径/（nm）
0	90.28±0.04	281.27±0.03
10	95.19±0.01	240.20±0.02
30	91.58±0.07	247.00±0.03
50	90.89±0.08	270.73±0.02

超声功率/（W）

包封率/（%）

粒径/（nm）

90.28±0.04

281.27±0.03

95.19±0.01

240.20±0.02

91.58±0.07

247.00±0.03

90.89±0.08

270.73±0.02

水平		因素
-1	8	10	0
0	12	12	1
1	16	14	3

水平

因素

X₁/（%）

X₂

X₃/（%）

-1

实验号	X₁/（%）	X₂值	X₃/（%）	包封率/（%）
1	8	12	1.5	92.26
2	16	12	1.5	91.51
3	8	16	1.5	92.47
4	16	16	1.5	90.60
5	8	14	0	85.03
6	16	14	0	77.29
7	8	14	3.0	82.06
8	16	14	3.0	90.13
9	12	12	0	93.51
10	12	16	0	91.53
11	12	12	3.0	95.77
12	12	16	3.0	94.22
13	12	14	1.5	98.56
14	12	14	1.5	97.58
15	12	14	1.5	98.25
16	12	14	1.5	97.37
17	12	14	1.5	97.56

实验号

X₁/（%）

X₂值

X₃/（%）

包封率/（%）

1.5

92.26

1.5

91.51

1.5

92.47

1.5

90.60

85.03

77.29

3.0

82.06

3.0

90.13

93.51

91.53

3.0

95.77

3.0

94.22

1.5

98.56

1.5

97.58

1.5

98.25

1.5

97.37

1.5

97.56

方差来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
Model	558.04	9	62.00	70.4	<0.000 1	**
A-溶剂比	0.655 5	1	0.655 5	0.744 3	0.416 9
B-投药比	2.24	1	2.24	2.54	0.155 1
C-探超时间	27.45	1	27.45	31.17	0.000 8	**
AB	0.313 6	1	0.313 6	0.356 1	0.569 5
AC	62.49	1	62.49	70.95	<0.000 1	**
BC	0.046 2	1	0.046 2	0.052 5	0.825 3
A2	279.12	1	279.12	316.92	<0.000 1	**
B2	16.64	1	16.64	18.89	0.003 4	**
C2	156.39	1	156.39	177.57	<0.000 1	**
残差	6.17	7	0.880 7
失拟项	5.11	3	1.70	6.49	0.051 2
净误差	1.05	4	0.262 6
总和	564.21	16

方差来源

平方和

自由度

均方

F值

P值

显著性

Model

558.04

62.00

70.4

<0.000 1

A-溶剂比

0.655 5

0.744 3

0.416 9

B-投药比

2.24

2.54

0.155 1

C-探超时间

27.45

31.17

0.000 8

0.313 6

0.356 1

0.569 5

62.49

70.95

<0.000 1

0.046 2

0.052 5

0.825 3

279.12

316.92

<0.000 1

16.64

18.89

0.003 4

156.39

177.57

<0.000 1

残差

6.17

0.880 7

失拟项

5.11

1.70

6.49

0.051 2

净误差

1.05

0.262 6

总和

564.21

批次	包封率	实测值	预测值	偏差
1	97.92	98.57±0.46	98.99	0.99%
2	98.99
3	98.80

批次

包封率

实测值

预测值

偏差

97.92

98.57±0.46

98.99

0.99%

98.99

98.80

t/（d）	室温/25℃	t/（d）	4℃
0	221.77±0.37	10.13±0.32	0	226.67±0.01	16.83±0.22
3	233.57±0.02	4.47±1.15	7	254.70±0.04	19.43±0.09
6	258.93±0.02	12.43±0.13	15	259.70±0.01	15.87±0.21
7	310.33±0.04	21.70±0.18	25	257.03±0.05	17.77±0.31
35	367.33±0.08	25.10±0.06	35	261.83±0.05	21.60±0.14

t/（d）

室温/25℃

t/（d）

4℃

平均粒径

PDI

平均粒径

PDI

221.77±0.37

10.13±0.32

226.67±0.01

16.83±0.22

233.57±0.02

4.47±1.15

254.70±0.04

19.43±0.09

258.93±0.02

12.43±0.13

259.70±0.01

15.87±0.21

310.33±0.04

21.70±0.18

257.03±0.05

17.77±0.31

367.33±0.08

25.10±0.06

261.83±0.05

21.60±0.14