中华中医药学刊

引物	序列（5’→3’）
LncRNA CASC9	正义链：CTTTTCTGGAACATAGCCTGTGA
	反义链：ATAGTGCCAATGACTCTCCAGC
E2F7	正义链：AGCATCCAACGCACACATCG
	反义链：CGTGACTGGTTCCTTTCTCTTCT
GAPDH	正义链：ACCCACTCCTCCACCTTTGA
	反义链：CCACCCTGTTGCTGTAGCCA
miR-195-5p	正义链：CGCAGCACAGAAATATTGGC
	反义链：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC
U6	正义链：CTCGCTTCGGCAGCACA
	反义链：AACGCTTCACGAATTTGCGT

引物	序列（5’→3’）
LncRNA CASC9	正义链：CTTTTCTGGAACATAGCCTGTGA
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LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7信号通路在二氢杨梅素抑制食管鳞状细胞癌增殖和转移中的作用研究

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郑璇 ¹ , 黄兰香 ² , 崔逸爽 ¹ , 吴亚男 ¹ , 洪紫谦 ¹ , 张梦诗 ¹ , 孙国贵 ²

中华中医药学刊 | 国家项目点击 2025,43(8): 65-70

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中华中医药学刊 |国家项目点击 2025 , 43 (8) : 65 -70

LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7信号通路在二氢杨梅素抑制食管鳞状细胞癌增殖和转移中的作用研究

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郑璇¹, 黄兰香², 崔逸爽¹, 吴亚男¹, 洪紫谦¹, 张梦诗¹, 孙国贵²

作者信息

^1.华北理工大学公共卫生学院，河北唐山 063200

^2.华北理工大学附属医院，河北唐山 063000

通讯作者:

孙国贵（1980-），男，河北唐山人，主任医师，研究方向：胸部肿瘤非编码RNA的功能机制及小分子药物筛选。E-mail：guogui_sun2021@sina.com。

作者简介:

郑璇（1992-），女，河北唐山人，主管检验技师，博士，研究方向：胸部肿瘤非编码RNA的功能机制及小分子药物筛选。

Research on Role of LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7 Signaling Pathway in Dihydromyricetin Inhibiting Proliferation Andmetastasis of Esophageal Squamous Cell Carcinoma

Xuan ZHENG¹, Lanxiang HUANG², Yishuang CUI¹, Yanan WU¹, Ziqian HONG¹, Mengshi ZHANG¹, Guogui SUN²

Affiliations

^1.School of Public Health，North China University of Science and Technology，Tangshan 063200，Hebei，China

^2.North China University of Science and Technology Affiliated Hospital，Tangshan 063000，Hebei，China

出版时间: 2025-08-10 doi: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.08.015

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摘要

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目的

探讨二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）对食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）增殖和转移的影响及是否由LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7轴介导。

方法

采用梯度浓度（0、25、50、100μmol/L）的DMY处理ESCC细胞，以探究DMY对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。利用生物信息学手段预测了ESCC中LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7轴之间是否存在相互作用。实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）实验检测细胞中LncRNA CASC9、miR-195-5p和E2F7的表达，RT-qPCR、蛋白免疫印迹（Western blot）和双荧光素酶报告基因实验进一步验证其调控关系。通过细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8，CCK-8）、集落形成、划痕以及Transwell侵袭实验分别检测细胞活性、增殖、迁移以及侵袭能力。应用Western blot实验检测上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）标志物如E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（NCadherin）、波形蛋白（Vimentin）的表达。

结果

DMY可以显著抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭。生物信息学分析及细胞水平验证发现LncRNA CASC9在ESCC中高表达，DMY处理后可通过下调ESCC细胞中LncRNA CASC9的表达水平，从而抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭。此外，miR-195-5p在ESCC中表达下调，而E2F7表达上调。RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因实验进一步证实LncRNA CASC9通过吸附miR-195-5p进而调控E2F7的表达。敲低E2F7可以逆转敲低miR-195-5p对ESCC细胞增殖、转移以及EMT进程的促进作用，而过表达E2F7可逆转过表达miR-195-5p产生的抑制作用。

结论

DMY可通过LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7轴抑制ESCC的增殖和转移。

关键词

二氢杨梅素 / LncRNA CASC9 / miR-195-5p / E2F7 / 食管鳞癌 / 转移

Abstract

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Objective

To investigate the effect of dihydromyricetin（DMY）on proliferation and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）and whether it is mediated by the LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7 axis.

Methods

Gradient concentrations（0，25，50，100μmol/L）of DMY were used to treat ESCC cells in order to investigate the effects of DMY on ESCC cells proliferation，migration and invasion.The possible interaction between the LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7 axis in ESCC was predicted using bioinformatics.Real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）assay was used to detect the expressions of LncRNA CASC9，miR-195-5p and E2F7 in cells，and the regulation relationship was confirmed using RT-qPCR，Western blot and double luciferase reporter gene assays.In order to test the cell viability，proliferation，migration and invasion ability，cell counting kit-8（CCK-8），colony formation，wound healing and Transwell invasion assays were used respectively.Western blot assay was used to test the expressions of epithelial mesenchymal transition（EMT）markers E-cadherin，NCadherin and Vimentin.

Results

The proliferation，migration and invasion abilities of ESCC cells were significantly inhibited by DMY.LncRNA CASC9 was hyperexpressed in ESCC by bioinformatics analysis and cell level verification.The proliferation，migration and invasion abilities of ESCC cells were inhibited by DMY treatment leaded to by down-regulating the expression level of LncRNA CASC9 in ESCC cells.Furthermore，the miR-195-5p expression was down-regulated in ESCC while E2F7 expression was up-regulated.RT-qPCR，Western blot and double luciferase reporter gene assays all confirmed that LncRNA CASC9 regulated E2F7 expression by adsorbing miR-195-5p.E2F7 knocking down-reversed the promotion of miR-195-5p knocking down on the proliferation，metastasis and EMT process of ESCC，whereas E2F7 overexpression reversed the inhibition of miR-195-5p overexpression.

Conclusion

DMY inhibits ESCC proliferation and metastasis via the LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7 axis.

Key words

dihydromyricetin / LncRNA CASC9 / miR-195-5p / E2F7 / esophageal squamous cell carcinoma / metastasis

引用本文

郑璇, 黄兰香, 崔逸爽, 吴亚男, 洪紫谦, 张梦诗, 孙国贵. LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7信号通路在二氢杨梅素抑制食管鳞状细胞癌增殖和转移中的作用研究. 中华中医药学刊, 2025 , 43 (8) : 65 -70 . DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.08.015

Xuan ZHENG, Lanxiang HUANG, Yishuang CUI, Yanan WU, Ziqian HONG, Mengshi ZHANG, Guogui SUN. Research on Role of LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7 Signaling Pathway in Dihydromyricetin Inhibiting Proliferation Andmetastasis of Esophageal Squamous Cell Carcinoma[J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2025 , 43 (8) : 65 -70 . DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.08.015

正文

收起

食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是目前食管癌的主要组织学类型，占所有病例的90%^[1]，其特点是高侵袭性、复发性和转移性^[2]。尽管包括放化疗和手术在内的诊疗技术取得了进步，但大多数患者诊断时已为晚期，并且由于复发和转移，ESCC患者的预后仍然不理想^[3-4]，5年总生存率仅为10%～30%^[5]。因此，探索ESCC发生转移的潜在机制，对发掘ESCC早期诊断和治疗的新型生物标志物和治疗靶点具有重要意义。

近年来，天然产物已成为抗肿瘤药物研发的热点^[6]。二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY）是葡萄属植物藤茶的提取物，是藤茶中的主要活性成分黄酮类化合物，具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种奇特功效^[7-8]。一项研究报道，DMY通过抑制AKT/stat3信号通路的激活和HMGB1的表达来抑制胃癌细胞的增殖和迁移^[9]。然而，DMY在ESCC转移中的作用以及潜在机制尚未得到充分地阐明。因此，DMY在ESCC转移中的作用值得进一步研究。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs，LncRNAs）已被证实与许多肿瘤的发展有关^[10]。例如，LncRNA CASC9在ESCC^[11]、胃癌^[12]和口腔鳞状细胞癌^[13]中高表达，促进肿瘤增殖、迁移和侵袭的作用。然而，LncRNA CASC9在ESCC增殖和转移中潜在作用机制尚不明。许多LncRNAs含有miRNA反应元件和结合位点，通过充当“miRNA海绵”来调节基因表达从而影响癌症的生长和进展^[14]。我们通过starbase数据库预测发现，LncRNA CASC9和miR-195-5p存在结合位点，且E2F7可能是miR-195-5p的靶基因。因此，本文旨在探讨DMY在ESCC细胞生物学行为中的作用以及DMY通过LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7轴在ESCC细胞转移中的功能。

1　材料与方法

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1.1　细胞和主要试剂

人ESCC细胞系（KYSE-150、KYSE-30以及ECA109）以及人正常食管上皮细胞（HEEC）购自北京北纳创联生物技术研究院；RPMI-1640培养基、F-12培养基、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）、细胞冻存液和细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8，CCK-8）购自北京中生奥邦生物科技有限公司；opti-MEM培养基、胎牛血清（Fetal calf serum，FBS）和Matrigel基质胶购自美国Corning公司；DMY购自上海陶术生物科技有限公司；Lipofectamine 2000和Trizol购自美国Invitrogen公司；普通实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒购自日本Takara公司；miRNA专用RT-qPCR试剂盒购自北京金百特生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、10%SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、聚偏二氟乙烯膜、ECL化学发光检测试剂盒购自上海雅酶生物医药科技有限公司；一抗兔抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-Cadherin）、波形蛋白（Vimentin）以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、二抗山羊抗兔IgG抗体购自美国Proteintech公司；小干扰RNA（si-CASC9、si-E2F7）及其阴性对照（si-NC）、miR-195-5p抑制剂（inhibitor-miR-195-5p）及其阴性对照（inhibitor-NC）、miR-195-5p模拟物（mimics-miR-195-5p）及其阴性对照（mimics-NC）由广州锐博生物科技有限公司设计并合成；过表达质粒（pcDNA3.1-CASC9和pcDNA3.1-E2F7）及其阴性对照（pcDNA3.1）、野生型和突变型LncRNA CASC9（CASC9-WT/MUT）及野生型和突变型E2F7（E2F7-WT/MUT）双荧光素酶报告基因质粒、LncRNA CASC9、E2F7、GAPDH、miR-195-5p和U6引物由北京西贝宏程生物科技有限公司设计并合成。

1.2　生信分析

使用starbase数据库预测与LncRNA CASC9具有相互作用的miRNA，选取在ESCC中低表达的miRNA，随后计算miRNA与LncRNA CASC9表达的相关性。进一步利用starbase、miRabel、miRDB和targetScan数据库预测miRNA的下游调控mRNA，取交集选取目的mRNA，并通过starbase数据库计算miRNA与mRNA表达的相关性。此外，从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库获得ESCC患者癌和癌旁的RNA-seq数据和miRNA数据（level3），通过R语言v4.0.3软件计算LncRNA CASC9、miRNA以及mRNA在ESCC癌和癌旁中的表达量并通过ggplot2包进行可视化。

1.3　细胞培养

KYSE-150和KYSE-30细胞培养于含45%RPMI-1640+45%F-12+10%FBS的完全培养基；ECA109细胞培养于含90%RPMI-1640+10%FBS的完全培养基；HEEC细胞培养于含90%DMEM+10%FBS的完全培养基，培养条件为37℃、5%CO₂。待细胞生长密度达90%以上时，进行后续实验研究。

1.4　细胞转染

将对数生长期细胞按3×10⁵个/孔接种到6孔板，待细胞生长汇合度达70%～90%时，按照Lipofectamine 2000试剂说明书要求将si-NC、si-CASC9、si-E2F7、pcDNA3.1、pcDNA3.1-CASC9、pcDNA3.1-E2F7、mimics-NC、mimics-miR-195-5p、inhibitor-NC以及inhibitor-miR-195-5p单独或联合转染至细胞。

1.5　总RNA提取和定量实时荧光定量聚合酶链反应（Realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）

使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，接下来，超微量分光光度计（Molecular Devices，SpectraMaxQuickDrop）测定RNA的浓度。将获得的RNA按照Takara公司或金百特公司逆转录试剂盒说明书操作获得互补DNA（complementary DNA，cDNA）模板。随后，使用各自对应的qPCR试剂盒制备反应系统，于荧光定量PCR仪（Thermo Fisher Scientific，QuantStudio3）上进行反应。实验条件如下：检测LncRNA CASC9和E2F7以GAPDH作为内参，反应程序：95℃30 s、95℃5 s、60℃34 s、40个循环；检测miR-195-5p以U6作为内参，反应程序：94℃3 min、94℃10 s、60℃34 s、40个循环。使用2^-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达水平。引物序列如表1。

1.6　蛋白免疫印迹（Western blot）实验

应用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白质，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。随后，将其转移至聚偏二氟乙烯膜上，于含5%脱脂奶粉的TBST中室温下封闭1 h。接下来，将膜置于稀释的一抗溶液E-cadherin（1∶5000）、N-Cadherin（1∶2000）、Vimentin（1∶2000）、GAPDH（1∶5000）中，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。将膜在与一抗种属对应的二抗（1∶5000）室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL底物试剂盒以及凝胶成像系统（Azure biosystems，c300）检测蛋白表达。

1.7　CCK-8实验

将细胞按5×10³ 个/孔接种于96孔板中，置于37℃、5%CO₂ 培养箱静置16 h，使细胞完全恢复形态，用梯度浓度（0、6.25、12.5、25、50、100μmol/L）DMY处理细胞24 h；用DMY联合转染剂或者单独转染剂处理细胞24 h，按2×10³个/孔接种于96孔板中，置于培养箱中继续培养细胞24、48、72和96 h。随后在相应孔中加入CCK-8溶液（10 μL/100μL培养基），37℃孵育2 h，随后应用酶标仪（Thermo Fisher Scientific，Multiskan FC）在450 nm 波长处测定吸光度值。

1.8　集落形成实验

将处理后细胞按2×10³个/孔接种于6孔板中，7～10 d后终止培养，用甲醇固定15 min，1%结晶紫溶液染色15 min，对染色的细胞集落进行拍照和计数。

1.9　划痕实验

将处理后细胞按3×10⁵个/孔接种于6孔板中，于37℃、5%CO₂培养箱培养48 h。用200μL枪头在孔内均匀划出一道直线，PBS冲洗，加入无血清培养基后拍照。然后，将细胞继续培养，24 h后用显微镜捕捉划痕区域的图像。划痕面积用image J软件（version 1.46）测量，并计算迁移率，迁移率＝（0 h划痕面积-24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.10　Transwell侵袭实验

将matrigel胶在4℃下融化，随后取50μL的matrigel胶混合液（matrigel：opti-MEM培养基＝1∶8）滴入transwell上室，在37℃培养箱中孵育2 h。收集处理后细胞，用opti-MEM培养基重悬制备单细胞悬液，按1×10⁵个/室接种于transwell上室，transwell下室加入600μL含20%FBS的完全培养基。培养24 h后，将小室底部在甲醇溶液中固定15 min，1%结晶紫溶液染色15 min，自来水冲洗，棉签去除上层细胞。随后风干小室滤膜，用手术刀片剔下整张滤膜，底面朝上平铺于载玻片上，加盖盖玻片，中性树胶封片，选取有代表性的区域进行拍摄并计数。

1.11　双荧光素酶报告基因实验

利用Lipofectamine2000将mimics-NC或mimics-miR-195-5p和LncRNA CASC9-WT/MUT或E2F7-WT/MUT双荧光素酶报告基因质粒共转染ESCC细胞。转染48 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行处理，使用发光光度计（Promega，GloMax®20/20）检测荧光素酶活性并计算其比值。

1.12　统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行实验数据分析，Graphpad Prism 7.0软件进行图像绘制，计量资料表示为平均数±标准差（

）。如LncRNA CASC9在ESCC患者肿瘤组织及邻近癌旁组织比较等计量资料，使用独立样本t检验进行两组间比较，如梯度浓度DMY对ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响，使用单因素方差分析进行比较，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

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2.1　DMY抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭

为了探究DMY在ESCC细胞生物学中的抗肿瘤活性，使用梯度浓度DMY（0、6.25、12.5、25、50、100μmol/L）处理KYSE-150和KYSE-30细胞24 h并通过CCK-8实验检测细胞活性。结果显示，与对照组相比，DMY以剂量依赖性方式抑制细胞活性，且高浓度DMY（25、50、100μmol/L）具有显著抑制效果（插页ⅩⅢ图1A）。DMY对KYSE-150和KYSE-30细胞的IC50值分别为99.38μmol/L和91.72μmol/L。集落形成、划痕以及Transwell侵袭实验结果表明，DMY显著抑制KYSE-150和KYSE-30细胞的增殖、迁移和侵袭能力，且抑制效果呈剂量依赖性（插页ⅩⅢ图1B-图1D）。

2.2　DMY可以下调LncRNA CASC9的表达，抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭

生物信息学分析发现LncRNA CASC9在ESCC患者肿瘤组织的表达显著高于邻近癌旁组织（插页ⅩⅣ图2A）。RT-qPCR实验检测正常食管上皮细胞HEEC和ESCC细胞系KYSE-150、KYSE-30和ECA109中LncRNA CASC9的表达水平，进一步证实LncRNA CASC9在ESCC中显著上调（插页ⅩⅣ图2B）。DMY（50μmol/L）处理导致KYSE-150和KYSE-30细胞中LncRNA CASC9的表达水平显著低于未处理组（插页ⅩⅣ图2C）。接下来，探究DMY联合LncRNA CASC9对ESCC细胞活性和增殖能力的影响。由于先前研究显示KYSE-150细胞中LncRNA CASC9表达水平相对较高，而KYSE-30细胞相对较低，故后续实验对KYSE-150细胞进行敲低处理，KYSE-30细胞进行过表达处理，RT-qPCR实验验证敲低或过表达效果（插页ⅩⅣ图2D）。CCK-8和集落形成实验结果表明敲低LncRNA CASC9显著抑制KYSE-150细胞活性和增殖能力，而DMY处理后增强了该抑制作用。相反，过表达LncRNA CASC9则显著促进KYSE-30细胞活性和增殖能力，而DMY处理后减弱了该促进作用（插页ⅩⅣ图2E-图2F）。

此外，应用划痕和Transwell侵袭实验进一步评估了DMY联合LncRNA CASC9对ESCC细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示，敲低LncRNA CASC9显著抑制KYSE-150细胞的迁移和侵袭能力，而添加DMY处理后增强这种抑制作用。相反地，过表达LncRNA CASC9显著促进KYSE-30细胞的迁移和侵袭能力，而添加DMY处理后减弱这种促进作用（插页ⅩⅤ图3A-图3B）。最后，Western blot实验检测上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白（E-cadherin、N-Cadherin、Vimentin）的表达，分析DMY联合LncRNA CASC9对细胞EMT的影响。结果显示，敲低LncRNA CASC9显著促进KYSE-150细胞中E-cadherin的表达，抑制Ncadherin和Vimentin的表达，而添加DMY进一步增强该效应。相反，过表达LncRNA CASC9则显著抑制KYSE-30细胞中E-cadherin的表达，促进N-Cadherin和Vimentin的表达，而添加DMY后部分逆转该效应（插页ⅩⅤ图3C）。

2.3　LncRNA CASC9靶向miR-195-5p调节E2F7的表达

为了探究LncRNA CASC9的下游调控机制，通过starbase数据库预测LncRNA CASC9靶向的miRNA，发现LncRNA CASC9与miR-195-5p存在结合位点，进一步预测显示LncRNA CASC9与miR-195-5p的表达水平显著负相关（插页ⅩⅥ图4A）。生物信息学分析和RT-qPCR实验验证分别显示miR-195-5p在ESCC组织和细胞中的表达水平显著下调（插页ⅩⅥ图4B-图4C）。接下来，将含有LncRNA CASC9-WT或LncRNA CASC9-MUT的双荧光素酶报告基因质粒与mimics-NC或mimics-miR-195-5p共转染到ESCC细胞，并进行荧光素酶基因报告测定。结果显示，过表达miR-195-5p会降低野生型LncRNA CASC9 3’-UTR荧光素酶活性（插页ⅩⅥ图4D-图4F）。此外，RT-qPCR结果显示敲低LncRNA CASC9可以显著提高miR-195-5p的表达，过表达LncRNA CASC9则显著降低miR-195-5p的表达（插页ⅩⅥ图4G）。

接着，使用starbase、miRabel、miRDB和targetScan数据库发现miR-195-5p与E2F7存在互补结合位点，表明E2F7为miR-195-5p的潜在靶点（插页ⅩⅦ图5A）。应用starbase数据库进行相关性分析显示miR-195-5p与E2F7的表达水平显著负相关（插页ⅩⅦ图5B）。生物信息学分析和RT-qPCR实验验证分别显示E2F7在ESCC组织和细胞中的表达水平显著上调（插页ⅩⅦ图5C-图5D）。为了进一步验证miR-195-5p与E2F7的结合关系，利用双荧光素酶实验验证两者的靶向结合关系，实验结果显示E2F7是miR-195-5p的直接靶标（插页ⅩⅦ图5E-图5F）。最后，分别用si-CASC9和in-miR-195-5p单独或共转染KYSE-150细胞，用pcDNA3.1-CASC9和mimics-miR-195-5p单独或共转染KYSE-30细胞，随后RT-qPCR和Western blot实验检测E2F7的表达水平。与si-NC+in-NC组相比，转染si-CASC9+in-NC后E2F7的表达水平显著降低，而共转染si-CASC9+in-miR-195-5p后E2F7的表达恢复到si-NC+in-NC组水平（插页ⅩⅦ图5G-图5H）；与pcDNA3.1+mimics-NC组相比，转染pcDNA3.1-CASC9+mimics-NC后E2F7的表达水平显著升高，而共转染pcDNA3.1-CASC9+mimics-miR-195-5p后E2F7的表达恢复到pcDNA3.1+mimics-NC组水平（插页ⅩⅦ图5I-图5J）。上述结果表明，LncRNA CASC9可以通过吸附miR-195-5p调控E2F7的表达。

2.4　miR-195-5p靶向E2F7抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭

为了证实miR-195-5p可能通过直接调节E2F7来影响ESCC细胞的恶性表型，分别用in-miR-195-5p和si-E2F7单独或共转染KYSE-150细胞，用mimics-miR-195-5p和pcDNA3.1-E2F7单独或共转染KYSE-30细胞，RTqPCR和Western blot实验验证E2F7的敲降或过表达效果（插页ⅩⅧ图6A-图6B）。随后，通过CCK-8、集落形成、划痕以及Transwell侵袭实验评估不同处理方式对ESCC细胞恶性表型的影响。结果显示，敲降miR-195-5p明显促进了KYSE-150细胞活性以及细胞的增殖、迁移和侵袭能力，进一步敲降E2F7可以逆转敲降miR-195-5p产生的促进作用；过表达miR-195-5p明显抑制了KYSE-30细胞活性以及细胞的增殖、迁移和侵袭能力，进一步过表达E2F7可以逆转过表达miR-195-5p产生的抑制作用（插页ⅩⅧ图6C-图6F）。此外，通过Western bolt实验评估不同处理方式对ESCC细胞EMT进程的影响。结果显示，敲降miR-195-5p显著抑制KYSE-150细胞中E-cadherin的表达，促进N-cadherin和Vimentin的表达，敲降E2F7后可逆转该效应；过表达miR-195-5p则显著促进KYSE-30细胞中E-cadherin的表达，抑制N-cadherin和Vimentin的表达，过表达E2F7后可逆转该效应（插页ⅩⅧ图6G）。总之，miR-195-5p靶向E2F7抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭。

3　讨论

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藤茶最早在《茶经》中被提及，之后人们在长期茶饮总结出其在抵抗疾病方面的潜力及药用价值，遂应用于医学治疗。中草药专著《中华本草》等都有对藤茶的相关记载。现代药理研究进一步揭示了藤茶中的关键成分二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY或DHM，也称为蛇葡萄素Ampelopsin，AMP）是其主要活性化合物，具有抗肿瘤、抗氧化和抗炎等多种药理作用。藤茶扮演着重要的药效角色，并成为当前研究的焦点。ESCC是一类预后差、恶性程度高、治愈率极低的肿瘤，尽管手术、放疗和化疗取得了较大的进展，但大多数转移性患者的治疗选择仍然有限^[15]。因此，寻找创新有效的候选药物及治疗靶点对改善目前的ESCC疗效至关重要。由于中药被认为含有具有潜在抗癌特性的化合物，从中草药中分离出的活性成分已逐渐被开发为新型治疗剂^[16]。本研究证实DMY可以通过LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7轴抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭，这一结果为DMY在ESCC中发挥抗肿瘤作用提供了新的证据。

我国传统中医药资源丰富，种类众多，已累积了大量在肿瘤治疗方面的实践经验。研究和开发中药中的活性成分，特别是那些具有低毒性和高效性的成分，展示了在肿瘤辅助治疗领域的巨大潜力^[17-21]。自然来源的草药化合物被视为抑制癌症增长和转移的有效选择；大部分从植物中提取的化合物在癌细胞中表现出显著的细胞毒性，成为未来药物开发的重要候选。DMY这种自然的黄酮类化合物主要从藤茶、枳椇子等植物的嫩茎叶中提取，含量可达38.5%^[22]。目前的研究已经证明DMY具有多种生物活性，包括抗氧化、抗癌、解酒和保护肝脏等，它通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、逆转药物耐药性以及减少癌细胞转移等机制发挥抗肿瘤作用^[23]。DMY黄酮类化合物在抑制肿瘤进展中起到抗转移作用。比如在宫颈癌中，DMY通过ERK1/2/β-catenin途径降低S100A4的表达，从而抑制肿瘤细胞迁移和侵袭^[24]；在胆管癌中，DMY通过下调miR-21的表达来抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭并促进细胞凋亡^[25]。本研究的结果表明DMY可以降低ESCC细胞中LncRNA CASC9的表达水平。LncRNA CASC9是多种癌症的致癌基因。在膀胱癌中，LncRNA CASC9海绵miR-758-3p通过上调TGF-β2促进膀胱癌增殖和EMT^[26]。此外，STAT3激活的LncRNA CASC9通过增强H3K27ac激活的SOX4促进乳腺癌侵袭和淋巴管的形成^[27]。我们发现DMY通过抑制ESCC细胞中LncRNA CASC9的表达，从而抑制细胞增殖、迁移和侵袭。过表达LncRNA CASC9可以促进ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭，而添加DMY可以部分逆转这种细胞表型。结合以上研究结果，我们推测DMY可通过多靶点多机制抑制多种肿瘤的增殖和转移。

LncRNAs影响下游基因表达的方式很多，最重要也是最常见的一种方式是作为miRNA的ceRNA，进一步调控miRNA下游mRNA 的表达，这种调控方式也被简单地总结为lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。如LncRNA LINC00680通过海绵吸附miR-423-5p来促进PAK6的表达，进而促进ESCC的增殖、迁移和侵袭^[28]。LncRNA LOC146880通过miR-328-5p/FSCN1/MAPK轴促进ESCC的增殖、侵袭、迁移和EMT^[29]。本研究利用生信数据库预测LncRNA CASC9的下游靶miRNA以及对应的靶基因mRNA，结果发现了LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7调控轴，随后通过细胞功能实验以及双荧光素酶报告基因实验证实LncRNA CASC9可以作为miR-195-5p的分子海绵，进而促进E2F7的表达。以上研究结果提示，ESCC中存在复杂的lncRNAs-miRNAs网络调控细胞增殖和转移。

miR-195-5p已被证实在多种肿瘤（包括ESCC、结直肠癌、三阴性乳腺癌）中发挥抑癌基因作用^[30-32]。如miR-195-5p靶向YAP1抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT^[33]；miR-195-5p通过FOXK1抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭^[34]。此外，FANG K等^[35]发现miR-195-5p是LncRNA FGD5-AS1的下游靶点，LncRNA FGD5-AS1通过调节miR-195-5p/NUAK2轴促进乳腺癌的恶性进展。本研究中，我们的结果表明miR-195-5p在ESCC组织和细胞中表达下调，过表达miR-195-5p可以抑制ESCC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT进程。这与MENG X F等^[36]报道的相一致。此外我们还发现miR-195-5p可以靶向抑制E2F7的表达。据报道，E2F7与大量癌症恶性增殖和转移密切相关^[37-38]。如microRNA-30a-5p通过靶向E2F7抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和转移^[39]；LINC00174通过miR-3127-5p/E2F7轴促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和EMT进程^[40]。本研究的结果表明，敲低E2F7可以逆转敲低miR-195-5p对食管鳞癌细胞增殖、转移以及EMT进程的促进作用，而过表达E2F7可逆转过表达miR-195-5p产生的抑制作用。总之，miR-195-5p在大多数肿瘤中起着抑癌作用，而E2F7是典型的促癌因子。以上结果说明miR-195-5p可通过多个靶基因在多种肿瘤中发挥抑癌作用，miR-195-5p/E2F7是ESCC治疗的潜在靶点。

综上，本研究证实DMY对ESCC细胞的增殖和转移具有明显抑制作用，表明DMY是治疗ESCC的潜在候选药物。我们还检测到DMY显著抑制LncRNA CASC9的表达，DMY通过下调LncRNA CASC9的表达，抑制ESCC细胞的增殖和转移。机制上，我们还证实LncRNA CASC9/miR-195-5p/E2F7在ESCC转移中的促癌作用。总之，在未来的研究中，我们将进行更多DMY在癌症治疗领域的应用和机制的探索，进一步深入分析DMY及其衍生物在癌症治疗中的作用机制，肿瘤微环境中的影响，以及与宿主因素的相互作用。充分利用藤茶这种具有药食同源特性的植物资源，开发基于DMY预防和治疗恶性肿瘤的创新药物，为中医药在全球医疗领域的应用和推广提供更多的科学依据，也有助于推动传统中药在现代医学中的创新和国际化。

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2025年第43卷第8期

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doi: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.08.015

首发时间：2026-10-30
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^1.华北理工大学公共卫生学院，河北唐山 063200

^2.华北理工大学附属医院，河北唐山 063000

通讯作者:

孙国贵（1980-），男，河北唐山人，主任医师，研究方向：胸部肿瘤非编码RNA的功能机制及小分子药物筛选。E-mail：guogui_sun2021@sina.com。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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