中华中医药学刊

分组	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
2%红细胞悬液/（mL）	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	/	/	/	/	/
生理盐水/（mL）	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5	/	4.5	4.6	4.7	4.8	4.9
纯化水/（mL）	/	/	/	/	/	/	2.5	/	/	/	/	/
ICG-ELE-NE/（mL）	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1	/	/	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1

分组	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
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组别	剂量/（mg·kg^-1）	TNF-α/（pg·mL^-1）	IL-6/（pg·mL^-1）	IFN-γ/（pg·mL^-1）
空白	-	25.39±2.31	102.96±1.01	33.23±2.74
①NS	-	76.48±1.92	146.01±2.43	17.41±2.03
②NS+Laser	-	67.29±3.47	134.76±4.78	17.14±2.33
③ELE溶液	30	61.59±2.73	110.04±1.14	26.21±3.94
④ICG-NE-gel	30	63.24±4.35	107.71±3.52	15.68±2.36
⑤ICG-NE-gel+Laser	30	69.84±4.52	130.63±7.83	17.48±2.36
⑥ICG-ELE-NE	30	64.33±4.38	125.17±3.91	18.57±2.94
⑦ICG-ELE-NE+Laser	30	56.29±3.81	96.33±2.45	26.89±2.21
⑧ICG-ELE-NE-gel	30	58.74±2.34	85.21±1.14	26.28±1.97
⑨ICG-ELE-NE-gel+Laser	30	30.48±3.06	82.58±3.69	30.03±0.55

组别	剂量/（mg·kg^-1）	TNF-α/（pg·mL^-1）	IL-6/（pg·mL^-1）	IFN-γ/（pg·mL^-1）
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近红外光响应性榄香烯纳米乳温敏水凝胶抗4T1小鼠乳腺癌研究

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赵梦洁 , 赵云龙 , 王华华 , 直炜炜 , 贾永艳 , 关延彬 , 韩德恩 , 祝侠丽

中华中医药学刊 | 国家项目点击 2025,43(2): 117-121

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中华中医药学刊 |国家项目点击 2025 , 43 (2) : 117 -121

近红外光响应性榄香烯纳米乳温敏水凝胶抗4T1小鼠乳腺癌研究

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赵梦洁（2000-），女，河南商丘人，硕士在读，研究方向：中药学-药物新剂型与新技术。

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赵梦洁（2000-），女，河南商丘人，硕士在读，研究方向：中药学-药物新剂型与新技术。

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赵梦洁, 赵云龙, 王华华, 直炜炜, 贾永艳, 关延彬, 韩德恩, 祝侠丽

作者信息

河南中医药大学药学院，河南郑州 450046

通讯作者:

祝侠丽（1980-），女，河南永城人，教授，硕士研究生导师，博士，研究方向：中药学-药物新剂型与新技术。E-mail：zhuxiali1980@126.com。

作者简介:

赵梦洁（2000-），女，河南商丘人，硕士在读，研究方向：中药学-药物新剂型与新技术。

Anti-4T1 Breast Cancer Effect of Near-Infrared Light Responsive Elemene Nanoemulsion Thermosensitive Hydrogel

Mengjie ZHAO, Yunlong ZHAO, Huahua WANG, Weiwei ZHI, Yongyan JIA, Yanbin GUAN, De'en HAN, Xiali ZHU

Affiliations

Pharmacy College，Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，Henan，China

出版时间: 2025-02-10 doi: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.02.027

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摘要

收起

目的

以4T1乳腺癌细胞为模型，结合808 nm近红外光照射，探讨共载吲哚菁绿与榄香烯纳米乳温敏水凝胶（ICG-ELE-NE-gel）的体内外抗肿瘤活性。

方法

通过体外溶血试验评价ICG-ELE-NE-gel的生物安全性。采用MTT法测定ICG-ELE-NE-gel对4T1细胞体外增殖的影响；采用倒置荧光显微镜法观察4T1细胞的摄取效果；通过细胞划痕试验探讨细胞迁移能力的变化。建立BALB/c小鼠荷4T1乳腺癌原位移植瘤动物模型，进行红外热成像试验和体内药效学研究，ELISA实验测定荷瘤小鼠血浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）和干扰素γ（IFN-γ）的水平，通过苏木精-伊红（H&E）和原位末端转移酶标记法（TUNEL）染色观察小鼠肿瘤组织病理变化。

结果

ICG-ELE-NE-gel的生物安全性较高、光热稳定性良好。ICG-ELE-NE-gel对4T1细胞的抑制作用具有浓度和时间依赖性特征，能被4T1细胞成功摄取，且能明显抑制4T1细胞的水平迁移能力。ICG-ELE-NE-gel及其激光组能够明显控制小鼠体质量及肿瘤体积的增长；可有效抑制TNF-α和IL-6的表达，促进IFN-γ的表达；H&E和TUNEL病理组织切片显示ICG-ELE-NE-gel组出现明显的肿瘤细胞凋亡，当结合808 nm激光照射后，小鼠的肿瘤组织出现更大面积的细胞损伤或凋亡。

结论

ICG-ELE-NE-gel结合近红外光照射后对4T1小鼠乳腺癌的体内外抗肿瘤活性均有所增强，可同时实现肿瘤的光-热-化联合治疗。

关键词

近红外光响应 / 榄香烯 / 吲哚菁绿 / 纳米乳温敏水凝胶 / 乳腺癌 / 药效学

Abstract

收起

Objective

To evaluate the in vitro and in vivo antitumor activity of near-infrared light responsive elemene nanoemulsion thermosensitive hydrogel（ICG-ELE-NE-gel）on 4T1 breast cancer cells when combined with 808 nm near infrared irradiation.

Methods

The biological safety of ICG-ELE-NE-gel was evaluated by hemolysis test in vitro. The effect of ICGELE-NE-gel on the proliferation of 4T1 cells in vitro was determined by MTT assay. The uptake effect of 4T1 cells was qualitatively observed by using an inverted fluorescence microscopy. And the changes of cell migration ability were investigated by cell scratch test. Infrared thermal imaging test and in vivo pharmacodynamic study were performed after the orthotopic transplantation animal model of 4T1 breast cancer in BALB/c mice was established. At the end of the pharmacodynamic experiment，the levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-6（IL-6）and interferon-γ（IFN-γ）in plasma of 4T1 tumor-bearing BALB/c mice were measured by ELISA. The pathological changes of the tumor tissues were observed by H&E and TUNEL staining.

Results

ICG-ELE-NE-gel had high biological safety and good photothermal stability. ICG-ELE-NE-gel could inhibit the migration of 4T1 cells in a concentration-and time-dependent manner. ICG-ELE-NE-gel could be successfully taken up by 4T1 cells and significantly inhibited the horizontal migration of 4T1 cells. ICG-ELE-NE-gel and its laser group could significantly inhibit the growth of body weight and tumor volume of 4T1 tumor-bearing mice. The hydrogel could also effectively inhibit the expressions of TNF-αand IL-6，and promote the expression of IFN-γ. The H&E and TUNEL pathological sections showed that the tumor tissues in ICG-ELE-NE-gel group had obvious tumor cell apoptosis. When combined with 808 nm laser irradiation，there was more extensive cell damage or apoptosis.

Conclusion

ICG-ELE-NE-gel combined with near-infrared light irradiation could enhance the anti-tumor activity of 4T1 breast tumor in vitro and in vivo，and possibly realize the photothermal-chemical combination therapy of breast cancer.

Key words

near-infrared light response / elemene / indocyanine green / nanoemulsion thermosensitive hydrogel / breast cancer / pharmacodynamics

引用本文

赵梦洁, 赵云龙, 王华华, 直炜炜, 贾永艳, 关延彬, 韩德恩, 祝侠丽. 近红外光响应性榄香烯纳米乳温敏水凝胶抗4T1小鼠乳腺癌研究. 中华中医药学刊, 2025 , 43 (2) : 117 -121 . DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.02.027

Mengjie ZHAO, Yunlong ZHAO, Huahua WANG, Weiwei ZHI, Yongyan JIA, Yanbin GUAN, De'en HAN, Xiali ZHU. Anti-4T1 Breast Cancer Effect of Near-Infrared Light Responsive Elemene Nanoemulsion Thermosensitive Hydrogel[J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2025 , 43 (2) : 117 -121 . DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.02.027

正文

收起

榄香烯是我国首次从天然中药植物温莪术中提取分离的具有抗癌活性的倍半萜烯类化合物，其主要有效成分为β-榄香烯（β-elemene，ELE）^[1]。临床药理研究表明，ELE疗效确切、不良反应轻微、抗瘤谱广^[2-4]，可单独或者联合其他药物用于乳腺癌、肺癌、肝癌等的临床治疗。ELE能够通过多途径、多分子、多靶点及多个信号通路，使肿瘤细胞凋亡、细胞周期受到阻滞、获能过程受到抑制、集落形成能力减弱、增强对化疗药物的敏感性、逆转耐药作用等，从而对多种恶性肿瘤细胞产生明显的抑制和杀灭作用^[5]。ELE能激活机体抗肿瘤免疫功能，抑制肿瘤细胞的淋巴系统转移，也可联合放疗、化疗产生增效减毒作用^[6-8]。

近红外光（near-infrared，NIR，700～1000 nm）对生物组织具有较强的穿透深度和时空可控性，可有效避免对正常组织的损伤^[9]，在肿瘤治疗中具有很大的潜力^[10-12]。肿瘤光热治疗（photothermal therapy，PTT）通过近红外光照射将光热材料转化为热能，实现肿瘤局部靶向治疗效果^[13-14]。吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）是被批准上市可用于临床的光热材料^[15]，具有较高的光热转换率和近红外荧光成像能力^[16]，生物安全性好，可用于肿瘤成像诊断和光热治疗^[17]。但ICG体内半衰期仅有2～4 min，且极易与血浆白蛋白结合从体内消除^[18]。

纳米乳温敏水凝胶兼具纳米乳与温敏水凝胶的双重优势^[19-21]，可通过肿瘤组织局部注射给药，延长药物在肿瘤组织的滞留时间，提高药物的稳定性和生物利用度。课题组前期通过水相滴定法制备共载ICG与ELE的纳米乳，以壳聚糖（chitosan，CS）和β-甘油磷酸钠（sodiumβ-glycerophosphate，β-GP）为主要材料制备温敏水凝胶，然后将两者按照一定比例混合制备共载吲哚菁绿与榄香烯纳米乳温敏水凝胶（ICGELE-NE-gel，设计思路见插页ⅩⅩ图1）。本实验以ICGELE-NE-gel为研究对象，以4T1乳腺癌细胞和4T1乳腺癌原位移植瘤小鼠为模型，结合808 nm近红外光照射，探讨ICG-ELE-NE-gel体内外抗肿瘤活性。

1　仪器与试剂

收起

1.1　仪器

Fluke Ti-400红外热成像仪（福禄克电子仪器仪表公司）；SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；L530型低温台式离心机（湖南湘仪实验室开发有限公司）；MW-GX-808/3000 mW激光仪（长春镭仕光电科技有限公司）；CCL-240B-8型二氧化碳培养箱（新加坡ESCO公司）；1510型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；Primo Vert倒置显微镜（德国Carl Zeiss公司）；XDS-1B型倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；Merk手持式细胞计数仪（美国Millipore Sigma公司）；0～150 mm电子数显卡尺（上海申韩量具有限公司）。

1.2　药品与试剂

β-榄香烯原料药（ELE，纯度≥95.0%，批号201001，苏州纳美特生物科技有限公司）；吲哚菁绿（ICG，批号D30GS172943，上海源叶生物科技有限公司）；榄香烯注射液［石药集团远大（大连）制药有限公司］；RPMI Medium 1640（北京索莱宝科技有限公司）；二苯基四氮唑溴盐（MTT，北京博奥拓达科技有限公司）；磷酸盐缓冲盐（PBS，北京索莱宝科技有限公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，上海碧云天生物技术有限公司）；无噬菌体胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；胰蛋白酶（北京雷根生物技术有限公司）；小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-6（IL-6）和干扰素γ（IFN-γ）ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；苏木精-伊红（H&E）染液和TUNEL试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）。

1.3　细胞与动物

小鼠乳腺癌4T1细胞（河南中医药大学武香香教授课题组赠予）；SPF级BALB/c小鼠［♀，16 g，7周龄，实验单位许可证号SYXK（豫）2020-0004；实验动物许可证号SCXK（鲁）20190003，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司］。本实验经过河南中医药大学动物实验伦理审查委员会审查批准（DWLL201830029）。

2　方法与结果

收起

2.1　ICG-ELE-NE-gel的制备与表征

首先采用水相滴定法制备ICG-ELE-NE，处方组成：蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-35）0.24 g，聚乙二醇-400（PEG-400）0.16 g，油酸乙酯（EO）0.12 g，榄香烯（ELE）0.06 g，0.3 mg·mL^-1的吲哚菁绿水溶液3.0 mL。测得ICG-ELE-NE粒径为（85.61±0.35）nm，电位为（-21.4±0.6）mV，包封率为（98.51±0.39）%，载药量为（10.96±0.24）%。表明ICGELE-NE具有较好的均匀性，粒径大小符合2020年版《中华人民共和国药典》相关规定。

采用冷溶法制备ICG-ELE-NE-gel，取2.5%的壳聚糖溶液3 mL置于磁力搅拌器上搅拌，搅拌过程中滴加ICGELE-NE 1 mL，持续搅拌15 min后，滴加800 mg·mL^-1的β-甘油磷酸钠溶液1 mL，再继续搅拌5 min即得ICG-ELENE-gel。结果显示ICG-ELE-NE-gel的胶凝温度和胶凝时间分别37℃和150 s，微观呈疏松多孔的网络结构。

2.2　ICG-ELE-NE的溶血性考察

2020年版《中华人民共和国药典》第四部中规定注射剂应当进行溶血性考察^[22]。取36支试管分为12组，每组3支，按表1依序加入2%红细胞悬液、生理盐水和不同量的ICGELE-NE（1～5为样品组，6为阴性对照组，7为阳性对照组，8～12为样品对照组，详见表1），将各试管轻度摇动混匀后（插页ⅩⅩ图2A），在37℃温育，观察1～7管内溶血情况（插页ⅩⅩ图2B）。3 h后在1500 r·min^-1转速下离心5 min（插页ⅩⅩ图2C），以纯化水为空白，在545 nm波长处测定吸光度A值，并按下列公式计算溶血率^[23]：溶血率＝（A_样品-A_阳性对照-A_阴性对照）/（A_阳性对照-A_阴性对照）×100%。由插页ⅩⅩ图2D可见，加入不同体积ICG-ELE-NE的红细胞悬液红细胞全部下沉，分层界面明显，各浓度下溶血率均低于3%。表明ICGELE-NE生物安全性良好。

2.3　ICG-ELE-NE-gel体外抗肿瘤活性研究

2.3.1　样品溶液的配制

精密称取10 mg ELE，溶于0.5 mL DMSO中，用4.5 mL 1640培养基（含10%胎牛血清、100μg·mL^-1链霉素、100 U·mL^-1青霉素）稀释配制为浓度为300、200、150、100μg·mL^-1；将ELE注射液、ICG-ELE-NE和ICG-ELE-NE-gel用1640培养基稀释配制浓度为100、150、200、300μg·mL^-1。将空白纳米乳（ICG-NE）和空白凝胶（ICG-NE-gel）按照上述样品方法进行同步稀释。

2.3.2　MTT细胞实验

将复苏的4T1细胞接种1640培养基中，在37℃、5% CO₂饱和湿度条件下培养，隔天传代^[24-25]。取对数生长期的4T1细胞，以2×10³个/孔的细胞密度接种于96孔板，同时设置空白对照组，空白对照组加200μL不含细胞的完全培养液，用PBS填充孔板四周，然后将96孔板置于培养箱继续培养。待细胞贴壁后，加入200μL不同浓度梯度的样品继续培养。在终止培养4 h前，取出96孔板，每孔加入5 mg·mL^-1的MTT溶液20μL，放入培养箱中避光孵育4 h后再次取出，弃培养液，每孔加150μL DMSO，于平板摇床上以1500 r·min^-1振荡15 min，用酶标仪在490 nm处测定吸光度（OD）值，每组设6个复孔。

2.3.3　空白载体对MCF-7细胞的影响

按“2.3.2”项下进行细胞培养。待细胞贴壁后，加入200μL不同浓度的空白纳米乳（ICG-NE）和空白凝胶（ICG-NE-gel），继续培养24、48 h。以下操作同“2.3.2”项测定OD值，按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率＝（OD_样-OD_空）/（OD_阴-OD_空）×100%。如插页ⅩⅪ图3所示，4T1细胞正常培养24、48 h后，空白纳米乳（插页ⅩⅪ图3A）和空白凝胶（插页ⅩⅪ图3B）在与加药组相同浓度范围内，细胞存活率均高于90%，表明空白载体毒性较弱，基本不会抑制4T1细胞的增殖。

2.3.4　不同制剂对MCF-7细胞的影响

按“2.3.2”项下进行细胞培养。待细胞贴壁后，加入200μL不同浓度的ELE溶液、ICG-ELE-NE和ICG-ELE-NE-gel，继续培养24、48、72 h。以下操作同“2.3.2”项测定OD值，按照下列公式计算细胞抑制率：细胞抑制率＝（OD_阴-OD_样）/（OD_阴 -OD_空）×100%。

插页ⅩⅪ图4A～C显示，ELE溶液、ELE注射液、ICGELE-NE和ICG-ELE-NE-gel孵育24、48、72 h对4T1细胞增殖均有抑制作用，且随着给药浓度和孵育时间的增加而增强。孵育时间相同的情况下，相同浓度的ELE溶液和注射液对4T1细胞的抑制效果相差不大。随着孵育时间的延长，ICG-ELE-NE-gel组的细胞抑制率与其他制剂组之间的差异显著增大。

ICG-ELE-NE和ICG-ELE-NE-gel激光组在给药后用808 nm激光（2.5 W·cm^-2）照射3 min，然后继续孵育24 h，考察ICG-ELE-NE和ICG-ELE-NE-gel结合激光照射对4T1细胞增殖的影响，结果见插页ⅩⅪ图4D。由插页ⅩⅪ图4D可知，结合808 nm（2.5 W·cm^-2）激光照射可显著增强ICG-ELE-NE和ICG-ELE-NE-gel对4T1细胞的增殖抑制作用。如当给药浓度为150μg·mL^-1时，ICG-ELE-NE加激光组的细胞抑制率由（45.46±7.28）%升至（51.32±2.31）%，ICG-ELE-NE-gel加激光组的细胞抑制率由（43.24±3.12）%升至（57.32±3.56）%。

2.3.5　细胞摄取试验

取对数生长期的4T1细胞，以2×10⁵个/孔的细胞密度接种于12孔板制作细胞爬片^[26]，置于37℃、5% CO₂条件下培养，待细胞融合至70%～80%时，弃去孔中原有培养液，每孔用1 mL PBS冲洗3次，加入ELE浓度为200μg·mL^-1的ICG溶液、ICG-ELE-NE或ICG-ELENE-gel，每组设3个复孔。分别在孵育0.5、1、2、4 h取出12孔板，弃去原有培养液，每孔用1 mL PBS冲洗3次，加入4%的组织细胞固定液600μL固定15 min，用无菌PBS溶液冲洗3遍。避光条件下每孔加入DAPI染色液300μL，避光染色15 min后，弃去染色液，用无菌PBS溶液冲洗3遍。将细胞爬片取出，用抗荧光淬灭封片液封片后于暗盒中保存。调整荧光信号通道，于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。采用Image J软件将同一视野绿光通道下拍摄的ICG摄取情况和蓝光通道下拍摄的DAPI摄取情况结果进行Merge，并将绿光通道下拍摄的摄取量进行荧光强度分析。

由插页ⅩⅫ图5A可见，ICG溶液、ICG-ELE-NE以及ICG-ELE-NE-gel均能被4T1细胞所摄取。随着孵育时间的延长，ICG溶液组4T1细胞的摄取量减少，ICG-ELE-NE和ICG-ELE-NE-gel组的摄取量则逐渐增加。由插页ⅩⅫ图5B可见，在2～4 h时，各组荧光密度由强到弱的顺序：ICGELE-NE-gel组>ICG-ELE-NE组>ICG溶液组，表明ICG-ELE-NE-gel可被细胞大量摄取，具有较好的缓释性和持久性。

2.3.6　细胞迁移试验

将对数生长期的4T1细胞，以5×10⁵个/孔的细胞密度接种于6孔板中，置37℃、5% CO₂条件下培养至细胞单层覆盖孔板底部。用200μL无菌塑料吸管尖垂直刮在细胞层上形成痕迹，使横线横穿各孔，每孔划3条线，用无菌PBS溶液清洗3遍以清洗脱离细胞，在显微镜下观察并记录细胞初始划痕状态。加入200μg·mL^-1的ELE溶液、ICGELE-NE或ICG-ELE-NE-gel后置培养箱中孵育36 h取出，其中ICG-ELE-NE和ICG-ELE-NE-gel激光组在孵育2 h后取出用808 nm激光（2.5 W·cm^-2）照射3 min，然后再放入培养箱继续孵育。弃去含药培养液，用无菌PBS溶液清洗3遍，用显微镜观察并记录36 h细胞划痕状态的图像，分析不同时间图像中划痕区域的变化情况，每组试验重复3次。采用Image J软件计算0 h和t h的划痕面积（S_初和S_t），按下列公式计算划痕迁移率：迁移率＝（S_初-S_t）/S_初×100%。

由插页ⅩⅩⅢ图6可见，ELE溶液、ICG-ELE-NE和ICGELE-NE-gel对4T1细胞的迁移能力均有明显的抑制作用。ELE溶液组、ICG-ELE-NE组和ICG-ELE-NE-gel组4T1细胞的迁移率分别为（45.92±2.20）%，（4.91±2.30）%和（4.04±1.60）%，表明ICG-ELE-NE和ICG-ELE-NE-gel均能明显抑制4T1细胞的水平迁移能力。另外，ICGELE-NE和ICG-ELE-NE-gel结合808nm激光照射后的迁移率分别降低至（-5.86±2.30）%和（-7.86±2.30）%，表明结合808 nm激光照射抑制4T1细胞迁移的作用增强。

2.4　ICG-ELE-NE-gel的体内抗肿瘤活性研究

2.4.1　4T1乳腺癌原位移植瘤模型的建立

取对数生长期的4T1细胞，计数后用生理盐水稀释至浓度为2×10⁶个·mL^-1的细胞悬液。于经皮下接种于雌性BALB/c小鼠右侧第4乳头的脂肪垫处，每只0.1 mL，共接种70只。小鼠正常喂食并密切观察肿瘤的生长状况，采用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V＝a×b²/2，计算肿瘤体积。待肿瘤体积增长至100～200 mm³认为造模成功。

2.4.2　红外热成像试验

取荷4T1雌性BALB/c小鼠3只，将小鼠固定后，分别尾静脉注射生理盐水0.1 mL、ICG-ELENE 0.1 mL，经肿瘤组织注射ICG-ELE-NE-gel 0.1 mL。各组给药0、2 h后，采用近红外808 nm激光（2.5 W·cm^-2）照射小鼠肿瘤部位，分别在照射0、1、2、3 min时采用红外热成像仪对荷瘤小鼠进行拍照，记录照射不同时间肿瘤部位的温度变化情况。

由插页ⅩⅩⅢ图7所示，随着照射时间的延长，各组小鼠肿瘤部位的温度均逐步上升。ICG-ELE-NE组和生理盐水组小鼠肿瘤部位的温度变化不大，这可能因为尾静脉注射给药后，ICG-ELE-NE中的ICG还未到达肿瘤部位；经瘤内注射的ICG-ELE-NE-gel组小鼠肿瘤部位的温度则明显上升，当激光照射时间为2、3 min时，小鼠肿瘤组织的温度分别升至38.9℃和44.9℃。给药2 h后，生理盐水组小鼠肿瘤部位的温度仍无明显变化；ICG-ELE-NE组小鼠肿瘤部位的温度上升，当激光照射时间为2、3 min时，小鼠肿瘤组织的温度分别上升至37.5℃和43.3℃，表明其中的部分ICG已到达肿瘤组织；ICG-ELE-NE-gel组小鼠肿瘤部位的温度仍呈明显上升趋势，进一步说明ICG-ELE-NE-gel光热稳定性良好。基于上述结果，在下一步的体内药效学实验中，经小鼠尾静脉注射给药组在给药2 h后进行照射，瘤内注射给药组在给药立即进行照射，照射时间均为3 min。

2.4.3　ICG-ELE-NE-gel的药效学试验

取荷4T1细胞的雌性BALB/c小鼠54只，随机分为9组，每组6只。具体分组如下：①NS组；②NS+Laser组；③ELE溶液组；④ICG-NE-gel组；⑤ICG-NE-gel+Laser组；⑥ICG-ELE-NE组；⑦ICG-ELE-NE+Laser组；⑧ICG-ELE-NE-gel组；⑨ICGELE-NE-gel+Laser组。给药前禁食12 h，自由饮水。①②③⑥⑦组尾静脉注射给药，其他组通过肿瘤内注射给药。每3天给药1次，共给药4次，给药剂量为30 mg·kg^-1^[27-28]。⑤⑨组给药后立即用808 nm激光（2.5 W·cm^-2）照射小鼠肿瘤部位3 min，②⑤组则在给药2 h后进行激光照射。实验中保证小鼠正常饮食、饮水，并密切观察小鼠的生活状态。每次给药前测定小鼠体质量和肿瘤大小，并绘制小鼠体质量和相对肿瘤体积随时间变化曲线。实验结束后，将各组小鼠通过眼球取血，在4500 r·min^-1转速下离心15 min，取上层血清在-80℃冰箱保存备用。解剖取各组小鼠的肿瘤组织，将瘤块置于通用型组织细胞固定液，并于4℃保存备用。

如插页ⅩⅩⅣ图8A所示，各组小鼠初始体质量均在20 g左右，实验结束时各组小鼠体质量变化不大。如插页ⅩⅩⅣ图8B所示，各组小鼠相对肿瘤体积均呈不断增长趋势，但增长速度不同。在0～4 d内，各组小鼠的相对肿瘤体积变化幅度较小；在6～12 d，各组小鼠的相对肿瘤体积增长幅度开始增加。不同治疗组之间比较，生理盐水组、生理盐水加激光组和ICGNE-gel空白载体组小鼠相对肿瘤体积增长迅速，ICG-NE-gel加激光组小鼠的相对肿瘤体积小于生理盐水组。ELE溶液组小鼠肿瘤体积变化较小，表明ELE溶液可在一定程度上抑制肿瘤的生长增殖。ICG-ELE-NE组和ICG-ELE-NE-gel组小鼠相对肿瘤体积的增长较为缓慢，表明两种制剂对小鼠肿瘤均具有较显著的抑制作用。ICG-ELE-NE和ICGELE-NE-gel结合激光照射后，小鼠相对肿瘤体积的增长速度减慢，这可能因为吲哚菁绿光热治疗和榄香烯药物治疗的双重作用。

2.4.4　病理组织切片分析

药效学实验结束后，将荷瘤小鼠处死并解剖取其肿瘤组织，用生理盐水清洗干净后浸泡于通用型组织细胞固定液中保存，采用石蜡包埋技术制备肿瘤切片。通过苏木精-伊红（H&E）染色法和原位末端转移酶标记法（TUNEL）进行染色，采用显微镜观察各组肿瘤组织的形态学变化并进行分析。

插页ⅩⅩⅤ图9为各组小鼠肿瘤组织H&E染色病理切片图，其中蓝紫色代表苏木精染色的细胞核，粉红色代表伊红染色的细胞质或细胞外基质。由插页ⅩⅩⅤ图9可知，生理盐水组肿瘤细胞排列紧密，细胞核呈现蓝紫色，表明该组肿瘤细胞仍处于增殖期，生长旺盛；ICG-NE-gel组肿瘤细胞排列紧密，少部分细胞出现核损伤，结合808 nm（2.5 W·cm^-2）激光照射后出现多数肿瘤细胞核萎缩、细胞质破裂溶解现象，表明肿瘤细胞在光热作用下出现热消融，发生凋亡；与生理盐水组相比，ELE溶液组肿瘤组织大量细胞发生核溶解消失或萎缩变形的情况。ICG-ELE-NE组和ICG-ELE-NE-gel组均大面积出现肿瘤细胞核溶解消亡、细胞质破损现象；结合激光照射后肿瘤组织发生细胞凋亡的面积增大，细胞核数量减少。ICG-ELE-NE-gel组细胞核数量最少，这很可能因为ICGELE-NE-gel经瘤内注射给药后，可以使药物缓慢释放并在肿瘤部位蓄积；结合808 nm激光照射可加速药物的释放和跨膜转运，发挥药物化疗与光热治疗的双重作用，对肿瘤细胞的杀伤作用更强，因而ICG-ELE-NE-gel加激光组核溶解消失或萎缩现象发生最为严重。

插页ⅩⅩⅥ图10为各组小鼠肿瘤组织TUNEL病理切片图，其中蓝色荧光为DAPI染色的活细胞的细胞核，绿色荧光为FITC荧光素标记的阳性凋亡细胞核。由插页ⅩⅩⅥ图10可知，各组小鼠肿瘤组织TUNEL病理切片结果分析与H&E病理切片结果一致。生理盐水组和ICG-NE-gel组肿瘤组织受损较少，ELE溶液组出现部分肿瘤细胞凋亡现象，ICG-ELE-NE组和ICG-ELE-NE-gel组则出现大量肿瘤细胞凋亡。当结合808 nm激光照射后，各组小鼠的肿瘤组织受损程度均较无激光照射时严重，出现更大面积细胞损伤或凋亡，绿色荧光面积增大。

2.4.5　小鼠血清中TNF-α、IL-6及IFN-γ含量的测定

药效学试验结束后，采用ELISA检测法测定各组小鼠血清中TNF-α、IL-6及IFN-γ含量。具体操作如下：先将-80℃保存的各组小鼠的血清取出，在室温放置平衡60 min至融化；将4℃冷藏保存的TNF-α、IFN-γ及IL-6试剂盒取出，在室温放置平衡15～30 min后方可使用；分别设空白孔、待测样品孔和标准品孔。往待测样品孔中先加样品稀释液40μL，再加待测样品10μL，轻轻晃动酶标板至样液混匀；空白孔中加样品稀释液50μL；标准品孔中加各种不同浓度的标准品50 μL。除空白孔外，每孔加入酶标试剂100μL；用封板膜封板后置37℃恒温箱中温育60 min；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干。每孔加洗涤液300μL，静置30 s后弃去，如此重复5遍，拍干；每孔先加入显色剂A 50μL，避光条件下再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡至A、B混匀，于37℃下避光显色15 min；每孔加入终止液50μL，可观察到溶液由蓝色迅速转为黄色，终止反应；在加终止液后15 min内，以空白孔为对照，依序测量各孔在450 nm波长的吸光度。

由表2、插页ⅩⅩⅣ图11可知，各组小鼠血清中的TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量水平均具有一定的差异。各给药组小鼠血清中TNF-α、IL-6含量均低于生理盐水组；ICG-ELENE-gel组TNF-α、IL-6含量低于ELE溶液组；ICG-ELENE和ICG-ELE-NE-gel加激光组的TNF-α、IL-6含量均低于不加激光组。除ICG-NE-gel组外，各实验组的IFN-γ含量均高于生理盐水组；ICG-ELE-NE和ICG-ELE-NE-gel加激光组IFN-γ的含量均高于ELE溶液组和不加激光组。

3　讨论

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本课题选择小鼠乳腺癌细胞4T1为肿瘤细胞模型，并结合808 nm（2.5 W·cm^-2）激光照射探讨ICG-ELE-NE-gel对肿瘤细胞体外增殖的影响；采用倒置荧光显微镜定性观察4T1细胞对ICG所制不同制剂孵育不同时间的摄取效果；进行细胞划痕试验探讨ICG-ELE-NE-gel对4T1细胞迁移能力的影响。实验结果显示不同制剂对4T1细胞的抑制率均显现出浓度依赖和时间依赖的特点，结合808 nm激光照射下，ICG-ELENE-gel对4T1细胞的抑制作用增强；ICG-ELE-NE-gel能够被4T1细胞摄取，并能明显抑制4T1细胞的水平迁移能力。

建立BALB/c小鼠荷4T1乳腺癌原位移植瘤动物模型，并结合808 nm（2.5 W·cm^-2）激光进行红外热成像试验和体内药效学研究。实验结果表明ICG-ELE-NE-gel的光热稳定性良好；ICG-ELE-NE-gel及激光组能够明显控制小鼠体质量及肿瘤体积的增长。病理组织切片结果可观察到ICGELE-NE组和ICG-ELE-NE-gel组明显的肿瘤细胞凋亡，且当结合808 nm激光照射后，小鼠的肿瘤组织受损程度均较无激光照射时严重，进一步证明ICG-ELE-NE-gel结合近红外激光照射后可对荷瘤小鼠产生更强的抗肿瘤作用。

TNF-α、IL-6及IFN-γ是较为常见的细胞炎性因子，是多种肿瘤病情进展和预后的生物标志物。TNF-α是反映全身或局部炎症的重要细胞因子，是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质。IL-6是淋巴细胞等在免疫调节、炎症反应等过程中生成的一种重要多效性细胞因子，已成为多种肿瘤病情进展和预后的生物标志物。IFN-γ具有对抗炎性细胞因子的作用，主要的生物学功能是抗肿瘤、抗病毒和免疫调节。药效学试验给药结束后，采用ELISA检测法测定各组小鼠血清中TNF-α、IL-6及IFN-γ含量，分析不同治疗方法治疗后荷4T1乳腺癌原位移植瘤BALB/c小鼠的预后情况^[29-30]。结果显示，ICG-ELE-NE-gel可有效抑制TNF-α和IL-6的表达，促进IFN-γ的表达。

基金

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国家自然科学基金项目(81803740)
河南省高等学校重点科研项目(23A360007)

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2025年第43卷第2期

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doi: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.02.027

首发时间：2026-10-30
出版时间：2025-02-10

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河南中医药大学药学院，河南郑州 450046

通讯作者:

祝侠丽（1980-），女，河南永城人，教授，硕士研究生导师，博士，研究方向：中药学-药物新剂型与新技术。E-mail：zhuxiali1980@126.com。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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