中华中医药学刊

基因	引物
GAPDH	5'GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC3'
	5'TGATGACCCTTTTGGCTCCC3'
VIM	5'GGAGGAGATGCTTCAGAGAGAG3'
	5'GGATTTCCTCTTCGTGGAGTTTC3'
α-SMA	5'CAATGTCCTATCAGGGGGCAC3'
	5'CGGCTTCATCGTATTCCTGTT3'

基因	引物
GAPDH	5'GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC3'
	5'TGATGACCCTTTTGGCTCCC3'
VIM	5'GGAGGAGATGCTTCAGAGAGAG3'
	5'GGATTTCCTCTTCGTGGAGTTTC3'
α-SMA	5'CAATGTCCTATCAGGGGGCAC3'
	5'CGGCTTCATCGTATTCCTGTT3'

组别	n	E-Cad	α-SMA
正常组	4	1.32±0.18	0.47±0.07
模型组	4	0.62±0.09^**	1.47±0.22^**
加味补阳还五汤组	4	0.87±0.14^＃	1.06±0.12^＃
中药培养基组	4	1.17±0.21^＃＃▲	0.68±0.09^＃＃▲▲

组别	n	E-Cad	α-SMA
正常组	4	1.32±0.18	0.47±0.07
模型组	4	0.62±0.09^**	1.47±0.22^**
加味补阳还五汤组	4	0.87±0.14^＃	1.06±0.12^＃
中药培养基组	4	1.17±0.21^＃＃▲	0.68±0.09^＃＃▲▲

组别	n	体积分数/（%）	干预前/（pg/mL）	干预后/（pg/mL）
中药培养基组	3	50	1 147.75±5.15^△△	64.25±1.96
普通培养基组	3	50	779.98±6.85	63.12±2.59
低HGF培养基组	3	50	489.68±6.12^△△	40.05±1.68^△△

组别	n	体积分数/（%）	干预前/（pg/mL）	干预后/（pg/mL）
中药培养基组	3	50	1 147.75±5.15^△△	64.25±1.96
普通培养基组	3	50	779.98±6.85	63.12±2.59
低HGF培养基组	3	50	489.68±6.12^△△	40.05±1.68^△△

组别	n	体积分数/（%）	E-Cad	α-SMA
正常组	3		1.65±0.05	0.30±0.05
模型组	3		0.73±0.16^**	1.14±0.12^**
中药培养基组	3	50	1.28±0.17^＃＃	0.44±0.11^＃＃
普通培养基组	3	50	1.06±0.19^＃	0.61±0.14^＃＃
低HGF培养基组	3	50	0.93±0.11	0.84±0.24^＃△

组别	n	体积分数/（%）	E-Cad	α-SMA
正常组	3		1.65±0.05	0.30±0.05
模型组	3		0.73±0.16^**	1.14±0.12^**
中药培养基组	3	50	1.28±0.17^＃＃	0.44±0.11^＃＃
普通培养基组	3	50	1.06±0.19^＃	0.61±0.14^＃＃
低HGF培养基组	3	50	0.93±0.11	0.84±0.24^＃△

组别	n	体积分数/（%）	E-Cad
正常组	3		1.00±0.03
模型组	3		0.22±0.02^**
中药培养基组	3	50	0.76±0.04^＃＃△△
普通培养基组	3	50	0.45±0.04^＃＃
低HGF培养基组	3	50	0.33±0.03^＃＃△△

组别	n	体积分数/（%）	E-Cad
正常组	3		1.00±0.03
模型组	3		0.22±0.02^**
中药培养基组	3	50	0.76±0.04^＃＃△△
普通培养基组	3	50	0.45±0.04^＃＃
低HGF培养基组	3	50	0.33±0.03^＃＃△△

组别	n	体积分数/（%）	α-SMA
正常组	3		1.00±0.00
模型组	3		6.85±0.24^**
中药培养基组	3	50	3.04±0.25^＃＃△△
普通培养基组	3	50	5.17±0.12^＃＃
低HGF培养基组	3	50	6.46±0.12^＃△△

组别	n	体积分数/（%）	α-SMA
正常组	3		1.00±0.00
模型组	3		6.85±0.24^**
中药培养基组	3	50	3.04±0.25^＃＃△△
普通培养基组	3	50	5.17±0.12^＃＃
低HGF培养基组	3	50	6.46±0.12^＃△△

EMT相关指标	相关性	HGF含量
E-Cad	r值	0.73
	P值	<0.05
α-SMA	r值	-1.00
	P值	<0.01

EMT相关指标	相关性	HGF含量
E-Cad	r值	0.73
	P值	<0.05
α-SMA	r值	-1.00
	P值	<0.01

组别	n	24 h愈合率	48 h愈合率
正常组	3	5.62±0.61	10.41±1.46
模型组	3	46.17±1.71^**	71.90±0.56^**
中药培养基组	3	14.80±1.86^＃＃△△	37.25±1.64^＃＃△△
普通培养基组	3	18.10±1.90^＃＃	58.70±0.74^＃＃
低HGF培养基组	3	23.70±0.71^＃＃△△	63.31±0.54^＃＃△△

组别	n	24 h愈合率	48 h愈合率
正常组	3	5.62±0.61	10.41±1.46
模型组	3	46.17±1.71^**	71.90±0.56^**
中药培养基组	3	14.80±1.86^＃＃△△	37.25±1.64^＃＃△△
普通培养基组	3	18.10±1.90^＃＃	58.70±0.74^＃＃
低HGF培养基组	3	23.70±0.71^＃＃△△	63.31±0.54^＃＃△△

大网膜脂肪干细胞旁分泌HGF与加味补阳还五汤抑制腹膜间皮细胞EMT相关性的体外研究

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郑敏麟 ¹ , 王亚楠 ² , 范文江 ² , 詹倩倩 ¹ , 陈锋斌 ³

中华中医药学刊 | 博士导师新论 2025,43(1): 11-18

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中华中医药学刊 |博士导师新论 2025 , 43 (1) : 11 -18

大网膜脂肪干细胞旁分泌HGF与加味补阳还五汤抑制腹膜间皮细胞EMT相关性的体外研究

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郑敏麟¹, 王亚楠², 范文江², 詹倩倩¹, 陈锋斌³

作者信息

^1．福建中医药大学中西医结合学院，福建　福州　350122

^2．福建中医药大学中西医结合研究院，福建　福州　350122

^3．福建医科大学附属第一医院，福建　福州　350005

作者简介:

郑敏麟（1971-），男，福建福州人，教授，博士研究生导师，硕士，研究方向：中医脏腑的理论和临床。

In Vitro Study on Correlation between HGF Paracrine Secretion by ADSCs in Greater Omentum and Inhibition of EMT in Peritoneal Mesothelial Cells by Supplemented Buyang Huanwu Decoction（加味补阳还五汤）

Minlin ZHENG¹, Yanan WANG², Wenjiang FAN², Qianqian ZHAN¹, Fengbin CHEN³

Affiliations

^1.College of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian, China

^2.Research Institute of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian, China

^3.The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian, China

出版时间: 2025-01-10 doi: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.01.003

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摘要

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目的

通过体外研究，探讨加味补阳还五汤抑制的腹膜间皮细胞（PMC）上皮-间充质转化（EMT）防治术后腹腔粘连（PAA）的作用，是否主要通过促进大网膜脂肪干细胞（ADSCs）旁分泌肝细胞生长因子（HGF）。

方法

实验1明确加味补阳还五汤抑制PMC的EMT作用，是该方对PMC的直接作用，还是通过调控大网膜中的ADSCs旁分泌的间接作用：使用加味补阳还五汤与加味补阳还五汤培养ADSCs后制取其条件培养基（以下称“中药培养基”）分别干预EMT模型的PMC，Western Blot法检测EMT相关的蛋白E-钙黏蛋白（E-Cad）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。实验2明确加味补阳还五汤抑制PMC的EMT作用，是否与大网膜中的ADSCs旁分泌HGF相关：用低表达HGF的ADSCs条件培养基（以下称“低HGF培养基”）、正常ADSCs条件培养基（以下称“普通培养基”）、中药培养基等3种培养基干预PMC，并检测以下指标：（1）用ELISA法检测在干预PMC之前和之后，3种培养基中HGF的含量。（2）Western Blot法、qPCR法、免疫荧光（IF）法检测干预后各组PMC的EMT相关蛋白表达水平，划痕实验检测各组PMC的迁移能力。

结果

实验1：加味补阳还五汤与中药培养基对EMT相关指标的影响。与模型组相比，加味补阳还五汤组上调E-Cad的蛋白表达（P<0.05），下调α-SMA的蛋白表达（P<0.05）；中药培养基组显著上调了E-Cad的蛋白表达（P<0.01），显著下调α-SMA的蛋白表达（P<0.01）。与加味补阳还五汤组相比，中药培养基组上调E-Cad的蛋白表达（P<0.05），显著下调α-SMA的蛋白表达（P<0.01）。实验2：（1）作用于PMC前后，3种不同的培养基中HGF含量的比较：作用于PMC前，相比于普通培养基，低HGF培养基中含量显著降低（P<0.01），中药培养基中含量显著增加（P<0.01）；作用于PMC后，各培养基组含量均显著性下降。（2）EMT相关蛋白表达情况：综合Western Blot、qPCR、IF结果，与模型组相比，各培养基组均可升高E-Cad表达（P<0.05或P<0.01），降低α-SMA、VIM表达（P<0.05或P<0.01），各培养基组均可抑制PMC的EMT，效果依次为中药培养基组>普通培养基组>低HGF培养基组。（3）发生EMT的细胞迁移能力变化情况：干预24、48 h后，与模型组相比，各组愈合率均有显著下降（P<0.01），各组培养基均可降低EMT模型的R的迁移能力，效果依次为中药培养基组>普通培养基组>低HGF培养基组。（4）EMT相关蛋白表达与HGF含量相关性分析：E-Cad蛋白表达量与HGF含量呈正相关性（P<0.05），α-SMA、VIM蛋白表达量与HGF含量呈负相关性（P<0.05或P<0.01）。

结论

加味补阳还五汤抑制PMC的EMT防治PAA的疗效可能是多靶点的，既有对PMC的直接作用，也有通过增强大网膜中的ADSCs旁分泌HGF的间接作用，而后者更为主要。

关键词

加味补阳还五汤 / 术后腹腔粘连 / 腹膜间皮细胞 / 脂肪间充质干细胞 / 肝细胞生长因子 / 上皮-间充质转化

Abstract

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Objective

Through in vitro studies，it explored whether Supplemented Buyang Huanwu Decoction（加味补阳还五汤，SBHD）could promote adipose stem cells（ADSCs）in greater omentum to paracrinehepatocyte growth factor（HGF）and whether this effect could inhibit the epithelial-mesenchymal transition（EMT）of peritonealmesothelial cells（PMC）in order to initially clarify the pharmacological mechanism and target of this prescription in preventing and treating postoperative abdominal adhesion（PAA）.

Methods

Experiment 1 clarified whether the inhibitory effect of SBHD on the EMT of PMCwas a directeffectof the formula on PMC or an indirect effect by regulating the paracrine secretion of ADSCs in the greater omentum. After culturing ADSCs with SBHD，conditional culture media（hereinafter referred to as“Chinese medicine culture media”）were prepared to intervene in the PMC of EMTmodels，and the expression levels of EMT related proteins E-cadherin（E-Cad）andα-smooth muscle actin（α-SMA）were detected by Western Blot. Experiment 2 clarified whether the inhibitory effectof SBHD on EMT of PMC was related to the secretion of HGF by ADSCs in the greater omentum. The intervention of PMC used three types ofmedia：low HGF expressing ADSCs conditioned medium（hereinafter referred to as “low HGFmedium”），normal ADSCs conditioned medium（hereinafter referred to as“normal medium”）and traditional Chinese medicine culture medium and the following indicators were detected.（1）ELISA was used to detect the content of HGF in the three media before and after intervention in PMC.（2）Western Blot，qPCR and IFmethods were used to detect the expression levels of EMT related proteins in each group of PMCs after intervention，and scratch assay was used to detect the migration ability of PMCs in each group.

Results

Experiment 1：Effect of SBHD and traditional Chinese medicine culture medium on EMT related indicators：Compared with the model group，the SBHD group up-regulated the protein expression of E-Cad（P<0.05）and down-regulated the protein expression of α-SMA（P<0.05）. The traditional Chinese medicine culture medium group significantly up-regulated the protein expression of E-Cad（P<0.01）and significantly down-regulated the protein expression of α-SMA（P<0.01）. Compared with the SBHD group，the traditional Chinese medicine culture medium group up-regulated the protein expression of E-Cad（P<0.05）and significantly downregulated the protein expression of α-SMA（P<0.01）. Experiment 2：（1）Comparison of HGF contents in three different culture media before and after acting on PMC：Before acting on PMC，compared with the normal medium，the content in low HGF medium was significantly reduced（P<0.01），while the content in traditional Chinese medicine culture medium was significantly increased（P<0.01）. After acting on PMC，the content of each culture medium group significantly decreased.（2）Expression of EMT-related proteins：Based on the results of Western Blot，qPCR and IF，compared with the model group，all culture medium groups were able to increase E-Cad expression（P<0.05 or P<0.01）and decrease the expressions of α-SMA and vimentin（VIM）（P<0.05 or P<0.01）. All culture medium groups were able to inhibit the EMT of PMC，with the order of effect being Chinese medicine culture medium group>normal medium group>low HGF medium group.（3）Changes in cellmigration ability of EMT：After intervention for 24 h and 48 h，the healing rate of each group was significantly decreased compared with that of the model group（P<0.01）. Each group of culturemedia can reduce the Rmigration ability of the EMT model，with the order of effect being Chinese medicine culture medium group>normal medium group>low HGF medium group.（4）Correlation analysis of EMT-related protein expression and HGF content：The expression level of E-Cad protein was positively correlated with the content of HGF（P<0.05）. The protein expressions of α-SMA and VIM were negatively correlated with the content of HGF（P<0.05 or P<0.01）.

Conclusion

The therapeutic effect of SBHD in inhibiting the EMT of PMC and preventing PAA may be multi-target，with both direct effects on PMC and indirect effects by enhancing the paracrine secretion of HGF by ADSCs in the greateromentum，with the latter beingmore important.

Key words

Supplemented Buyang Huanwu Decoction（加味补阳还五汤） / postoperative abdominal adhesions（PAA） / peritoneal mesothelial cells / adipose-derived stem cells（ADSCs） / hepatocyte growth factor（HGF） / epithelial-mesenchymal transition（EMT）

引用本文

郑敏麟, 王亚楠, 范文江, 詹倩倩, 陈锋斌. 大网膜脂肪干细胞旁分泌HGF与加味补阳还五汤抑制腹膜间皮细胞EMT相关性的体外研究. 中华中医药学刊, 2025 , 43 (1) : 11 -18 . DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.01.003

Minlin ZHENG, Yanan WANG, Wenjiang FAN, Qianqian ZHAN, Fengbin CHEN. In Vitro Study on Correlation between HGF Paracrine Secretion by ADSCs in Greater Omentum and Inhibition of EMT in Peritoneal Mesothelial Cells by Supplemented Buyang Huanwu Decoction（加味补阳还五汤）[J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2025 , 43 (1) : 11 -18 . DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.01.003

正文

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术后腹腔粘连（PAA）是腹、盆部手术中常见的严重并发症，可引发慢性顽固性腹痛、不孕症，并增加再次手术的难度；其中很大的一部分可进展为粘连性肠梗阻，甚至危及生命^[1]。尽管目前在临床上已经有几种方法（如改进外科术式^[2]、药物防治^[3-4]及腹腔内使用隔离物^[2]等）用于防止粘连的形成，但均因效果不够稳定，导致无法在临床中广泛应用。PAA对患者的生活质量和社会经济成本都造成了重大影响，防治PAA是当今世界外科领域非常关注的前沿问题，也是目前亟须解决的外科方面的世界难题^[5-6]。

PAA的具体发病机制现在仍不十分明确。最新的证据^[7]显示，手术中受损的腹膜间皮细胞（PMC）引发的上皮-间充质转化（EMT），是PAA的关键发病因素。

研究表明，转化生长因子-β1（TGF-β1）是EMT的最主要诱发因子，而脂肪干细胞（ADSCs）能通过旁分泌肝细胞生长因子（HGF）从而抑制EMT^[8]。

大网膜在控制腹腔炎症时有强大的作用，大网膜的脂肪库中富含ADSCs。然而，大网膜中的ADSCs旁分泌HGF功能的异常，是否与PAA发病密切相关，目前尚未得到深入研究和阐明。本课题组在临床研究中观察到，PAA患者通常表现为体形消瘦、腹部脂肪较少，且未发现有腹部肥胖的病例出现PAA的情况。早期的动物研究表明^[9]，自体大网膜脂肪细胞再培养后注入腹腔，能有效预防PAA。本课题组推测，以上现象均应该与其中的ADSCs相关。

本课题组应用加味补阳还五汤（SBHD）在临床中治疗PAA，获得了较好的疗效；同时，在动物实验中发现，该方可以抑制PMC的EMT^[10-12]。但尚不明确是否通过调控大网膜的ADSCs旁分泌HGF实现。本研究拟通过两个序列的细胞实验，对此进行探讨：①实验1通过对比中药培养基（TCM-ADSC-CM），即加味补阳还五汤培养ADSCs后制取其条件培养基（CM），与加味补阳还五汤对PMC的EMT影响，以确定该方的上述疗效是该方对PMC的直接作用，还是通过大网膜ADSCs的间接作用；②实验2在实验1的结果上，进一步明确加味补阳还五汤抑制PMC的EMT作用，是否与大网膜中的ADSCs旁分泌HGF相关。

1　材料

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1.1　细胞株

人脂肪间充质干细胞细胞株（简称ADSCs），购于海星生物有限公司。人PMC，采用HMrSV5细胞株，购于广州吉妮欧生物有限公司。

1.2　实验药物

1.2.1　制备加味补阳还五汤浓缩液

中药购自福建中医药大学附属第三人民医院，黄芪100 g，红花10 g，桃仁15 g，赤芍15 g，当归10 g，川芎10 g，蒲黄10 g，五灵脂15 g，土鳖虫10 g，地龙干10 g，炙甘草5 g等。参照参考文献^[13-14]，制备采用水煎醇沉法，制取含原生药2.0 g/mL的母液，经0.22 μm的滤膜进行过滤除菌后，瓶子分装，保存在-20℃冰箱中备用。用于干预细胞时，以DMEM高糖培养基临时调配浓度为10 mg/mL生药量再使用。

1.2.2　制备各种条件培养基

方法参照参考文献^[13，15-17]，分别制备正常ADSCs条件培养基（普通培养基，Normal-ADSC-CM）、加味补阳还五汤培养的条件培养基（中药培养基，TCM-ADSC-CM）、低表达HGF的条件培养基（低HGF培养基，Low-HGF-ADSC-CM）；其中低HGF培养基使用HGFSiRNA-652基因片段（基因片段由福州载基生物提供）转染ADSCs取得。实验时用含3% FBS的DMEM高糖培养基配制成50%体积分数。

1.3　实验试剂及仪器

1.3.1　实验试剂

E-钙黏蛋白（E-Cad）抗体（14472S）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（ab124964）、Vimentin（VIM）抗体（3H9D1）、Human HGF ELISA试剂盒（EK1H01-96）、DMEM高糖培养基（8121645）、成人脂肪间充质干细胞完全培养基（ADHX-G101）、PBS（SH30256.01B）、胎牛血清（CCS3001002）、胰蛋白酶（2520007225）、青霉素-链霉素（SV30010）、HRP-羊抗鼠IgG（SA00013-1）、HRP-羊抗兔IgG（SA00013-2）、CoraLite488-羊抗兔IgG（SA00013-2）、CoraLite488-羊抗鼠IgG（SA00013-1）、抗荧光淬灭封片液（含DAPI）（P0131-5 mL）、极超敏化学发光试剂盒（ED0015-B）、SweScript RT IFirst Strand cDNA Synthesis Kit（G3330-50）、2×SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX）（G3320-05）。

1.3.2　实验仪器

高压灭菌锅（LMQ.C80E）、-80℃超低温冰箱（ulT1386-5-V41）、细胞培养箱（Cytoperm2）、荧光倒置显微镜（TS-100F）、台式冷冻离心机（Multifuge X3R）、低速离心机（Multifuge X3R）、微孔板酶标仪（Bio-TEKELx800）、小型垂直电泳槽（Mini PROTEAN Tetra）、Trans-Blot小型转印槽转膜仪（Trans-Blot SD）、基础电泳仪电源（PowerPac Basic）、基因扩增仪（A37028）、超高灵敏度化学发光成像系统（ChemiDoc XRS+）、荧光定量PCR仪（CFX96TM Optics Module）。

2　方法

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2.1　实验1

加味补阳还五汤与中药培养基二者抑制PMC的EMT疗效比较。

2.1.1　实验分组和药物治疗

取第3代融合至70%左右时接种于6孔板中，每孔2×10⁵ 个，每组3个复孔。细胞贴壁后，更换无血清培养基，对细胞进行饥饿处理，12 h后加入10 ng/mL的TGF-β1干预，48 h后分别加入10 mg/m L的加味补阳还五汤与50%体积分数的中药培养基。分组如下：正常组：3% FBS+DMEM；模型组：3% FBS+DMEM+TGF-β1；加味补阳还五汤组：3% FBS+DMEM+TGF-β1+加味补阳还五汤浓缩液；中药培养基组：3% FBS+DMEM+TGF-β1+中药培养基。

2.1.2　Western Blot检测E-Cad、α-SMA蛋白表达

按照试剂盒说明书操作。

2.2　实验2

加味补阳还五汤抑制PMC的EMT作用，与大网膜ADSCs旁分泌HGF的相关性研究。

2.2.1　实验分组

（1）正常组：3% FBS+DMEM；（2）模型组：3% FBS+DMEM+TGF-β1；（3）中药培养基组（即加味补阳还五汤培养的ADSCs条件培养基组）：3% FBS+DMEM+TGF-β1+中药培养基；（4）普通培养基组（即正常ADSCs条件培养基组）：3% FBS+DMEM+TGF-β1+普通培养基；（5）低HGF培养基组（即低表达HGF的ADSCs条件培养基组）：3% FBS+DMEM+TGF-β1+低HGF培养基。

2.2.2　模型构建和药物治疗

方法参照参考文献^[13]，当第3代PMC融合至70%左右时，按每孔2×10⁵个，每组3个复孔，接种于6孔板中。当观察到细胞贴壁后，再更换为无血清培养基；并在12 h后，除正常组以外的其他4组均加入10 ng/m L的TGF-β1进行EMT的造模；在48 h后，中药培养基组、普通培养基组和低HGF培养基组再分别加入相应的条件培养基（50%体积分数），继续培养24 h。

2.2.3　指标检测

（1）ELISA法检测各组CM在干预PMC前、后的HGF不同含量：操作方法按该试剂盒的说明书。

（2）Western Blot检测PMC的E-Cad、α-SMA蛋白的表达量：操作方法按该试剂盒的说明书。

（3）qPCR检测PMC的α-SMA的mRNA的表达量：操作方法按该试剂盒的说明书，先分别提取各组PMC的总RNA，通过逆转录取得cDNA，最后行qPCR，引物序列见表1。结果分析，mRNA的相对表达量＝2^-ΔΔCt，ΔΔCt＝各组（Ct目的-Ct内参）-对照组（Ct目的-Ct内参）。

（4）免疫荧光（IF）法检测PMC的E-Cad荧光相对强度：操作方法按参考文献方法^[18-19]，在荧光显微镜下观察，然后拍照。

（5）划痕实验检测各组条件培养基干预PMC的EMT迁移能力的变化：使用记号笔与直尺在6孔板背面中间1条直线，取第3代融合至70%左右的PMC接种于该6孔板中，每组3个复孔，每孔2×10⁵个。细胞融合至70%左右时，除正常组以外的组别均加入TGF-β1（10 ng/mL），继续干预48 h后，使用直尺与200 μL枪头，垂直于事先划好的直线，力度均匀地每隔0.5 cm划1条直线。PBS洗去散落的细胞后，分别加入含各组CM。分别在0、24、48 h于显微镜下拍照记录，根据公式计算愈合率，公式为：愈合率＝［（0 h划痕面积-某一时间段划痕面积）/0 h划痕面积］×100%。

2.3　统计学方法

统计数据采用SPSS 26.0软件分析，并用

±s表示，数据符合正态性分布采用方差分析，数据方差齐两两比较采用LSD法，数据方差不齐两两比较采用Games-Howell法比较；数据不符合正态性分布则采用多样本秩和检验；相关性分析采用皮尔逊法；P<0.05为差异有统计学意义。

3　结果

收起

3.1　实验1

加味补阳还五汤与中药培养基二者抑制PMC的EMT的疗效比较。

使用加味补阳还五汤、中药培养基分别对PMC的EMT模型进行干预，应用Western Blot法检测E-Cad、α-SMA蛋白表达。结果如表2、图1所示：①与正常组相比，模型组显著下调E-Cad的蛋白表达（P<0.01），显著上调α-SMA的蛋白表达（P<0.01）。②与模型组相比，加味补阳还五汤组上调E-Cad的蛋白表达（P<0.05），下调α-SMA的蛋白表达（P<0.05）；中药培养基组显著上调了E-Cad的蛋白表达（P<0.01），显著下调α-SMA的蛋白表达（P<0.01）。③与加味补阳还五汤组相比，中药培养基组上调E-Cad的蛋白表达（P<0.05），显著下调α-SMA的蛋白表达（P<0.01）。

3.2　实验2

加味补阳还五汤抑制PMC的EMT作用，与大网膜ADSCs旁分泌HGF的相关性研究。

3.2.1　在干预PMC前后，ELISA法检测各组条件培养基中HGF含量

详见表3。干预PMC前HGF的含量，与普通培养基组比较，中药培养基组显著升高（P<0.01），低HGF培养基组的显著降低（P<0.01）。与干预前相比，干预PMC后，HGF含量在各组的条件培养基中均显著性下降。

3.2.2　各组在相应的不同条件培养基干预后，PMC的EMT相关蛋白表达情况

（1）E-Cad表达情况。Western Blot结果详见表4、图2。各组E-Cad蛋白的表达比较：相较于正常组，模型组的水平显著下调（P<0.01）。相较于模型组，中药培养基组的表达显著上调（P<0.01），普通培养基组的表达上调（P<0.05），而低HGF培养基组变化则无统计学意义。IF结果详见表5、插页Ⅵ图3，各组E-Cad相对荧光强度比较：相较于正常组，模型组显著减少（P<0.01）。相较于模型组，各条件培养基组均显著增强（P<0.01）。相较于普通培养基组，中药培养基组显著增加（P<0.01），低HGF培养基组显著减少（P<0.01）。这表明，中药培养基组对提高PMC的E-Cad表达效果优于普通培养基组，而低HGF培养基组的效果较为不理想。

（2）α-SMA表达情况。Western Blot结果详见表4、图2。各组α-SMA蛋白表达的结果比较：相较于正常组，模型组显著增加（P<0.01）。相较于模型组，中药培养基组、普通培养基组均显著下调（P<0.01），低HGF培养基组下调（P<0.05）。相较于普通培养基组，低HGF培养基组上调（P<0.05）。qPCR结果详见表6，各组α-SMA的mRNA表达结果比较如下：相较于正常组，模型组显著上调（P<0.01）。相较于模型组，中药培养基组、普通培养基组均显著下调（P<0.01），低HGF培养基组下调（P<0.05）。相较于普通培养基组，中药培养基组显著下调（P<0.01），低HGF培养基组显著上调（P<0.01）。说明抑制PMCα-SMA表达的效果依次为中药培养基组>普通培养基组>低HGF培养基组。

（3）E-Cad、α-SMA蛋白表达与HGF含量相关性分析。通过皮尔逊相关性分析，结果详见表7。E-Cad蛋白表达量与HGF含量之间的相关系数r为0.73，说明它们之间呈正相关性（P<0.05）。α-SMA与HGF含量之间的相关系数r为-1.00，说明它们之间呈负相关性（P<0.05或P<0.01），说明各组CM抑制PMC的EMT能力与其HGF含量相关。

3.2.3　各组CM干预PMC的EMT迁移能力变化情况

应用划痕实验检测各组CM对经TGF-β1诱导的PMC的迁移能力的影响，结果如表8、插页Ⅶ图4所示。24 h后，正常组划痕只有轻微愈合，模型组的划痕约愈合了1/3，48 h后，正常组划痕稍有愈合，模型组的划痕约愈合了2/3，两个时间段3种上清液组划痕均有愈合，愈合程度依次为中药培养基组<普通培养基组<低HGF培养基组。与模型组相比，各组愈合率均有显著下降（P<0.01）；与普通培养基组相比，中药培养基组愈合率下降（P<0.05），低HGF培养基组愈合率显著上升（P<0.01）。各组CM均可降低EMT模型的PMC的迁移能力。

4　讨论

收起

4.1　PMC的EMT与PAA发病机制之间的关系

4.1.1　EMT

EMT是指在上皮细胞转化为间充质细胞的过程，在此过程中，上皮细胞将失去极性，细胞间紧密连接和黏附连接，获得游走迁移的能力^[17]。

（1）发生EMT时上皮细胞的主要变化。①E-Cad又名上皮细胞钙黏素，是一种主要在上皮细胞表达、Ca²⁺依赖性的跨膜糖蛋白，在介导上皮细胞间彼此连接有重要作用，通过黏附连接，促进上皮细胞之间的黏附，抑制细胞的运动迁移。ECad是上皮细胞的重要标志分子^[18-19]。②α-SMA与VIM一起构成细胞骨架，发生EMT时，转化中的上皮细胞肌动蛋白中会表达和被掺入α-SMA，逐渐获得肌成纤维细胞的表型。α-SMA是肌成纤维细胞的标志分子^[20]。③迁移能力：上皮细胞本身拥有顶端-基底极性，通过E-Cad、紧密连接蛋白等介导细胞间黏附、连接的蛋白和桥粒结合固定在基底膜上。在经典的TGF-β1诱导的Smad信号途径中，下游转录因子SNAIL1被激活，上皮细胞结构的主要成分受到抑制，间充质状态相关基因（如α-SMA等）激活，立方状、扁平状的上皮细胞顶端-基底极性丢失，细胞骨架重组（顶端收缩、形成肌动蛋白应力纤维），细胞转化成具有前后极性的纺锤状的间充质细胞，迁移能力增强^[21]。

在本实验中，与正常组相比，模型组E-Cad表达降低，α-SMA表达升高，划痕实验24 h与48 h后的愈合率均显著上升，说明PMC经历了EMT，造模成功。

（2）TGF-β1和HGF被认为是ADSCs调控EMT最重要的一对细胞因子。①TGF-β1特异性激活Smad信号通路，是EMT最主要的激发因子^[5，15-16]。TGF-β1与其Ⅰ型受体、Ⅱ型受体结合后，启动下游的信号通路，从而抑制E-Cad等上皮基因表达、刺激α-SMA等间充质基因表达，启动EMT^[22-24]。经历EMT的上皮细胞失去极性和黏附连接，同时获得间充质细胞表型和更强的迁移能力，这些变化还重塑了细胞与邻近细胞以及基底膜和其他细胞外基质结构的接触^[25]。本实验PMC的EMT模型组就是通过TGF-β1诱导制作的。②HGF可以抑制TGF-β1激发EMT。最新的研究认为，HGF是一种有效的抗纤维化蛋白，具备多种生物活性，它可以降低TGF-β1受体的表达数量，从而降低细胞对TGF-β1的敏感性，达到阻断TGF-β1/Smad通路^[26-29]，抑制促进细胞外基质生成和纤维化的相关基因（如TGF-β1、肿瘤坏死因子、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原等）表达的作用，最终抑制细胞的EMT及其后续的纤维化过程^[30-32]。本实验结果发现，E-Cad蛋白表达量与HGF含量之间呈正相关性，α-SMA蛋白表达量与HGF含量之间呈负相关性，说明HGF是抑制PMC的EMT的关键。

4.1.2　PMC的EMT与PAA的发病机制之间的关系

腹膜是覆盖在腹壁（壁层腹膜）及内脏器官（脏层腹膜）表面的一层浆膜，其主要成分为PMC，是单层、扁平状的上皮细胞。

由于PMC通过松散的细胞间桥连接，腹膜极易受到创伤^[2]。手术对腹膜造成的损伤使PMC的完整性受损，基底膜暴露，胶原蛋白、纤维蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质成分渗出、沉积^[6-7，33]。之前的研究表明^[34]，当腹膜受到损伤后，PMC会发生EMT，转化为成纤维细胞和肌成纤维细胞以应对这种损伤。在EMT过程中，新转化成的成纤维细胞和肌成纤维细胞，将会合成大量的细胞外基质，细胞外基质过度沉积就形成腹膜之间的粘连^{[7，20，24]}。同时，失去了PMC被覆的腹膜表面，更为PAA提供了黏贴部位。

4.2　大网膜中的脂肪干细胞与PMC的EMT、PAA的关系

4.2.1　ADSCs

ADSCs是从脂肪组织中提取的具有多向分化能力的干细胞。它们在全身脂肪组织中广泛分布、数量庞大^[35]（1 g脂肪组织含有ADSCs为3.5×10⁵～1×10⁶个^[36]）。大网膜具有控制炎症、保护腹腔内脏器的作用，是一个腹腔中功能强大的器官。作为人体主要的脂肪库之一，大网膜中富含ADSCs。

4.2.2　ADSCs旁分泌（TGF-β1、HGF）与EMT的关系

目前研究发现^[37-40]，ADSCs能够通过合成并释放多种可溶性的、具有生物活性的物质，用以调控其附近细胞的功能，以及调节其生长和发育的进程。在体外培养ADSCs的条件培养基中，可检测到包括TGF-β1、HGF、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子和角化细胞生长因子等在内的多种生长因子，在调节细胞EMT和组织的炎症、纤维化等多个环节发挥了非常重要的作用。其中，TGF-β1和HGF被认为是ADSCs调控EMT最重要的一对细胞因子。

4.2.3　由于大网膜ADSCs旁分泌HGF不足、无法有效抑制PMC的EMT，可能是导致PAA发生的关键原因

腹腔内的大网膜是连在胃的大弯侧和横结肠之间的四层腹膜结构，悬垂覆盖于空肠和回肠的前面。大网膜对腹腔内器官的炎症有强大的防御作用。作为人体主要的脂肪储存库之一，大网膜富含脂肪组织和ADSCs。

较早时有学者发现^[9]，取出动物大网膜的脂肪细胞，经过体外培养后再注入原动物的腹腔，可以有效预防PAA，考虑到脂肪细胞中富含大量ADSCs，笔者认为应该是ADSCs而非单纯的脂肪细胞，在其中起了关键作用。在临床中，笔者观察到，PAA患者普遍体形消瘦、腹部的脂肪含量较少，而基本少见腹部肥胖的PAA患者；考虑到ADSCs旁分泌HGF对EMT的强大抑制作用，以及PMC的EMT在PAA发病中充当关键角色，因此推测该病可能与大网膜中ADSCs旁分泌HGF不足密切相关。

通过对本实验相关性分析的结果可见，PMC的EMT严重程度与ADSCs旁分泌HGF量的高低之间呈正相关性。与HGF含量正常的普通培养基组相比，HGF含量较低的低HGF培养基组其PMC的EMT程度更加严重；说明大网膜中ADSCs旁分泌的低HGF状态，更容易导致PMC的EMT，更易在腹腔手术后患上PAA。

4.3　加味补阳还五汤抑制PMC的EMT的作用，及其作用的途径和靶点初探

4.3.1　加味补阳还五汤防治PAA的由来

中医药在防治PAA方面有一定作用。大多数学者认为^[41-42]，PAA由瘀血留滞，肠腑气机不利所致，属里实证；治法以理气导滞通腑，或行气活血化瘀等泻实法为主，用药多以大承气汤、通腑泻热灌肠合剂等。

PAA因腹部手术引起，本课题组在临床研究中发现，患者原本素体就元气不足，手术后元气更加损伤；中医认为，气是推动血液运行的动力，“气行则血行”，气虚无力推动血行则血瘀，瘀久入络，导致肠腑粘连，故发为PAA。其病机应为“本虚标实”，以“元气虚”为本，以“血瘀入络”为标。故治法应为益气活血通络，予以加味补阳还五汤。本课题组运用该方在临床治疗和动物实验中都取得了较好的疗效；并且前期的动物实验表明^[7-9]，加味补阳还五汤能明显减轻术后的PMC的EMT、纤维化和腹腔粘连。

4.3.2　加味补阳还五汤的组成和方解

加味补阳还五汤是在传统名方“补阳还五汤”的基础上，加入了另一名方“失笑散”（即蒲黄和五灵脂），以及土鳖虫、炙甘草而形成的方剂，全方具有大补元气和活血通络止痛之功，非常切合PAA的病因病机，故笔者在临床中用于治疗该病，效如桴鼓。

补阳还五汤，原本是用于治疗气虚血瘀引起的中风后遗症的主要方剂，源自清代的名医王清任所著的《医林改错》一书。原方中黄芪用至四两（笔者的临床用量为100 g），可以大补术后受损之元气，量大为君，为本方君药，补气以行血，主治PPA气虚血瘀的主要病机；臣以红花、桃仁、赤芍、当归、川芎，以助君药行气活血祛瘀；少佐地龙活血通络，加强全方活血祛瘀之功。

加土鳖虫者，因虫类通络，故土鳖虫擅长逐瘀通络理伤，既能与地龙干配伍以通络，又能调理因手术损伤的肠腑，并加强全方活血祛瘀之功。

加蒲黄、五灵脂者，二药即“失笑散”，为专治瘀血停滞之腹痛，功效卓越的中医名方；《太平惠民和剂局方》说该方能“治产后心腹痛欲死，百药不效，服此顿愈”；《医宗金鉴·删补名医方论》认为该方“小腹结痛，迷闷欲绝……有推陈致新之功，甘不伤脾，辛能散瘀，不觉诸证悉除，直可以一笑而置之矣”；故此二药对PAA和由此引起的顽固性腹痛有奇效。更妙的是，失笑散还可将补阳还五汤补气活血的作用专注于腹部，起到“引药归经”的作用。

加炙甘草调和诸药，使“补阳还五汤”合“失笑散”两方合为一方。全方共奏补气活血、通络理伤之功，治疗PAA的功效相得益彰。

4.3.3　关于补阳还五汤现代研究和加味补阳还五汤的前期研究

多项研究结果指出，补阳还五汤能抑制EMT和抗纤维化。在EMT和纤维化相关模型中，该方能够显著上调E-Cad的表达水平^[43]，下调α-SMA^[44-45]的表达水平，并且与TGF-β1/Smad^[46]等通路密切相关。

加味补阳还五汤是补阳还五汤的强化升级版本。本课题组之前的动物实验也已经证实，该方能有效抑制PAA模型大鼠的粘连部位的TGF-β1/Smad通路的信号传递以及PMC的EMT，在改善纤维化和粘连方面具有较显著的治疗作用，对预防和治疗PAA效果较好^[10-12]。

4.3.4　实验1的研究结果表明，加味补阳还五汤抑制PMC的EMT作用是多途径、多靶点的，主要是通过调控ADSCs旁分泌功能实现

本课题组的前期的动物实验表明^[10-12]，加味补阳还五汤可以通过抑制PMC的EMT，从而防治PAA。目前的研究显示，ADSCs可通过其旁分泌抑制EMT^[31-32]。那么，加味补阳还五汤对PMC的EMT的抑制，是该方对PMC的直接作用，还是通过调控大网膜ADSCs旁分泌的间接作用呢？

加味补阳还五汤极有可能是通过调控大网膜中的ADSCs旁分泌，从而实现防治PAA的作用。

在本实验1的Western Blot结果表明：①与模型组相比，加味补阳还五汤组与中药培养基组均可下调α-SMA的蛋白表达，上调E-Cad的蛋白表达，说明二者均可抑制PMC的EMT，说明了加味补阳还五汤抑制PMC的EMT的作用是多途径、多靶点的；加味补阳还五汤既可以直接作用于PMC，抑制其EMT；也可通过调控ADSCs旁分泌，降低其中TGF-β1的水平，提高HGF的水平，从而抑制PMC的EMT。②相比于加味补阳还五汤组，中药培养基组的效果明显强于加味补阳还五汤；说明加味补阳还五汤抑制PMC的EMT的作用主要是通过调控ADSCs旁分泌功能实现的。

4.3.5　实验2的研究结果表明，加味补阳还五汤主要通过提高大网膜ADSCs旁分泌HGF的水平，从而抑制PMC的EMT

在实验2中，相较于普通培养基组，中药培养基组中HGF含量明显增加，这表明加味补阳还五汤的疗效可能是通过调控ADSCs旁分泌功能，促进HGF的分泌来实现的。

实验2发现，E-Cad蛋白表达量与HGF含量之间呈正相关性，α-SMA蛋白表达量与HGF含量之间呈负相关性，说明各组ADSCs的CM抑制PMC的EMT能力与其HGF含量相关。

实验2还发现，中药培养基组的CM中HGF含量显著升高；并且PMC表达E-Cad上升，表达α-SMA下降，迁移能力降低，说明加味补阳还五汤能通过增强ADSCs旁分泌HGF的作用，有效抑制PMC的EMT。

4.4　小结

综上所述，并综合本课题组前期的动物实验的研究结果，得出以下结论：（1）ADSCs抑制PMC的EMT的作用与其旁分泌HGF的能力呈正相关。（2）PAA的发生，可能与大网膜中的ADSCs旁分泌HGF水平低下有关。（3）加味补阳还五汤抑制PMC的EMT从而预防和治疗PAA的作用是多途径、多靶点的。加味补阳还五汤既可以直接作用于PMC，抑制其EMT；也可通过调控大网膜内ADSCs、促进其旁分泌HGF，从而抑制PMC的EMT，而后者的作用比前者强得多，因此后者是加味补阳还五汤抑制PMC的EMT防治PAA的主要靶标。

基金

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国家自然科学基金面上项目(82274516)
福建省自然科学基金面上项目(2022J01842)
福建中医药大学校管科研课题-重点项目（自然科学）(X2021003-重点)

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文献

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2025年第43卷第1期

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doi: 10.13193/j.issn.1673-7717.2025.01.003

首发时间：2026-10-30
出版时间：2025-01-10

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国家自然科学基金面上项目(82274516)

福建省自然科学基金面上项目(2022J01842)

福建中医药大学校管科研课题-重点项目（自然科学）(X2021003-重点)

作者信息

^1．福建中医药大学中西医结合学院，福建　福州　350122

^2．福建中医药大学中西医结合研究院，福建　福州　350122

^3．福建医科大学附属第一医院，福建　福州　350005

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/zhzyyxk/CN/10.13193/j.issn.1673-7717.2025.01.003

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

基因	引物
GAPDH	5'GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC3'
	5'TGATGACCCTTTTGGCTCCC3'
VIM	5'GGAGGAGATGCTTCAGAGAGAG3'
	5'GGATTTCCTCTTCGTGGAGTTTC3'
α-SMA	5'CAATGTCCTATCAGGGGGCAC3'
	5'CGGCTTCATCGTATTCCTGTT3'

基因

引物

GAPDH

5'GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC3'

5'TGATGACCCTTTTGGCTCCC3'

VIM

5'GGAGGAGATGCTTCAGAGAGAG3'

5'GGATTTCCTCTTCGTGGAGTTTC3'

α-SMA

5'CAATGTCCTATCAGGGGGCAC3'

5'CGGCTTCATCGTATTCCTGTT3'

组别	n	E-Cad	α-SMA
正常组	4	1.32±0.18	0.47±0.07
模型组	4	0.62±0.09^**	1.47±0.22^**
加味补阳还五汤组	4	0.87±0.14^＃	1.06±0.12^＃
中药培养基组	4	1.17±0.21^＃＃▲	0.68±0.09^＃＃▲▲

组别

E-Cad

α-SMA

正常组

1.32±0.18

0.47±0.07

模型组

0.62±0.09^**

1.47±0.22^**

加味补阳还五汤组

0.87±0.14^＃

1.06±0.12^＃

中药培养基组

1.17±0.21^＃＃▲

0.68±0.09^＃＃▲▲

组别	n	体积分数/（%）	干预前/（pg/mL）	干预后/（pg/mL）
中药培养基组	3	50	1 147.75±5.15^△△	64.25±1.96
普通培养基组	3	50	779.98±6.85	63.12±2.59
低HGF培养基组	3	50	489.68±6.12^△△	40.05±1.68^△△

组别

体积分数/（%）

干预前/（pg/mL）

干预后/（pg/mL）

中药培养基组

1 147.75±5.15^△△

64.25±1.96

普通培养基组

779.98±6.85

63.12±2.59

低HGF培养基组

489.68±6.12^△△

40.05±1.68^△△

组别	n	体积分数/（%）	E-Cad	α-SMA
正常组	3		1.65±0.05	0.30±0.05
模型组	3		0.73±0.16^**	1.14±0.12^**
中药培养基组	3	50	1.28±0.17^＃＃	0.44±0.11^＃＃
普通培养基组	3	50	1.06±0.19^＃	0.61±0.14^＃＃
低HGF培养基组	3	50	0.93±0.11	0.84±0.24^＃△

组别

体积分数/（%）

E-Cad

α-SMA

正常组

1.65±0.05

0.30±0.05

模型组

0.73±0.16^**

1.14±0.12^**

中药培养基组

1.28±0.17^＃＃

0.44±0.11^＃＃

普通培养基组

1.06±0.19^＃

0.61±0.14^＃＃

低HGF培养基组

0.93±0.11

0.84±0.24^＃△

组别	n	体积分数/（%）	E-Cad
正常组	3		1.00±0.03
模型组	3		0.22±0.02^**
中药培养基组	3	50	0.76±0.04^＃＃△△
普通培养基组	3	50	0.45±0.04^＃＃
低HGF培养基组	3	50	0.33±0.03^＃＃△△

组别

体积分数/（%）

E-Cad

正常组

1.00±0.03

模型组

0.22±0.02^**

中药培养基组

0.76±0.04^＃＃△△

普通培养基组

0.45±0.04^＃＃

低HGF培养基组

0.33±0.03^＃＃△△

组别	n	体积分数/（%）	α-SMA
正常组	3		1.00±0.00
模型组	3		6.85±0.24^**
中药培养基组	3	50	3.04±0.25^＃＃△△
普通培养基组	3	50	5.17±0.12^＃＃
低HGF培养基组	3	50	6.46±0.12^＃△△

组别

体积分数/（%）

α-SMA

正常组

1.00±0.00

模型组

6.85±0.24^**

中药培养基组

3.04±0.25^＃＃△△

普通培养基组

5.17±0.12^＃＃

低HGF培养基组

6.46±0.12^＃△△

EMT相关指标	相关性	HGF含量
E-Cad	r值	0.73
	P值	<0.05
α-SMA	r值	-1.00
	P值	<0.01

EMT相关指标