现代预防医学

α多样性	Control组	AOM组	AbxAOM组	Abx组	F值	P值
Chao1	1 146.39±118.86	1 102.21±104.58	1 326.61±50.64^#	1 068.94±115.56	3.391	0.039
ACE	1 135.46±108.92	1 091.66±97.50	1 315.92±52.20^#	1 059.22±103.50	4.629	0.025
Shannon	4.80±0.29	4.58±0.18	5.00±0.23	4.33±0.36^*	3.804	0.043
Simpson	0.98±0.01	0.97±0.003	0.98±0.004	0.96±0.01^**	7.957	0.004

α多样性	Control组	AOM组	AbxAOM组	Abx组	F值	P值
Chao1	1 146.39±118.86	1 102.21±104.58	1 326.61±50.64^#	1 068.94±115.56	3.391	0.039
ACE	1 135.46±108.92	1 091.66±97.50	1 315.92±52.20^#	1 059.22±103.50	4.629	0.025
Shannon	4.80±0.29	4.58±0.18	5.00±0.23	4.33±0.36^*	3.804	0.043
Simpson	0.98±0.01	0.97±0.003	0.98±0.004	0.96±0.01^**	7.957	0.004

短期抗生素联用对氧化偶氮甲烷诱导小鼠肠道菌群的影响

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何夏梦 ¹ , 商正云 ² , 胡雯 ¹ , 蒲芳芳 ¹

现代预防医学 | 实验技术及其应用 2024,51(1): 138-142

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现代预防医学 | 实验技术及其应用 2024, 51(1): 138-142

短期抗生素联用对氧化偶氮甲烷诱导小鼠肠道菌群的影响

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何夏梦¹, 商正云², 胡雯¹, 蒲芳芳¹

作者信息

^1.四川大学华西医院临床营养科，四川成都 610041

^2.重庆市江津区卫生健康委员会疾病预防控制科

何夏梦（1995—），女，硕士，初级营养师，研究方向：营养与健康

通讯作者:

蒲芳芳，E-mail: pufangfang128@163.com

Effects of short-term antibiotics cocktail exposure on intestinal microbiota induced by azomethane in mice

Xia-meng HE¹, Zheng-yun SHANG², Wen HU¹, Fang-fang PU¹

Affiliations

Department of Clinical Nutrition, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan 610041, China

出版时间: 2024-01-10 doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202308116

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摘要

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目的

研究短期抗生素联用对氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）诱导小鼠肠道菌群的影响。

方法

40只3～4周龄ICR雄性小鼠随机等分成对照组（Control组）、AOM组（AOM组）、抗生素组（Antibiotics，Abx组）及抗生素+AOM组（AbxAOM组）。灌胃期：AbxAOM组和Abx组灌胃抗生素溶液，Control组和AOM组灌胃等体积纯水，每天2次，连续2周。腹腔注射期：AOM组和AbxAOM组腹腔注射AOM溶液，Control组和Abx组腹腔注射无菌0.9%NaCl溶液，每周1次，连续4周。腹腔注射结束5周后采集小鼠粪便，采用16S rRNA测序技术对粪便肠道菌群进行分析。

结果

AbxAOM组Chao1指数、ACE指数高于AOM组（P<0.05）。门水平下，AbxAOM组厚壁菌门相对丰度显著高于AOM组（P<0.05），拟杆菌门相对丰度显著低于AOM组（P<0.05）。属水平下，AbxAOM组拟杆菌属、拟普雷沃菌相对丰度较AOM组显著下降（P<0.05），另枝菌属、梭状杆菌XIVa、布劳特菌相对丰度显著增高（P<0.05）。

结论

抗生素处理后的肠道菌群改变提示可能由特定微生物组而非单种菌株对AOM诱导小鼠CRC的发生发展具有重要作用。

关键词

抗生素 / 氧化偶氮甲烷 / 结直肠癌 / 肠道菌群

Abstract

收起

Objective

To study the effect of short-term antibiotics cocktail exposure on the intestinal flora induced by azomethane (AOM) in mice.

Methods

Forty male ICR mice aged 3 to 4 weeks were randomly divided into control group (Control group), AOM group (AOM group), antibiotic group (Abx group), and antibiotic + AOM group (AbxAOM group). During the gavage period, AbxAOM group and Abx group were administered with antibiotic solution, meanwile Control group and AOM group were administrated with corresponding volume of pure water twice a day for 2 weeks. During the period of intraperitoneal injection,AOM group and AbxAOM group were intraperitoneally injected with AOM solution, the Abx group and Control group were intraperitoneally injected with sterile 0.9% NaCl solution once a week for 4 weeks. The feces of mice were collected 5 weeks after intraperitoneal injection, and the intestinal flora of feces was analyzed by 16SrRNA sequencing.

Results

The Chao1 index and ACE index in AbxAOM group were higher than those in AOM group. Compared with AOM group, the relative abundance of Firmicutes in AbxAOM group was significantly higher (P<0.05), while that of Bacteroidetes was significantly lower at the phylum level (P<0.05). Compared with AOM group, the relative abundance of Bacteroides and Prevotella in AbxAOM group decreased significantly (P<0.05), and the relative abundance of Alistipes, Clostridium XIVa and Blautia increased significantly at the genus level (P<0.05).

Conclusion

The changes of intestinal flora after antibiotic treatment suggest that specific microbial groups rather than single strains may play an important role in the occurrence and development of CRC induced by AOM in mice.

Key words

Antibiotics / Azomethane / Colorectal cancer / Intestinal flora

引用本文

何夏梦, 商正云, 胡雯, 蒲芳芳. 短期抗生素联用对氧化偶氮甲烷诱导小鼠肠道菌群的影响. 现代预防医学, 2024 , 51 (1) : 138 -142 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202308116

Xia-meng HE, Zheng-yun SHANG, Wen HU, Fang-fang PU. Effects of short-term antibiotics cocktail exposure on intestinal microbiota induced by azomethane in mice[J]. Modern Preventive Medicine, 2024 , 51 (1) : 138 -142 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202308116

正文

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结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界各国尤其是我国常见肿瘤之一，作为高发病率、高致死率疾病，CRC严重危害人类健康。据世界卫生组织国际癌症研究机构最新资料统计显示，2020年全世界约有193万CRC新发病例和94万死亡病例，发病率、死亡率分别高居恶性肿瘤第三位和第二位^[1]。CRC是多种因素共同作用的结果，包括遗传背景因素和环境危险因素^[2]。近年来大量研究证实CRC患者肠道微生物群落构成及数量与健康人群存在显著差异^[3]，肠道微生物群在CRC的发生发展过程中发挥了重要作用^[4]。其机制可能为肠道内的微生物失调和个别菌株（或一组特定的微生物群整体）可通过激活致瘤途径、诱导炎症和破坏宿主DNA^[4-6]，从而诱发肿瘤或促进癌症进程。Wong等人^[7]研究发现CRC患者的粪便微生物群促进了给予致癌物的无菌或常规小鼠的肿瘤发生，显示CRC微生物群的致癌特性，为肠道微生物导致CRC提供了“直接证据”，然而与CRC密切相关的某种（些）特定肠道微生物及其作用机制尚未完全阐明。课题组前期研究中发现在使用氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）诱导小鼠CRC模型过程中，短期抗生素暴露可以加剧AOM小鼠异常隐窝灶（aberrant crypt foci，ACF）等癌前病变的产生，提示肠道微生物在CRC中扮演一定作用^[8]。本研究利用16S rRNA测序技术，从肠道菌群角度进一步分析短期抗生素暴露对AOM诱导小鼠CRC发展的短期作用，同时探索与CRC密切相关的肠道微生物。

1　材料与方法

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1.1　主要试剂

AOM购自Sigma-Aldrich公司，AOM工作液（浓度为1 mg/ml）以无菌0.9%NaCl溶液制备。

依照文献^[7,9-10]，采用的抗生素联用方案如下：新霉素100 mg/kg、氨苄西林100 mg/kg、甲硝唑100 mg/kg、万古霉素50 mg/kg和两性霉素B1 mg/kg。抗生素溶液以纯水配制，现配现用。抗生素均购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2　动物分组与处理

3～4周龄雄性ICR小鼠40只，SPF级，22～26 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养于四川大学华西公共卫生学院分析测试中心，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2018-209。饲养环境温度（23±2）℃，湿度40%～70%，明暗节律为12h。饲料和饮水均经无菌处理，干预开始前适应性饲养1周。

采用随机数字表法将40只小鼠按每组10只随机等分为4组：（1）对照组（Control组）：纯水灌胃后腹腔注射无菌0.9%NaCl溶液；（2）AOM组（AOM组）：纯水灌胃后腹腔注射AOM溶液；（3）抗生素组（Antibiotics，Abx组）：抗生素灌胃后腹腔注射无菌0.9%NaCl溶液；（4）抗生素+AOM组（AbxAOM组）：抗生素灌胃后腹腔注射AOM溶液。

灌胃频次为2次/d，早晚间隔12 h，持续2周；腹腔注射给药剂量为10 mg/（kg·bw），1次/周，连续4周。每天监测小鼠生长状况，并于腹腔注射结束后第5周处死小鼠。于实验终点前一天采集小鼠粪便，将收集到的粪便置于无菌无酶的2ml EP管中，并立即置于-80℃冰箱储存。动物实验方案已通过四川大学华西医院实验动物伦理委员会审批，伦理备案号为：20230731008。

1.3　16S rRNA测序和生物信息学分析

每组随机抽取3～4个小鼠粪便样品混合成一份，每份粪便混样重量为200 mg。根据试剂盒（粪便基因组DNA提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司）说明提取粪便DNA，并测定其浓度与纯度，通过琼脂凝胶电泳测定其完整度。扩增16S rRNA V3-V4区段，扩增引物为341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’），16S rRNA测序和生物信息学分析由成都贝斯拜尔生物科技有限公司完成。

1.4　统计方法

采用SPSS软件（v26.0）及R软件（v4.1.3）进行数据分析。α多样性采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。组间群落结构差异比较采用置换多元方差分析（Adonis分析）。门、属水平下物种差异组间两两比较采用Metastats丰度差异分析，并用Bonferroni法进行矫正。检验水准α=0.05。

2　结果

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2.1　一般情况

实验期间小鼠死亡情况：实验第3周AOM组有1只小鼠死亡，实验第3周及第4周AbxAOM组共有3只小鼠死亡，解剖均未发现病变或肿瘤。其余小鼠外观、行为无异常，体毛光亮，生长状况良好，无其他异常体征。

2.2　肠道菌群物种多样性分析

2.2.1　α多样性分析

丰富度指数（Chao1和ACE）和多样性指数（Shannon和Simpson）结果如表1所示，Abx组Shannon指数（P=0.037）、Simpson指数（P=0.003）较Control组显著下降，Chao1指数、ACE指数呈下降趋势。与AOM组相比，AbxAOM组Chao1（P=0.017）、ACE（P=0.011）指数显著升高，Shannon、Simpson指数呈升高趋势。

2.2.2　β多样性分析

使用基于加权Unifrac距离的非度量多维尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）检验样本或组之间的差异，结果如图1，本研究的stress值小于0.05，提示各组间肠道菌群物种构成存在差异。Adonis分析结果证实各组间菌落结构存在显著差异（R²=0.49，P=0.046），进一步两两比较显示了Control组与AOM组（P=0.02）、Abx组与AbxAOM组（P=0.005）、Abx组与AOM组（P<0.001）的群落组成有显著差异。

2.3　肠道菌群组成结构

2.3.1　门水平上的肠道菌群分类组成

根据门水平上物种注释结果，如图2所示，Control组以厚壁菌门（49.11%）、拟杆菌门（44.02%）、变形菌门（4.74%）、疣微菌门（1.14%）、脱铁杆菌门（0.52%）、放线菌门（0.22%）丰度较高；AOM组肠道微生物群丰度从高到低依次为拟杆菌门（75.44%）、厚壁菌门（21.45%）、变形菌门（2.09%）和疣微菌门（0.43%）等；AbxAOM组肠道微生物群排名前四的依次是拟杆菌门（61.28%）、厚壁菌门（33.13%）、变形菌门（3.54%）、疣微菌门（0.92%）。AOM组厚壁菌门（P=0.005）、变形菌门（P=0.011）相对丰度较Control组显著降低，拟杆菌门相对丰度显著升高（P<0.001）。而AbxAOM组厚壁菌门相对丰度较AOM组显著升高（P=0.035），拟杆菌门相对丰度显著降低（P=0.028）。

2.3.2　属水平上的肠道菌群分类组成

如图3和图4所示，AOM组巴恩斯菌属（P=0.048）、拟普雷沃菌属（P<0.001）、副拟杆菌属（P=0.026）、丁酸单胞菌属（P=0.046）相对丰度较Control组均显著增加，而脱硫弧菌属（P=0.004）、产醋菌属（P=0.02）及颤杆菌克属（P=0.001）相对丰度显著减少。与AOM组相比，AbxAOM组的拟杆菌属（P=0.041）和拟普雷沃菌属（P=0.005）相对丰度显著下降，而另枝菌属（P= 0.031）、梭状杆菌XIVa（P=0.008）和布劳特菌属（P=0.032）相对丰度显著增高。

3　讨论

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现今，CRC因其发病率高、致死率高、病理机制复杂等特点，严重影响患者的生命生活质量，为个人和社会带来沉重负担^[11]。随着分子生物学技术的飞速进步，许多研究已发现肠道菌群在CRC的发生发展过程中发挥重要作用。微生物群参与了肠上皮的许多保护、结构和代谢作用，还抑制和阻止入侵病原体的肠道定植。肠道微生物群落时刻处于微妙的平衡状态，是目前公认的维持机体健康的重要因素之一^[12]。课题组在前期研究发现抗生素诱导的肠道菌群失调在短期内有加剧AOM所致结肠炎症损伤和相关信号通路进一步激活的可能^[8]，进一步提示肠道菌群在CRC发生发展过程中具有重要作用。

本实验中，在α多样性上，与Control组相比，Abx组多样性指数明显下降、丰富度指数呈下降趋势，提示初步构建出肠道菌群失调模型。AOM处理使得Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数均呈下降趋势，与Drewes等^[13]发现CRC患者肠道菌群菌落多样性下降及丰度明显改变的结论一致。结合前期研究显示短期抗生素暴露可能会加速AOM诱导CRC，本研究中AbxAOM组Chao1指数、ACE指数较AOM组显著上升可能是因为结肠损伤导致结肠通透性增加从而导致较多有害菌的侵入和定植。

门水平上，小鼠粪便菌群中厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、疣微菌门为优势菌，与陈文杰等^[14]研究结果一致。AOM处理使得小鼠粪便呈现拟杆菌门相对丰度显著升高，厚壁菌门相对丰度显著下降的有害改变，与前人研究结果一致^[15-16]。属水平上，有研究发现与健康人群相比，CRC患者粪便样本拟杆菌增加^[17]。移植CRC患者粪便微生物群的小鼠粪便样本中副拟杆菌属相对丰度显著高于移植健康个体微生物群的小鼠，且与CRC肿瘤发生率呈正相关^[18] 。溃疡性结肠炎癌变小鼠的粪便中拟普雷沃菌属相对丰度显著增加^[19]。另枝菌属作为潜在的病原体可能会诱发CRC^[20]。另有研究发现，小鼠结肠炎中有益的丁酸盐产生菌例如产醋菌属、颤杆菌克属相对丰度显著降低^[21]。同样的，在早期CRC中，布劳特菌显著降低^[22]。梭状芽孢杆菌科的成员，尤其是梭状杆菌XIVa，其相对丰度与CRC肿瘤发生率也呈负相关^[18]。总体上来讲，本研究发现AOM组副拟杆菌属、拟普雷沃菌属等有害菌相对丰度显著上升，产醋菌属、颤杆菌克属等产丁酸盐有益菌相对丰度显著下降。抗生素处理后，拟杆菌、拟普雷沃菌属等相对丰度显著降低，另枝菌属、梭状杆菌XIVa、布劳特菌属等相对丰度显著增加，可能原因之一是短期内是特定微生物组而非单种菌株对CRC的发生发展具有重要作用，尽管关键病原体的丰度相对较低，但它们可以与其他物种结合并且相互作用，重塑微生物群，改变肿瘤微环境从而起到促癌作用^[7]。

综上所述，AOM引起肠道菌群丰富度及多样性呈下降趋势，抗生素处理后肠道菌群改变提示可能是一组特定组成的微生物群对CRC发生发展具有促进作用。但肿瘤形成是长期、慢性、多因素影响的过程，且早期被抗生素处理破坏的肠道菌群会随着抗生素的停用、时间的推移而逐渐向正常菌群的方向恢复。因此，我们认为抗生素所导致的肠道菌群改变及其对CRC发生发展的影响还需设计更长时间的实验予以论证。

基金

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四川省科技厅重点研发项目(2019YFS0260)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第51卷第1期

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接收时间：2023-08-10
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出版时间：2024-01-10

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收稿日期：2023-08-10

基金

四川省科技厅重点研发项目(2019YFS0260)

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^1.四川大学华西医院临床营养科，四川成都 610041

^2.重庆市江津区卫生健康委员会疾病预防控制科

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蒲芳芳，E-mail: pufangfang128@163.com

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科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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