现代预防医学

logk_max	致敏性分类
logk_max≥-2.0	UN GHS 1A类（1A类）
无反应性或logk_max<-2.0	未分类为UN GHS 1A类（非1A类）

logk_max	致敏性分类
logk_max≥-2.0	UN GHS 1A类（1A类）
无反应性或logk_max<-2.0	未分类为UN GHS 1A类（非1A类）

实验次序	暴露时间(min）	肽消耗率（%）	速率常数K L/(s*mol)	Logk
第一次	10	23.67	27.14	47.07	65.77	75.28	0.411 9	-0.39
	30	20.31	26.97	57.93	83.11	92.03	0.281 7	-0.55
	90	47.11	66.80	87.35	94.65	98.66	0.139 6	-0.86
	150	55.80	78.59	91.90	96.55	99.00	0.146 1	-0.91
	210	58.25	84.96	93.13	98.03	99.00	0.216 4	-0.99
	1 440	64.76	82.02	94.26	98.78	99.00	0.042 1	-1.76
第二次	10	3.58	32.52	40.52	52.22	80.91	0.522 4	-0.28
	30	21.32	40.65	51.29	75.42	93.88	0.297 2	-0.53
	90	41.45	64.68	86.88	96.07	99.00	0.226 2	-0.65
	150	44.30	72.44	92.72	98.52	99.00	0.181 7	-0.74
	210	35.13	71.24	94.71	99.00	99.00	0.149 6	-0.83
	1 440	84.17	98.67	99.00	99.00	99.00	0.091 6	-1.04
第三次	10	29.55	39.43	47.69	72.62	82.00	0.494 1	-0.31
	30	28.29	50.07	67.09	86.40	91.23	0.243 2	-0.61
	90	22.71	54.55	81.21	92.94	97.61	0.131 6	-0.88
	150	49.12	75.19	91.66	96.71	98.91	0.134 0	-0.87
	210	54.83	84.57	95.80	99.00	99.00	0.196 0	-0.71
	1 440	68.55	92.15	99.00	99.00	99.00	0.041 9	-1.38

实验次序	暴露时间(min）	肽消耗率（%）	速率常数K L/(s*mol)	Logk
第一次	10	23.67	27.14	47.07	65.77	75.28	0.411 9	-0.39
	30	20.31	26.97	57.93	83.11	92.03	0.281 7	-0.55
	90	47.11	66.80	87.35	94.65	98.66	0.139 6	-0.86
	150	55.80	78.59	91.90	96.55	99.00	0.146 1	-0.91
	210	58.25	84.96	93.13	98.03	99.00	0.216 4	-0.99
	1 440	64.76	82.02	94.26	98.78	99.00	0.042 1	-1.76
第二次	10	3.58	32.52	40.52	52.22	80.91	0.522 4	-0.28
	30	21.32	40.65	51.29	75.42	93.88	0.297 2	-0.53
	90	41.45	64.68	86.88	96.07	99.00	0.226 2	-0.65
	150	44.30	72.44	92.72	98.52	99.00	0.181 7	-0.74
	210	35.13	71.24	94.71	99.00	99.00	0.149 6	-0.83
	1 440	84.17	98.67	99.00	99.00	99.00	0.091 6	-1.04
第三次	10	29.55	39.43	47.69	72.62	82.00	0.494 1	-0.31
	30	28.29	50.07	67.09	86.40	91.23	0.243 2	-0.61
	90	22.71	54.55	81.21	92.94	97.61	0.131 6	-0.88
	150	49.12	75.19	91.66	96.71	98.91	0.134 0	-0.87
	210	54.83	84.57	95.80	99.00	99.00	0.196 0	-0.71
	1 440	68.55	92.15	99.00	99.00	99.00	0.041 9	-1.38

样品名称	CAS No.	性状	logk_max值	kDPRA分类	UN GHS分类
异丁香酚^*	97-54-1	液体	-0.99	-1.15	-1.09	-1.08	0.08	1A	1A
辛酸甲酯^*	111-12-6	液体	-1.64	-1.61	-1.28	-1.51	0.20	1A	1A
异噻唑啉酮^*	2682-20-4	固体	-0.58	-0.52	-0.55	-0.55	0.03	1A	1A
香叶醇	106-24-1	液体	-2.18	-3.33	-3.93	-3.15	0.89	非1A	1B
己基肉桂醛	101-86-0	液体	无反应性	无反应性	无反应性	—	—	非1A	1B
羟基香茅醛	107-75-5	液体	-3.25	无反应性	无反应性	—	—	非1A	1B
丁二酮^*	431-03-8	液体	-2.21	-2.22	-2.14	-2.19	0.04	非1A	1B
对甲氧基苯乙酮^*	100-06-1	固体	无反应性	无反应性	无反应性	—	—	非1A	非致敏物
正丁醇	71-36-3	液体	无反应性	无反应性	无反应性			非1A	非致敏物
羟基苯甲酸丙酯	94-13-3	固体	无反应性	无反应性	无反应性	—	—	非1A	非致敏物

样品名称	CAS No.	性状	logk_max值	kDPRA分类	UN GHS分类
异丁香酚^*	97-54-1	液体	-0.99	-1.15	-1.09	-1.08	0.08	1A	1A
辛酸甲酯^*	111-12-6	液体	-1.64	-1.61	-1.28	-1.51	0.20	1A	1A
异噻唑啉酮^*	2682-20-4	固体	-0.58	-0.52	-0.55	-0.55	0.03	1A	1A
香叶醇	106-24-1	液体	-2.18	-3.33	-3.93	-3.15	0.89	非1A	1B
己基肉桂醛	101-86-0	液体	无反应性	无反应性	无反应性	—	—	非1A	1B
羟基香茅醛	107-75-5	液体	-3.25	无反应性	无反应性	—	—	非1A	1B
丁二酮^*	431-03-8	液体	-2.21	-2.22	-2.14	-2.19	0.04	非1A	1B
对甲氧基苯乙酮^*	100-06-1	固体	无反应性	无反应性	无反应性	—	—	非1A	非致敏物
正丁醇	71-36-3	液体	无反应性	无反应性	无反应性			非1A	非致敏物
羟基苯甲酸丙酯	94-13-3	固体	无反应性	无反应性	无反应性	—	—	非1A	非致敏物

样品名称	CAS No.	性状	logk_max值	kDPRA分类	UN GHS分类
甲醛	50-00-0	液体	-0.70	1A	1A
苄叉丙酮	122-57-6	固体	-1.66	1A	1A
没食子酸丙酯	121-79-9	固体	-1.59	1A	1A
丙烯酸羟乙酯	818-61-1	液体	-0.71	1A	1A
苯醌	106-51-4	固体	0.54	1A	1A
新铃兰醛	31906-04-4	液体	-1.43	1A	1A
1,4-苯二酚	123-31-9	固体	-2.06	非1A	1B
丁香酚	97-53-0	液体	-2.21	非1A	1B
苯乙醛	122-78-1	液体	无反应性	非1A	1B
苯甲醇	100-51-6	液体	无反应性	非1A	1B
柠檬醛	5392-40-5	液体	-3.21	非1A	1B
芳樟醇	78-70-6	液体	无反应性	非1A	1B
金合欢醇	4602-84-0	液体	-3.40	非1A	1B
β-香茅醇	106-22-9	液体	无反应性	非1A	1B
柠檬烯	5989-27-5	液体	无反应性	非1A	1B
对氨基苯甲酸	150-13-0	固体	-2.20	非1A	非致敏物
2,5-二甲基-2,5-己二醇	110-03-2	固体	无反应性	非1A	非致敏物
乳酸	50-21-5	液体	无反应性	非1A	非致敏物
莰烯	79-92-5	固体	无反应性	非1A	非致敏物
2-庚酮	110-43-0	液体	无反应性	非1A	非致敏物

样品名称	CAS No.	性状	logk_max值	kDPRA分类	UN GHS分类
甲醛	50-00-0	液体	-0.70	1A	1A
苄叉丙酮	122-57-6	固体	-1.66	1A	1A
没食子酸丙酯	121-79-9	固体	-1.59	1A	1A
丙烯酸羟乙酯	818-61-1	液体	-0.71	1A	1A
苯醌	106-51-4	固体	0.54	1A	1A
新铃兰醛	31906-04-4	液体	-1.43	1A	1A
1,4-苯二酚	123-31-9	固体	-2.06	非1A	1B
丁香酚	97-53-0	液体	-2.21	非1A	1B
苯乙醛	122-78-1	液体	无反应性	非1A	1B
苯甲醇	100-51-6	液体	无反应性	非1A	1B
柠檬醛	5392-40-5	液体	-3.21	非1A	1B
芳樟醇	78-70-6	液体	无反应性	非1A	1B
金合欢醇	4602-84-0	液体	-3.40	非1A	1B
β-香茅醇	106-22-9	液体	无反应性	非1A	1B
柠檬烯	5989-27-5	液体	无反应性	非1A	1B
对氨基苯甲酸	150-13-0	固体	-2.20	非1A	非致敏物
2,5-二甲基-2,5-己二醇	110-03-2	固体	无反应性	非1A	非致敏物
乳酸	50-21-5	液体	无反应性	非1A	非致敏物
莰烯	79-92-5	固体	无反应性	非1A	非致敏物
2-庚酮	110-43-0	液体	无反应性	非1A	非致敏物

致敏性分类		CLP（ECHA）
kDPRA	1A	10	0	0	10
	非1A	0	13	8	21
	合计	10	13	8	31

致敏性分类		CLP（ECHA）
kDPRA	1A	10	0	0	10
	非1A	0	13	8	21
	合计	10	13	8	31

应用动力学直接多肽反应试验检测化学物皮肤致敏性

PDF下载

何国群 , 赵敏 , 王晶 , 李庆 , 蒋关清 , 黄志彪

现代预防医学 | 实验技术及其应用 2025,52(5): 911-915

收起

现代预防医学 | 实验技术及其应用 2025, 52(5): 911-915

应用动力学直接多肽反应试验检测化学物皮肤致敏性

全屏

何国群, 赵敏, 王晶, 李庆, 蒋关清, 黄志彪

作者信息

广东省疾病预防控制中心卫生毒理所，广东广州 511430

何国群（1970—），女，硕士，主任医师，研究方向：环境毒理工作

Kinetic direct peptide reactivity assay for detecting skin sensitization of chemicals

Guo-qun HE, Min ZHAO, Jing WANG, Qing LI, Guan-qing JIANG, Zhi-biao HUANG

Affiliations

Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention, Institute of Health Toxicology; Guangzhou, Guangdong 511430, China

出版时间: 2025-03-10 doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202411400

文章导航

摘要

收起

目的

评估动力学直接多肽反应试验(kinetic direct peptide reactivity assay, kDPRA)对化学物皮肤致敏性的鉴别能力。

方法

选用已知皮肤致敏强度的31种化学物，将化学物用磷酸盐缓冲液或乙腈配制成1.25、2.5、5.0、10.0和20.0 mmol/L 溶液，分别取40 μl上述溶液与120 μl的0.667 mmol/L半胱氨酸肽混合，同时设空白对照、溶剂对照、测试物对照和阳性对照（肉桂醛），在25℃条件下孵育10、30、90、150、210和1 440 min，作用相应时间后，每孔加入40 μl 3 mmol/L的单溴二胺作用5 min，在酶标仪上以390 nm的激发光和480 nm的发射光测定荧光强度；计算半胱氨酸肽的消耗率和速率常数，取6个时间点中最大对数速率常数(log kmax)作为评价指标，评价各种化学物的皮肤致敏性。

结果

应用2,4-二硝基氯苯的3次测试获得log kmax分别为-0.39、-0.28、-0.31，结果均判定为1A类致敏物；对10种化学物的3次重复测试均能获得一致的致敏性分类；扩展对20种化学物测试的结果，6种化学物判为1A类，14种判为非1A类，所测31种化学物皮肤致敏性分类结果均与欧洲化学品管理局(European Chemicals Agency，ECHA)数据库一致。

结论

该方法对化学物皮肤致敏性具有较好的鉴别能力。

关键词

动力学直接多肽反应试验 / 化学物 / 皮肤致敏性

Abstract

收起

Objective

To evaluate the discriminative ability of the Kinetic Direct Peptide Reactivity Assay (kDPRA) for identifying the skin sensitization potential of chemicals.

Methods

A total of 31 chemicals with known skin sensitization strengths were selected.These chemicals were prepared in phosphate-buffered saline or acetonitrile to create solutions at concentrations of 1.25, 2.5, 5.0,10.0, and 20.0 mmol/L. A mixture of 40 μl of the above solutions with 120 μl of a 0.667 mmol/L cysteine peptide was prepared, alongside blank controls, solvent controls, test substance controls, and a positive control (cinnamaldehyde). The mixtures were incubated at 25°C for 10, 30, 90, 150, 210, and 1 440 minutes. After the respective incubation times, 40 μl of 3 mmol/L monobromination was added for 5 minutes, and fluorescence intensity was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader with excitation at 390 nm and emission at 480 nm. The consumption rate and rate constant of the cysteine peptide were calculated, with the maximum logarithmic rate constant (log kmax) from the six time points serving as the evaluation metric for the skin sensitization potential of various chemicals.

Results

Testing 2,4-dinitrochlorobenzene yielded log kmax values of -0.39,-0.28, and -0.31 across three tests, all classified as Category 1A sensitizers. Consistent sensitization classifications were obtained from three repeated tests on 10 chemicals. Expanding to 20 additional chemicals, 6 were classified as Category 1A and 14 as non-1A. The skin sensitization classifications for all 31 tested chemicals were consistent with the European Chemicals Agency (ECHA) database.

Conclusion

This method demonstrates good discriminative ability for assessing the skin sensitization potential of chemicals.

Key words

Kinetic direct peptide reactivity assay / Chemicals / Skin sensitization

引用本文

何国群, 赵敏, 王晶, 李庆, 蒋关清, 黄志彪. 应用动力学直接多肽反应试验检测化学物皮肤致敏性. 现代预防医学, 2025 , 52 (5) : 911 -915 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202411400

Guo-qun HE, Min ZHAO, Jing WANG, Qing LI, Guan-qing JIANG, Zhi-biao HUANG. Kinetic direct peptide reactivity assay for detecting skin sensitization of chemicals[J]. Modern Preventive Medicine, 2025 , 52 (5) : 911 -915 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202411400

正文

收起

皮肤过敏是日常生活与职业中较常见的健康问题，是皮肤经过反复接触致敏物后引起的皮肤变应性反应。根据联合国全球化学物统一分类和标签制度(United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, UNGHS)的规定，经过准确的评估可将皮肤致敏物分类为1类，其子分类为1A类（相当于强致敏物）和1B类（相对较弱致敏物）^[1]。皮肤致敏性及致敏强度的鉴定是化学物健康风险评估的步骤之一，以往用于鉴定致敏物的证据主要来自于人类资料和动物实验，由于人类能确证的数据不易获得，研究人员以往通常采用动物试验方法检测化学物的皮肤变应性反应^[2-3]，然而动物试验存在周期长、动物伦理等问题，随着“3R”原则［即替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement）］的提出和科学技术的发展，基于人源细胞的体外测试、化学反应性测试、计算机模型分析等多种非动物试验方法被开发用于皮肤致敏性评估^[4-6]，其中动力学直接多肽反应性试验(kinetic Direct Peptide Reactivity Assay, kDPRA)是反映外源化学物与皮肤蛋白质共价结合的皮肤致敏反应机制中的分子启动事件，该方法灵敏而且快速，作为致敏性化学物筛选方法有着很大的优势，目前已通过多个国际间实验室验证，并被欧洲美国等权威机构采纳^[7-9]，且已作为一种新技术方法应用于下一代风险评估策略中^[10]，而kDPRA在国内研究应用的相关资料极少。

本研究主要参照欧洲替代方法验证中心发布的实验方案^[11]，建立kDPRA方法，并转化应用于已知致敏性的化学物检测，评估该方法在本实验室应用的灵敏度、特异度和一致性。旨在接轨国际化学物健康危害评估技术，为我国化学品健康风险评估和监管提供科学技术支持。

1　材料与方法

收起

1.1　检测的化学物

选择31种在欧洲化学品管理局（European Chemicals Agency，ECHA）数据库可查皮肤致敏性及致敏性分类的化学物，其中包括OECD TG 442C推荐的6种参考化学物^[8]，31种化学物含1A、1B类致敏物和非致敏物，主要购于美国Sigma公司和上海麦克林公司；先应用1A类致敏物2,4-二硝基氯苯（CAS No.97-00-7）测试以建立方法，再用10种化学物作3次重复的实验，以确认试验方法在本实验室的可重现性，然后扩展应用到另外的20种化学物。

1.2　主要试剂与仪器

包括半胱氨酸多肽Ac-RFAACAA-COOH（美国GenScript 公司）、单溴二胺（mBrB，CAS No.74235-78-2，麦克林公司）、电子天平（日本A&D 公司）、酶标仪（美国Thermo Fisher公司）、恒温孵育箱（上海一恒公司）。

1.3　对照组设置

包括测试物对照组，用来计算化学物或阳性对照荧光校正值以确定受试物是否引起强自发荧光和荧光淬灭；空白对照组，用作计算溶剂对照荧光校正值；溶剂对照组，水溶性化学物溶剂为磷酸盐缓冲液，非水溶性化学物溶剂为乙腈，溶剂对照荧光校正值用于计算多肽消耗率；阳性对照组，用于检验试验系统是否成立，阳性物为肉桂醛CAS No.104-55-2，购于美国Sigma公司。

1.4　试验步骤

根据化学物溶解性用乙腈或磷酸盐缓冲液配制10.00、5.00、2.50和1.25 mmol/L浓度的化学物和阳性物，同时取6个黑色96孔分析板分别标记用于10、30、90、150和210 min以及24 h暴露时间的测试，每个孔板设置空白对照、溶剂对照、阳性物对照和测试物对照和受试物孔，受试物每浓度设3个复孔；每孔加入相应试剂，其中空白对照每孔加40 μl溶剂和120 μl磷酸盐缓冲液，溶剂对照每孔加40 μl溶剂和120 μl多肽溶液，测试物对照每孔加40 μl相应浓度的待测化学物或阳性物和120 μl磷酸盐缓冲液，化学物/阳性物测试孔每孔加40 μl相应浓度的化学物/阳性物和120 μl多肽溶液，阳性对照每孔加40 μl相应浓度的阳性物和120 μl多肽溶液。加液完成后，在（25±2.5）°C下分别孵育10、30、90、150和210 min以及24 h，当达到相应的暴露时间时，在黑暗中将新鲜制备的3 mmol/L mBrB溶液加到分析板中，40 μl/孔，以200 r/min的转速摇晃5 min，然后用酶标仪以390 nm的激发光和480 nm的发射光测定荧光强度。

1.5　统计学分析

用EXCEL电子表格录入数据并分析，计算空白对照、溶剂对照荧光值的算术平均值，用溶剂对照荧光平均值减去空白对照荧光平均值获得溶剂对照校正值；将各个浓度的化学物或阳性物荧光值，减去各自的测试物对照荧光值，获得化学物校正值；按照公式（1）计算每个暴露时间内各化学物浓度多肽消耗率；绘制每个时间点各浓度化学物对应的未消耗肽浓度的自然对数图，按照公式（2）计算单位浓度（每mol）和单位暴露时间（每秒）肽消耗的反应动力学常数(kt)。取6个时间点中最大速率常数对数logkmax作为致敏性判定指标。

公式（1）

公式（2）

公式（2）中，t为暴露时间的分钟数，K为相应暴露时间所得的反应速率常数。

1.6　结果评价

参照OECD TG442C附录3^[8]，如果在给定时间的最高测试化学物浓度(5mmol/L)下观察到肽消耗率≥13.89%，且与溶剂对照比有统计学差异，则认为该化学物具有肽反应性，再进一步确定反应动力学速率常数，若logk_max≥-2.0，则判定为1A类致敏物；若logk_max<-2.0，则判定为非1A类致敏物。如肽消耗率<13.89%，则该化学物为无反应性，即属于非致敏物。皮肤致敏性分类方法见表1。kDPRA对化学物皮肤致敏性判定能力评价时，化学物皮肤致敏性分类资料来源于ECHA分类标签和包装数据库（Classification Labelling & Packaging，CLP）^[12]。

2　结果

收起

2.1 应用2,4-二硝基氯苯进行kDPRA检测，结果见表2。比较每次试验各暴露时间点速率常数对数值取最大值（即logKmax），得到三次试验的logKmax分别为-0.39、-0.28、-0.31。根据表1判定标准，可判定该物质为1A类致敏物，符合ECHA数据库分类，表明本实验室应用kDPRA方法对该物质致敏性测试是成立的。绘制2,4-二硝基氯苯的肽消耗浓度曲线，可观察到三次试验中5个浓度该物质在6个暴露时间点的肽消耗速率常数线性趋势是相似的，见图1。

2.2　对10 种化学物进行3次重复试验的结果表明，根据kDPRA判定标准，每种化学物3次重复均能获得一致的致敏性分类，其中3种化学物皮肤致敏性被判为1A类，其余7种化学物被判为非1A类，此7种化学物中有4种是1B类致敏物，另3种是非致敏性物质，均属于非1A类。10种化学物皮肤致敏性kDPRA判定结果与ECHA数据库是一致的，试验的结果见表3。

2.3　将kDPRA试验方法扩展应用于20种化学物中，结果表明，有6种化学物被kDPRA判定为1A类，分类结果与ECHA一致；其余14种化学物被kDPRA判定为为非1A类，此14种化学物在ECHA数据库或相关文献中获得的UN GHS分类有9种为1B类致敏物，5种为非致敏物，均属于非1A类，结果见表4。

2.4　评价kDPRA对化学物皮肤致敏性判定能力，共检测31种化学物（包括2,4-二硝基氯苯），化学物致敏性分类以ECHA 的CLP分类结果作为参考，kDPRA可准确的评估10种GHS 1A类化学物，对13种GHS 1B类化学物和8种非致敏物均判为非1A类致敏物，因此，在本实验条件下根据此31种化学物kDPRA检测结果进行皮肤致敏性分类，其灵敏度、特异度和符合率均是100%。见表5。

3　讨论

收起

根据UN GHS定义，化学物致敏性可分为3类，1A指物质在人类中发生率高，和/或在动物中呈高致敏性，可以假定有可能在人类中造成严重过敏；1B指物质在人类中发生率低至中，和/或在动物中呈低至中致敏性，可以假定有可能在人类中造成过敏；未满足1A和1B条件的物质为非致敏性物质。随着对化学物皮肤致敏生物学机制研究的不断深入，人们对化学物皮肤致敏的关键事件达成了普遍共识，认为有四个关键事件连续发生形成了皮肤致敏的不良反应结局，分别包括化学物与皮肤蛋白质共价结合、角质细胞活化、树突状细胞活化、T细胞增殖^[13]。化学物与皮肤蛋白质共价结合作为皮肤致敏的分子启始事件，是皮肤致敏后续发生机制的基础，基于此，研究人员将化学物与合成多肽共价结合来模拟化学物与皮肤蛋白结合，研发出几种化学反应的方法来筛选致敏性化学物，目前成熟的主要有三种，包括直接多肽反应试验（direct peptide reactivity assay，DPRA)、氨基酸衍生物反应试验(amino acid derivative reactivity assay,ADRA)和动力学直接多肽反应试验(kDPRA)^[14]。这三种方法不需要繁琐的细胞培养，不存在动物伦理问题，实验周期短，操作简便快捷而且灵敏，其中DPRA和ADRA已在我国通过验证并纳入化妆品安全性评价方法中^[15]，但kDPRA在国内应用的资料很少。

kDPRA是DPRA的改良方法，DPRA使用半胱氨酸和赖氨酸两种合成肽，通过一个暴露时间和一种浓度的测试结果判定致敏性，而kDPRA只使用半胱氨酸合成肽，通过6个暴露时间和5种浓度测试获得动力学结果，得到更丰富的致敏性反应信息，能区分化学物UN GHS分类对应的皮肤致敏性子类别1A类（相当于强致敏物）和非1A类化学物（含1B类致敏物和非致敏物），而DPRA和ADRA均只能区分致敏性和非致敏性化学物，不能区分致敏性化学物的子类别。不过，任何测试方法都有一定的局限性，kDPRA也不例外，金属、无机化合物和具有荧光淬灭或高自发荧光的物质均不适宜采用kDPRA检测其皮肤致敏性^[16]，且kDPRA尚不能将非1A类中的1B类物质和非致敏物进行区分。尽管如此，对于适用该方法的化学物，由于kDPRA产生的化学反应动力学速率与致敏效力有很强的相关性，能有效提高化学物致敏性类别的鉴别能力，多种方法的组合使用可克服kDPRA单独使用的局限性，已有研究人员将kDPRA的结果与细胞体外试验结果以及计算机毒理信息结合，应用于皮肤致敏限定性方法或综合评价方法中，通过一套数据整合程序，将新技术方法的数据信息有效地应用于下一代风险评估中^[17-19]，既提高了鉴定结果的准确性，又避免了动物试验，并加快了致敏性物质的筛选效率。

本研究应用已知致敏物2,4-二硝基氯苯建立kDPRA方法，然后用10种化学物作3次重复的实验，再将方法扩展应用到另外的20种化学物，最后将实验结果与欧洲化学品管理局数据库或相关文献化学物致敏性结果相比较，评价kDPRA方法对化学物的皮肤致敏性鉴定能力，获得的灵敏度、特异度和一致性结果均是100%，实现了该方法在本实验室的应用转化。kDPRA作为一种新技术方法（NAMs），在化学物适用范围内，可有效应用于化学污染物、工业原料、药物等化学物的皮肤致敏性筛选。

基金

收起

国家药品监督管理局化妆品风险评估重点实验室开放课题(KF2021013)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

United Nations. Globally harmonized system of classification and labelling of chemicals (GHS)[EB/OL]. [2025-01-26]. https://unece.org/sites/default/files/2021-09/GHS_Rev9E_0.pdf.

[2]

OECD. Guidelines for the testing of chemicals, section 4:health effects.Test No. 406: Skin Sensitisation[EB/OL]. [2025-01-26]. https://www.oecd.org/en/publications/test-no-406-skin-sensitisation_9789264070660-en.html.

[3]

OECD. Guidelines for the testing of chemicals, section 4:health effects. Test No.429: Skin sensitisation: Local lymph node assay[EB/OL]. [2025-01-26]. https://www.oecd.org/en/publications/test-no-429-skin-sensitisation_9789264071100-en.html.

[4]

Strickland

, Truax

, Corvaro

, et al. Application of defined approaches for skin sensitization to agrochemical products[J]. Front Toxicol, 2022, 4: 852856.

[5]

Gilmour

, Reynolds

, Przybylak

, et al. Next Generation risk assessment for skin allergy: Decision making using new approach methodologies[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2022,131: 105159.

[6]

Silva

, Tamburic

. A State-of-the-Art review on the alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics[J]. Cosmetics, 2022, 9(5): 90.

[7]

Wareing

, Kolle

, Birk

, et al. The kinetic direct peptide reactivity assay (kDPRA): Intra- and inter-laboratory reproducibility in a seven-laboratory ring trial[J]. Altex, 2020, 37(4): 639-651.

[8]

OECD. Guidelines for the testing of chemicals, section 4:health effects. Test No.442C.In chemico skin sensitization: assays addressing the adverse outcome pathway key event on covalent binding to proteins[EB/OL]. [2025-01-26]. https://www.oecd.org/en/publications/test-no-442c-in-chemico-skin-sensitisation_9789264229709-en.html.

[9]

National Institutes of Health. Alternative methods accepted by US agencies[EB/OL]. [2025-01-30]. https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods.

[10]

Lee

, Na

, Lavelle

, et al. Predicting points of departure and potency categories for fragrance ingredients by integrating OECD in vitro models[J]. Food and Chemical Toxicology, 2024, 193: 114998.

[11]

EURL ECVAM. DB-ALM protocol n°217: Kinetic Direct Peptide Reactivity Assay(kDPRA)[EB/OL]. [2025-01-26]. http://cidportal.jrc.ec.europa.eu/ftp/jrc-opendata/EURL-ECVAM/datasets/DBALM/LATEST/online/DBALM_docs/217_P_kDPRA_final_27Oct20.pdf.

[12]

European Chemicals Agency. Search for chemicals/regulated substances[EB/OL]. [2025-01-30]. https://echa.europa.eu/.

[13]

彭双清.21世纪毒性测试策略[M].北京：军事医学出版社，2016.

Peng

. Toxicity testing strategy in the 21st century toxicity testing strategy in the 21st century[M]. Beijing: Military Medical Press, 2016.(In Chinese)

[14]

Alépée

, Tourneix

, Singh

, et al. Off to a good start? Review of the predictivity of reactivity methods modelling the molecular initiating event of skin sensitization[J]. Altex, 2023, 40(4): 606-618.

[15]

国家药品监督管理局.国家药监局关于将油包水类化妆品的pH值测定方法等21项制修订项目纳入化妆品安全技术规范（2015年版）的通告（2023年第41号）[EB/OL].[2025-01-30]. https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/hzhpggtg/jmhzhptg/20230828170520159.html.

National Medical Products Administration. Notice of national medical products administration on the inclusion of 21 revision items such as the determination method of pH value of water-in-oil cosmetics into the Cosmetic Safety Technical Specification (2015 edition) (No. 41 of 2023)[EB/OL]. [2025-01-30]. https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/hzhpggtg/jmhzhptg/20230828170520159.html. (In Chinese)

[16]

Roberts

. A critical review of the kinetic direct peptide reactivity assay (kDPRA) for skin sensitizer potency assessment -taking it forward[J]. Critical Reviews in Toxicology, 2021, 51(10):805-819.

[17]

Natsch

, Gerberick

. Integrated skin sensitization assessment based on OECD methods (I): Deriving a point of departure for risk assessment[J]. Altex, 2022, 39(4): 636-646.

[18]

Mohoric

, Wilm

, Onken

, et al. Increasing accessibility of bayesian Network-Based defined approaches for skin sensitisation potency assessment[J]. Toxics, 2024, 12(9): 666.

[19]

Natsch

, Gerberick

. Integrated skin sensitization assessment based on OECD methods(II):Hazard and potency by combining kinetic peptide reactivity and the"2 out of 3"Defined Approach[J]. Altex, 2022, 39(4): 647-655.

2025年第52卷第5期

PDF下载

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202411400

接收时间：2024-11-25
首发时间：2026-03-18
出版时间：2025-03-10

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2024-11-25

基金

国家药品监督管理局化妆品风险评估重点实验室开放课题(KF2021013)

作者信息

广东省疾病预防控制中心卫生毒理所，广东广州 511430

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/xdyfyx/CN/10.20043/j.cnki.MPM.202411400

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT

logk_max	致敏性分类
logk_max≥-2.0	UN GHS 1A类（1A类）
无反应性或logk_max<-2.0	未分类为UN GHS 1A类（非1A类）

logk_max

致敏性分类

logk_max≥-2.0

UN GHS 1A类（1A类）

无反应性或logk_max<-2.0

未分类为UN GHS 1A类（非1A类）

实验次序	暴露时间(min）	肽消耗率（%）	速率常数K L/(s*mol)	Logk
第一次	10	23.67	27.14	47.07	65.77	75.28	0.411 9	-0.39
	30	20.31	26.97	57.93	83.11	92.03	0.281 7	-0.55
	90	47.11	66.80	87.35	94.65	98.66	0.139 6	-0.86
	150	55.80	78.59	91.90	96.55	99.00	0.146 1	-0.91
	210	58.25	84.96	93.13	98.03	99.00	0.216 4	-0.99
	1 440	64.76	82.02	94.26	98.78	99.00	0.042 1	-1.76
第二次	10	3.58	32.52	40.52	52.22	80.91	0.522 4	-0.28
	30	21.32	40.65	51.29	75.42	93.88	0.297 2	-0.53
	90	41.45	64.68	86.88	96.07	99.00	0.226 2	-0.65
	150	44.30	72.44	92.72	98.52	99.00	0.181 7	-0.74
	210	35.13	71.24	94.71	99.00	99.00	0.149 6	-0.83
	1 440	84.17	98.67	99.00	99.00	99.00	0.091 6	-1.04
第三次	10	29.55	39.43	47.69	72.62	82.00	0.494 1	-0.31
	30	28.29	50.07	67.09	86.40	91.23	0.243 2	-0.61
	90	22.71	54.55	81.21	92.94	97.61	0.131 6	-0.88
	150	49.12	75.19	91.66	96.71	98.91	0.134 0	-0.87
	210	54.83	84.57	95.80	99.00	99.00	0.196 0	-0.71
	1 440	68.55	92.15	99.00	99.00	99.00	0.041 9	-1.38

实验
次序

暴露时间(min）

肽消耗率（%）

速率常数K
L/(s*mol)

Logk

0.312 5 mmol/L

0.625 mmol/L

1.25 mmol/L

2.5 mmol/L

5.0 mmol/L

第一次

23.67

27.14

47.07

65.77

75.28

0.411 9

-0.39

20.31

26.97

57.93

83.11

92.03

0.281 7

-0.55

47.11

66.80

87.35

94.65

98.66

0.139 6

-0.86

150

55.80

78.59

91.90

96.55

99.00

0.146 1

-0.91

210

58.25

84.96

93.13

98.03

99.00

0.216 4

-0.99

1 440

64.76

82.02

94.26

98.78

99.00

0.042 1

-1.76

第二次

3.58

32.52

40.52

52.22

80.91

0.522 4

-0.28

21.32

40.65

51.29

75.42

93.88

0.297 2

-0.53

41.45

64.68

86.88

96.07

99.00

0.226 2

-0.65

150

44.30

72.44

92.72

98.52

99.00

0.181 7

-0.74

210

35.13

71.24

94.71

99.00

0.149 6

-0.83

1 440

84.17

98.67

99.00

0.091 6

-1.04

第三次

29.55

39.43

47.69

72.62

82.00

0.494 1

-0.31

28.29

50.07

67.09

86.40

91.23

0.243 2

-0.61

22.71

54.55

81.21

92.94

97.61

0.131 6

-0.88

150

49.12

75.19

91.66

96.71

98.91

0.134 0

-0.87

210

54.83

84.57

95.80

99.00

0.196 0

-0.71

1 440

68.55

92.15

99.00

0.041 9

-1.38

样品名称	CAS No.	性状	logk_max值	kDPRA分类	UN GHS分类
异丁香酚^*	97-54-1	液体	-0.99	-1.15	-1.09	-1.08	0.08	1A	1A
辛酸甲酯^*	111-12-6	液体	-1.64	-1.61	-1.28	-1.51	0.20	1A	1A
异噻唑啉酮^*	2682-20-4	固体	-0.58	-0.52	-0.55	-0.55	0.03	1A	1A
香叶醇	106-24-1	液体	-2.18	-3.33	-3.93	-3.15	0.89	非1A	1B
己基肉桂醛	101-86-0	液体	无反应性	无反应性	无反应性	—	—	非1A	1B
羟基香茅醛	107-75-5	液体	-3.25	无反应性	无反应性	—	—	非1A	1B
丁二酮^*	431-03-8	液体	-2.21	-2.22	-2.14	-2.19	0.04	非1A	1B
对甲氧基苯乙酮^*	100-06-1	固体	无反应性	无反应性	无反应性	—	—	非1A	非致敏物
正丁醇	71-36-3	液体	无反应性	无反应性	无反应性			非1A	非致敏物
羟基苯甲酸丙酯	94-13-3	固体	无反应性	无反应性	无反应性	—	—	非1A	非致敏物

样品名称

CAS No.

性状

logk_max值

kDPRA分类

UN GHS分类

第1次

第2次

第3次

均值

标准差

异丁香酚^*

97-54-1

液体

-0.99

-1.15

-1.09

-1.08

0.08

辛酸甲酯^*

111-12-6

液体

-1.64

-1.61

-1.28

-1.51

0.20

异噻唑啉酮^*

2682-20-4

固体

-0.58

-0.52

-0.55

0.03

香叶醇

106-24-1

液体

-2.18

-3.33

-3.93

-3.15

0.89

非1A

己基肉桂醛

101-86-0

液体

无反应性

—

非1A

羟基香茅醛

107-75-5

液体

-3.25

无反应性

—

非1A

丁二酮^*

431-03-8

液体

-2.21

-2.22

-2.14

-2.19

0.04

非1A

对甲氧基苯乙酮^*

100-06-1

固体

无反应性

—

非1A

非致敏物

正丁醇

71-36-3

液体

无反应性

非1A

非致敏物

羟基苯甲酸丙酯

94-13-3

固体

无反应性

—

非1A

非致敏物

样品名称	CAS No.	性状	logk_max值	kDPRA分类	UN GHS分类
甲醛	50-00-0	液体	-0.70	1A	1A
苄叉丙酮	122-57-6	固体	-1.66	1A	1A
没食子酸丙酯	121-79-9	固体	-1.59	1A	1A
丙烯酸羟乙酯	818-61-1	液体	-0.71	1A	1A
苯醌	106-51-4	固体	0.54	1A	1A
新铃兰醛	31906-04-4	液体	-1.43	1A	1A
1,4-苯二酚	123-31-9	固体	-2.06	非1A	1B
丁香酚	97-53-0	液体	-2.21	非1A	1B
苯乙醛	122-78-1	液体	无反应性	非1A	1B
苯甲醇	100-51-6	液体	无反应性	非1A	1B
柠檬醛	5392-40-5	液体	-3.21	非1A	1B
芳樟醇	78-70-6	液体	无反应性	非1A	1B
金合欢醇	4602-84-0	液体	-3.40	非1A	1B
β-香茅醇	106-22-9	液体	无反应性	非1A	1B
柠檬烯	5989-27-5	液体	无反应性	非1A	1B
对氨基苯甲酸	150-13-0	固体	-2.20	非1A	非致敏物
2,5-二甲基-2,5-己二醇	110-03-2	固体	无反应性	非1A	非致敏物
乳酸	50-21-5	液体	无反应性	非1A	非致敏物
莰烯	79-92-5	固体	无反应性	非1A	非致敏物
2-庚酮	110-43-0	液体	无反应性	非1A	非致敏物

样品名称

CAS No.

性状

logk_max值

kDPRA分类

UN GHS分类

甲醛

50-00-0

液体

-0.70

苄叉丙酮

122-57-6

固体

-1.66

没食子酸丙酯

121-79-9

固体

-1.59

丙烯酸羟乙酯

818-61-1

液体

-0.71

苯醌

106-51-4

固体

0.54

新铃兰醛

31906-04-4

液体

-1.43

1,4-苯二酚

123-31-9

固体

-2.06

非1A

丁香酚

97-53-0

液体

-2.21

非1A

苯乙醛

122-78-1

液体

无反应性

非1A

苯甲醇

100-51-6

液体

无反应性

非1A

柠檬醛

5392-40-5

液体

-3.21

非1A

芳樟醇

78-70-6

液体

无反应性

非1A

金合欢醇

4602-84-0

液体

-3.40

非1A

β-香茅醇

106-22-9

液体

无反应性

非1A

柠檬烯

5989-27-5

液体

无反应性

非1A

对氨基苯甲酸

150-13-0

固体

-2.20

非1A

非致敏物

2,5-二甲基-2,5-己二醇

110-03-2

固体

无反应性

非1A

非致敏物

乳酸

50-21-5

液体

无反应性

非1A

非致敏物

莰烯

79-92-5

固体

无反应性

非1A

非致敏物

2-庚酮

110-43-0

液体

无反应性

非1A

非致敏物

致敏性分类		CLP（ECHA）
kDPRA	1A	10	0	0	10
	非1A	0	13	8	21
	合计	10	13	8	31

致敏性分类

CLP（ECHA）

非致敏物

合计

kDPRA

非1A

合计