现代预防医学

抗体名称	厂家	备注
Anti-Tau（TAU-5）	Abcam	总tau蛋白
Phospho-Tau（Thr231）	Affinity	p-tau蛋白
Anti-Tau（phosphoS202+ T205）	Abcam	p-tau蛋白
METTL3	Abcam	m⁶A甲基化酶
METTL14	Abclonal	m⁶A甲基化酶
WTAP	Abclonal	m⁶A甲基化酶
FTO	成都正能生物	m⁶A去甲基化酶
ALKBH5	成都正能生物	m⁶A去甲基化酶
GAPDH	华安生物	内参蛋白
Goatanti-RabbitIgG Goat Polyclonal Antibody	华安生物	二抗，抗兔

抗体名称	厂家	备注
Anti-Tau（TAU-5）	Abcam	总tau蛋白
Phospho-Tau（Thr231）	Affinity	p-tau蛋白
Anti-Tau（phosphoS202+ T205）	Abcam	p-tau蛋白
METTL3	Abcam	m⁶A甲基化酶
METTL14	Abclonal	m⁶A甲基化酶
WTAP	Abclonal	m⁶A甲基化酶
FTO	成都正能生物	m⁶A去甲基化酶
ALKBH5	成都正能生物	m⁶A去甲基化酶
GAPDH	华安生物	内参蛋白
Goatanti-RabbitIgG Goat Polyclonal Antibody	华安生物	二抗，抗兔

基因名称	引物序列（5’-3’）
METTL3	F:AGATGGGGTAGAAAGCCTCCT R: TGGTCAGCATAGGTTACAAGAGT
METTL14	F:GAGTGTGTTTACGAAAATGGGGT R: CCGTCTGTGCTACGCTTCA
WTAP	F:TTGTAATGCGACTAGCAACCAA R: GCTGGGTCTACCATTGTTGATCT
ALKBH5	F:CATCTAATCTTGTCTTCCTGAG R: TCCAGTTCAAGCCTATTCG
FTO	F:CTTCACCAAGGAGACTGCTATTTC R: CAAGGTTCCTGTTGAGCACTCTG
GAPDH	F:TCTATAAATTGAGCCCGCAGC R: CCAATACGACCAAATCCGTTG

基因名称	引物序列（5’-3’）
METTL3	F:AGATGGGGTAGAAAGCCTCCT R: TGGTCAGCATAGGTTACAAGAGT
METTL14	F:GAGTGTGTTTACGAAAATGGGGT R: CCGTCTGTGCTACGCTTCA
WTAP	F:TTGTAATGCGACTAGCAACCAA R: GCTGGGTCTACCATTGTTGATCT
ALKBH5	F:CATCTAATCTTGTCTTCCTGAG R: TCCAGTTCAAGCCTATTCG
FTO	F:CTTCACCAAGGAGACTGCTATTTC R: CAAGGTTCCTGTTGAGCACTCTG
GAPDH	F:TCTATAAATTGAGCCCGCAGC R: CCAATACGACCAAATCCGTTG

N⁶甲基腺苷在砷诱导tau蛋白磷酸化中的作用研究

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龙科言 , 熊文晓 , 郑群荟 , 张乾 , 张遵真 , 赵田禾

现代预防医学 | 实验技术及其应用 2025,52(3): 533-540

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现代预防医学 | 实验技术及其应用 2025, 52(3): 533-540

N⁶甲基腺苷在砷诱导tau蛋白磷酸化中的作用研究

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龙科言, 熊文晓, 郑群荟, 张乾, 张遵真, 赵田禾

作者信息

四川大学华西公共卫生学院/华西第四医院，四川成都 610041

龙科言（1999—），男，硕士在读，研究方向：环境与健康

通讯作者:

赵田禾，E-mail: zhaotianhe8@163.com

Study on the role of N⁶-methyl adenosine in arsenic induced tau protein phosphorylation

Ke-yan LONG, Wen-xiao XIONG, Qun-hui ZHENG, Qian ZHANG, Zun-zhen ZHANG, Tian-he ZHAO

Affiliations

West China School of Public Health/West China Fourth Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan 610041, China

出版时间: 2025-02-10 doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202406423

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摘要

收起

目的

探究N⁶甲基腺苷（N⁶-methyladenosine, m⁶A）是否参与砷诱导的tau蛋白磷酸化。

方法

采用0、1、5和10 μmol/L亚砷酸钠处理神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞24 h后，检测细胞内m⁶A水平，qPCR检测细胞内m⁶A相关酶mRNA的表达量，Western Blot检测细胞内总tau蛋白表达量、磷酸化tau蛋白水平和m⁶A相关酶的表达量。利用3-脱氮腺苷抑制细胞内m⁶A水平后，验证细胞内m⁶A水平和tau蛋白磷酸化水平的变化。采用SPSS对实验结果进行方差分析，检验水准α=0.05。

结果

各浓度砷处理SH-SY5Y细胞24 h后，细胞内总tau蛋白水平差异不显著（F=3.047, P>0.05）。5 μmol/L砷处理细胞24 h后，细胞内m⁶A水平上升31.4%（F=4.511, P<0.05），磷酸化tau蛋白（T231位点）水平上升42.6%（95%CI: 0.165～0.689, P<0.01）。磷酸化tau蛋白（S202+T205位点）水平随砷浓度的提高而上升，最高在10 μmol/L浓度砷处理24 h后上升55.2%（95%CI: 0.050～0.409, P<0.05）。随着砷处理浓度增加，细胞内METTL3 mRNA表达增加，10 μmol/L浓度下最高增加73.2%（95%CI: 0.201～1.423, P<0.05）。METTL14、WTAP和FTO mRNA表达量下降，在10 μmol/L砷处理后分别降至对照组的65.4%（95%CI: -1.055～-0.337, P<0.01）、64.8%（95%CI: -0.389～-0.111, P<0.05）和85.4%（95%CI: -0.030～-0.010, P<0.01）。ALKBH5 mRNA表达先升高后降低，在1 μmol/L砷处理24 h后表达量增加27.5%（95%CI: 0.033～0.147, P<0.05）；而10 μmol/L浓度砷处理后降低30.7%（95%CI: -1.62～-0.038, P<0.01）。砷处理导致METTL3蛋白表达增高，最高在5 μmol/L浓度砷处理24 h后增加107.1%（95%CI: 0.331～1.009, P<0.01），而METTL14、WTAP和ALKBH5蛋白表达量在10 μmol/L砷处理SH-SY5Y细胞24 h后分别下降至对照组的20.4%（95%CI:-0.788～-0.509, P<0.001）、23.5%（95%CI: -1.371～-0.685, P<0.001）和49.2%（95%CI: -0.423～-0.183, P<0.001）。FTO蛋白表达量随砷浓度的提高呈下降趋势，最低在10 μmol/L砷处理24 h后降低45.3%（95%CI: -0.709～-0.413, P<0.001）。DAA抑制细胞内m⁶A水平后，磷酸化tau蛋白水平均显著降低（P<0.05）。

结论

砷可以通过增加m⁶A甲基化酶METTL3的表达量、降低m⁶A去甲基化酶FTO和ALKBH5的表达量，提高SH-SY5Y细胞内的m⁶A水平，进而诱导细胞内tau蛋白发生磷酸化。

关键词

砷 / N⁶甲基腺苷 / 磷酸化tau蛋白 / SH-SY5Y细胞

Abstract

收起

Objective

To explore whether N⁶-methyl adenosine (m⁶A) is involved in arsenic-induced tau protein phosphorylation.

Methods

Neuroblastoma (SH-SY5Y) cells were treated with 0, 1, 5, 10 μmol/L sodium arsenate for 24 hours. Then, the intracellular m⁶A level was detected, the mRNA expression levels of m⁶A-related enzymes in the cells were detected by qPCR,and the total tau protein expression level, phosphorylated tau protein level and m⁶A-related enzyme expression levels in the cells were detected by Western Blot. After inhibiting the intracellular m⁶A level with 3-deoxyadenosines, the changes in the intracellular m⁶A level and tau protein phosphorylation level were verified. SPSS was used for analysis of variance of the experimental results, with α=0.05.

Results

After SH-SY5Y cells were treated with various concentrations of arsenic for 24 hours, there was no significant difference in the total tau protein level in the cells (F=3.047, P > 0.05). After the cells were treated with 5 μmol/L arsenic for 24 hours, the intracellular m⁶A level increased by 31.4% (F=4.511, P < 0.05), and the phosphorylated tau protein (at site T231) level increased by 42.6% (95%CI: 0.165-0.689, P < 0.01). The level of phosphorylated tau protein (at sites S202 + T205) increased with the increase in arsenic concentration, and the highest increase was 55.2%(95%CI: 0.050-0.409, P < 0.05) after treatment with 10 μmol/L arsenic for 24 hours. As the arsenic treatment concentration increased, the METTL3 mRNA expression in the cells increased, with the highest increase of 73.2% (95%CI: 0.201-1.423, P < 0.05) at a concentration of 10 μmol/L. The mRNA expression levels of METTL14, WTAP and FTO decreased, and they decreased to 65.4% (95%CI:-1.055 to-0.337, P < 0.01), 64.8% (95%CI:-0.389 to -0.111, P < 0.05) and 85.4% (95%CI: -0.030 to -0.010, P < 0.01) of the control group respectively after treatment with 10 μmol/L arsenic. The ALKBH5 mRNA expression first increased and then decreased, with an increase of 27.5% (95%CI: 0.033-0.147, P < 0.05) after treatment with 1 μmol/L arsenic for 24 hours; while it decreased by 30.7% (95%CI:-1.62 to -0.038, P < 0.01) after treatment with 10 μmol/L arsenic. Arsenic treatment led to an increase in METTL3 protein expression, with the highest increase of 107.1% (95%CI: 0.331-1.009, P < 0.01) after treatment with 5 μmol/L arsenic for 24 hours, while the protein expression levels of METTL14, WTAP and ALKBH5 decreased to 20.4% (95%CI: -0.788 to -0.509, P < 0.001), 23.5% (95%CI:-1.371 to -0.685, P <0.001) and 49.2% (95%CI:-0.423 to -0.183, P < 0.001) of the control group respectively after treatment of SH-SY5Y cells with 10 μmol/L arsenic for 24 hours. The FTO protein expression level showed a decreasing trend with the increase in arsenic concentration, with the lowest decrease of 45.3% (95%CI:-0.709 to -0.413, P < 0.001) after treatment with 10 μmol/L arsenic for 24 hours. After DAA inhibited the intracellular m⁶A level, the phosphorylated tau protein levels were significantly decreased (P < 0.05).

Conclusion

Arsenic can increase the m⁶A level in SH-SY5Y cells by increasing the expression level of the m⁶A methylase METTL3 and decreasing the expression levels of the m⁶A demethylases FTO and ALKBH5, thereby inducing the phosphorylation of tau protein in the cells.

Key words

Arsenic / N⁶-methyl adenosine / Phosphorylated tau protein / SH-SY5Y cells

引用本文

龙科言, 熊文晓, 郑群荟, 张乾, 张遵真, 赵田禾. N⁶甲基腺苷在砷诱导tau蛋白磷酸化中的作用研究. 现代预防医学, 2025 , 52 (3) : 533 -540 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202406423

Ke-yan LONG, Wen-xiao XIONG, Qun-hui ZHENG, Qian ZHANG, Zun-zhen ZHANG, Tian-he ZHAO. Study on the role of N⁶-methyl adenosine in arsenic induced tau protein phosphorylation[J]. Modern Preventive Medicine, 2025 , 52 (3) : 533 -540 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202406423

正文

收起

砷不仅是人类致癌物，同时也是明确的神经毒物，能通过血脑屏障富集于特定脑区^[1]，是以阿尔茨海默症（Alzheimer disease, AD）为代表的多种神经系统退行性疾病的危险因素^[2]。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要在神经组织中表达，生理状态下tau蛋白促进微管的组装，并维持微管结构的稳定^[3]。已有研究显示砷暴露可诱导tau蛋白磷酸化^[4]，磷酸化的tau蛋白将失去正常的生理功能，并从微管剥离^[5]，最终经过折叠、剪切等变化演变成tau蛋白聚集^[6]。磷酸化tau（phosphorylated tau, p-tau）蛋白聚集是AD的主要病理特征之一，临床上已将部分p-tau蛋白认定为AD的生物标志物^[7]。砷诱导tau蛋白磷酸化的机制研究不多，特别是RNA表观遗传学中的N⁶甲基腺苷（N⁶-methyladenosine, m⁶A）在砷诱导tau蛋白磷酸化中的作用知之甚少。大量研究显示m⁶A是细胞感知外界环境变化的关键因子，与砷诱发的神经系统损伤密切相关^[8-9]。更重要的是，细胞内m⁶A不仅可以激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（BPI3K/AKT）通路^[10]，也可以介导糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的磷酸化^[11]，提示m⁶A具有调控蛋白磷酸化的作用。然而，m⁶A是否可以引起tau蛋白发生磷酸化目前尚未见报道，因此本研究从表观遗传学角度探讨砷是否可以通过m⁶A诱导tau蛋白发生磷酸化，为砷的神经毒性研究提供新线索。

1　材料与方法

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1.1　细胞与受试物

采用人源性神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞（武汉赛维尔生物）作为研究对象。亚砷酸钠（sodium arsenite, NaAsO₂,购自Fluka,纯度>99.0%）是典型的砷化物，白色粉末易溶于水，广泛应用于砷毒性机制研究。

1.2　Cell Counting Kit-8（CCK8）法检测SH-SY5Y细细胞存活探究

采用CCK8法探究不同浓度、不同时间的亚砷酸钠对SH-SY5Y细胞增殖的影响。将SH-SY5Y细胞按1×105个/孔的浓度接种至96孔板中，采用1～30 μmol/L（实验组浓度梯度设置为1、5、10、20和30 μmol/L，设置对照组和空白组）亚砷酸钠分别处理24、48、72和96 h，加入CCK8试剂（TargetMol公司）于37℃孵育1 h后，用酶标仪（Thermo Fisher,Multiskan GO 1510）检测450 nm吸光值，设置对照组吸光度为100%，按公式计算细胞存活率。细胞存活率（%）

1.3　蛋白免疫印迹（Western Blot, WB）检测细胞内蛋白表达量

根据1.2实验的结果，设置WB分组为对照组和砷处理组（分为1、5、10 μmol/L亚砷酸钠），处理时间为24 h。采用RIPA裂解液（TargetMol公司）提取细胞总蛋白，用BCA法（南京诺唯赞生物）测定蛋白浓度。WB方案参照本课题组以前的研究^[12]，电泳、转膜、封闭后孵育一抗和二抗，最后滴加ECL显色液成像拍照。

T231（苏氨酸）位点是tau蛋白最先发生磷酸化的位点^[7]，S202+T205（丝氨酸202+苏氨酸205）位点磷酸化伴随tau蛋白的构象变化，可以反映细胞中神经原纤维缠结（一种由高磷酸化tau蛋白组成的聚集体）的水平^[6]，因此本研究选择T231和S202+T205位点作为tau蛋白磷酸化的观察指标。METTL3、METTL14和WTAP（m⁶A甲基化酶）以及FTO和ALKBH5（m⁶A去甲基化酶）是目前研究较为深入，功能明确的m⁶A相关酶^[8]。本研究所使用的WB抗体见表1。

1.4　实时荧光定量PCR（qPCR）检测m⁶A相关酶的基因表达水平

实验分组与1.3一致，细胞处理24 h后，提取总RNA（Vazyme Biotech），逆转录为cDNA以备用。qPCR方案参照本课题组以前的研究^[12]，设置GAPDH基因为内参。依据阈值循环数（Ct值）计算2^(-ΔΔCt)以进行数据处理和统计分析。本研究所选用的qPCR引物见表2。

1.5　检测细胞内m⁶A总水平

采用斑点印迹（Dot Blot）和EpiQuik m⁶A RNA Methylation Quantification试剂盒（简称EpiQuik法）两种方法测定细胞内m⁶A水平。实验分组与1.3一致。斑点印迹是将RNA样品于95℃加热3 min后接种至尼龙膜，于紫外灯下照射1 h；用5%脱脂牛奶封闭1 h后孵育一抗（Anti-m⁶A Antibody,华安生物，稀释比1∶2 000）过夜，次日于室温孵育二抗（Goat anti-Rabbit IgG Goat Polyclonal Antibody,华安生物，稀释比1∶50 000）1 h，滴加ECL显色液成像拍照。成像后洗脱ECL显色液，将膜置于亚甲蓝染色液中染色30 min，随后洗去多余染色液并拍照。EpiQuik法参照本课题组以前的研究^[12]，根据吸光度测算m⁶A水平。

1.6　3-脱氮腺苷（3-Deazaadenosine, DAA）抑制细胞的整体m⁶A水平

采用DAA（APExBIO公司，终浓度为3.9 μmol/L）预处理细胞24 h后，加入亚砷酸钠（终浓度为5 μmol/L）处理24 h；随后提取细胞总RNA检测m⁶A抑制效果，见1.5实验，提取总蛋白检测p-tau蛋白水平，见1.3实验。

1.7　统计分析

所有实验重复至少3次，实验数据以（

）来表示。采用SPSS 26进行统计分析。对于3组及3组以上的数据间比较使用单因素方差分析（one-way analysis of variance, ANOVA），检验水准α=0.05；当方差分析表明差异显著时，采用Student-Newman-Keuls或Dunnett t检验进行多组内各处理组与对照组的比较。使用SigmaPlot 12.5制作图表，误差棒值表示一个标准差大小。检验水准α=0.05。

2　结果

收起

2.1　砷抑制SH-SY5Y细胞增殖

CCK8实验表明，亚砷酸钠在各浓度下均可以抑制SH-SY5Y细胞的增殖。10 μmol/L砷处理24 h后，细胞存活率为88.4%；5 μmol/L砷处理48 h后，细胞存活率为79.4%；而1 μmol/L砷处理72 h后，细胞存活率降低至71.2%。因此，为确保细胞存活率高于80%，保证后续实验的可行性，本研究设置亚砷酸钠的浓度梯度为1、5和10 μmol/L，处理时间为24 h。见图1。

2.2　砷导致细胞内tau蛋白磷酸化增加

与对照组相比，1、5和10 μmol/L砷处理SH-SY5Y细胞24 h后，细胞内总tau蛋白表达量的差异不具有统计学差异（F=3.047, P>0.05），见图2A。然而，砷处理可以显著增加细胞内tau蛋白T231位点（图2B）磷酸化，在5 μmol/L砷处理24 h后最高上升42.6%（95%CI: 0.165～0.689, P<0.01）。此外，S202+T205位点的磷酸化水平（图2C）伴随砷浓度的提高而上升，在10 μmol/L浓度砷处理24 h后最高上升55.2%（95%CI: 0.050～0.409, P<0.05）。这些结果表明，砷可以显著诱导SH-SY5Y细胞内p-tau蛋白增加。

2.3　砷诱导细胞内m⁶A水平增加

从斑点印迹结果可以直观看出，砷处理组SH-SY5Y细胞内的m⁶A水平高于对照组，见图3A。由于斑点印迹不便定量分析，为了增加客观性，本研究采用EpiQuik法对细胞内的m⁶A水平进行精确定量。图3B表明，砷可以刺激细胞内m⁶A水平上升（F=4.511, P<0.05），在5 μmol/L砷处理24 h后最高上升31.4%，在10 μmol/L砷处理24 h后上升28.5%。

2.4　砷通过影响m⁶A相关酶来增加细胞内m⁶A水平

如图4A所示，随着砷处理浓度增加，细胞内METTL3 mRNA表达增加，10 μmol/L浓度下最高增加73.2%（95%CI: 0.201～1.423, P<0.05）。METTL14、WTAP和FTO mRNA表达量下降，在10 μmol/L砷处理后分别降至对照组的65.4%（95%CI: -1.055～-0.337, P<0.01）、64.8%（95%CI: -0.389～-0.111, P<0.05）和85.4%（95%CI: -0.030～-0.010, P<0.01），见图4B、C、E。图4D所示，ALKBH5 mRNA在1 μmol/L砷处理24 h后表达量增加27.5%（95%CI: 0.033～0.147, P<0.05），但在5 μmol/L砷浓度下与对照组基本持平，而10 μmol/L浓度砷处理后降低30.7%（95%CI: -1.62～-0.038, P<0.01）。

如图5A所示，砷处理24 h后细胞内METTL3蛋白表达增加，5 μmol/L浓度下最高增加107.1%（95%CI: 0.331～1.009, P<0.01），10 μmol/L浓度下增加58.7%（95%CI: 0.028～0.706, P<0.05）。1 μmol/L砷处理24 h后，METTL14和WTAP蛋白表达量基本不变，但在10 μmol/L砷处理后分别降至对照组的20.4%（95%CI: -0.788～-0.509, P<0.001）和23.5%（95%CI: -1.371～-0.685, P<0.001），对细胞内RNA的甲基化催化作用下降，见图5B、C。图5D所示，ALKBH5蛋白表达趋势与mRNA表达趋势相似，在1 μmol/L砷处理24 h后表达量增加35.6%（95%CI:0.092～0.332, P<0.01），在10 μmol/L浓度砷处理后降低50.8%（95%CI: -0.423～-0.183, P<0.001）。图5E表明，随着砷浓度增高，FTO蛋白表达量呈下降趋势，在10 μmol/L浓度砷处理24 h时降低45.3%（95%CI:-0.709～-0.413, P<0.001）。

2.5　m⁶A参与砷导致的tau蛋白磷酸化

实验1.3～1.5的结果表明，5 μmol/L的亚砷酸钠处理24 h可以有效增加SH-SY5Y细胞内的m⁶A水平，并显著诱导tau蛋白发生磷酸化。因此，为探究m⁶A是否参与了砷诱导的tau蛋白磷酸化，本研究采用DAA来抑制细胞内的m⁶A水平，见图6A。图6B、C显示，与无DAA组相比，细胞内T231位点p-tau蛋白水平降低至对照组的129.0%（P<0.05），S202+T205位点p-tau蛋白水平降低至对照组的110.1%（P<0.05）说明m⁶A可以调控tau蛋白的磷酸化，是砷诱导tau蛋白磷酸化的关键环节之一。

3　讨论

收起

大量研究显示，细胞内p-tau蛋白聚集体的产生是AD的重要病理特征。Tau蛋白全长有多个位点可发生磷酸化，其中T231是最先发生磷酸化的位点，因此成为AD最早的生物标志物^[7]。Tau蛋白T231位点发生磷酸化后，会引发一系列磷酸化过程，期间tau蛋白发生折叠、剪切等变化，最后形成聚集体^[6]。S202+T205位点磷酸化对tau蛋白的构象改变具有关键作用，是神经原纤维缠结产生的关键环节^[6]，同样被认为是AD重要的生物标志物^[7]。鉴于此，本研究选择tau蛋白的T231和S202+T205位点磷酸化作为结局，探究m⁶A在砷诱导tau蛋白磷酸化的作用。研究结果显示，砷处理后SH-SY5Y细胞内tau蛋白T231位点和S202+T205位点磷酸化显著上升，提示砷不只是诱导SH-SY5Y细胞内tau蛋白发生磷酸化，还可能诱导细胞内神经原纤维缠结的产生，具有导致神经退行性疾病的潜在风险。

斑点印迹法和EpiQuik法是目前最常用于检测细胞内m⁶A整体水平的实验方法，斑点印迹法可以直观地看出不同砷处理组的m⁶A水平与对照组存在差异，EpiQuik法则可以精确定量砷对SH-SY5Y细胞内m⁶A的影响。本研究发现，砷可以诱导细胞内m⁶A水平显著上升，在5 μmol/L砷浓度下最高上升31.4%。砷处理导致细胞内tau蛋白磷酸化和m⁶A水平同步上升，提示两者之间可能存在关联。

m⁶A水平升高首先依赖于m⁶A甲基化酶的增加，砷处理24 h后细胞内METTL3 mRNA表达增加，METTL14和WTAP mRNA表达降低。相应的，砷处理后METTL3蛋白表达增加，而METTL14和WTAP蛋白表达量在5和10 μmol/L浓度砷浓度时降低。这些结果提示，METTL3可能是砷诱导细胞内m⁶A水平增加的主要调节酶。相印证的是，研究发现METTL3和tau蛋白在AD患者海马体的不溶性成分中显著增多，提示METTL3增多与tau蛋白的聚集有关^[13]。不仅如此，随着砷处理浓度增加，FTO mRNA和蛋白表达量呈下降趋势；ALKBH5 mRNA和蛋白在1 μmol/L砷处理时表达量增高，但10 μmol/L砷处理后表达量显著下降，这说明m⁶A去甲基化酶的降低也是砷导致细胞内m⁶A水平增加的原因。相似的是，动物实验发现，亚砷酸钠可以降低小鼠大脑中FTO的水平、增加m⁶A水平，从而引起小鼠神经功能缺陷^[9]；细胞实验发现，敲低ALKBH5会导致tau蛋白发生过度磷酸化^[14]，提示m⁶A水平增加可能与tau蛋白过度磷酸化存在关系，也恰好印证了本研究的观点。此外，本研究发现METTL3 mRNA在表达高浓度砷处理时持续升高，但METTL3蛋白的表达量在高浓度砷处理后却明显低于中浓度砷处理组，且其他m⁶A相关酶的蛋白表达量下降程度也远高于mRNA表达量的下降程度。究其原因，可能与蛋白的翻译后修饰、高浓度砷对SH-SY5Y细胞正常生理状态的干扰，以及亚砷酸钠的低剂量兴奋效应^[15]有关。

纵观m⁶A的水平变化和调节酶的表达量变化，本研究发现在1 μmol/L砷浓度情况下，ALKBH5的增加限制了m⁶A的增长速率。但在高浓度砷处理下，METTL3显著增加，伴随着FTO的显著降低、ALKBH5表达量的下降，故细胞内m⁶A水平显著增加。这些结果表明，METTL3、ALKBH5和FTO蛋白是参与砷诱导细胞内m⁶A水平增加的主要调节酶。为了证实m⁶A在砷诱导tau蛋白磷酸化中的关键作用，本研究采用DAA抑制细胞内的m⁶A水平。结果表示，在m⁶A水平被明显抑制的情况下，砷处理后的tau蛋白磷酸化也显著抑制，尤其是S202+T205位点磷酸化的抑制，说明m⁶A水平降低能有效防止tau蛋白的过度折叠，提示降低m⁶A水平（m⁶A抑制剂、降低m⁶A甲基化酶或者增加m⁶A去甲基化酶等）可能有助于延缓砷致神经退行性疾病的发生发展。

m⁶A结合蛋白是m⁶A行使功能的必要条件^[8]，砷处理诱导SH-SY5Y细胞内m⁶A水平增加后，可能通过m⁶A结合蛋白来调控蛋白激酶的表达，从而影响tau蛋白的磷酸化。值得注意的是，研究发现AD患者大脑中的m⁶A结合蛋白——HNRNPA2B1表达增多；HNRNPA2B1可以将m⁶A修饰的RNA与tau蛋白连接起来，促进tau蛋白寡聚体的形成，最终导致tau蛋白聚集^[16]。这说明，m⁶A不仅可以调控tau蛋白磷酸化，间接导致tau蛋白聚集，还可以直接诱导tau蛋白形成寡聚体。由此可见，RNA甲基化修饰与tau蛋白聚集之间的关系密切且复杂，亟待深入研究。在之后的研究中，可以从m⁶A结合蛋白、信号通路等方面深入探究m⁶A如何调控tau蛋白的磷酸化。

综上所述，本研究表明，砷可以通过增加METTL3、降低ALKBH5和FTO来增加细胞内m⁶A水平，进而促进tau蛋白磷酸化、促进神经原纤维缠结产生。总之，本研究建立了m⁶A与tau蛋白磷酸化之间的联系，丰富了AD的病理机制，也为砷在神经退行性疾病中的研究提供了新的线索。

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四川省自然科学基金青年基金项目(24NSFSC3231)

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2025年第52卷第3期

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doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202406423

接收时间：2024-06-23
首发时间：2026-03-18
出版时间：2025-02-10

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收稿日期：2024-06-23

基金

四川省自然科学基金青年基金项目(24NSFSC3231)

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四川大学华西公共卫生学院/华西第四医院，四川成都 610041

通讯作者:

赵田禾，E-mail: zhaotianhe8@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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