现代预防医学

基因名称	引物序列（5'→3'）	PCR产物大小（bp）	退火温度（℃）	参考文献
23S rRNA	F: CCACAGCGATGTGGTCTCAG	425	55	[14]
	R: CTCCATAAGAGCCAAAGCCC
gyrA	F: TTTRGCTTATTCMATGAGCGT	428	55
	R: GCAGACGGCTTGGTARAATA
cagA	F: GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG	349	54
	R: CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA
vacA m1/m2	F: CAATCTGTCCAATCAAGCGA	570（m1）	55
	R: GCGTCTAAATAATTCCAAGG	645（m2）
vacA s1/s2	F: ATGGAAATACAACAAACACAC	176（s1）	57	[15]
	R: CCTGAGACCGTTCCTACAGC	203（s2）
iceA1	F: GTGTTTTTAACCAAAGTATC	247	50	[16]
	R: CTATAGCCAATTCTTTGCA
iceA2	F: GTTGGGTATATCACAATTTAT	334/229	50
	R: TTTCCCTATTTTTTAGTAGGT
oipA	F: CGCGGAAAGGAACGGGTTTT	519	54
	R: TTAGCGTCTAGCGTTCTGCC

基因名称	引物序列（5'→3'）	PCR产物大小（bp）	退火温度（℃）	参考文献
23S rRNA	F: CCACAGCGATGTGGTCTCAG	425	55	[14]
	R: CTCCATAAGAGCCAAAGCCC
gyrA	F: TTTRGCTTATTCMATGAGCGT	428	55
	R: GCAGACGGCTTGGTARAATA
cagA	F: GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG	349	54
	R: CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA
vacA m1/m2	F: CAATCTGTCCAATCAAGCGA	570（m1）	55
	R: GCGTCTAAATAATTCCAAGG	645（m2）
vacA s1/s2	F: ATGGAAATACAACAAACACAC	176（s1）	57	[15]
	R: CCTGAGACCGTTCCTACAGC	203（s2）
iceA1	F: GTGTTTTTAACCAAAGTATC	247	50	[16]
	R: CTATAGCCAATTCTTTGCA
iceA2	F: GTTGGGTATATCACAATTTAT	334/229	50
	R: TTTCCCTATTTTTTAGTAGGT
oipA	F: CGCGGAAAGGAACGGGTTTT	519	54
	R: TTAGCGTCTAGCGTTCTGCC

分类	分组	患者数	分离株数（株）	分离率（%）	χ²值	P值
性别	男	27	17	63.0	0.850	0.404
	女	31	23	74.2
年龄（岁）	<45	21	16	76.2	0.803	0.398
	≥45	37	24	64.9
上腹不适症状	有	45	36	80.0	4.214	0.040
	无	13	6	46.2
吸烟史	有	7	7	100.0	-	0.087
	无	51	33	64.7
饮酒史	有	9	8	88.9	1.027	0.311
	无	49	32	65.3
消化道肿瘤家族史	有	8	5	62.5	0.000	0.989
	无	50	35	70.0
家庭成员Hp感染	有	16	12	75.0	0.087	0.768
	无	42	28	66.7

分类	分组	患者数	分离株数（株）	分离率（%）	χ²值	P值
性别	男	27	17	63.0	0.850	0.404
	女	31	23	74.2
年龄（岁）	<45	21	16	76.2	0.803	0.398
	≥45	37	24	64.9
上腹不适症状	有	45	36	80.0	4.214	0.040
	无	13	6	46.2
吸烟史	有	7	7	100.0	-	0.087
	无	51	33	64.7
饮酒史	有	9	8	88.9	1.027	0.311
	无	49	32	65.3
消化道肿瘤家族史	有	8	5	62.5	0.000	0.989
	无	50	35	70.0
家庭成员Hp感染	有	16	12	75.0	0.087	0.768
	无	42	28	66.7

耐药类型	抗生素	分离耐药菌株数（株）	菌株比例（%）
单重耐药	MTZ	5	12.5
双重耐药	MTZ+CLA	6	15.0
	MTZ+LEV	2	5.0
三重耐药	MTZ+CLA+LEV	27	67.5

耐药类型	抗生素	分离耐药菌株数（株）	菌株比例（%）
单重耐药	MTZ	5	12.5
双重耐药	MTZ+CLA	6	15.0
	MTZ+LEV	2	5.0
三重耐药	MTZ+CLA+LEV	27	67.5

根除次数（次）	抗生素
1	13（100.0）	7（53.8）	6（46.2）
2	16（100.0）	15（93.8）	13（81.3）
≥3	11（100.0）	11（100.0）	10（90.9）
χ²	—	9.190	6.278
P值	—	0.004	0.048

根除次数（次）	抗生素
1	13（100.0）	7（53.8）	6（46.2）
2	16（100.0）	15（93.8）	13（81.3）
≥3	11（100.0）	11（100.0）	10（90.9）
χ²	—	9.190	6.278
P值	—	0.004	0.048

耐药基因	突变位点	菌株例数（株）	突变率（%）
23S rRNA	T2182C	4	14.3
	A2143G	5	17.9
	A2143G+T2182C	12	42.9
	T2182C+A2223G	2	7.1
	A2143G+T2182C+C2195T	2	7.1
	A2143G+T2182C+A2223G	1	3.6
	A2143G+C2165T+T2182C+A2219G	1	3.6
	—	1	3.6

耐药基因	突变位点	菌株例数（株）	突变率（%）
23S rRNA	T2182C	4	14.3
	A2143G	5	17.9
	A2143G+T2182C	12	42.9
	T2182C+A2223G	2	7.1
	A2143G+T2182C+C2195T	2	7.1
	A2143G+T2182C+A2223G	1	3.6
	A2143G+C2165T+T2182C+A2219G	1	3.6
	—	1	3.6

耐药基因	突变位点	菌株例数（株）	突变率（%）
gyrA	N87K	7	28.0
	N87I	4	16.0
	D91G	2	8.0
	D91Y	2	8.0
	A88V	1	4.0
	N87I+D91Y	1	4.0
	N87K+A97V	1	4.0
	—	7	28.0

耐药基因	突变位点	菌株例数（株）	突变率（%）
gyrA	N87K	7	28.0
	N87I	4	16.0
	D91G	2	8.0
	D91Y	2	8.0
	A88V	1	4.0
	N87I+D91Y	1	4.0
	N87K+A97V	1	4.0
	—	7	28.0

根除治疗失败患者幽门螺杆菌的耐药特性及毒力基因研究

PDF下载

何琪云娜 ¹ , 潘美伶 ² , 田海英 ¹ , 何蕾 ¹ , 罗姝菡 ¹ , 郑田利 ¹ , 陈嘉熠 ¹ , 裴晓方 ¹ , 许欣 ¹ , 廖娟 ¹^,³

现代预防医学 | 临床与预防 2024,51(7): 1331-1337

收起

现代预防医学 | 临床与预防 2024, 51(7): 1331-1337

根除治疗失败患者幽门螺杆菌的耐药特性及毒力基因研究

全屏

何琪云娜¹, 潘美伶², 田海英¹, 何蕾¹, 罗姝菡¹, 郑田利¹, 陈嘉熠¹, 裴晓方¹, 许欣¹, 廖娟¹^,³

作者信息

^1.四川大学华西公共卫生学院/华西第四医院，四川成都 610041

^2.成都市双流区疾病预防控制中心

^3.四川大学华西-协和陈志潜健康研究院慢病研究中心，四川成都 610041

何琪云娜（1995—），女，硕士在读，研究方向：卫生检验与检疫

通讯作者:

廖娟，E-mail:juanliao@scu.edu.cn

Study on drug resistance and virulence genes of Helicobacter pylori in patients with failed eradication therapy

Qi-yun-na HE¹, Mei-ling PAN², Hai-ying TIAN¹, Lei HE¹, Shu-han LUO¹, Tian-li ZHENG¹, Jia-yi CHEN¹, Xiao-fang PEI¹, Xin XU¹, Juan LIAO¹^,³

Affiliations

West China School of Public Health, Sichuan University/West China Fourth Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan 610041, China

出版时间: 2024-04-10 doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202401036

文章导航

摘要

收起

目的

研究根除治疗失败患者幽门螺杆菌（Helicobater pylori，Hp）的耐药表型、耐药基因和毒力基因，为补救治疗提供参考依据。

方法

采集根除治疗失败患者胃黏膜组织分离培养Hp，药敏实验检测分离菌株对甲硝唑（metronidazole, MTZ）、克拉霉素（clarithromycin, CLA）、左氧氟沙星（levofloxacin, LEV）、阿莫西林（amoxicillin, AMX）、四环素（tetracycline, TET）和呋喃唑酮（furazolidone, FZ）的耐药情况，PCR扩增CLA、LEV耐药基因23S rRNA、gyrA及毒力基因cagA、vacA、iceA、oipA，进一步探究耐药表型与耐药及毒力基因的关系。

结果

从58例患者中分离获得40株Hp（69.0%），其对MTZ、CLA、LEV、AMX、TET、FZ的耐药率分别为100.0%、82.5%、72.5%、0%、0%、0%。23S rRNA、gyrA基因最常见的突变位点分别为T2182C（78.6%）和N87K（32.0%），并在CLA耐菌株中新发现了C2165T和A2219G突变。此外，这些菌株毒力基因cagA、vacA s1、vacA s2、vacA m1、vacA m2、iceA1、iceA2、oipA的阳性率分别为97.1%、100.0%、0%、42.9%、57.1%、62.9%、11.4%、68.6%，LEV耐药菌株中vacA m2基因阳性率更高，差异具有统计学意义（P<0.05）。

结论

本地区根除治疗失败患者Hp分离株对MTZ、CLA、LEV的耐药情况严峻，补救治疗推荐选用AMX、TET、FZ。CLA耐药与C2165T和A2219G突变及LEV耐药与vacA m2的关系值得进一步探讨。

关键词

幽门螺杆菌 / 根除治疗失败 / 抗生素耐药性 / 耐药基因 / 毒力基因

Abstract

收起

Objective

To study the drug resistance phenotype, drug resistance gene, and virulence gene of Helicobacter pylori(Hp) in patients with failed eradication therapy, and to provide reference for remedial therapy.

Methods

Hp was isolated and cultured from gastric mucosa of patients with failed eradication therapy. Drug sensitivity test was used to detect the resistance of isolated strains to Metronidazole (MTZ), Clarithromycin (CLA), Levofloxacin (LEV), Amoxicillin (AMX), Tetracycline (TET),and Furazolidone (FZ). CLA and LEV resistance genes 23S rRNA, gyrA and virulence genes cagA, vacA, iceA, oipA were amplified by PCR, to further explore the relationship between drug resistance phenotype and drug resistance and virulence genes.

Results

In total 40 strains of Hp were isolated from 58 patients (69.0%). The resistance rates to MTZ, CLA, LEV, AMX, TET, and FZ were 100.0%, 82.5%, 72.5%, 0%, 0%, and 0%, respectively. The most common mutations of 23S rRNA and gyrA genes were T2182C (78.6%) and N87K (32.0%), respectively, and new C2165T and A2219G mutations were found in CLA resistant strains. In addition, the positive rates of virulence genes cagA, vacA s1, vacA s2, vacA m1, vacA m2, iceA1, iceA2, and oipA were 97.1%, 100.0%, 0%, 42.9%, 57.1%, 62.9%, 11.4%, and 68.6%, respectively, and the difference was statistically significant.

Conclusion

The resistance of Hp isolates to MTZ, CLA and LEV in patients with failed eradication therapy in this area is serious, and AMX, TET and FZ are recommended for remedial therapy. The relationship between CLA resistance and C2165T and A2219G mutation and LEV resistance and vacA m2 warrants further investigation.

Key words

Helicobacter pylori / Failure of eradication therapy / Antibiotic resistance / Drug resistance gene / Virulence gene

引用本文

何琪云娜, 潘美伶, 田海英, 何蕾, 罗姝菡, 郑田利, 陈嘉熠, 裴晓方, 许欣, 廖娟. 根除治疗失败患者幽门螺杆菌的耐药特性及毒力基因研究. 现代预防医学, 2024 , 51 (7) : 1331 -1337 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202401036

Qi-yun-na HE, Mei-ling PAN, Hai-ying TIAN, Lei HE, Shu-han LUO, Tian-li ZHENG, Jia-yi CHEN, Xiao-fang PEI, Xin XU, Juan LIAO. Study on drug resistance and virulence genes of Helicobacter pylori in patients with failed eradication therapy[J]. Modern Preventive Medicine, 2024 , 51 (7) : 1331 -1337 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202401036

正文

收起

幽门螺杆菌（Helicobater pylori，Hp）长期感染可能引发慢性胃炎、消化性溃疡等疾病，并发展为胃腺癌和黏膜相关淋巴组织（mucosa-associated lymphoid tissue, MALT）淋巴瘤，全球感染率高达50%^[1-2]。1994年，Hp被国际癌症研究机构认定为I类致癌物，全球近90%的远端胃癌是由Hp感染引起的^[3]。为防止胃癌的发生和发展，Hp感染者应接受根除治疗^[4-6]。常用的治疗方案包括标准三联疗法、铋剂四联疗法、伴随疗法和序贯疗法等^[7]。然而，由于抗生素的广泛使用，Hp的耐药性不断升高，导致根除率逐年下降^[8-9]。因此了解根除治疗失败患者的Hp耐药性及相关规律，对补救治疗具有重要意义。Hp耐药性与地理和社会经济因素有关^[10]。因此，了解成都地区根除治疗失败患者Hp分离株的耐药特性对补救治疗药物的选择具有重要意义。而且成都地区根除治疗失败患者Hp的耐药性是否与耐药基因发生了突变有关也值得进一步研究。此外，有研究报道了长春地区Hp菌株的耐药性与vacA和iceA基因密切相关^[11]，而成都地区根除治疗失败患者Hp分离株的耐药性与毒力基因的研究未见报道。因此，本研究采集成都市某三甲医院根除失败患者的胃黏膜组织进行Hp的分离培养，检测其耐药性、耐药相关基因（23S rRNA、gyrA）和毒力基因（vacA、cagA、iceA和oipA），旨在了解根除治疗失败患者Hp的耐药情况，探讨耐药表型与耐药基因及毒力基因间的关系，为根除失败患者的补救治疗方案的选择积累宝贵的资料。

1　对象与方法

收起

1.1　研究对象

以成都市某三甲医院就诊的一次或多次根除治疗失败，且同意行胃镜检查和胃黏膜活检的患者为研究对象。纳入标准：（1）曾接受过Hp根除治疗；（2）治疗后13C尿素呼气试验结果为阳性。排除标准：（1）过去1个月内使用过抗生素、质子泵抑制剂（proton pump inhibitors, PPIs）和铋剂等药物；（2）有严重凝血功能及严重心、肺、脑疾病；（3）既往行胃部手术或有胃恶性肿瘤病史。本研究经医学伦理委员会批准，所有研究对象均在参与研究前签署知情同意书。

1.2　仪器与试剂

显微镜（日本olympus公司）；三气培养箱、iBright 1500凝胶成像仪（美国Thermo Fisher公司）；十万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；ProFlex^TM PCR仪（美国ABI公司）。

哥伦比亚琼脂、Mueller-Hinton（MH）琼脂、脑心浸液（Brain Heart Infusion, BHI）肉汤、氧化酶试验试纸条（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）；3%过氧化氢试验试剂（广东环凯微生物科技有限公司）；革兰染液（北京索莱宝科技有限公司）；甲硝唑（metronidazole，MTZ）、克拉霉素（clarithromycin,CLA）、左氧氟沙星（levofloxacin, LEV）、阿莫西林（amoxicillin，AMX）、四环素（tetracycline, TET）药敏试纸条（温州康泰生物科技有限公司）；抗菌药物药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）；脲酶试验试剂（三明市贝真生物科技有限公司）；无菌脱纤维绵羊血（郑州益康生物工程有限公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒、Golden Easy PCR System（天根生化科技（北京）有限公司）等。

1.3　Hp分离和鉴定

将采集到的根除治疗失败患者的胃窦和胃体黏膜样本充分研磨制成匀浆，接种于选择性哥伦比亚血平板，于37℃，5%O₂、10%CO₂、85%N₂的环境中培养3～5 d。选取平板上圆形、灰白色或半透明、针尖大小凸起、边缘整齐的小菌落进行革兰染色，观察细菌镜下形态，并进行脲酶、氧化酶和过氧化氢酶试验。根据《幽门螺杆菌感染的基础与临床》^[12]、《幽门螺杆菌感染及其相关疾病的诊治》^[13]，H. pylori分离培养阳性的标准为：符合典型H. pylori菌落特征，显微镜下观察到革兰阴性弯曲杆菌，过氧化氢酶、氧化酶、脲酶试验均为阳性。将Hp菌株混悬于含30%甘油的BHI肉汤中，于-80℃冰箱保存备用。

1.4　药敏实验

分别用浓度梯度纸条扩散法（E-test法）和纸片扩散法进行药敏试验。用生理盐水制备Hp菌悬液，将其均匀涂布于MH血平板。待干燥后，将AMX、MTZ、LEV、CLA和TET的试纸条有梳齿的一侧插入MH血平板，将呋喃唑酮（furazolidone, FZ）的药敏纸片贴于MH血平板，以空白纸片为对照。Hp标准菌株ATCC 43504用于质量控制。

判定结果参照欧洲抗菌药敏试验委员会（EUCAST）关于抗菌药敏试验的技术说明和药敏纸片制造商的说明，Hp对AMX、CLR、MTZ、LEV和TET耐药定义为最小抑菌浓度分别>0.125、>0.5、>8、>1和>1 mg/L。FZ药敏纸片抑菌圈直径≤14 mm时，判定为耐药。

1.5　细菌DNA提取

从-80℃冰箱取出冻存菌株，复苏后传代活化。刮取适量菌落于无菌生理盐水中，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。

1.6　耐药及毒力基因扩增

CLA耐药基因23S rRNA、LEV耐药基因gyrA和毒力基因cagA、vacA、iceA、oipA的特异性引物序列见表1。PCR扩增条件参照参考文献。

1.7　耐药及毒力基因测序和比对

PCR反应产物经电泳鉴定后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。以NCBI在线数据库下载的Hp 26695菌株的23S rRNA和gyrA基因序列为阴性对照。23S rRNA基因序列直接进行比对，gyrA基因序列经MEGA 11软件翻译为氨基酸序列后进行比对。毒力基因测序结果于NCBI在线数据网站进行BLAST比对分析。

1.8　统计学分析

2　结果

收起

2.1　研究对象基本信息

本研究共纳入58例Hp根除失败患者，其中男性27例，占46.6%，女性31例，占53.4%；年龄范围为19～69岁，平均年龄为（49.1±11.9）岁。

2.2　Hp菌株分离情况

成功分离培养出40株Hp，分离率为69.0%。根据患者的年龄、性别、是否有上腹不适症状、吸烟史、饮酒史、消化道肿瘤家族史以及家庭成员感染的情况进行分类，不同分类患者的Hp分离情况见表2。有上腹不适症状的患者胃部组织中Hp的分离率明显高于无症状患者（χ²=4.214，P<0.05）。采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析。计数资料采用率（%）进行描述，组间比较采用χ²检验或Fisher确切概率进行比较，检验水准α=0.05。

2.3　Hp分离株耐药情况

40株Hp分离株对MTZ、CLA、LEV、AMX、TET、FZ的耐药率分别为100.0%（40/40）、82.5%（33/40）、72.5%（29/40）、0%、0%、0%，多重耐药情况见表3。

2.4　Hp耐药率与患者根除治疗失败次数关系分析

比较不同根除次数组间的Hp分离株的耐药情况，不同根除次数组间CLA和LEV的耐药率具有统计学意义（χ²=9.190, P<0.05; χ²=6.278, P<0.05），随着根除治疗次数增加，Hp对CLA和LEV耐药率不断增加。见表4。

2.5　CLA与LEV耐药相关基因突变分析

共复苏出35株冻存菌株，其中CLA、LEV耐药分别为28株和25株。Hp菌株的23S rRNA基因序列比对结果显示，CLA敏感菌株未发生突变，耐药菌株中除1株未发生23S rRNA V区突变外，其余27株均发生23S rRNA V区突变。最常见的突变位点为T2182C，其次是A2143G，突变率分别为78.6%（22/28）、75.0%（21/28）。见表5。

Hp菌株的gyrA氨基酸序列比对结果显示，LEV敏感菌株未发生突变，耐药株中除7株未发生突变外，其余18株均发生了突变。其中，N87K突变率最高，突变率为32.0%（8/25）。见表6。

2.6　毒力基因分析

Hp的毒力基因除vacA s2未检出外，cagA、vacA s1、vacA m1、vacA m2、iceA1、iceA2和oipA均有检出。cagA阳性率为97.1%（34/35）。vacA基因分s和m区，所有菌株s区分型均为s1型（100.0%）；m区中m1型阳性率为42.9%（15/35）、m2型阳性率57.1%（20/35）。iceA阳性率为74.3%（26/35），两个等位基因iceA1型与iceA2型的阳性率分别为62.9%（22/35）、11.4%（4/35）。oipA基因阳性率为68.6%（24/35）。 Hp毒力基因vacA、iceA和oipA在CLA和LEV耐药和敏感株之间的分布差异见表7，其中，LEV耐药菌株中vacA m2基因阳性率更高（P<0.05）。

3　讨论

收起

本研究首次对成都地区某三甲医院根除治疗失败患者的Hp进行分离培养及耐药特性研究，并初步探讨了耐药特性与毒力基因的关系。我们从58例患者中成功分离获得了40株Hp，发现Hp分离株对MTZ、CLA、LEV的耐药情况严峻，并且在CLA耐药菌株中发现了C2165T和A2219G两个新突变位点，此外，还首次观察到LEV耐药菌株中毒力基因vacA m2阳性率更高。

抗生素耐药是影响Hp根除治疗方案疗效的主要因素^[17]。全球大多数地区的Hp对MTZ、CLA、LEV的耐药率均超过15%^[18]。Hp的继发耐药是导致耐药情况严重的一个重要因素，首次抗生素治疗后，细菌若产生耐药性，再次使用同类抗生素可能失效^[19]。有报道，亚洲人群对MTZ、CLA、LEV、AMX和TET的继发耐药率分别为62.0%、64.3%、15.7%、10.3%、10.4%^[20]；而国内叶峰等人^[21]报道的根除失败患者对MTZ、CLA、LEV、AMX、TET和FZ的耐药率分别为97.37%、58.95%、48.42%、0%、0%、0%；本研究中，MTZ、CLA、LEV、AMX、TET和FZ的耐药率分别为100.0%、82.5%、72.5%、0%、0%、0%，提示本地区患者MTZ、CLA、LEV耐药情况更为严重。此外，有研究发现根除治疗失败会导致更多的多重耐药菌株出现^[22]，我国南方的一项多中心、前瞻性队列研究发现初次治疗失败后对MTZ+CLA、MTZ+LEV、MTZ+CLA+LEV的耐药率分别为34.0%、38.7%、17.8%^[10]，本研究中MTZ+CLA、MTZ+LEV、MTZ+CLA+LEV的耐药率分别为15.0%、5.0%、67.5%，相比之下，本地区三重耐药情况更为严重，而且CLA、LEV的耐药率随治疗次数增加而升高，提示补救治疗应选择非MTZ、CLA、LEV的抗生素以提高成功率，并且应密切关注多重耐药的情况。

Hp耐药性与耐药基因突变有关^[23]，如CLA耐药与Hp的23S rRNA基因V区的点突变有关，常见突变位点为A2142G和A2143G^[24]，也有T2182C、A2223G和C2195T等位点突变及检出率的报道^[25-26]，如Albasha等人^[25]报道的苏丹患者中CLA耐药菌株突变位点A2143G、T2182C和C2195T的突变率分别为20%、16%、12%；国内张择伟等人^[27]报道的CLA耐药菌株常见的突变位点T2182C、A2143G的突变率分别为35.29%、20.0%；而本研究发现的最常见突变位点T2182C、A2143G的突变率分别为78.6%、75.0%，特别值得关注的是我们还发现了C2165T和A2219G新突变位点，提示本地区根除失败患者的CLA耐药菌株T2182C和A2143G位点突变频率更高，应加强关注。不过新突变位点与CLA耐药的关系还需更多研究予以确证。另一方面，LEV耐药机制与喹诺酮类耐药决定区gyrA基因的突变有关，常见突变在第87位（N87L、I、A或K）和第91位（D91G、N、A、Y或H）的氨基酸取代^[28]，还发现了A88V、A97V等突变位点^[29-30]。Wang等人^[31]的研究中常见突变N87K、D91N突变率分别为20.2%、10.5%，而本研究中突变以N87K、N87I为主，突变率分别为32.0%、20.0%，未发现新的突变位点。

值得关注的是Hp耐药表型可能与毒力基因相关，如意大利西西里地区的一项研究显示CLA耐药性与cagA基因相关^[32]；蒋洁^[11]等人发现，Hp菌株CLA耐药与iceA1基因与密切相关，但与cagA基因无关；林定赛^[33]等人发现，CLA耐药可能与vacA基因有关；而本研究我们发现对LEV耐药的菌株中vacA m2基因阳性率更高（P<0.05），提示LEV耐药可能与vacA m2基因相关。因此，CLA、LEV的耐药性与vacA、iceA及oipA之间的关系值得进一步探讨。

此外，本研究在对根除失败患者感染的Hp分离培养中发现，从有上腹不适症状患者的标本中分离获得Hp的比例为80.0%，显著高于无该症状患者的标本（P<0.05），提示有上腹不适症状患者的Hp分离成功率更高。

本研究发现，根除失败患者Hp分离株对MTZ、CLA和LEV的耐药率高。因此，在临床补救治疗中，建议首选AMX、TET和FZ。此外，CLA耐药与C2165T和A2219G突变的关系，以及LEV耐药与毒力基因vacA m2的关系值得进一步深入研究。

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Tshibangu-Kabamba

, Yamaoka

. Helicobacter pylori infection and antibiotic resistance - from biology to clinical implications[J].Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2021, 18(9): 613-629.

[2]

Ansari

, Yamaoka

. Helicobacter pylori Infection, Its Laboratory Diagnosis, and Antimicrobial Resistance: a Perspective of Clinical Relevance[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2022, 35(3):e0025821.

[3]

Thrift

, Wenker

, El-Serag

. Global burden of gastric cancer: epidemiological trends, risk factors, screening and prevention[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2023, 20(5): 338-349.

[4]

Malfertheiner

, Camargo

, El-Omar

, et al. Helicobacter pylori infection[J]. NATURE REVIEWS DISEASE PRIMERS, 2023,9(1): 19.

[5]

Ford

, Yuan

, Moayyedi

. Helicobacter pylori eradication therapy to prevent gastric cancer: systematic review and meta-analysis[J]. Gut, 2020, 69(12): 2113-2121.

[6]

Malfertheiner

, Megraud

, Rokkas

, et al. Management of helicobacter pylori infection: the Maastricht VI/Florence consensus report[J]. Gut, 2022, 71: 1724-1762.

[7]

Sun

, Yuan

, Zhou

, et al. Helicobacter pylori infection:a dynamic process from diagnosis to treatment[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2023, 13: 1257817.

[8]

Shah

, Iyer

, Moss

. Aga clinical practice update on the management of refractory helicobacter pylori infection: expert review[J]. Gastroenterology, 2021, 160(5): 1831-1841.

[9]

Suzuki

, Kusano

, Horii

, et al. The ideal helicobacter pylori treatment for the present and the future[J]. Digestion, 2022, 103(1):62-68.

[10]

Lyu

, Cheung

, Ni

, et al. High prevalence and risk factors of multiple antibiotic resistance in patients who fail first-line Helicobacter pylori therapy in southern China: a municipality-wide,multicentre, prospective cohort study[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2020, 75(11): 3391-3394.

[11]

蒋洁，于军，江海洋，等.长春地区幽门螺杆菌耐药性与毒力基因相关性分析[J].胃肠病学和肝病学杂志，2020，29（7）：784-788.

Jiang

, Yu

, Jiang

, et al. The correlation between virulence genes and antibiotic resistance in Helicobacter pylori isolates in Changchun area[J].Chinese Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2020, 29(7): 784-788.

[12]

胡伏莲，周殿元.幽门螺杆菌感染的基础与临床[M].北京：中国科学技术出版社，2002.

, Zhou

. Basis and clinical aspects of helicobacter pylori infection[M]. Beijing: China Science and Technology Press, 2002.

[13]

池肇春，邹全明，姜相君.幽门螺杆菌感染及其相关疾病的诊治[M].北京：人民卫生出版社，2017.

Chi

, Zou

, Jiang

. Diagnosis and treatment of helicobacter pylori infection and related diseases[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 2017.

[14]

王莉莉.幽门螺杆菌耐药性及相关基因突变特征研究[D].青岛：青岛大学，2016.

Wang

. Study on the resistance and related gene mutation characteristics of helicobacter pylori[D]. Qingdao: Qingdao University, 2016.

[15]

潘美伶，李荧，沈丹芸, 等. 不同类型慢性胃炎患者幽门螺杆菌的分离培养、耐药与毒力基因研究[J].现代预防医学，2022，49（8）：1480-1484, 1494.

Pan

, Li

, Shen

, et al. Study on isolation, drug resistance and virulence genes of Helicobacter pylori from patients with different types of chronic gastritis[J]. Modern Preventive Medicine, 2022, 49(8): 1480-1484,1494.

[16]

董霄，吴多智，曹芹芳，等.海口地区老年Hp相关性胃病患者病原菌基因型检测及其与疾病病理类型的关系[J].中国老年学杂志，2022，42（23）：5700-5703.

Dong

, Wu

, Cao

, et al. Pathogenic gene typing of helicobacter pylori in elderly patients with hp-related gastric diseases in Haikou area and its relationship with disease pathological types[J]. Chinese Journal of Gerontology, 2022, 42(23): 5700-5703.

[17]

Kasahun

, Demoz

, Desta

. Primary resistance pattern of helicobacter pylori to antibiotics in adult population: a systematic review[J]. Infection and Drug Resistance, 2020, 13: 1567-1573.

[18]

Savoldi

, Carrara

, Graham

, et al. Prevalence of antibiotic resistance in helicobacter pylori: a systematic review and meta-analysis in World Health Organization regions[J]. Gastroenterology,2018, 155(5): 1372-1382.

[19]

王春燕，李胜棉.2017幽门螺杆菌感染诊治相关国内外指南更新[J].河北医科大学学报，2019，40（2）：125-127, 132.

Wang

, Li

. Update on the diagnosis and treatment guidelines for helicobacter pylori infection in 2017: a review of domestic and international guidelines[J]. Journal of Hebei Medical University, 2019, 40(2): 125-127,132.

[20]

王舟一.亚洲人群幽门螺杆菌分离株对抗生素耐药率的系统评价[D].泸州：西南医科大学，2018.

Wang

. A systematic review of antibiotic resistance rates of helicobacter pylori isolates in Asian populations[D]. Luzhou: Southwest Medical University, 2018.

[21]

叶峰，陈涵，杨振，等.幽门螺杆菌根除失败患者耐药情况分析[J].江苏医药，2021，47（12）：1267-1269.

, Chen

, Yang

, et al. An analysis of antibiotics resistance in patients with Helicobacter pylori eradication failure[J]. Jiangsu Medical Journal, 2021, 47(12): 1267-1269.

[22]

Rokkas

, Ekmektzoglou

. Advances in the pharmacological and regulatory management of multidrug resistant Helicobacter pylori[J]. Expert Review of Clinical Pharmacology, 2023, 16(12): 1229-1237.

[23]

Mannion

, Dzink-Fox

, Shen

, et al. Helicobacter pylori Antimicrobial Resistance and Gene Variants in High- and Low-Gastric-Cancer-Risk Populations[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2021, 59(5): e03203-e03220.

[24]

Rosli

, Al-Maleki

, Loke

, et al. Polymorphism of virulence genes and biofilm associated with in vitro induced resistance to clarithromycin in Helicobacter pylori[J]. Gut Pathogens,2023, 15(1): 52.

[25]

Albasha

, Elnosh

, Osman

, et al. Helicobacter pylori 23S rRNA gene A2142G, A2143G, T2182C, and C2195T mutations associated with clarithromycin resistance detected in Sudanese patients[J]. BMC Microbiology, 2021, 21(1): 38.

[26]

宋顺佳，王鑫莹，姜菲菲，等.幽门螺杆菌对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药率及其相关耐药基因突变特征[J].吉林大学学报:医学版，2022，48（3）：630-637.

Song

, Wang

, Jiang

, et al. Resistance rates of Helicobacter pylori to clarithromycin, metronidazole, and levofloxacin and mutation characteristics of their related drug resistance genes[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2022, 48(3): 630-637.

[27]

张择伟，张新颖，王晓东，等.张家口市某院幽门螺杆菌的抗生素耐药菌株突变基因与耐药的相关性分析[J].医学动物防制，2023，39（3）：267-271, 277.

Zhang

, Zhang

, Wang

, et al. Correlation analysis of mutation gene and drug resistance of Helicobacter pylori antibiotic-resistant strains in a hospital in Zhangjiakou City[J]. Journal of Medical Pest Control, 2023,39(3): 267-271, 277.

[28]

Medakina

, Tsapkova

, Polyakova

, et al. Helicobacter pylori antibiotic resistance: molecular basis and diagnostic methods[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(11): 9433.

[29]

简文华，李清秀，何朝晖.幽门螺杆菌治疗的研究新进展[J].大医生，2023，8（8）：131-134.

Jian

, Li

, He

. Recent advances in the treatment of helicobacter pylori infection[J]. Doctor, 2023, 8(8): 131-134.

[30]

王松松，苏艳华，战淑慧，等.青岛地区幽门螺杆菌对左氧氟沙星耐药性及gyrA基因突变分析[J].胃肠病学和肝病学杂志，2013，22（5）：428-430.

Wang

, Su

, Zhan

, et al. Analysis of the levofloxacin resistance and gyrA gene mutation of Helicobacter pylori in Qingdao[J]. Chinese Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2013, 22(5): 428-430.

[31]

Wang

, Wang

, Gong

, et al. Genotype profiles of Helicobacter pylori from gastric biopsies and strains with antimicrobial-induced resistance[J]. Therapeutic Advances in Gastroenterology, 2020, 13(期缺失): 1756284820952596.

[32]

Fasciana

, Calà

, Bonura

, et al. Resistance to clarithromycin and genotypes in Helicobacter pylori strains isolated in Sicily[J].Journal of Medical Microbiology, 2015, 64(11): 1408-1414.

[33]

林定赛，夏莲，方蕾，等.幽门螺杆菌VacA基因型与耐药性相关性研究[J].医学研究杂志，2018，47（2）：124-126.

Lin

, Xia

, Fang

, et al. Relevance analysis of VacA virulence gene of helicobacter pylori and its drug resistance[J]. Journal of Medical Research,2018, 47(2): 124-126.

2024年第51卷第7期

PDF下载

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202401036

接收时间：2024-01-03
首发时间：2026-03-18
出版时间：2024-04-10

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2024-01-03

基金

作者信息

^1.四川大学华西公共卫生学院/华西第四医院，四川成都 610041

^2.成都市双流区疾病预防控制中心

^3.四川大学华西-协和陈志潜健康研究院慢病研究中心，四川成都 610041

通讯作者:

廖娟，E-mail:juanliao@scu.edu.cn

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/xdyfyx/CN/10.20043/j.cnki.MPM.202401036

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT

基因名称	引物序列（5'→3'）	PCR产物大小（bp）	退火温度（℃）	参考文献
23S rRNA	F: CCACAGCGATGTGGTCTCAG	425	55	[14]
	R: CTCCATAAGAGCCAAAGCCC
gyrA	F: TTTRGCTTATTCMATGAGCGT	428	55
	R: GCAGACGGCTTGGTARAATA
cagA	F: GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG	349	54
	R: CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA
vacA m1/m2	F: CAATCTGTCCAATCAAGCGA	570（m1）	55
	R: GCGTCTAAATAATTCCAAGG	645（m2）
vacA s1/s2	F: ATGGAAATACAACAAACACAC	176（s1）	57	[15]
	R: CCTGAGACCGTTCCTACAGC	203（s2）
iceA1	F: GTGTTTTTAACCAAAGTATC	247	50	[16]
	R: CTATAGCCAATTCTTTGCA
iceA2	F: GTTGGGTATATCACAATTTAT	334/229	50
	R: TTTCCCTATTTTTTAGTAGGT
oipA	F: CGCGGAAAGGAACGGGTTTT	519	54
	R: TTAGCGTCTAGCGTTCTGCC

基因名称

引物序列（5'→3'）

PCR产物大小（bp）

退火温度（℃）

参考文献

23S rRNA

F: CCACAGCGATGTGGTCTCAG

425

[14]

R: CTCCATAAGAGCCAAAGCCC

gyrA

F: TTTRGCTTATTCMATGAGCGT

428

R: GCAGACGGCTTGGTARAATA

cagA

F: GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG

349

R: CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA

vacA m1/m2

F: CAATCTGTCCAATCAAGCGA

570（m1）

R: GCGTCTAAATAATTCCAAGG

645（m2）

vacA s1/s2

F: ATGGAAATACAACAAACACAC

176（s1）

[15]

R: CCTGAGACCGTTCCTACAGC

203（s2）

iceA1

F: GTGTTTTTAACCAAAGTATC

247

[16]

R: CTATAGCCAATTCTTTGCA

iceA2

F: GTTGGGTATATCACAATTTAT

334/229

R: TTTCCCTATTTTTTAGTAGGT

oipA

F: CGCGGAAAGGAACGGGTTTT

519

R: TTAGCGTCTAGCGTTCTGCC

分类	分组	患者数	分离株数（株）	分离率（%）	χ²值	P值
性别	男	27	17	63.0	0.850	0.404
	女	31	23	74.2
年龄（岁）	<45	21	16	76.2	0.803	0.398
	≥45	37	24	64.9
上腹不适症状	有	45	36	80.0	4.214	0.040
	无	13	6	46.2
吸烟史	有	7	7	100.0	-	0.087
	无	51	33	64.7
饮酒史	有	9	8	88.9	1.027	0.311
	无	49	32	65.3
消化道肿瘤家族史	有	8	5	62.5	0.000	0.989
	无	50	35	70.0
家庭成员Hp感染	有	16	12	75.0	0.087	0.768
	无	42	28	66.7

分类

分组

患者数

分离株数（株）

分离率（%）

χ²值

P值

性别

男

63.0

0.850

0.404

女

74.2

年龄（岁）

<45

76.2

0.803

0.398

≥45

64.9

上腹不适症状

有

80.0

4.214

0.040

无

46.2

吸烟史

有

100.0

0.087

无

64.7

饮酒史

有

88.9

1.027

0.311

无

65.3

消化道肿瘤家族史

有

62.5

0.000

0.989

无

70.0

家庭成员Hp感染

有

75.0

0.087

0.768

无

66.7

耐药类型	抗生素	分离耐药菌株数（株）	菌株比例（%）
单重耐药	MTZ	5	12.5
双重耐药	MTZ+CLA	6	15.0
	MTZ+LEV	2	5.0
三重耐药	MTZ+CLA+LEV	27	67.5

耐药类型

抗生素

分离耐药菌株数（株）

菌株比例（%）

单重耐药

MTZ

12.5

双重耐药

MTZ+CLA

15.0

MTZ+LEV

5.0

三重耐药

MTZ+CLA+LEV

67.5

根除次数（次）	抗生素
1	13（100.0）	7（53.8）	6（46.2）
2	16（100.0）	15（93.8）	13（81.3）
≥3	11（100.0）	11（100.0）	10（90.9）
χ²	—	9.190	6.278
P值	—	0.004	0.048

根除次数（次）

抗生素

MTZ

CLA

LEV

13（100.0）

7（53.8）

6（46.2）

16（100.0）

15（93.8）

13（81.3）

≥3

11（100.0）

10（90.9）

χ²

—

9.190

6.278

P值

—

0.004

0.048

耐药基因	突变位点	菌株例数（株）	突变率（%）
23S rRNA	T2182C	4	14.3
	A2143G	5	17.9
	A2143G+T2182C	12	42.9
	T2182C+A2223G	2	7.1
	A2143G+T2182C+C2195T	2	7.1
	A2143G+T2182C+A2223G	1	3.6
	A2143G+C2165T+T2182C+A2219G	1	3.6
	—	1	3.6

耐药基因

突变位点

菌株例数（株）

突变率（%）

23S rRNA

T2182C

14.3

A2143G

17.9

A2143G+T2182C

42.9

T2182C+A2223G

7.1

A2143G+T2182C+C2195T

7.1

A2143G+T2182C+A2223G

3.6

A2143G+C2165T+T2182C+A2219G

3.6

—

3.6

耐药基因	突变位点	菌株例数（株）	突变率（%）
gyrA	N87K	7	28.0
	N87I	4	16.0
	D91G	2	8.0
	D91Y	2	8.0
	A88V	1	4.0
	N87I+D91Y	1	4.0
	N87K+A97V	1	4.0
	—	7	28.0

耐药基因

突变位点

菌株例数（株）

突变率（%）

gyrA

N87K

28.0

N87I

16.0

D91G

8.0

D91Y

8.0

A88V

4.0

N87I+D91Y

4.0

N87K+A97V

4.0

—

28.0

抗生素

分组

vacAm1⁺ (n=15)

vacAm1^-(n=20)

χ²值

P值

vacAm2⁺
(n=20)

vacAm2^-
(n=15)

χ²值

P值

iceA1⁺
(n=22)

iceA1^-
(n=13)

χ²值

P值

iceA2⁺
(n=4)

iceA2^-
(n=31)

χ²值

P值

oipA⁺
(n=24)

oipA^-(n=11)

χ²值

P值

CLA

耐药（n=28）

0.660

0.101

0.525

0.609

0.619

敏感
（n=7）

LEV

耐药（n=25）

0.179

0.047

0.560

0.319

0.138

敏感（n=10）