现代预防医学

运动速度(m/min)	运动时间(min)	日期时间
8	20	Day1
9	30	Day2
10	40	Day3
11	50	Day4
12	60	Day5

运动速度(m/min)	运动时间(min)	日期时间
8	20	Day1
9	30	Day2
10	40	Day3
11	50	Day4
12	60	Day5

基因	5′-3′	引物序列
NF-κB p65	Forward	AGCAACCAAAACAGAGGGGA
	Reverse	TGCAAATTTTGACCTGTGGGT
TNF-α	Forward	CCCTCACACTCAGATCATCTTCT
	Reverse	GCTACGACGTGGGCTACAG
IL-6	Forward	CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC
	Reverse	CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT
GAPDH	Forward	AGGCCGGTGCTGAGTATGTC
	Reverse	TGCCTGCTTCACCACCTTCT

基因	5′-3′	引物序列
NF-κB p65	Forward	AGCAACCAAAACAGAGGGGA
	Reverse	TGCAAATTTTGACCTGTGGGT
TNF-α	Forward	CCCTCACACTCAGATCATCTTCT
	Reverse	GCTACGACGTGGGCTACAG
IL-6	Forward	CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC
	Reverse	CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT
GAPDH	Forward	AGGCCGGTGCTGAGTATGTC
	Reverse	TGCCTGCTTCACCACCTTCT

有氧运动对CNPY2调控NF-κB信号通路改善非酒精性脂肪肝的作用研究

PDF下载

蒋昌君 ¹^,² , 王佳倩 ² , 李亚龙 ² , 李军汉 ²

现代预防医学 | 临床与预防 2024,51(11): 2100-2107

收起

现代预防医学 | 临床与预防 2024, 51(11): 2100-2107

有氧运动对CNPY2调控NF-κB信号通路改善非酒精性脂肪肝的作用研究

全屏

蒋昌君¹^,², 王佳倩², 李亚龙², 李军汉²

作者信息

^1.西南石油大学体育学院，四川成都 610000

^2.成都体育学院运动医学与健康学院，四川成都 610041

蒋昌君（1997—），男，硕士，助教，研究方向：运动干预慢性病的机制研究

通讯作者:

李军汉，E-mail:junhanli@cdsu.edu.cn

Study on the effect of aerobic exercise on CNPY2 regulating NF- κB signal pathway to improve non-alcoholic fatty liver

Chang-jun JIANG¹^,², Jia-qian WANG², Ya-long LI²

Affiliations

School of Physical Education, Southwest University of Petroleum, Chengdu, Sichuan 610000, China

出版时间: 2024-06-10 doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202310070

文章导航

摘要

收起

目的探讨冠层同源物2(canopy homolog 2，CNPY2)和有氧运动经核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)信号通路在高脂膳食诱导非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)中的作用机制。方法 (12±1)周龄雄性CNPY2基因敲除(CNPY2 KO)小鼠及同系同窝同龄野生(WT)小鼠经一周适应性喂养后随机分为对照组(CON)，高脂模型组(MOD)和高脂模型运动组(MOD+EX)。CON组喂养普通饲料，MOD组和MOD+EX组喂养高脂饲料，直至18周实验结束。从第10周开始，MOD+EX组小鼠进行一周的适应性跑台训练，随后持续运动干预至18周实验结束。全自动生化分析仪检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT和AST水平；HE染色和油红O染色分析肝脏病理形态；Western Blot检测肝脏CNPY2、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达，ELISA检测肝脏炎症因子TNF-α和IL-6水平；qRT-PCR检测肝脏NF-κB mRNA、TNF-α mRNA和IL-6 mRNA表达。通过单因素方差分析和独立样本t检验分析数据。结果 WT小鼠MOD组CNPY2表达较CON组升高(t=-5.730, P=0.001)，MOD+EX组CNPY2表达较MOD组降低(t=3.714, P= 0.010)；与CON组相比，WT小鼠和CNPY2 KO小鼠MOD组血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST水平均升高(WT: t=-13.325、-4.889、-10.442、-3.500、-15.122, P<0.001、<0.001、<0.001、=0.003、<0.001; CNPY2 KO: t=-6.910、-4.962、-7.457、-4.584、-7.336, P均<0.001)，肝脏TNF-α、IL-6、p-IκBα/IκBα、p-NF-κB/NF-κB、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA和IL-6 mRNA水平均升高(WT: t=-25.179、-21.043、-9.177、-12.207、-5.205、-6.910、-4.802，P<0.001、<0.001、<0.001、<0.001、=0.002、<0.001、=0.003; CNPY2 KO: t=-18.878、-21.840、-14.033、-12.511、-6.870、-9.546、-8.303, P均<0.001)，HDL-C水平均降低(WT: t=11.695, P<0.001; CNPY2 KO: t=6.598, P<0.001)，肝细胞脂肪变性，可见大量脂滴；与MOD组相比，WT小鼠和CNPY2 KO小鼠MOD+EX组上述指标均有效改善。与WT小鼠相比，CNPY2 KO小鼠上述指标基本均有效改善。结论 CNPY2调控NF-κB信号通路参与NAFLD的形成与发展。CNPY2基因缺失和有氧运动均能改善NAFLD，其机制可能与有氧运动降低肝脏CNPY2表达、抑制NF-κB信号通路、下调肝脏炎症因子表达水平、减轻肝脏炎症有关。

关键词

有氧运动 / 非酒精性脂肪肝 / CNPY2 / 炎症 / NF-κB

Abstract

收起

Objective To explore the mechanism of Canopy homolog 2 (CNPY2) and aerobic exercise through nuclear factor kappa-B (NF-κB) signal pathway in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) induced by high fat diet. Methods Male CNPY2 knockout (CNPY2 KO) mice and wild (WT) mice aged (12±1) weeks were randomly divided into control group (CON),hyperlipidemic model group (MOD), and hyperlipidemic model exercise group (MOD+EX) after one week of adaptive feeding.CON group was fed with normal diet, and MOD group and MOD+EX group were fed with high fat diet until the end of 18 weeks.From the 10^th week, the mice in the MOD+EX group received adaptive treadmill training for a week, followed by continuous exercise intervention until the end of the 18-week experiment. The serum levels of TC, TG, LDL-C, HDL-C, ALT, and AST were detected by automatic biochemical analyzer, the pathological morphology of liver was analyzed by HE staining and oil red O staining, the protein expressions of CNPY2, IκB α, p-IκBα, NF-κB, and NF-κB in liver were detected by Western Blot, thelevels of TNF-α and IL6 in liver were detected by ELISA, and the expressions of NF- κB mRNA, TNF- α mRNA, and IL-6 mRNA in liver were detected by q RT-PCR. The data were analyzed by single factor analysis of variance and independent sample t-test. Results The expression of CNPY2 in MOD group was higher than that in CON group (t=-5.730, P=0.001) while the expression of CNPY2 in MOD+EX group was lower than that in MOD group (t=3.714, P=0.010).Compared with CON group, the serum levels of TC, TG, LDL-c, ALT, and AST in MOD group of WT mice and CNPY2 KO mice were higher (WT: t=-13.325, P < 0.001; t=-4.889, P < 0.001; t=-10.442, P < 0.001; t=-3.500, P=0.003; t=-15.122, P <0.001; CNPY2 KO: t=-6.910, P < 0.001; t=-4.962, P < 0.001; t=-7.457, P < 0.001; t=-4.584, P < 0.001; t=-7.336, P <0.001).The levels of TNF-α, IL-6, p-IκBα/IκBα, p-NF-κB/NF-κB, NF-κB mRNA, TNF-α mRNA, and IL-6 mRNA in liver were increased significantly (WT: t=-25.179, P < 0.001; t=-21.043, P < 0.001; t=-9.177, P < 0.001; t=-12.207, P < 0.001; t=-5.205, P=0.002; t=-6.910, P < 0.001; t=-4.802, P=0.003; CNPY2 KO: t=-18.878, P < 0.001; t=-21.840, P < 0.001; t=-14.033, P < 0.001; t=-12.511, P < 0.001; t=-6.870, P < 0.001; t=-9.546, P < 0.001; t=-8.303, P < 0.001), HDL-C level decreased (WT: t=11.695, P < 0.001; CNPY2 KO: t=6.598, P < 0.001), and hepatocyte steatosis with large amount of lipid droplets was observed. Compared with MOD group, the above-mentioned indexes were effectively improved in WT mice and CNPY2 KO mice in MOD+EX group. Compared with WT mice, the above-mentioned indexes of CNPY2 KO mice were improved effectively. Conclusion CNPY2 regulates NF-κB signal pathway and participates in the formation and development of NAFLD. Both CNPY2 gene deletion and aerobic exercise can improve NAFLD, which may be related to the decrease of liver CNPY2 expression, inhibition of NF-κB signal pathway, down-regulation of liver inflammatory cytokines and reduction of liver inflammation.

Key words

Aerobic exercise / Non-alcoholic fatty liver / CNPY2 / Inflammation / NF-κB

引用本文

蒋昌君, 王佳倩, 李亚龙, 李军汉. 有氧运动对CNPY2调控NF-κB信号通路改善非酒精性脂肪肝的作用研究. 现代预防医学, 2024 , 51 (11) : 2100 -2107 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202310070

Chang-jun JIANG, Jia-qian WANG, Ya-long LI. Study on the effect of aerobic exercise on CNPY2 regulating NF- κB signal pathway to improve non-alcoholic fatty liver[J]. Modern Preventive Medicine, 2024 , 51 (11) : 2100 -2107 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202310070

正文

收起

非酒精性脂肪性肝(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是当今全球最为常见的肝脏疾病，约有25%的人被认为患上NAFLD^[1-2]，这种疾病的范围从肝脏单纯肝脏脂肪变性延伸至非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)，NASH是一种更为严重的NAFLD形式，伴有脂肪变性、炎症和细胞损伤，到后期随着病情的加重可能进展为肝功能衰竭、晚期肝纤维化、肝硬化或肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)^[3-4]。同时，NAFLD与多种肝外疾病有关^[5]，如肝外癌症和心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)并发症。

肝脏炎症反应是NAFLD形成与发展的关键环节，它导致了肝脏单纯脂肪变性向NASH的转变，炎症因子失衡是NAFLD病情发展过程中致肝细胞损伤的重要病理基础，典型的炎症反应是NAFLD主要病理表现之一。核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)被认为是炎症反应的主要调节因子，它能够控制触发免疫和炎症反应相关基因的转录^[6]。在静止细胞中，NF-κB被其抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)限制在细胞质中，不能发挥其调节功能^[7]。而当一些刺激如游离脂肪酸增加、脂肪变性、胰岛素抵抗等会使IκB泛素化和降解，NF-κB获释放并转运至细胞核，在核内参与激活下游基因转录，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNFα)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)等炎症因子，从而介导肝细胞炎症反应^[8]。

内质网(endoplasmic reticulum)蛋白冠层同源物2(canopy homolog 2，CNPY2)在肝脏、心脏和肺组织中高度表达^[9]，属于CNPY家族的一员。现针对CNPY2的研究较少，对其功能认识尚不完全。此前研究表明，CNPY2可能是治疗未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)相关疾病(如炎症、癌症和代谢障碍)的潜在新靶点^[10]。在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中，CNPY2表达上调导致IκBα磷酸化水平增加，最终激活NF-κB^[11]。近期一项研究显示，有氧运动通过抑制CNPY2-PERK信号通路改善NAFLD^[12]。然而，尚未见文献报道CNPY2能否通过调控NF-κB信号通路在有氧运动改善NAFLD中发挥作用。本研究旨在通过8周高脂膳食喂养建立NAFLD小鼠模型，结合8周有氧运动训练研究有氧运动对NAFLD的改善效果，并重点探讨CNPY2在其中发挥的作用。

1　材料与方法

收起

1.1　主要试剂及仪器

动物跑台(SA101，江苏SansBio公司)；凝胶成像系统(BioSpectrum，美国UVP公司)；qRT-PCR仪(Q2000A，杭州LongGene公司)；酶标仪(Multiskan SkyHigh，美国Thermo Fisher公司)；RIPA裂解液(PC101，上海Epizyme Bio公司)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(ZJ102，上海Epizyme Bio公司)、特超敏ECL(P0018AS，上海Beyotime Bio公司)、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(ST506，上海Beyotime Bio公司)；TNF-α ELISA试剂盒(RK00027，武汉ABconal公司)、IL-6 ELISA试剂盒(RK00008，武汉ABconal公司)；RNA抽提试剂盒(R1200，北京Solarbio公司)及逆转录试剂盒(FP205，北京TIANGEN公司)；抗体:Anti-CNPY2(14635-1-AP，武汉Proteintech公司)、Anti-β-actin(CL495-66009，武汉Proteintech公司)、Anti-IκBα(A11168，武汉ABconal公司)、Anti-p-IκBα(AP0614，武汉ABconal公司)、Anti-NF-κB(A19653，武汉ABconal公司)、Anti-p-NF-κB(AP0124，武汉ABconal公司)；HRP标记二抗:Goat anti-Rabbit(HA1001，杭州HuaBio公司)、Goat anti-Mouse(HA1006，杭州HuaBio公司)。

1.2　实验动物

健康雄性(12±1)周龄SPF级CNPY2基因敲除(CNPY2 KO)小鼠及同系同窝同龄野生(WT)小鼠各30只。CNPY2 KO小鼠是由江苏集萃药康生物技术有限公司[许可证编号:JSNJ(苏)2020-0003]以C57BL/6J为背景构建CNPY2杂合子小鼠，后交至成都达硕实验动物有限公司繁育，繁育总共历经10代，并进行基因鉴定，得到实验所需CNPY2 KO纯合子小鼠数量，后转移至成都体育学院实验动物中心实验室进行饲养、造模。CNPY2 KO小鼠和WT小鼠按鼠种分笼饲养，所有小鼠均用耳标和尾标标记，每笼3～4只，室内温度18～22 ℃，相对湿度45%～55%，12 h光照和12 h熄灯模拟昼夜交替，期间自由饮食和饮水，每周更换垫料2次。本动物实验方案符合《实验动物的护理和使用指南》规定，并得到成都体育学院动物伦理委员会批准(伦理编号:［2021］59号)。

1.3　实验分组与运动方案

所有小鼠在一周的适应性喂养后随机分为对照组(CON)、高脂模型组(MOD)和高脂模型运动组(MOD+EX)，每组10只。CON组喂养普通饲料，MOD组和MOD+EX组喂养高脂饲料，直至18周实验结束。

高脂膳食喂养8周后，分别从CON组和MOD组中各随机抽取WT小鼠和CNPY2 KO小鼠各2只检测，以判断造模是否成功^[13]。运动方案参照先前的文献报道^[14]。MOD+EX组小鼠先进行一周的适应性训练，期间内小鼠的初始运动方案为8 m/min，持续时间20 min，每天以0.5 m/min的速度和10min/d的时间逐渐递增至12 m/min，持续时间60 min，具体适应性训练方案见表1。适应性训练结束后，在接下来的8周内以12 m/min，持续时间60 min，每天一次，每周五天的训练方案进行正式训练。

1.4　实验样本取样

所有小鼠处死前先禁食24 h。待小鼠称量体重后腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液，眼球静脉抽血。血液在室温下静置30 min，3 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm，收集上清用于血清生化分析。从小鼠腹腔中迅速取出肝脏，称重，并用生理盐水反复清洗血液。部分肝组织置于液氮中冷冻，并在- 80 °C的冰箱中保存，用于ELISA、Western Blot和qRT-PCR检测，部分肝组织用4%多聚甲醛固定，待进行病理检测。

1.5　肝脏病理形态检测

HE染色:4%多聚甲醛固定肝组织24 h，经脱水、透明、进蜡、包埋、切片等步骤，常规HE染色，光学显微镜下观察小鼠肝脏病理形态。

油红O染色:肝组织OTC包埋切片，入油红O工作染液浸润，经60%异丙醇溶液分化，并用自来水清洗，苏木素复染，最后用甘油明胶封片，光学显微镜下观察小鼠肝细胞脂滴积聚情况，Image Pro plus 6.0图像分析系统计算脂滴光密度值。

1.6　血清生化检测

按照操作流程标准，通过全自动化分析仪检测小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)水平。

1.7　ELISA

严格按照ELISA试剂盒说明书的操作流程标准检测小鼠肝脏炎症因子TNF-α和IL-6水平。

1.8　Western Blot

称取20 mg肝组织置入研磨管中，加入200 μl的RIPA裂解液，研磨后冰上裂解5～10 min，离心并提取上清部分，BCA法检测蛋白浓度后进行10 min的蛋白变性。蛋白样品经凝胶电泳分离后湿转至PVDF膜，经5%BSA室温下封闭2 h。5%BSA稀释一抗CNPY2、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB、β-actin，并在室温下孵育1 h，放入4 ℃冰箱孵育过夜，次日取出，并用TBST洗涤3次，根据对应种属选择相应的二抗孵育1.5 h，ECL法显色曝光，采用image J软件分析灰度值，并根据“目的蛋白/β-actin”计算方法计算蛋白相对表达量。

1.9　qRT-PCR

从肝细胞中提取总RNA，根据试剂盒操作流程逆转录成cDNA，加入扩增反应体系，以GAPDH为内参进行qRT-PCR检测，结果用2^-ΔΔCT方法进行相对表达。引物设计见表2。

1.10　统计学分析

所有数据采用SPSS 21.0软件进行分析处理，结果以（

）的形式表示，采用Graph Pad Prism 8.0软件作图。WT小鼠和CNPY2 KO小鼠各自组内比较采用单因素方差分析，通过LSD-t检验进行组间差异的多重比较。WT小鼠和CNPY2 KO小鼠对应高脂喂养组(MOD，MOD+EX)间比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2　结果

收起

2.1　体重、肝湿重和肝指数变化

各组小鼠的初始体重无显著性差异(F=0.479，P=0.789)，在整个实验过程中，各组小鼠体重均逐渐增长，但高脂膳食喂养小鼠体重增长较快，CNPY2 KO小鼠较WT小鼠体重增加较缓；实验第9周，无论是WT小鼠还是CNPY2 KO小鼠，MOD组体重均显著高于CON组(WT: t=-12.932, P<0.001; CNPY2 KO: t=-5.059, P<0.001)，相较于WT小鼠，CNPY KO小鼠体重降低(t=12.53, P<0.001; t=11.46, P<0.001)；实验第18周，WT小鼠MOD+EX组体重均显著低于MOD组(t=7.653, P<0.001)，相较于WT小鼠，CNPY KO小鼠体重降低(t=14.16, P<0.001; t=10.16, P<0.001)。见图1。

小鼠肝湿重和肝指数结果显示，WT小鼠MOD组肝湿重、肝指数较CON组均显著增加(t=-13.393, P<0.001; t=-6.298, P<0.001)，MOD+EX组肝湿重、肝指数较MOD组均显著降低(t=10.342, P<0.001; t=7.975,P<0.001)；CNPY2 KO小鼠MOD组肝湿重较CON组显著增加(t=-3.295, P=0.005)，肝指数未见显著性差异(t=-1.878, P=0.080)，MOD+EX组肝湿重、肝指数较MOD组均未见显著性差异(t=1.392, P= 0.184; t=1.702, P=0.109)；相较于WT小鼠，CNPY2 KO小鼠肝湿重降低(t=9.994, P<0.001; t=4.735, P<0.001)，肝指数方面，CNPY2 KO小鼠MOD组降低(t=4.306, P=0.002)。见图1。

2.2　肝脏病理形态变化

HE染色和油红O染色结果显示，无论是WT小鼠还是CNPY2 KO小鼠，CON组小鼠肝细胞形态结构正常，肝索排列整齐，肝小叶结构清晰，几乎无脂滴分布；MOD组小鼠肝细胞肿胀，出现明显的脂肪变性和空泡化，脂滴数量较CON组小鼠增加(WT: t=-9.643, P<0.001; CNPY2 KO: t=-8.021, P<0.001)，肝索排列紊乱，并伴有炎性细胞浸润；MOD+EX组小鼠肝细胞脂肪变性和空泡化程度有所改善，脂滴数量较MOD组小鼠有所降低(WT: t=6.396, P=0.001; CNPY2 KO: t=5.646, P=0.001)。与WT小鼠相比，CNPY2 KO小鼠肝细胞形态结构改善，脂肪空泡化减少，脂滴数量有所降低(t=3.570, P=0.023; t=2.897, P=0.044)。见图2、3。

2.3　血液生化指标变化

全自动生化分析仪检测小鼠血液生化指标结果显示，无论是WT小鼠还是CNPY2 KO小鼠，MOD组相较于CON组，血清TC、TG、LDL-C、ALT和AST水平均显著升高(WT: t=-13.325、-4.889、-15.122、-10.442、-3.500, P<0.001、<0.001、<0.001、<0.001、=0.003; CNPY2 KO: t=-6.910、-4.962、-7.336、-7.457、-4.584, P均<0.001)，HDL-C水平显著降低(WT: t=11.695, P<0.001; CNPY2 KO: t=6.598, P<0.001)；无论是WT小鼠还是CNPY2 KO小鼠，MOD+EX组相较于MOD组，血清TC、TG、LDL-C、ALT和AST水平均显著降低(WT: t=-4.310、6.063、9.006、10.564、6.427, P均<0.001; CNPY2 KO: t=4.599、5.804、 4.553、7.668、9.154, P均<0.001)，HDL-C水平显著升高(WT: t=-5.163, P<0.001; CNPY2 KO: t=-3.037,P=0.008)。相较于WT小鼠，CNPY2 KO小鼠MOD组血清TC、TG、LDL-C和ALT水平均显著降低(t=7.470、4.317、10.340、6.367, P均<0.001)，HDL-C水平显著升高(t=4.703, P=0.001)，AST无显著性差异(t=0.128, P=0.901)；相较于WT小鼠，CNPY2 KO小鼠MOD+EX组血清TC、TG和LDL-C水平显著降低(t=12.070、4.266、7.160, P<0.001、=0.001、<0.001)，HDL-C水平显著升高(t=2.217, P= 0.049)，ALT和AST无显著性差异(t=0.674、0.277, P=0.514、0.786)。见图4。

2.4　肝脏炎症因子水平变化

ELISA检测小鼠肝脏相关炎性因子水平显示，无论是WT小鼠还是CNPY2 KO小鼠，MOD组TNF-α和IL-6表达水平较CON组均显著升高(WT: t=-25.179、-21.043, P均<0.001; CNPY2 KO: t=-18.878、-21.840, P均<0.001)，MOD+EX组TNF-α和IL-6表达水平较MOD组显著降低(WT: t=14.113、11.289 , P均<0.001; CNPY2 KO: t=16.683、16.805, P均<0.001)。相较于WT小鼠，CNPY2 KO小鼠TNF-α和IL-6表达水平均显著降低(t=4.778、5.838、11.950、6.673, P=0.003、=0.002、<0.001、=0.001)。见图5。

2.5　肝脏CNPY2、p-IκBα/IκBα和p-NF-κB/NF-κB

蛋白相对表达水平变化Western Blot检测肝脏相关蛋白表达水平显示，在WT小鼠内，MOD组肝脏CNPY2表达较CON组显著升高(t=-5.730, P=0.001)，MOD+EX组CNPY2表达量较CON组显著降低(t=3.714, P=0.010)；在CNPY2 KO小鼠内，各组小鼠肝脏CNPY2表达量极少，且各组间对比不具有显著性差异(t=0.838, P=0.434; t=-0.541, P=0.608)。见图6。

无论是WT小鼠还是CNPY2 KO小鼠，MOD组相较于CON组p-IκBα/IκBα和p-NF-κB/NF-κB表达量均显著升高(WT: t=-9.177、-12.207, P均<0.001;CNPY2 KO: t=-14.033、-12.511, P均<0.001)，MOD+EX组较MOD组p-IκBα/IκBα和p-NF-κB/NF-κB表达量均显著降低(WT: t=6.063、7.676, P= 0.001、<0.001;CNPY2 KO: t=10.363、5.873, P<0.001、=0.001)。与WT小鼠相比，CNPY2 KO小鼠p-IκBα/IκBα和p-NF-κB/NF-κB表达量均显著降低(t= 5.417、5.456、4.673、5.666, P=0.006、0.006、0.010、 0.005)。见图6。

2.6　肝脏NF-κB mRNA、TNF-α mRNA和IL-6 mRNA相对表达水平变化

qRT-PCR法检测肝脏相关mRNA表达水平显示，无论是WT小鼠还是CNPY2 KO小鼠，MOD组相较于CON组pNF-κB mRNA、TNF-α mRNA和IL-6 mRNA表达量均显著升高(WT:t=-5.205、-6.910、-4.802, P=0.002、<0.001、=0.003;CNPY2 KO: t=-6.870、-9.546、-8.303, P均<0.001)，MOD+EX组较MOD组NF-κB mRNA、TNF-α mRNA和IL-6 mRNA表达量均显著降低(WT: t= 5.963、3.187、3.261, P=0.001、0.019、0.017; CNPY2 KO: t=6.469、7.197、6.180, P=0.001、<0.001、=0.001)。与WT小鼠相比，CNPY2 KO小鼠上述各指标表达量均显著降低(t=3.467、3.393、3.421、4.424、3.579、3.135, P=0.026、0.028、0.027、0.012、0.023、0.035)。见图7。

3　讨论

收起

高脂膳食建立NAFLD小鼠模型是当今最为常见的一种NAFLD模型造模方式，尽管其造模时间较长，但其与人类NAFLD发病过程相似且发病率稳定^[15]。目前多项研究已经证明了运动训练在改善NAFLD方面存在有益作用，但运动如何在分子水平上影响肝脏尚不清楚。肝脏脂肪的异常堆积会导致脂质代谢问题，并产生慢性炎症，促使肝脏单纯脂肪变性向NASH转化，甚至可能导致肝细胞癌的发生和发展^[16-17]。有氧运动可有效改善高脂膳食诱导的肝脏脂质代谢紊乱^[18]，抑制趋化因子和黏附分子，减少肝脏炎性巨噬细胞浸润，减轻NAFLD^[19]。此外，有研究表明有氧运动可以通过降低炎症因子的表达来改善肝脏炎症^[20]。

CNPY2是一种新型促血管生成分泌因子，越来越多的研究指出其在健康和疾病中发挥着重要作用^[21]，尤其是CNPY2在代谢性疾病中发挥的作用逐渐得到关注。有研究通过10周高脂膳食喂养成功建立NAFLD小鼠模型，通过对比发现CNPY2基因缺失改善了NAFLD小鼠脂代谢紊乱，并延缓了NAFLD进程，指出CNPY2缺失阻断PERK-CHOP通路，对肝细胞受到UPR介导的肝细胞损伤和脂肪变性具有保护作用^[10]。另一项研究发现CNPY2在高TC倾向性的ApoE基因敲除鼠中高度表达，注射外源性CNPY2引起了机体代谢紊乱，加剧了动脉粥样硬化的发病进程^[22]，这些研究都表明CNPY2与脂代谢密切相关。本实验发现MOD组小鼠肝细胞形态异常，肝细胞肿胀，肝索排列紊乱，出现脂肪空泡，脂滴数量增加，血清TC、TG、ALT、AST和LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，相较于WT小鼠，CNPY2 KO小鼠肝细胞形态结构改善，脂滴数量减少，TC、TG、ALT和LDL-C水平降低，HDL-C水平上升，另外8周的有氧运动训练同样改善了肝细胞形态结构，减少了脂滴数量，降低了TC、TG、ALT、AST和LDL-C水平，升高了HDL-C水平，提示CNPY2缺失和有氧运动可有效改善高脂膳食诱导的NAFLD，调节肝脏脂代谢，保护肝细胞功能。

NF-κB信号通路作为经典的炎症信号通路，可通过炎症因子的转录介导肝脏炎症，而炎症因子又可再度激活NF-κB信号通路，形成慢性炎症的恶性循环^[6]。研究发现NF-κB信号通路在NAFLD小鼠^[23]肝脏中持续激活。近期一项研究表明，CNPY2的过表达显著激活了NSCLC中NF-κB信号通路^[11]，提示CNPY2与NF-κB信号通路密切相关。目前关于CNPY2与NAFLD联系的报道较少，在NAFLD中，有氧运动能够抑制CNPY2-PERK信号通路改善NAFLD^[12]，其中，CNPY2是关键启动子^[10]。在本研究中，我们发现高脂膳食诱导WT小鼠肝脏CNPY2表达增加，NF-κB信号通路上调，肝脏炎症因子TNF-α和IL-6表达水平升高，而8周的有氧运动训练降低了CNPY2表达，抑制了NF-κB信号通路，肝脏炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平降低。本实验利用基因编辑技术敲除小鼠CNPY2基因，以进一步研究CNPY2的功能。最后，研究结果显示NF-κB信号通路表达水平下调，肝脏中炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平显著降低，肝细胞形态结构改善，脂滴数量减少，表明CNPY2缺失改善了肝脏炎症，有效减缓了NAFLD的发病进程。

综上所述，CNPY2通过调控信号通路参与NAFLD的形成与发展。有氧运动和CNPY2缺失均对改善NAFLD存在有益作用，其机制可能为CNPY2表达下调，抑制NF-κB信号通路，从而减少炎症因子的转录，减轻肝脏炎症，最终改善NAFLD。

基金

收起

国家自然科学基金青年基金项目(31900846)
四川省自然科学基金项目(2024NSFSC0644)
运动医学四川省重点实验室暨国家体育总局重点实验室(2023-A007)
成都体育学院运动医学与研究所/郑怀贤骨伤研究所项目(CX21B04)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Younossi

, Tacke

, Arrese

, et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis[J]. Hepatology, 2019, 69(6): 2672-2682.

[2]

Zhou

, Zhou

, Wang

, et al. Epidemiological features of NAFLD from 1999 to 2018 in China[J]. Hepatology, 2020, 71(5):1851-1864.

[3]

Powell

, Wong

VWS

, Rinella

. Non-alcoholic fatty liver disease[J]. Lancet, 2021, 397(10290): 2212-2224.

[4]

Huang

, El-Serag

, Loomba

. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: trends, predictions, risk factors and prevention[J]. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2021,18(4): 223-238.

[5]

, Wang

, Zhang

, et al. NAFLD: an emerging causal factor for cardiovascular disease[J]. Physiology (Bethesda, Md.),2023, 38(6): 921-937.

[6]

Capece

, Verzella

, Flati

, et al. NF-κB: blending metabolism,immunity, and inflammation[J]. Trends in Immunology, 2022, 43(9):757-775.

[7]

Priester

, Dreute

, Kracht

, et al. Post-Transcriptional control of mRNA metabolism and protein secretion: the third level of regulation within the NF-κB system[J]. Biomedicines, 2022, 10(9): 2108.

[8]

Karin

, Ben-Neriah

. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity[J]. Annual Review of Immunology,2000, 18: 621-663.

[9]

Hatta

, Guo

, Ludke

, et al. Expression of CNPY2 in mouse tissues: quantification and localization[J]. PLOS One, 2014, 9(11):e111370.

[10]

Hong

, Liu

, Wu

, et al. CNPY2 is a key initiator of the PERK-CHOP pathway of the unfolded protein response[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2017, 24(10): 834-839.

[11]

, Qin

, Jun-Qiang

, et al. CNPY2 enhances resistance to apoptosis induced by cisplatin via activation of NF-κB pathway in human non-small cell lung cancer[J]. Biomedecine &Pharmacotherapie, 2018, 103: 1658-1663.

[12]

, Huang

, Xiong

, et al. Aerobic exercise improves non-alcoholic fatty liver disease by down-regulating the protein expression of the CNPY2-PERK pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2022, 603: 35-40.

[13]

Guo

, Wu

, et al. Effect of lycium barbarum polysaccharide and aerobic exercise on rats with non-alcoholic fatty liver disease and its mechanism[J]. Journal of Shanghai Jiaotong University(Medical Science), 2020, 40(1): 30-36.

[14]

Marques

CMM

, Motta

, Torres

, et al. Beneficial effects of exercise training (treadmill) on insulin resistance and nonalcoholic fatty liver disease in high-fat fed C57BL/6 mice[J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2010, 43(5): 467-475.

[15]

Gallage

, Avila

JEB

, Ramadori

, et al. A researcher's guide to preclinical mouse NASH models[J]. Nat Metab, 2022, 4(12): 1632-1649.

[16]

Fourman

, Stanley

, Zheng

, et al. Clinical predictors of liver fibrosis presence and progression in human immunodeficiency Virus-Associated nonalcoholic fatty liver disease[J]. Clinical Infectious Diseases, 2021, 72(12): 2087-2094.

[17]

Filali-Mouncef

, Hunter

, Roccio

, et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease[J]. Autophagy, 2022, 18(1): 50-72.

[18]

, Dun

, Zhang

, et al. Exercise improves lipid droplet metabolism disorder through activation of AMPK-mediated lipophagy in NAFLD[J]. Life Sciences, 2021, 273: 119314.

[19]

Callegari

, Rocha

, Oliveira

APE

, et al. And disease treatment: the role of macrophages[J]. Frontiers in Physiology, 2023,14: 1061353.

[20]

Simões e silva

, Santos de Sousa Fernandes

, Kubrusly

, et al. Effects of aerobic exercise protocol on genes related to insulin resistance and inflammation in the pancreas of ob/ob mice with NAFLD[J]. Clinical and Experimental Gastroenterology, 2020, 13:223-234.

[21]

Chen

, Zhang

, Wang

, et al.Progress in research on CNPY2 in diseases[J]. Mini - Reviews in Medicinal Chemistry, 2024,24(4): 391-402.

[22]

Huang

, Tang

, Li

, et al. The role of CNPY2 in endothelial injury and inflammation during the progress of atherosclerosis[J]. Journal of Molecular Histology, 2023, 54(3): 195-205.

[23]

Ding

, Xu

, Meng

, et al. Myeloid-derived growth factor alleviates non-alcoholic fatty liver disease alleviates in a manner involving IKKβ/NF-κB signaling[J]. Cell Death & Disease, 2023, 14(6): 376.

2024年第51卷第11期

PDF下载

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202310070

接收时间：2023-10-06
首发时间：2026-03-18
出版时间：2024-06-10

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2023-10-06

基金

国家自然科学基金青年基金项目(31900846)

四川省自然科学基金项目(2024NSFSC0644)

运动医学四川省重点实验室暨国家体育总局重点实验室(2023-A007)

成都体育学院运动医学与研究所/郑怀贤骨伤研究所项目(CX21B04)

作者信息

^1.西南石油大学体育学院，四川成都 610000

^2.成都体育学院运动医学与健康学院，四川成都 610041

通讯作者:

李军汉，E-mail:junhanli@cdsu.edu.cn

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/xdyfyx/CN/10.20043/j.cnki.MPM.202310070

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT