现代预防医学

引物名称	引物序列
wnt3a
正向引物序列	5’-TGACACGCTCATGTGCAGAA-3’
反向引物序列	5’-ACACCATCCCACCAAACTCG-3’
β-catenin
正向引物序列	5’-CATCTACACAGTTTGATGCTGCT-3’
反向引物序列	5’-GCAGTTTGTCAGTTCAGGGA-3’
GAPDH
正向引物序列	5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’
反向引物序列	5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

引物名称	引物序列
wnt3a
正向引物序列	5’-TGACACGCTCATGTGCAGAA-3’
反向引物序列	5’-ACACCATCCCACCAAACTCG-3’
β-catenin
正向引物序列	5’-CATCTACACAGTTTGATGCTGCT-3’
反向引物序列	5’-GCAGTTTGTCAGTTCAGGGA-3’
GAPDH
正向引物序列	5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’
反向引物序列	5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

原花青素下调wnt/β-catenin通路拮抗砷诱导的人肝细胞L-02增殖

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任庆新 ¹ , 张卫兵 ¹ , 黄建萍 ¹ , 安娜 ¹ , 柴婧 ²

现代预防医学 | 实验技术及其应用 2024,51(8): 1486-1492

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现代预防医学 | 实验技术及其应用 2024, 51(8): 1486-1492

原花青素下调wnt/β-catenin通路拮抗砷诱导的人肝细胞L-02增殖

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任庆新¹, 张卫兵¹, 黄建萍¹, 安娜¹, 柴婧²

作者信息

^1.南通市疾病预防控制中心，江苏南通 226007

^2.乌鲁木齐市疾病预防控制中心

任庆新（1994—），男，硕士，医师，研究方向：天然产物与健康

通讯作者:

柴婧，E-mail：943610839@qq.com

Effects of proanthocyanidins down-regulating wnt/β-catenin signaling pathway to antagonize arsenic-induced proliferation of human hepatocyte L-02

Qing-xin REN¹, Wei-bing ZHANG¹, Jian-ping HUANG¹, Na AN¹, Jing CHAI²

Affiliations

Nantong Center for Disease Control and Prevention, Nantong, Jiangsu 226007, China

出版时间: 2024-04-25 doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202311249

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摘要

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目的

本次研究使用原花青素（Proanthocyanidins, PC）和亚砷酸钠（Sodium arsenite, NaAsO₂）对人肝细胞L-02进行干预，探究砷致细胞增殖的效应，PC对砷作用的拮抗以及与wnt/β-catenin信号通路的关系。

方法

以不同剂量的PC单独或与NaAsO₂联合干预细胞，利用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）法检测细胞增殖活力，使用细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力，使用实时聚合酶链反应（Real-time Polymerase Chain Reaction, Real-time PCR）法和免疫印迹（Western Blotting, WB）法检测相关因子的信使RNA（message RNA, mRNA）和蛋白表达水平。

结果

NaAsO₂致细胞增殖活性（1.740±0.105）升高，迁移（556.000±3.606）、侵袭（439.667±8.622）能力增强，上调原癌基因c-myc（0.739±0.012）、细胞周期蛋白D1（cyclinD1）（0.943 ± 0.002）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）（1.020±0.019）、凋亡抑制基因survivin（0.571±0.033）和基质金属蛋白酶-7（Matrix metalloproteinase-7, MMP-7）（0.695±0.059）的蛋白表达水平，上调wnt3a和β-连环蛋白（β-catenin）的蛋白（分别为1.044±0.010, 0.958±0.037）和mRNA（分别为1.789±0.165, 1.596±0.217）水平。当PC与NaAsO₂联合处理后，相较于NaAsO₂单独干预，c-myc（0.438±0.046）等增殖相关蛋白及信号通路核心分子wnt3a（0.822±0.015）、β-catenin（0.832±0.064）表达水平下降，通路抑制因子糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）（0.885±0.058）和轴蛋白（Axin）（0.749±0.016）表达升高。

结论

NaAsO₂诱导L-02细胞增殖，这可能是由其激活了wnt/β-catenin信号通路导致的；PC可以下调wnt/β-catenin通路，进而拮抗NaAsO₂所致的细胞增殖。

关键词

砷 / 原花青素 / 增殖 / wnt/β-catenin信号通路

Abstract

收起

Objective

To explore the effect of arsenic on cell proliferation, the antagonism of PC against arsenic and the relationship associated to wnt/β-catenin signaling pathway by using Proanthocyanidins (PC) and sodium arsenite (NaAsO₂) to intervene human hepatocyte L-02.

Methods

We treated cells with different doses of PC alone or in combination with NaAsO₂. The cell activities were detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) method. Cell scratch experiment and Transwell experiment were used to detect the ability of cell migration and invasion. Real-time Polymerase Chain Reaction (Real-time PCR) method and western blotting (WB) method were used to detect the expression levels of message RNA (mRNA) and protein.

Results

NaAsO₂ increased the activity of cell proliferation (1.740±0.105), enhanced the ability of migration (556.000±3.606) and invasion (439.667±8.622). NaAsO₂ up-regulated the protein expression of proto-oncogene c-myc (0.739±0.012), cyclinD1 (0.943±0.002), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) (1.020±0.019), apoptosis inhibitor gene survivin (0.571±0.033)and Matrix Metalloproteinase-7 (MMP-7) (0.695±0.059). NaAsO₂could also up-regulate the protein and mRNA levels of pathway core moleculars wnt3a (protein: 1.044±0.010, mRNA: 1.789±0.165) and β-catenin (protein: 0.958±0.037, mRNA: 1.596±0.217). Compared with NaAsO₂ group, when PC intervention was introduced, the levels of proliferation related proteins such as c-myc (0.438±0.046) decreased. The levels of mRNA and protein of wnt3a (mRNA: 1.181±0.018, protein: 0.822±0.015) and β-catenin (mRNA: 0.965±0.078, protein: 0.832±0.064) decreased. The expression of pathway inhibitors Glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) (0.885±0.058) and Axin (0.749±0.016) increased.

Conclusion

NaAsO₂ induce L-02 cell proliferation, which may be due to its activation of wnt/β-catenin signaling pathway. PC can down-regulate wnt/β-catenin pathway, thereby antagonizing the cell proliferation induced by NaAsO₂.

Key words

Arsenic / Proanthocyanidins / Proliferation / Wnt/β-catenin signaling pathway

引用本文

任庆新, 张卫兵, 黄建萍, 安娜, 柴婧. 原花青素下调wnt/β-catenin通路拮抗砷诱导的人肝细胞L-02增殖. 现代预防医学, 2024 , 51 (8) : 1486 -1492 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202311249

Qing-xin REN, Wei-bing ZHANG, Jian-ping HUANG, Na AN, Jing CHAI. Effects of proanthocyanidins down-regulating wnt/β-catenin signaling pathway to antagonize arsenic-induced proliferation of human hepatocyte L-02[J]. Modern Preventive Medicine, 2024 , 51 (8) : 1486 -1492 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202311249

正文

收起

砷（Arsenic, As）具有毒性和致癌等作用^[1-4]。肝脏是机体中毒、致癌的重要靶器官。砷可致肝细胞增殖^[5-6]，c-myc是一种原癌基因^[7]，细胞周期蛋白D1(cyclinD1)是细胞周期的正向调控蛋白^[8-9]，研究发现亚砷酸钠（Sodium arsenite, NaAsO₂）上调c-myc和cyclinD1，致大鼠肝上皮细胞TRL1215增殖^[10]。

wnt/β-catenin信号通路与细胞增殖联系紧密^[11-12]，β-连环蛋白（β-catenin）的水平受其与轴蛋白（Axin）/糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）/结肠癌抑制因子（Adenomatous polyposis coli, APC）/酪蛋白激酶1α（Casein kinase 1α, CK1α）组成的复合体控制。细胞在正常状态下，复合体磷酸化降解β-catenin。当wnt信号存在时，细胞会分泌wnt蛋白（包括wnt1, wnt3a, wnt7a等），wnt蛋白与细胞膜上卷曲蛋白（Frizzled）家族的七次跨膜受体结合，将wnt信号传入细胞，致复合体解体。因此，β-catenin不能被降解，进而进入细胞核，结合胸腺粗提因子/白细胞移动增强因子（Thymus crude factor/Leukokinsis-enhancing factor, TCF/LEF），上调c-myc、cyclinD1^[12-13]，肿瘤生物标记物基质金属蛋白酶-7（Matrix metalloproteinase-7, MMP-7）^[14]、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）^[15]及凋亡抑制基因survivin^[16]等，导致细胞增殖。

原花青素（Proanthocyanidins, PC）是一种天然多酚化合物^[17]，可抑制人食管癌ECA109细胞增殖^[18]。Vaid^[19]报道，PC可以促使β-catenin降解，抑制黑色素瘤细胞生长。而PC能否通过调控wnt/β-catenin通路，拮抗砷致肝细胞增殖未见报道。本研究以NaAsO₂和PC干预人肝细胞L-02，观察wnt/β-catenin通路及增殖相关指标的变化，为PC的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

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1.1 实验对象

人肝细胞（L-02细胞）购自和元生物技术（上海）有限公司，由人正常肝组织原代提取。

1.2 试剂耗材

NaAsO₂（上海化学试剂公司, 分析纯），PC（标准品，购自天津尖峰天然产物研究开发有限公司）性状：红棕色粉末，气微、味涩，溶于水和大多有机溶剂；纯度：本研究所使用的PC为纯化的小分子二聚体，纯度大于98%；成分：PC是以黄烷-3-醇为结构单元通过C—C键聚合而形成的化合物。Dickkopf相关蛋白1重组蛋白（武汉优尔生科技股份有限公司），CCK-8试剂（上海尚宝生物科技有限公司），wnt3a、VEGF、c-myc、cyclinD1抗体（英国Abcam公司），Axin、APC、survivin、MMP-7抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），β-catenin、GSK-3β抗体（美国CST公司），wnt3a、β-catenin、GAPDH引物（生物工程（上海）有限公司），Transwell小室（美国Corning生物科技有限公司）。

1.3 仪器

酶标仪（680，美国Bio-Rad公司），倒置相差显微镜（AE31，麦克奥迪集团），超微量核酸分析仪（A280，上海金鹏分析仪器有限公司），实时荧光定量PCR仪（QuantStudio 6，美国应用生物系统公司），逆转录仪（ABI 9700，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）。

1.4 细胞培养及分组

以不同剂量NaAsO₂干预细胞12 h, 24 h, 48 h，筛选出最易促进细胞增殖的NaAsO₂剂量和时间。施加0 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 75 mg/L的PC干预，以确定PC发挥作用的最适剂量。将细胞随机分为4组：空白对照组、NaAsO₂组、PC组、PC+NaAsO₂组，测定细胞的迁移、侵袭能力，各相关指标水平。引入通路抑制剂Dickkopfs家族成员-1（Dickkopf-1, DKK-1）干预，将细胞分为DKK-1组、PC+DKK-1组、NaAsO₂+DKK-1组、NaAsO₂+DKK-1+PC组，验证PC作用。

1.5 细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）法检测细胞增殖活力

取对数生长期的细胞接种于96孔培养板内，加入100 μl干预试剂，培养至规定时间后，用200 μl移液管吸去各孔培养液，各孔加入10 μlCCK-8试剂和90 μl完全培养基，置于37℃，5%CO₂培养箱中约2 h。之后用酶标仪测定490 nm波长处的OD值。计算公式为“细胞增殖活力%=（加药细胞OD-空白OD）÷（对照细胞OD-空白OD）×100%”。每组试验重复3次。

1.6 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

准备6孔板，使用马克笔在每孔底部画3条平行横线，距离均等。取细胞接种于板内，每孔掌握为1 ml，含1~4×10⁵个细胞，待细胞铺满培养板孔底部后，使用200 μl移液器吸头，在长满细胞的孔内垂直于板孔底平面和马克笔所画线划3条线，线间距离相等，以划痕与马克笔线交叉处为观察点。吸去原培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline, PBS）清洗各孔，再干预细胞。培养到规定时间后，通过显微镜观察细胞迁移的状况及形态，拍照并测量痕宽。每组试验重复3次。

1.7 Transwell法检测细胞迁移、侵袭能力

上室加入200 μl含NaAsO₂或PC的培养基与细胞的混悬液，下室加入600 μl无血清培养基，培养至规定时间。将上下室培养液吸出，再用PBS各冲洗2遍。在下室加入4%多聚甲醛600 μl，将上室放入下室中20 min。接着将上室底膜晾干，在下室加入0.1%结晶紫染液，染液的体积与多聚甲醛相同，将上室再次放入下室中20 min，将细胞染成紫色，用PBS将上室的底膜洗2遍，用棉球将小室底部固定不紧密的细胞轻轻擦掉。在显微镜下拍照、计数。侵袭实验中，在上室底部聚碳酸酯膜上铺一层基质胶，以模仿细胞外基质，其余操作同迁移实验。每组试验重复3次。

1.8 信号通路抑制剂DKK-1的使用

DKK-1是wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，其可以与wnt蛋白竞争性结合细胞膜上的低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（Low Density Lipoprotein Receptor Related Protein 5/6, LRP5/6），阻止wnt-Frizzled复合体形成，进而阻止wnt信号传入细胞，最终抑制wnt/β-catenin信号通路^[20]。先将DKK-1用缓冲液和完全培养基配制成20 ng/ml的浓度^[21]。在6孔板培养细胞，待密度>90%后，用PBS清洗，每孔加入2.5 ml的含DKK-1培养基，培养4~6 h后，将含有DKK-1的培养液吸除，再用PBS清洗，加入新的完全培养基。

1.9 免疫印迹（Western Blotting, WB）法测定蛋白水平

在提取出来的蛋白上清液中加入上样缓冲液，贴封口膜沸水浴10 min，将其冷却至室温，置于-20 ℃冰箱保存。制备分离胶和浓缩胶，将制好的胶固定在电泳盒里，在上样孔依次加入10 μl各剂量组融化后的蛋白样品，开始电泳。在电泳结束后取出凝胶，按照湿转法进行电转，根据所测蛋白分子量选择电转条件。电转结束后，使用脱脂奶粉配置封闭液，封闭2 h。再孵育一抗16~18 h，二抗2 h，回收二抗，进行曝光。每组试验重复3次。

1.10 实时聚合酶链反应（Real-time Polymerase Chain Reaction, Real-time PCR）法测定mRNA水平

以mRNA为模板，应用逆转录酶、T重复寡核苷酸（Oligo(dT)），逆转录成互补DNA（complementary DNA, cDNA），再以cDNA为模板进行扩增，最后计算得出mRNA水平。取细胞提取mRNA，将其逆转录得到cDNA。取cDNA加入引物、绿色荧光染料混合液（Green Master Mix）、荧光定量PCR参比染料（ROX Reference Dye）、焦碳酸二乙酯（Diethyl Pyrocarbonate, DEPC）水，轻轻混匀，上PCR机进行检测，得到循环阈值（Cycle threshold, Ct）。使用2^-ΔΔCt法进行计算，得出mRNA的相对表达量。每组试验重复3次。

1.11 统计分析

以Excel 2010软件录入实验数据，应用SPSS 21.0软件进行统计分析。各指标首先以

进行描述，再采用方差分析法进行多组比较，组间的多重比较使用Bonferroni法，所有检验均采用双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果

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2.1 NaAsO₂和PC对L-02细胞增殖活力的影响

如图1A所示，在12 h干预下，各剂量组与空白对照组之间差异无统计学意义（F=0.968, P=0.497）；在24 h干预下，以2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 μM的NaAsO₂处理后，细胞活性相较于空白对照组增高（P均<0.05）；在48 h干预下，以2.5 μM的NaAsO₂处理后，细胞活性相较于空白对照组升高（t=7.466, P=0.002）。此外，1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 μM的NaAsO₂干预24 h后的细胞增殖活力高于在这些剂量下干预12 h后的细胞（P均<0.05）；2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 μM的NaAsO₂干预24 h后的细胞增殖活力高于在这些剂量下干预48 h后的细胞（P均<0.05）。因此，本研究选择2.5 μM和24 h为NaAsO₂干预的剂量和时间。

如图1B所示，与对照组相比，2.5 μM NaAsO₂干预24 h后，细胞活力提升（1.470 ± 0.105）（t=7.768, P=0.001）。与NaAsO₂组相比，当其与50 mg/L（0.983 ± 0.101）和75 mg/L（0.808 ± 0.062）的PC联合干预24 h时，细胞活力下降（t=5.795, P=0.004; t=9.396, P=0.001）。与空白对照组和25 mg/L的PC单独处理组（1.039 ± 0.052）相比，75 mg/L的PC干预24 h后，细胞活力下降（0.603 ± 0.089）（t=7.738, P=0.002; t=7.344, P=0.002）。故选择50 mg/L作为PC的剂量。

2.2 PC抑制NaAsO₂引起的肝L-02细胞迁移、侵袭能力提升

如图2A、图2B所示，与划痕0时刻的痕道宽度相比，24 h后四个干预组的痕道宽度均缩窄，相较于空白对照组（259.997 ± 7.644），NaAsO₂组（123.890 ± 5.565）的痕道宽度减小（t=29.931, P<0.001），而NaAsO₂ + PC组（316.313 ± 5.945）的痕道宽于NaAsO₂组（t=40.926, P<0.001）。从镜下看出NaAsO₂组细胞有排列紊乱、成层生长的趋势，PC抑制此趋势。

如图2C、图2D所示，相较于空白对照组，NaAsO₂组的迁移（556.000 ± 3.606）、侵袭（439.667 ± 8.622）能力提高（t_迁移=-74.300, P<0.001; t_侵袭=-25.146, P<0.001）；与NaAsO₂组相比，PC+NaAsO₂组的迁移（322.000 ± 6.245）、侵袭（315.333 ± 9.074）、能力下降（t_迁移=56.205, P<0.001; t_侵袭=17.205, P<0.001）。

2.3 PC和NaAsO₂对细胞增殖指标蛋白表达的影响

如图3所示，相较于空白对照组，NaAsO₂组c-myc（0.739 ± 0.012）、cyclinD1（0.943 ± 0.002）、VEGF（1.020 ± 0.019）、MMP-7（0.695 ± 0.059）、survivin（0.571 ± 0.033）升高（P均<0.05）。PC组c-myc（0.257 ± 0.007）、cyclinD1（0.291 ± 0.013）、MMP-7（0.240 ± 0.001）降低（P均<0.05）。相较于NaAsO₂组，PC + NaAsO₂组c-myc（0.438 ± 0.046）、cyclinD1（0.530 ± 0.009）、VEGF（0.683 ± 0.022）、MMP-7（0.548 ± 0.015）、survivin（0.484 ± 0.009）水平下降（P均<0.05）。以上结果阐明PC具有拮抗NaAsO₂促增殖的作用。

2.4 PC和NaAsO₂对wnt/β-catenin信号通路各蛋白水平的影响

如图4所示，与空白对照组相比，NaAsO₂组的wnt3a（1.044±0.010）、β-catenin（0.958±0.037）水平升高，GSK-3β（0.630±0.004）、Axin（0.430±0.037）、APC（0.801±0.030）下降（P均<0.05）；PC组wnt3a（0.666±0.031）、β-catenin（0.682±0.009）、APC（0.801±0.018）下降，GSK-3β（1.114±0.039）、Axin（0.845±0.012）上升（P均<0.05）。与NaAsO₂组相比，PC+NaAsO₂组wnt3a（0.822±0.015）、β-catenin（0.832±0.064）降低，GSK-3β（0.885±0.058）、Axin（0.749±0.016）水平升高（P均<0.05）。以上结果表明NaAsO₂上调wnt/β-catenin通路，PC对NaAsO₂具有抑制作用。

2.5 PC通过wnt/β-catenin信号通路对NaAsO₂致增殖效应的拮抗作用

首先需要确定抑制剂的有效性。如图5所示，与NaAsO₂组相比，NaAsO₂ + DKK-1组的wnt3a（0.825 ± 0.024）、β-catenin（0.633 ± 0.002）下降（t_wnt3a=5.430, P=0.006; t_β-catenin=7.730, P=0.002），故抑制方式有效。

如图6所示，在不施加NaAsO₂时，相较于DKK-1组，PC + DKK-1干预后c-myc（0.310±0.003）、cyclinD1（0.297±0.006）、VEGF（0.260±0.011）、MMP-7（0.406±0.022）、survivin（0.239±0.024）水平下降（P均<0.05）。当施加NaAsO₂时，相较于DKK1 + NaAsO₂组，DKK1 + NaAsO₂ + PC联合干预组的c-myc（0.358±0.000）、cyclinD1（0.370±0.002）、VEGF（0.432±0.006）、MMP-7（0.487±0.008）、survivin（0.212±0.002）下降（P均<0.05）。本结果表明PC与DKK-1具有协同作用。

将PC的作用与抑制剂进行比较，如图7所示，与NaAsO₂组相比，NaAsO₂ + DKK-1组的wnt3a（0.766±0.021）、β-catenin（0.593±0.012）表达减少（t_wnt3a=12.062, P<0.001; t_β-catenin=14.910, P<0.001），NaAsO₂ + PC组的wnt3a（0.759±0.022）、β-catenin（0.561±0.012）水平降低（t_wnt3a=12.188, P<0.001; t_β-catenin=16.456, P<0.001）。这验证了PC下调wnt/β-catenin信号通路，拮抗细胞增殖。

2.6 PC和NaAsO₂对wnt3a、β-catenin的mRNA表达的影响

如图8所示，与空白对照组相比，NaAsO₂组wnt3a（1.789±0.165）、β-catenin（1.596±0.217）的mRNA水平升高（t_wnt3a=-8.290, P=0.001, t_β-catenin=-4.752, P=0.009），PC组wnt3a（0.741±0.046）、β-catenin（0.657±0.052）的mRNA降低（t_wnt3a=9.801, P=0.001; t_β-catenin=11.542, P<0.001）。相较于NaAsO₂组，NaAsO₂ + PC组wnt3a（1.181±0.018）、β-catenin（0.965±0.078）的mRNA表达降低（t_wnt3a=6.352, P=0.003; t_β-catenin=4.738, P=0.009）。

3 讨论

收起

砷具有致增殖效应^[22]，wnt/β-catenin信号通路与增殖联系紧密^[23]。PC是一种天然多酚化合物，可拮抗氧化损伤^[24]，也有抑制细胞增殖的作用^[25]。本研究发现，NaAsO₂使细胞增殖活性升高，上调wnt/β-catenin通路；当PC与NaAsO₂联合处理后，相较于NaAsO₂组，增殖蛋白水平下降，通路负性因子GSK-3β和Axin表达升高。这说明上调wnt/β-catenin通路是砷促使细胞增殖的途径之一，而PC可以抑制该通路，拮抗砷的促增殖作用。

Patterson^[26]的研究发现，以2.0 μM的NaAsO₂处理自然永生化人表皮细胞11 d后，细胞的集落形成能力增强；当wnt/β-catenin信号通路激活后，即可上调致增殖的分子^[27]。在Zeng等人^[28]的研究中，以0.1 μM的NaAsO₂干预人成骨hFOB 1.19细胞24 h后，发现β-catenin表达升高，与本研究结果一致。PC具有一定的抗增殖功效^{[18，25，29-31]}，Prasad^[32]的研究表明，PC可以抑制细胞周期蛋白依赖激酶（Cyclin-dependent kinases, Cdk）活性，进而抑制cyclinD1表达，诱导细胞周期变慢，增殖活力降低。Vaid等人^[33]指出，β-catenin是PC的特异性分子靶点之一，可直接受PC调控，进一步抑制增殖蛋白表达，这与本研究发现的PC下调β-catenin蛋白和mRNA水平的现象相一致。本研究也发现，对于β-catenin上游的wnt3a分子，PC起到下调作用，这就使通路的起始信号减少，阻碍wnt蛋白激活散乱蛋白（Dishevelled, Dsh），进而更少地触发细胞内信号转导。由此可见，PC能够在wnt/β-catenin通路中的不同环节产生抑制效应。当PC与通路抑制剂联合使用时，比单纯使用抑制剂更抑制增殖蛋白表达，这验证了PC下调wnt/β-catenin通路产生抑增殖的效应。

PC是一种强效抗氧化剂，清除细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）^[34]，ROS水平增高是砷的致癌效应中重要的途径^[35-36]。Haack等人^[37]指出，内源性ROS提高Dsh蛋白表达，激活wnt/β-catenin通路，故降低ROS水平不仅是PC缓解氧化损伤的机制，也可能是PC抑制wnt/β-catenin通路的途径。对于PC样品，在动物实验或实际临床方面已有应用，目前关于其应用更多围绕抗氧化特性展开：PC通过核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）通路拮抗砷致小鼠肝脏氧化损伤^[38]，也使受试者的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）水平升高，达到抗氧化的作用^[39]，然而，PC在抑制增殖、抗癌方面的临床应用暂未见报道。本研究发现NaAsO₂诱导L-02细胞增殖，这可能是由其激活wnt/β-catenin通路导致的；PC下调通路，进而拮抗NaAsO₂所致的细胞增殖。因此，本研究提供了PC应用的新思路，在后续研究中，我们将继续深入探索PC抗增殖的机制，为PC的功效提供理论依据。

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2024年第51卷第8期

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doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202311249

接收时间：2023-11-13
首发时间：2026-03-16
出版时间：2024-04-25

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收稿日期：2023-11-13

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^1.南通市疾病预防控制中心，江苏南通 226007

^2.乌鲁木齐市疾病预防控制中心

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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