现代预防医学

名称	序列（5'-3'）	引物长度（bp）	Tm	产物长度（bp)
BRCA1 F	TCTCGTTACTGGAAGTTAGCAC	22	54.4	184
BRCA1 R	CTTGTTTCCCGACTGTGGTT	20	57.3
β-actin F	CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG	25	62	156
β-actin R	CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT	24	64.4

名称	序列（5'-3'）	引物长度（bp）	Tm	产物长度（bp)
BRCA1 F	TCTCGTTACTGGAAGTTAGCAC	22	54.4	184
BRCA1 R	CTTGTTTCCCGACTGTGGTT	20	57.3
β-actin F	CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG	25	62	156
β-actin R	CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT	24	64.4

组别	mRNA相对表达水平	BRCA1蛋白相对表达水平
Control组	1.00 ± 0.11	1.00 ± 0.04
shRNA-NC组	1.11± 0.16	1.14 ± 0.08
shRNA-BRCA1组	0.20 ± 0.03^ab	0.29 ± 0.05^ab
F值	57.521	178.036
P 值	< 0.001	< 0.001

组别	mRNA相对表达水平	BRCA1蛋白相对表达水平
Control组	1.00 ± 0.11	1.00 ± 0.04
shRNA-NC组	1.11± 0.16	1.14 ± 0.08
shRNA-BRCA1组	0.20 ± 0.03^ab	0.29 ± 0.05^ab
F值	57.521	178.036
P 值	< 0.001	< 0.001

组别	γ-H2AX阳性率（%）	细胞周期分布（%）	凋亡率（%）
Normal组	1.02±0.77	56.00±0.89	21.69±0.41	22.31±0.62	8.09±1.09
Control组	11.01±1.21^a	59.42±0.97^a	15.85±0.58^a	24.73±0.77^a	37.99±1.25^a
shRNA-NC组	10.08±1.12^a	59.95±0.90^a	16.38±0.65^a	23.67±0.68	38.52±1.30^a
shRNA-BRCA1组	26.94±2.93^abc	65.31±1.13^abc	8.59±0.45^abc	26.10±0.41^ac	52.84±1.21^abc
F值	117.063	46.511	307.732	19.266	361.429
P 值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

组别	γ-H2AX阳性率（%）	细胞周期分布（%）	凋亡率（%）
Normal组	1.02±0.77	56.00±0.89	21.69±0.41	22.31±0.62	8.09±1.09
Control组	11.01±1.21^a	59.42±0.97^a	15.85±0.58^a	24.73±0.77^a	37.99±1.25^a
shRNA-NC组	10.08±1.12^a	59.95±0.90^a	16.38±0.65^a	23.67±0.68	38.52±1.30^a
shRNA-BRCA1组	26.94±2.93^abc	65.31±1.13^abc	8.59±0.45^abc	26.10±0.41^ac	52.84±1.21^abc
F值	117.063	46.511	307.732	19.266	361.429
P 值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

组别	BRCA1蛋白相对表达水平	Rad51蛋白相对表达水平	53BP1蛋白相对表达水平	CHK1蛋白相对表达水平	DNA-PKcs蛋白相对表达水平	ATM蛋白相对表达水平	ATR蛋白相对表达水平
Normal组	1.00±0.06	1.00±0.20	1.00±0.38	1.00±0.32	1.00±0.51	1.00±0.24	1.00±0.31
Control组	0.32±0.04^a	1.97±0.21^a	6.59±0.45^a	1.88±0.29	2.49±0.66	4.13±0.27^a	3.27±0.66^a
shRNA-NC组	0.31±0.07^a	2.08±0.23^a	6.76±0.43^a	1.83±0.34	2.48±0.64	4.50±0.30^a	2.78±0.68^a
shRNA-BRCA1组	0.09±0.05^abc	0.52±0.10^abc	9.73±0.87^abc	2.35±0.46^a	3.85±0.93^a	6.10±0.48^abc	6.25±0.92^abc
F值	148.256	46.842	123.651	7.358	8.253	121.174	30.994
P值	<0.001	<0.001	<0.001	0.011	0.008	<0.001	<0.001

组别	BRCA1蛋白相对表达水平	Rad51蛋白相对表达水平	53BP1蛋白相对表达水平	CHK1蛋白相对表达水平	DNA-PKcs蛋白相对表达水平	ATM蛋白相对表达水平	ATR蛋白相对表达水平
Normal组	1.00±0.06	1.00±0.20	1.00±0.38	1.00±0.32	1.00±0.51	1.00±0.24	1.00±0.31
Control组	0.32±0.04^a	1.97±0.21^a	6.59±0.45^a	1.88±0.29	2.49±0.66	4.13±0.27^a	3.27±0.66^a
shRNA-NC组	0.31±0.07^a	2.08±0.23^a	6.76±0.43^a	1.83±0.34	2.48±0.64	4.50±0.30^a	2.78±0.68^a
shRNA-BRCA1组	0.09±0.05^abc	0.52±0.10^abc	9.73±0.87^abc	2.35±0.46^a	3.85±0.93^a	6.10±0.48^abc	6.25±0.92^abc
F值	148.256	46.842	123.651	7.358	8.253	121.174	30.994
P值	<0.001	<0.001	<0.001	0.011	0.008	<0.001	<0.001

铅暴露下BRCA1基因沉默对TK6细胞DNA双链断裂损伤修复的研究

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刘祥铨 ¹^,² , 唐宏阁 ¹ , 黄思敏 ¹ , 吴海婷 ¹

现代预防医学 | 环境与职业卫生 2026,53(11): 1969-1974

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现代预防医学 |环境与职业卫生 2026 , 53 (11) : 1969 -1974

铅暴露下BRCA1基因沉默对TK6细胞DNA双链断裂损伤修复的研究

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刘祥铨¹^,², 唐宏阁¹, 黄思敏¹, 吴海婷¹

作者信息

^1.厦门医学院公共卫生与医学技术学院，福建厦门 361023

^2.福建医科大学公共卫生学院，福建福州 350108

通讯作者:

刘祥铨，E-mail：lxq@xmmc.edu.cn

作者简介:

刘祥铨（1974—），男，博士，副教授、主任医师，研究方向：环境与健康风险评估

Effect of BRCA1 gene silencing on the repair of lead-induced DNA double-strand breaks in TK6 cells

Xiang-quan LIU¹^,², Hong-ge TANG¹, Si-min HUANG¹, Hai-ting WU¹

Affiliations

School of Public Health and Medical Technology, Xiamen Medical College, Xiamen, Fujian 361023, China

出版时间: 2026-06-10 doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202601037

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摘要

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目的

探讨BRCA1基因沉默对醋酸铅诱导的人淋巴母细胞TK6细胞 DNA双链断裂损伤修复的影响。

方法

采用慢病毒载体介导的shRNA技术构建BRCA1稳定沉默的TK6细胞模型，设置Normal组（未处理对照组）、Control组（空载体对照组）、shRNA-NC组（阴性对照慢病毒组）和shRNA-BRCA1组（BRCA1沉默组）。所有染毒组均用480 μmol/L醋酸铅处理24 h。通过qPCR和蛋白质印迹法（Western blot）验证沉默效率；采用免疫荧光法检测DNA损伤标志物γ-H2AX焦点；运用流式细胞术分析细胞周期与凋亡；并通过Western blot检测同源重组、非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复通路关键蛋白及DNA损伤应答信号分子表达。

结果

BRCA1沉默模型构建成功，shRNA-BRCA1组细胞BRCA1 mRNA及蛋白相对表达水平均显著低于Control组与shRNA-NC组（P<0.05）。铅暴露下，shRNA-BRCA1组γ-H2AX阳性率（26.94±2.93）%、G1期细胞比例（65.31±1.13）%及凋亡率（52.84±1.21）%均显著高于其他各组（P<0.05），而S期细胞比例（8.59±0.45）%进一步降低。蛋白检测显示，与Control组和shRNA-NC组相比，shRNA-BRCA1组同源重组通路关键蛋白Rad51表达下降（0.52±0.10），而NHEJ通路蛋白53BP1（9.73±0.87）及损伤应答信号分子ATM（6.10±0.48）、ATR（6.25±0.92）、CHK1（2.35±0.46）和DNA-PKcs（3.85±0.93）表达均显著升高（P<0.05）。

结论

BRCA1沉默抑制同源重组修复，增强铅诱导的DNA双链断裂，阻滞G1/S进程并加剧细胞凋亡，其机制与激活ATM/ATR-CHK1及代偿性上调NHEJ通路有关。

关键词

BRCA1基因 / 铅 / DNA双链断裂 / 同源重组修复 / 非同源末端连接

Abstract

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Objective

To investigate the effect of BRCA1 gene silencing on the repair of DNA double-strand breaks (DSBs) induced by lead acetate in human lymphoblastoid TK6 cells.

Methods

A stable BRCA1-silenced TK6 cell model was established using lentivirus-mediated shRNA technology. Cells were divided into four groups: normal group (untreated control group), control group (empty vector control group), shRNA-NC group (negative control lentivirus group), and shRNA-BRCA1 group (BRCA1 knockdown group). All exposed groups were treated with 480 μmol/L lead acetate for 24 h. Silencing efficiency was confirmed by qPCR and Western blot. DNA damage was assessed by immunofluorescence staining for γ-H2AX foci. Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. The expression of key proteins in the homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ) repair pathways and DNA damage response (DDR) signaling molecules was detected by Western blot.

Results

The BRCA1 silencing model was successfully constructed, with significantly lower levels of BRCA1 mRNA and protein in the shRNA-BRCA1 group compared to the control and shRNA-NC groups (P<0.05). Under lead exposure, the shRNA-BRCA1 group showed a significantly higher positive rate of γ-H2AX (26.94±2.93)%, a higher proportion of G1 phase cells (65.31±1.13)%, and a higher apoptosis rate (52.84±1.21)% compared to all other groups (P<0.05), while the proportion of S phase cells (8.59±0.45)% was further reduced. Protein analysis revealed that, compared to the control and shRNA-NC groups, the expression of the HR key protein Rad51 was decreased (0.52±0.10) in the shRNA-BRCA1 group, while the expression levels of the NHEJ pathway protein 53BP1 (9.73±0.87) and the DDR signaling molecules ATM (6.10±0.48), ATR (6.25±0.92), CHK1 (2.35±0.46), and DNA-PKcs (3.85±0.93) were significantly increased (P<0.05).

Conclusion

BRCA1 silencing inhibits homologous recombination repair, exacerbates lead-induced DNA double-strand breaks, arrests the G1/S phase progression, and intensifies apoptosis. The mechanism may be related to the activation of the ATM/ATR-CHK1 pathway and compensatory upregulation of the NHEJ repair pathway.

Key words

BRCA1 gene / Lead / DNA double-strand breaks / Homologous recombination repair / Non-homologous end joining

引用本文

刘祥铨, 唐宏阁, 黄思敏, 吴海婷. 铅暴露下BRCA1基因沉默对TK6细胞DNA双链断裂损伤修复的研究. 现代预防医学, 2026 , 53 (11) : 1969 -1974 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202601037

Xiang-quan LIU, Hong-ge TANG, Si-min HUANG, Hai-ting WU. Effect of BRCA1 gene silencing on the repair of lead-induced DNA double-strand breaks in TK6 cells[J]. Modern Preventive Medicine, 2026 , 53 (11) : 1969 -1974 . DOI: 10.20043/j.cnki.MPM.202601037

正文

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铅及其无机化合物是广泛存在的环境污染物和职业病危害因素，国际癌症研究机构依据致癌性证据的强弱，将无机铅化合物评定为2A类（很可能对人类致癌），并将金属铅划分为2B类（可能对人类致癌）^[1]。铅暴露可导致包括DNA双链断裂在内的多种遗传损伤，在各类DNA损伤中，双链断裂对基因组完整性的威胁最为严重^[2-3]。同源重组修复（homologous recombination repair，HR）和非同源末端连接修复（non-homologous end joining,NHEJ）是真核细胞修复DNA双链断裂的两条主要机制，其中前者属于高保真修复，后者则属于易错修复^[4]。其中，HR途径的启动与执行高度依赖于BRCA1-RAD51轴心蛋白的核心调控^[5]。我们前期研究发现，铅暴露可诱导人淋巴母细胞TK6中RAD51表达上调并参与部分双链断裂的修复；若抑制RAD51，则会导致双链断裂累积并伴NHEJ修复途径的代偿性激活^[6-7]。值得注意的是，作为HR通路上游的关键调控因子及RAD51功能的直接调控者，BRCA1在铅致双链断裂修复应答中的具体作用尚不清楚。为此，本研究利用shRNA慢病毒建立BRCA1沉默TK6细胞模型，系统评估BRCA1缺失对铅诱导DNA损伤水平、细胞周期分布、细胞凋亡及HR/NHEJ修复蛋白表达的影响，以阐明BRCA1在铅遗传毒性中的分子角色，为铅致癌机制提供新的实验依据。

1　材料与方法

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1.1　实验试剂

乙酸铅粉剂（中国Aladdin公司）；RPMI 1640培养基、2×Taq PCR MasterMix（Solarbio公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；EdU成像检测试剂盒（中国凯基生物）；γ-H2AX抗体（英国Abcam）；DAPI（中国阿拉丁）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒、RAD51抗体、BRCA1抗体、ATM抗体、CHK1抗体、全蛋白提取试剂盒、内参抗体β-actin（中国万类生物公司）；DNA-PKcs抗体、53BP1抗体（中国abclonal公司）；ATR抗体（中国affinity公司）；BeyoRT II M-MLV反转录酶（碧云天公司）；RNase inhibitor（上海生工公司）。

1.2　仪器

HF-90型CO₂培养箱（上海力申公司）；IX53倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）；ELX-800酶标仪（美国BIOTEK公司）；NovoCyte流式细胞仪（美国Aceabio公司）；WD-9413B型凝胶成像系统、DYCZ-24DN双垂直蛋白电泳仪（北京六一公司）；NANO 2000紫外分光光度计（美国Thermo公司）；Exicycler 96荧光定量PCR仪（韩国BIONEER公司）。

1.3　方法

1.3.1　针对BRCA1的 shRNA慢病毒载体构建与感染

本研究采用的pLVX-shRNA1慢病毒载体及干扰序列由万类生物科技有限公司构建。其中阴性对照序列sh-NC为cccTTCTCCGAACGTGTCACGTttc aagagaACGTGACACGTTCGGAGAAttttt，针对BRCA1的特异性干扰序列sh-BRCA1为ccgGCAGTTTATT ACTCACTAAAGttcaagagaCTTTAGTGAGTAATAAACT GCttttt。慢病毒包装：将sh-BRCA1、sh-NC质粒与辅助包装质粒 psPAX2、pMD2.G 共转染至HEK-293T细胞。转染前，将HEK-293T细胞接种于10 cm培养皿中，待细胞密度达50%～70%时，按照Lipofectamine 3 000转染试剂盒说明书进行操作。转染后6 h更换新鲜完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM），分别于转染后48 h和72 h收集病毒上清，经0.45 μm滤膜过滤后分装，置于-80 ℃保存备用。经检测，BRCA1沉默慢病毒的滴度为2×10⁸ TU/ml，阴性对照慢病毒的滴度为3.4×10⁸ TU/ml。病毒感染：感染前1 d，将TK6细胞接种于6孔板中，使感染当日细胞汇合度达50%～70%，每孔细胞数量约为6×10⁵个。根据病毒滴度及感染复数（MOI=10）计算所需病毒量，计算公式为：加病毒量（μl）=MOI×细胞数/病毒滴度（TU/ml）×1 000。经计算，BRCA1沉默慢病毒每孔加入30 μl，阴性对照慢病毒每孔加入17.6 μl。感染时，吸去细胞培养基，加入含病毒液的新鲜培养基，并添加8 μg/ml Polybrene以提高感染效率。混匀后置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。24 h后吸去含病毒的培养液，更换新鲜完全培养基继续培养。感染48 h后收集细胞进行后续检测。

1.3.2　TK6细胞培养和分组处理

本研究所用的TK6细胞来源于武汉普诺赛生命科技有限公司。细胞常规培养条件为：采用添加了10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱对细胞进行培养。实验前，将细胞以约1×10⁶个/孔的密度铺于6孔板中过夜。随后将细胞随机分为四组：（1）Normal组（未处理对照组）：仅细胞培养，无病毒感染及药物处理；（2）Control组（空载体对照组）：未感染病毒，施加480 μmol/L醋酸铅（避光）染毒24 h；（3）shRNA-NC组（阴性对照慢病毒组）：转染空载体慢病毒后，同Control组条件进行醋酸铅染毒；（4）shRNA-BRCA1组（BRCA1沉默组）：转染特异性shRNA慢病毒后，同Control组条件进行醋酸铅染毒。染毒结束后，收集各组细胞用于后续检测。

1.3.3　实时荧光定量聚合酶链反应分析

利用NANO 2000紫外分光光度计对样本总RNA进行定量检测。完成定量后，将RNA逆转录为cDNA，使用韩国BIONEER公司生产的Exicycler^TM 96仪器开展实时荧光定量检测，相对表达量的计算依据2^-△△CT法，引物信息列于表1。扩增参数设置如下：95 ℃ 5 min的初始变性（1个循环），随后进行40个循环的95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s。

1.3.4　免疫荧光检测γ-H2AX表达

细胞经1.3.2处理后制备涂片，先利用0.1% Triton X-100在室温下透化30 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）洗涤后，再于室温下使用山羊血清封闭15 min。一抗孵育选用兔抗γ-H2AX（1∶200），4 ℃过夜；二抗选用Cy3标记的山羊抗兔IgG（1∶200），室温避光反应1 h。最后经DAPI复染细胞核及抗荧光淬灭封片。在600倍荧光显微镜下观察，将核内红色荧光焦点数≥5个的细胞计为阳性，每组随机选取至少200个细胞进行计数，按公式“阳性细胞数/总细胞数×100.0%”计算阳性率。

1.3.5　细胞周期的流式检测

收集经1.3.2处理后的各组细胞，用4 ℃PBS重悬并调整浓度至约1×10⁶/ml。取细胞悬液1 ml，经离心后，用预冷70%乙醇4 ℃固定过夜。经PBS洗涤（2次，5 min/次）后，依次进行37 ℃ RNase A水浴处理（100 μl，30 min）及碘化丙啶染色（500 μl）。4 ℃避光反应30 min。样品经400目细胞筛过滤后上机检测（激发波长488 nm），计算细胞群体中处于G1、S、G2期的细胞比例。

1.3.6　细胞凋亡的流式检测

收集经1.3.2处理后的各组细胞，以4 ℃PBS重悬并调整细胞数至5×10⁵个/组。按照试剂盒说明操作：加入500 μl结合缓冲液，再依次滴入5 μl Annexin V-FITC及10 μl 碘化丙啶。充分混匀后，室温避光孵育15 min，并在1 h内上流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.3.7　Western blot检测蛋白表达

各组细胞经1.3.2步骤处理后，通过放射免疫沉淀裂解获取总蛋白，用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。吸取40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，并将分离后的蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜。经5%脱脂奶粉室温封闭后，依次加入一抗：BRCA1 (1∶500)、Rad51 (1∶500)、53BP1 (1∶1 000)、γ-H2AX (1∶5 000)、ATM (1∶500)、ATR (1∶1 000)、CHK1(1∶500)、DNA-PKcs (1∶1 000)及内参β-actin (1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。洗膜后，加入对应辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）并在室温下孵育45 min。经电化学发光液显影及凝胶成像系统采集图像后，使用ImageJ软件分析条带灰度，并以目的蛋白与β-actin的灰度比值量化蛋白相对表达水平。

1.4　统计学处理

所有数据均在SPSS 27.0软件中运算。计量资料经检验确认符合正态分布后，以（均值±标准差）表达。针对多组均数的差异，选用单因素方差分析；组间两两比较则在满足方差齐性条件时，采用LSD-t检验。双侧检验，检验水准α=0.05。

2　结果

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2.1　 BRCA1沉默模型的验证

荧光定量PCR扩增体系稳定, 熔解曲线峰值高, 无引物二聚体及非特异性产物产生, 扩增产物特异，结果显示，三组细胞间BRCA1 mRNA 的相对表达水平差异具有统计学意义（F=57.521, P<0.01），shRNA-BRCA1组的 BRCA1 mRNA 表达水平为（0.20±0.03），显著低于 Control 组的（1.00±0.11）与 shRNA-NC 组的（1.11±0.16）（P<0.05），Control组与shRNA-NC组间的BRCA1 mRNA相对表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；Western blot实现发现，BRCA1蛋白在三组细胞中的表达差异显著（F=178.036, P<0.01），shRNA-BRCA1组的BRCA1蛋白相对表达水平为（0.29±0.05），显著低于Control组的（1.00±0.04）与 shRNA-NC组的（1.14±0.08）（P<0.05）。BRCA1蛋白在Control 组与 shRNA-NC组中的相对表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。表明BRCA1沉默模型构建成功。见图1、表2。

2.2　 BRCA1基因沉默对铅诱导TK6细胞γ-H2AX表达的影响

免疫荧光检测结果显示，四组细胞间的γ-H2AX阳性率比较，差异具有统计学意义（F=117.063, P<0.01）；进一步比较显示，醋酸铅染毒的Control组与shRNA-NC组的γ-H2AX阳性率分别为（11.01±1.21）%、（10.08±1.12）%，均高于Normal组的（1.02±0.77）%（P<0.05）。shRNA-BRCA1组的γ-H2AX阳性率为（26.94±2.93）%，显著高于Control组、shRNA-NC组及Normal组（P<0.05）。见图2、表3。

2.3　 BRCA1基因沉默对铅诱导TK6细胞周期的影响

细胞周期分布显示，四组细胞在G1期、S期和G2期的比例差异均具有统计学意义（F=46.511、307.732、19.266；P值均<0.01）。与Normal组相比，醋酸铅染毒导致Control组与shRNA-NC组细胞G1期比例升高，S期比例降低（P<0.05）。shRNA-BRCA1组与Control组及shRNA-NC组相比，其G1期比例进一步升高，S期比例进一步降低（P<0.05）。在G2期，Control组比例显著高于Normal组（P<0.05），shRNA-BRCA1组G2期比例高于Normal组与shRNA-NC组（P<0.05）。见图3、表3。

2.4　 BRCA1基因沉默对铅诱导TK6细胞γ-H2AX凋亡的影响

四组细胞间的凋亡率比较，差异具有统计学意义（F=361.429, P<0.01）。醋酸铅染毒的Control组（37.99±1.25）%与shRNA-NC组（38.52±1.30）%的凋亡率均高于Normal组（8.09±1.09）%（P<0.05）。shRNA-BRCA1组的凋亡率（52.84±1.21）%显著高于Control组、shRNA-NC组及Normal组（P<0.05）。见图4、表3。

2.5　铅暴露下BRCA1基因沉默对TK6细胞DNA损伤修复及信号通路相关蛋白表达的影响

2.5.1　同源重组与非同源末端连接修复相关蛋白的表达

四组细胞间BRCA1、Rad51及53BP1蛋白的相对表达水平差异均具有统计学意义（F=148.256、46.842、123.651；P值均< 0.01）。与Normal组的BRCA1蛋白相对表达水平（1.00±0.06）相比，醋酸铅染毒的Control组与shRNA-NC组的BRCA1蛋白相对表达水平降低（P<0.05），分别为（0.32±0.04）、（0.31±0.07）；shRNA-BRCA1组的相对表达水平（0.09±0.05）进一步低于Control组及shRNA-NC组（P<0.05）。对于Rad51蛋白，Control组与shRNA-NC组的相对表达水平分别为（1.97±0.21）、（2.08±0.23），高于Normal组的（1.00±0.20）（P<0.05）；而shRNA-BRCA1组的相对表达水平（0.52±0.10）低于Control组及shRNA-NC组（P<0.05）。对于53BP1蛋白，Control组、shRNA-NC组及shRNA-BRCA1组的相对表达水平分别为（6.59±0.45）、（6.76±0.43）、（9.73±0.87），均高于Normal组的（1.00±0.38）（P<0.05），且shRNA-BRCA1组的相对表达水平高于Control组及shRNA-NC组（P<0.05）。见图5、表4。

2.5.2　DNA损伤应答信号通路相关蛋白的表达

四组细胞间CHK1、DNA-PKcs、ATM及ATR蛋白的相对表达水平差异均具有统计学意义（F=7.358、8.253、121.174、30.994；P值均<0.05）。CHK1蛋白在shRNA-BRCA1组的相对表达水平为（2.35±0.46），高于Normal组的（1.00±0.32）（P<0.05）。DNA-PKcs蛋白在shRNA-BRCA1组的相对表达水平为（3.85±0.93），高于Normal组的（1.00±0.51）（P<0.05）。ATM蛋白在Control组、shRNA-NC组及shRNA-BRCA1组的相对表达水平，分别为（4.13±0.27）、（4.50±0.30）、（6.10±0.48），均高于Normal组的（1.00±0.24）（P<0.05），且shRNA-BRCA1组的相对表达水平高于Control组及shRNA-NC组（P<0.05）。ATR蛋白在Control组、shRNA-NC组及shRNA- BRCA1组的相对表达水平分别为（3.27±0.66）、（2.78±0.68）、（6.25±0.92），均高于Normal组的（1.00±0.31）（P<0.05），且shRNA-BRCA1组的相对表达水平，高于Control组及shRNA-NC组（P<0.05）。见图5、表4。

3　讨论

收起

铅作为明确的环境与职业毒物，其遗传毒性机制，特别是对DNA双链断裂修复系统的影响，是阐释其健康危害的关键。双链断裂的准确修复对于维持基因组稳定性至关重要，主要依赖于高保真的HR和易错的NHEJ两条通路^[8-9]。BRCA1蛋白是HR修复途径的核心调控因子，近年来其在肿瘤发生发展中的功能日益受到关注^[10]，不仅参与早期损伤识别与信号传导，更在启动DNA末端切除、促进RAD51核丝形成等关键步骤中发挥不可替代的作用^[11-12]。本研究首次在铅暴露的背景下，利用人源性TK6细胞模型（该细胞具有正常p53状态及完整二倍体基因组，能较好模拟人体细胞应答），系统探讨了BRCA1功能缺失对铅致双链断裂修复结局的影响。结果揭示，BRCA1沉默通过破坏HR/NHEJ修复平衡，显著加剧了铅的遗传毒性。

本研究首先证实了BRCA1特异性shRNA能有效下调TK6细胞中BRCA1的mRNA和蛋白表达，成功构建了功能缺失模型。在铅暴露条件下，BRCA1沉默导致DNA损伤标志物γ-H2AX的阳性率较单纯铅染毒组进一步显著升高，表明BRCA1缺失加剧了DNA损伤的累积。这一现象与细胞命运的改变相一致：BRCA1沉默细胞表现出更严重的G1/S期阻滞和更高的凋亡率。这提示，当高保真的HR修复因BRCA1缺失而受阻时，细胞可能因无法有效修复铅诱导的双链断裂，从而激活更强的细胞周期检查点并走向凋亡。

本研究提供了BRCA1调控修复通路选择的直接证据。BRCA1沉默后，其下游HR执行蛋白Rad51的表达显著下调，证实HR通路功能被实质性削弱。与此同时，NHEJ通路的关键蛋白53BP1和DNA-PKcs的表达则协同上调。这一“HR抑制-NHEJ增强”的分子表型与前期Rad51沉默研究结果相呼应^[7]，但因其作用于HR通路的更上游，对修复通路选择的调控作用更为根本。HR与NHEJ通路存在竞争关系^[13]。BRCA1的缺失削弱了HR的竞争力，可能导致更多的双链断裂被导向易错的NHEJ途径进行修复。NHEJ介导的修复易产生微小插入或缺失，是基因组不稳定的重要来源，这为理解铅暴露如何增加突变负荷提供了新的机制线索。

此外，本研究观察到BRCA1沉默后，DNA损伤应答网络的核心激酶ATM、ATR及其下游效应蛋白CHK1的表达均进一步升高。这可能是对持续存在且无法被HR有效修复的双链断裂的强化反应。强烈的损伤应答信号一方面可能试图协调修复资源，另一方面也最终触发了上述的细胞周期阻滞与凋亡程序。因此，BRCA1在铅毒性中的作用，不仅在于直接参与修复，还在于其作为修复“传感器”和“调度员”，影响着全局的损伤应答与细胞命运决策。

综上所述，本研究证实BRCA1是细胞防御铅诱导DNA损伤的关键分子。在铅暴露环境下，BRCA1功能完整对于维持HR修复能力、抑制易错修复倾向、从而保障基因组稳定性至关重要。其功能缺失可能构成个体对铅遗传毒性敏感性增高的内在风险因素，为从DNA修复能力角度评估职业与环境铅暴露的健康风险提供了新的理论依据。

本研究存在一定局限性。一是，尚未通过BRCA1基因回补实验直接证明表型的可逆性；二是，未使用特异性的HR或NHEJ通路抑制剂进一步验证通路转换的因果关系。未来研究可结合CRISPR/Cas9基因编辑、染色质免疫共沉淀及高通量测序技术，深入解析BRCA1在铅暴露条件下调控下游修复网络的具体转录程序与蛋白互作动态，以更全面地阐明其分子机制。

基金

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福建省科技计划项目(2021D005)
厦门市科技计划项目(3502Z202474032)
厦门医学院科技计划项目(K2022-08)

参考文献

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文献

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2026年第53卷第11期

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doi: 10.20043/j.cnki.MPM.202601037

接收时间：2026-01-03
首发时间：2026-11-02
出版时间：2026-06-10

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收稿日期：2026-01-03

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作者信息

^1.厦门医学院公共卫生与医学技术学院，福建厦门 361023

^2.福建医科大学公共卫生学院，福建福州 350108

通讯作者:

刘祥铨，E-mail：lxq@xmmc.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

名称	序列（5'-3'）	引物长度（bp）	Tm	产物长度（bp)
BRCA1 F	TCTCGTTACTGGAAGTTAGCAC	22	54.4	184
BRCA1 R	CTTGTTTCCCGACTGTGGTT	20	57.3
β-actin F	CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG	25	62	156
β-actin R	CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT	24	64.4

名称

序列（5'-3'）

引物长度（bp）

产物长度（bp)

BRCA1 F

TCTCGTTACTGGAAGTTAGCAC

54.4

184

BRCA1 R

CTTGTTTCCCGACTGTGGTT

57.3

β-actin F

CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG

156

β-actin R

CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT

64.4

组别	mRNA相对表达水平	BRCA1蛋白相对表达水平
Control组	1.00 ± 0.11	1.00 ± 0.04
shRNA-NC组	1.11± 0.16	1.14 ± 0.08
shRNA-BRCA1组	0.20 ± 0.03^ab	0.29 ± 0.05^ab
F值	57.521	178.036
P 值	< 0.001	< 0.001

组别

mRNA相对表达水平

BRCA1蛋白相对表达水平

Control组

1.00 ± 0.11

1.00 ± 0.04

shRNA-NC组

1.11± 0.16

1.14 ± 0.08

shRNA-BRCA1组

0.20 ± 0.03^ab

0.29 ± 0.05^ab

F值

57.521

178.036

P 值

< 0.001

组别	γ-H2AX阳性率（%）	细胞周期分布（%）	凋亡率（%）
Normal组	1.02±0.77	56.00±0.89	21.69±0.41	22.31±0.62	8.09±1.09
Control组	11.01±1.21^a	59.42±0.97^a	15.85±0.58^a	24.73±0.77^a	37.99±1.25^a
shRNA-NC组	10.08±1.12^a	59.95±0.90^a	16.38±0.65^a	23.67±0.68	38.52±1.30^a
shRNA-BRCA1组	26.94±2.93^abc	65.31±1.13^abc	8.59±0.45^abc	26.10±0.41^ac	52.84±1.21^abc
F值	117.063	46.511	307.732	19.266	361.429
P 值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

组别

γ-H2AX阳性率（%）

细胞周期分布（%）

凋亡率（%）

G1期

S期

G2期

Normal组

1.02±0.77

56.00±0.89

21.69±0.41

22.31±0.62

8.09±1.09

Control组

11.01±1.21^a

59.42±0.97^a

15.85±0.58^a

24.73±0.77^a

37.99±1.25^a

shRNA-NC组

10.08±1.12^a

59.95±0.90^a

16.38±0.65^a

23.67±0.68

38.52±1.30^a

shRNA-BRCA1组

26.94±2.93^abc

65.31±1.13^abc

8.59±0.45^abc

26.10±0.41^ac

52.84±1.21^abc

F值

117.063

46.511

307.732

19.266

361.429

P 值

<0.001

组别	BRCA1蛋白相对表达水平	Rad51蛋白相对表达水平	53BP1蛋白相对表达水平	CHK1蛋白相对表达水平	DNA-PKcs蛋白相对表达水平	ATM蛋白相对表达水平	ATR蛋白相对表达水平
Normal组	1.00±0.06	1.00±0.20	1.00±0.38	1.00±0.32	1.00±0.51	1.00±0.24	1.00±0.31
Control组	0.32±0.04^a	1.97±0.21^a	6.59±0.45^a	1.88±0.29	2.49±0.66	4.13±0.27^a	3.27±0.66^a
shRNA-NC组	0.31±0.07^a	2.08±0.23^a	6.76±0.43^a	1.83±0.34	2.48±0.64	4.50±0.30^a	2.78±0.68^a
shRNA-BRCA1组	0.09±0.05^abc	0.52±0.10^abc	9.73±0.87^abc	2.35±0.46^a	3.85±0.93^a	6.10±0.48^abc	6.25±0.92^abc
F值	148.256	46.842	123.651	7.358	8.253	121.174	30.994
P值	<0.001	<0.001	<0.001	0.011	0.008	<0.001	<0.001

组别

BRCA1蛋白相对表达水平

Rad51蛋白相对表达水平

53BP1蛋白相对表达水平

CHK1蛋白相对表达水平

DNA-PKcs蛋白相对表达水平

ATM蛋白相对表达水平

ATR蛋白相对表达水平

Normal组

1.00±0.06

1.00±0.20

1.00±0.38

1.00±0.32

1.00±0.51

1.00±0.24

1.00±0.31

Control组

0.32±0.04^a

1.97±0.21^a

6.59±0.45^a

1.88±0.29

2.49±0.66

4.13±0.27^a

3.27±0.66^a

shRNA-NC组

0.31±0.07^a

2.08±0.23^a

6.76±0.43^a

1.83±0.34

2.48±0.64

4.50±0.30^a

2.78±0.68^a

shRNA-BRCA1组

0.09±0.05^abc

0.52±0.10^abc

9.73±0.87^abc

2.35±0.46^a

3.85±0.93^a

6.10±0.48^abc

6.25±0.92^abc

F值

148.256

46.842

123.651

7.358

8.253

121.174

30.994

P值

<0.001

0.011

0.008

<0.001