食品工业科技

引物	序列
R-pColdⅡ	CATATGATGATGATGATGATGCACTTTGTGATTC
F-pColdⅡ	GAATTCAAGCTTGTCGACCTGCAGTCTAG
R-CrMnp	CGACAAGCTTGAATTCGGATCCTTACG
F-CrMnp	CATCATCATCATATGGAGCTCATGGCTTTC
R-GsLiP	CGACAAGCTTGAATTCGGATCCTTACG
F-GsLiP	CATCATCATCATATGGAGCTCATGGCATTTG

引物	序列
R-pColdⅡ	CATATGATGATGATGATGATGCACTTTGTGATTC
F-pColdⅡ	GAATTCAAGCTTGTCGACCTGCAGTCTAG
R-CrMnp	CGACAAGCTTGAATTCGGATCCTTACG
F-CrMnp	CATCATCATCATATGGAGCTCATGGCTTTC
R-GsLiP	CGACAAGCTTGAATTCGGATCCTTACG
F-GsLiP	CATCATCATCATATGGAGCTCATGGCATTTG

脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的异源表达及应用

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王进瑶 ¹^,²^,³ , 叶永丽 ¹^,²^,³^,^* , 杨阳 ¹^,²^,³ , 高松 ¹^,²^,³ , 纪剑 ¹^,²^,³ , 孙秀兰 ¹^,²^,³

食品工业科技 | 生物工程 2026,47(3): 172-180

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食品工业科技 |生物工程 2026 , 47 (3) : 172 -180

脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的异源表达及应用

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王进瑶¹^,²^,³, 叶永丽¹^,²^,³^,^*, 杨阳¹^,²^,³, 高松¹^,²^,³, 纪剑¹^,²^,³, 孙秀兰¹^,²^,³

作者信息

¹江南大学食品学院，江苏无锡 214122

²国家市场监督管理总局重点实验室（食品安全风险物质甄别与防控），江苏无锡 214122

³江苏集萃未来食品技术研究所有限公司，江苏宜兴 214200

通讯作者:

叶永丽（1990−），女，博士，副研究员，研究方向：食品安全与质量控制，E-mail：yyly0222@jiangnan.edu.cn。

作者简介:

王进瑶（2000−），男，硕士研究生，研究方向：食品安全与质量控制，E-mail：1300650257@qq.com

Heterologous Expression and Application of Deoxynivalenol-degrading Enzymes

Jinyao WANG¹^,²^,³, Yongli YE¹^,²^,³^,^*, Yang YANG¹^,²^,³, Song GAO¹^,²^,³, Jian JI¹^,²^,³, Xiulan SUN¹^,²^,³

Affiliations

¹School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

²Key Laboratory of Screening, Prevention, and Control of Food Safety Risks, State Administration for Market Regulation, Wuxi 214122, China

³Institute of Future Food Technology, JITRI, Yixing 214200, China

出版时间: 2026-02-01 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010109

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摘要

收起

本研究聚焦于评估两种酶—GsLiP（源自Gelatoporia subvermispora的木质素过氧化物酶）和CrMnp（源自Ceriporiopsis rivulosa的锰过氧化物酶）对脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）的降解能力及其酶学性质。结果表明，在pH4.5和30 ℃的条件下，GsLiP和CrMnp均能有效降解DON，且在24 h时降解率均超过50%。分子对接模拟显示两种酶与DON之间的结合能为−34.78 kcal/mol和−33.38 kcal/mol，表明其具有较强的DON降解能力。经酶处理后的DON对Caco-2细胞的毒性显著降低，1 μg/mL的DON经过降解后对细胞抑制率低于10%。此外，GsLiP和CrMnp两种酶在小麦基质中对DON的降解率分别达到23.07%±0.59%和24.63%±0.20%。综上，这两种酶在温和条件下对DON具有高效降解能力，在细胞毒性评估和小麦基质应用中展现出显著的降毒效果和实际应用潜力。

关键词

脱氧雪腐镰刀菌烯醇 / 生物降解 / 过氧化物酶 / 细胞毒性

Abstract

收起

This study investigated the degradation efficiency and enzymatic characteristics of two fungal enzymes—GsLiP (lignin peroxidase derived from Gelatoporia subvermispora) and CrMnp (manganese peroxidase derived from Ceriporiopsis rivulosa)—against deoxynivalenol (DON). Under optimized conditions of pH4.5 and 30 ℃, both enzymes exhibited significant DON-degrading activity, achieving degradation rates exceeding 50% within 24 h. Molecular docking analysis revealed strong binding affinities between the enzymes and DON, with binding energies of −34.78 kcal/mol for GsLiP and −33.38 kcal/mol for CrMnp, supporting their high degradation potential. DON cytotoxicity was significantly reduced following enzymatic treatment, as evidenced by a cell inhibition rate of less than 10% in Caco-2 cells at a DON concentration of 1 μg/mL. In a wheat matrix, GsLiP and CrMnp achieved degradation efficiencies of 23.07%±0.59% and 24.63%±0.20%, respectively. These findings underscore that GsLiP and CrMnp can effectively degrade DON under mild conditions, significantly reducing its toxicity, and highlight their potential applications in mitigating DON contamination in food safety and agricultural contexts.

Key words

deoxynivalenol / biodegradation / peroxidase / cytotoxicity

引用本文

王进瑶, 叶永丽, 杨阳, 高松, 纪剑, 孙秀兰. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的异源表达及应用. 食品工业科技, 2026 , 47 (3) : 172 -180 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010109

Jinyao WANG, Yongli YE, Yang YANG, Song GAO, Jian JI, Xiulan SUN. Heterologous Expression and Application of Deoxynivalenol-degrading Enzymes[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (3) : 172 -180 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010109

正文

收起

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是一种由镰刀菌属真菌产生的次级倍半萜类代谢产物，是小麦赤霉病和玉米赤霉病主要病原菌所产生的单端孢菌毒素^[1−2]。DON污染严重可导致小麦、玉米、大麦和水稻等禾谷类粮食作物产量下降，并具有系列生物毒性^[3]。因此，DON的广泛污染给农业和畜牧业带来严重损失。猪对DON特别敏感，猪饲料中DON含量超过1 μg/kg时，即可引起猪食欲下降、呕吐甚至拒食，导致体重增长缓慢^[4−5]。帝斯曼（DSM）公司关于动物饲料中真菌毒素污染的调查研究发现，2023年中亚地区抽检样品中DON含量高于风险阈值的比例达到100%，而中国受DON污染高于风险阈值的样品比例为78%（结论来源于：http://www.biomin.net）。人和动物暴露于DON后，易引发免疫功能障碍、生殖问题、畸形效应、癌症风险增加以及细胞间通信的异常^[2,6−7]。DON的毒性机制在于其与核糖体结合，干扰60S亚基活性，抑制蛋白质合成，并错误激活相关激酶和MAPK信号通路，破坏线粒体和细胞膜，诱导脂质过氧化，影响细胞生长分裂^[8]。DON同时危及农作物生产以及人与动物的健康，其广泛存在和高毒性使其成为食品安全和公共卫生领域亟待解决的重要问题。

DON具有高度的化学稳定性和耐热性^[9]。已有一些研究探索了利用物理、化学及生物方法来降解DON^[10−11]。然而，物理和化学法降解毒素由于去除效果不稳定、难以规模化处理、营养成分损失大和化学物质残留等缺点而受到限制^[12−13]。生物降解方法因其绿色、高效、特异性强等优势而备受关注。研究表明，微生物可利用其自身结构实现对毒素的吸附，细菌细胞壁中的葡聚糖和甘露聚糖是吸附DON的关键成分^[14−15]。已有超过20种微生物在其代谢路径中被确认为对DON具有活性作用^[16]。

酶降解法作为一种利用微生物分泌酶进行解毒的技术，能够将DON转化为毒性较低或无毒的物质^[17]。酶降解法不受微生物生长周期的限制，能够实现对解毒反应更为精确的调控，并有效规避微生物可能带来的致病风险。但目前DON降解酶类报道有限，亟需挖掘可有效降解DON的酶类。木质素酶可通过环氧开环反应氧化苯环，作用于酚类、非酚类芳香化合物和氨基芳香化合物，产生酚氧化物和羟基自由基^[18]。这类酶包括木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）、锰过氧化物酶（Mn-dependent peroxidase，MnP）和漆酶（Laccase）等^[19]。研究表明，从金针菇中提取的过氧化物酶在50 U/g用量下，仅有60%的DON被降解^[20]。此外，白腐真菌中的锰过氧化物酶需经过72 h孵育，对DON的降解才能达到92%^[21]。然而，这类酶在降解DON时存在所需的酶量较大、反应时间较长，且应用场景有限等缺陷。鉴于木质素降解酶在降解DON方面的研究价值和应用前景，且不同来源的酶活性各异，因此，从多种微生物中筛选出更多能高效降解DON的木质素酶显得尤为重要，这不仅有助于丰富酶资源库，还可能在降解性能和应用上带来新的优势。本研究通过BlastP比对，从NCBI数据库中筛选出两种新的木质素降解酶GsLiP和CrMnp，对这两种酶进行克隆表达，并对其酶学特性进行表征，验证其对DON的有效降解能力，并利用Caco-2细胞模型进行毒性分析，拟为这些酶在粮食和食品工业中的实际应用提供研究基础。

1　材料与方法

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1.1　材料与仪器

质粒提取试剂盒　天根生物技术有限公司；咪唑、氨苄青霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）　生工生物工程有限公司；DON（纯度≥97%）　青岛普瑞邦生物工程有限公司；2,20-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸）（ABTS）、氯化钠、磷酸氢二钠、硫酸锰、丙二酸、一水合丙二酸钠、聚氰基丙烯酸正丁酯（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒、基因表达宿主菌株E. coli BL21（DE3）　上海泰坦科技股份有限公司；氯化血红素　伊诺凯科技有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶快速制备试剂盒、蛋白Marker、蛋白上样缓冲液　上海雅酶生物医药科技有限公司；Cell Counting Kit8（CCK-8）试剂盒、无缝克隆试剂盒、蛋白纯化试剂盒　上海碧云天生物技术有限公司；含有目的基因的pET28（+）质粒　天霖生物科技无锡有限公司；Caco-2人结肠癌细胞株　上海赛百慷生物技术股份有限公司。

Agilent 6470B LC/TQ、Agilent 1290 Infinity II液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）　安捷伦科技有限公司；JY92-IIN超声波细胞粉碎机　宁波新芝生物科技股份有限公司；Nano-300微量可见分光光度计　上海元析仪器有限公司；BJ-150型多功能粉碎机　德清拜杰电器有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　 GsLiP和CrMnp质粒构建

本研究所用的2组DON降解酶基因序列来自Gelatoporia subvermispora菌株木质素过氧化物酶GsLiP（GenBank：AAO61784.1）和来自Ceriporiopsis rivulosa菌株锰过氧化物酶CrMnp（GenBank：ABB83812.1），并将其克隆到（+）pColdⅡ中。使用的引物见表1，使用三对引物通过PCR扩增出GsLiP和CrMnp两种目的酶以及pColdⅡ载体，然后将三种PCR产物纯化，纯化后的产物通过无缝克隆试剂盒连接，以获得pColdⅡ-GsLiP和pColdⅡ-CrMnp，将这2个重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。测序正确后进行蛋白表达。

1.2.2　酶蛋白表达和纯化

参考王晓璐^[22]和汪洋等^[23]的方法，将含有pColdⅡ-GsLiP和pColdⅡ-CrMnp的大肠杆菌BL21（DE3）菌株接种在含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37 ℃以220 r/min振荡培养8 h。按照1%的接种量将预培养物接种到200 mL的LB培养基中培养至OD₆₀₀=0.6~0.8，添加终浓度为2 mmol/L的IPTG，并在16 ℃下180 r/min振荡20 h，在添加IPTG的6 h后，每隔2 h添加20 μL的1 mol/L氯化钙和100 μL的10 g/L氯化血红素，总计5次。诱导结束后，收集表达细胞重悬于1×PBS缓冲溶液并进行超声破碎。将超声处理的混合物在4 ℃下以10000 r/min离心30 min，随后上清液经0.45 μm滤膜过滤后加入到3 mL Ni-NTA琼脂糖纯化柱中。用3 mL洗涤缓冲液（20 mmol/L磷酸氢二钠，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）和1 mL洗脱缓冲液（20 mmol/L磷酸氢二钠，500 mmol/L NaCl，40~100 mmol/L咪唑）纯化目的酶。通过10 kDa超滤管浓缩蛋白并去除咪唑。采用SDS-PAGE电泳检测表达情况，通过凝胶成像系统拍摄电泳图谱，并与蛋白Marker进行对比，将达到电泳纯的酶合并。将合并后的酶液装入透析袋（Mw：7000）中，随后置于1×PBS缓冲溶液中透析6 h，共计2次，所获酶液于4 ℃保存。采用BCA法测定酶蛋白浓度，将牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）进行梯度稀释后加入工作液，37 ℃孵育30 min，然后在562 nm处测定吸光度并绘制标准曲线。同样的方法用于处理待测酶液，依据标准曲线计算实际浓度。纯化后的酶在50 mmol/L pH4.5丙二酸缓冲液中进行紫外-可见光谱分析。扫描范围为230~800 nm。通过计算Rz值（Rz=A₄₀₇/A₂₈₀）来评估蛋白质的复性效率。

1.2.3　酶活性测定

1 mL重组酶（2 mg/mL）在50 mmol/L丙二酸（1 mmol/L ABTS、1 mmol/L MnSO₄和0.1 mmol/L H₂O₂，pH4.5，25 ℃）缓冲溶液中反应3 min，紫外分光光度计监测420 nm处ABTS（ε420=36000 （mol/L）⁻¹·cm⁻¹）的氧化速率确定酶的活性。一个单位（1 U）的酶活性被定义为在标准分析条件下每分钟催化1 μmol底物的酶量。

1.2.4　酶对DON的降解效果

DON的降解反应在pH4.5的50 mmol/L丙二酸缓冲液中进行。体系包括：5 U/mL酶、1 mmol/L MnSO₄、0.1 mmol/L H₂O₂和5 μg/mL DON。在30 ℃下反应0、1、3、6、12、24和36 h，同时轻轻摇动，以确定最佳生物降解时间。在98 ℃加热反应2 min终止反应。以不加酶的反应体系作为阴性对照。

1.2.5　酶学性质探究

1.2.5.1　探究pH和温度对重组酶活力的影响

选择pH4~6范围的丙二酸缓冲溶液制备反应液，于25 ℃孵育，酶活最高的pH条件被视为最适pH，将该最适pH条件下的相对酶活设定为100%。选择pH4.5的丙二酸缓冲溶液，在20~40 ℃下水浴孵育。酶活最高的温度条件被视为最适温度，将该温度条件下的相对酶活设定为100%。

1.2.5.2　探究pH和温度对酶对呕吐毒素降解效果的影响

研究酶在pH4.5下，不同温度（20、30、40、50、60、70、80 ℃）对DON的降解效果；研究温度为30 ℃时，不同pH（3、3.5、4、4.5、5、5.5、6）对DON的降解效果。在98 ℃加热反应2 min终止反应。以不加酶的反应体系作为阴性对照。

1.2.6　分子对接模拟

使用Autodock Tools 1.5.6进行降解酶和DON之间的对接研究。通过AutoDock Tools对蛋白质和配体进行预处理，包括添加氢原子、计算电荷和删除水分子（对蛋白质）以及能量最小化（对配体）。然后，在AutoDock Tools中定义一个对接盒以覆盖蛋白质的活性位点。使用AutoDock Vina软件进行分子对接，并设置相关参数（蛋白质和配体的文件路径、对接盒的参数、输出文件的路径等）。对接完成后，分析多个配体构象的对接得分，选择最佳构象进行进一步分析。使用分子可视化工具查看和分析最佳构象，分析蛋白质与配体之间的相互作用。

1.2.7　体外细胞毒性实验

Caco-2细胞株在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，培养条件为恒温37 ℃和5% CO₂环境。经过两次细胞传代后，离心收集细胞，并将其接种至96孔培养板中，每孔的细胞密度设定为1.0×10⁵ cell/mL，37 ℃培养24 h^[24]。加入含有不同浓度DON的培养液，控制终浓度分别为1、2、5 mg/L；设置对照组为正常培养的Caco-2细胞，实验组则包括：a.添加不同浓度DON（1、2、5 mg/L）的细胞培养液；b.在相应DON浓度下，经过酶降解处理后产物的细胞培养液。使用CCK-8试剂盒，按照说明书测定细胞活性的抑制率^[25]。

$\rm 抑制率({\text{%}})=\left(1-\frac{实验组OD值}{对照组OD值}\right)\times 100 $

(1)

1.2.8　酶对霉变小麦的降解效果的验证

使用粉碎机将小麦磨碎，过80目筛。称取粉状小麦5.0 g加入50 mL离心管中后灭菌。将发霉小麦（经检测DON含量为2.31~2.44 mg/L）浸泡在含有GsLiP和CrMnp的丙二酸缓冲溶液中。在30 ℃和pH4.5的环境下反应，分别在0、12和24 h取样，98 ℃加热反应2 min终止反应，旋涡振荡5 min，10000 r/min离心1 min，利用1 mL无菌注射器吸取上清液，过0.22 μm的水系滤膜收集到进样小瓶中，处理后的样品保存在-20 ℃。DON降解率（%）计算方法如下：

$\rm R({\text{%}}) = \frac{{Rb - Ra}}{{Rb}} \times 100 $

(2)

式中：R表示DON降解率，%；Rb表示原样品中DON含量，μg/mL；Ra表示酶解后样品中剩余的DON含量，μg/mL。

1.2.9　液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）分析DON浓度

反应结束后取1 mL样品，0.22 μm水系滤膜过滤后转移至色谱进样瓶中。液相色谱条件：通过装配C₁₈液相色谱柱（柱长100 mm，柱内径2.1 mm；填料粒径1.7 μm）的LC-MS系统测定反应体系中的DON浓度。流动相A相：0.01%氨水溶液；B相：乙腈。梯度洗脱：2% B（0~0.8 min），24% B（3.0~4.0 min），100% B（6.0~6.9 min），2% B（6.9~7.0 min）；流速：0.35 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL。质谱条件：电喷雾离子源（负离子模式），母离子：295 m/z，锥孔电压：14 eV，定量离子：265 m/z，碰撞电压：12 eV，定性离子：138 m/z，碰撞电压：18 eV。采用0.1~10 μg/mL的DON标准品建立标准曲线，以浓度（X）对峰面积（Y）进行线性拟合，并据此计算样品中DON的浓度。

1.3　数据处理

每个实验重复3次，利用GraphPad Prism 8、AutoDock Vina、PyMOL进行数据图像绘制，统计计算使用SPSS 26.0分析（P<0.05）。

2　结果与分析

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2.1　质粒构建

将优化后的GSLiP和CrMnp基因插入到BamHI和Xhol之间的质粒pColdⅡ中，得到重组质粒pColdⅡ-GSLiP和pColdⅡ-CrMnp。用三对引物对载体pColdⅡ和两个酶的目的基因进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶鉴定后得到的实验结果显示（图1），pColdⅡ载体大小为4407 bp，GsLiP是源自Gelatoporia subvermispora基因组的一个木质素过氧化物酶基因，其长度为1134 bp^[26]。CrMnp是从Ceriporiopsis rivulosa基因组中鉴别出的一个锰过氧化物酶基因，其长度为1134 bp^[27]，均与预期片段大小相符。

2.2　 GsLiP和CrMnp的表达和纯化

GsLiP能编码377个氨基酸，Expasy网站预测的分子量约为41.3 kDa（图2a）。CrMnp能编码378个氨基酸，预测的分子量约为41.8 kDa（图2b）。经过蛋白电泳检测，这两种蛋白质的实际分子量均与理论预测值相符。

紫外-可见光谱分析结果显示，纯化后的GsLiP和CrMnp酶均呈现出与含有血红素酶相似的典型特征^[28]。血红素是过氧化物酶的重要辅基，血红素中的铁原子在静止状态下通常处于Fe³⁺的氧化态，能够与过氧化氢等底物发生反应。具体来说，GsLiP和CrMnp分别在405 nm和408 nm处存在一个明显的吸收峰，这些特定的吸收峰是血红素辅基的典型光谱特征，这充分证明了血红素基团已经被成功掺入到纯化的重组蛋白质中（图2c）。此外，纯化的 GsLiP 和 CrMnp 的 Rz值（A₄₀₅/A₂₈₀和A₄₀₇/A₂₈₀）均为1.8。Rz值的变化提示酶功能活性和稳定性的变化，Rz值是表征酶分子中血红素辅基含量的关键指标。由于这两种酶的活性均依赖于血红素，因此Rz值能直接反映其功能活性和结构稳定性：高Rz值表明血红素结合完整，预示着高活性与高稳定性；反之，其变化则提示酶功能可能受损^[29]。

2.3　 GsLiP和CrMnp对DON的降解效果

如图3 所示，含 5 U/mL 的纯化的 GsLiP 和 CrMnp 酶在 24 h 对 DON的降解率达到 51.75%±0.52% 和 55.19%±0.43%，在反应初期 0~3 h 内，酶与 DON 的反应并不明显，3 h后降解率仅为11.34%±0.73%和16.47%±0.31%，在3~24 h中，随着反应时间的延长，DON的降解率不断升高。反应24 h后，反应体系出现絮状沉淀，酶逐渐失活，DON的降解速率虽略有下降，但其整体降解过程已进入稳定阶段。酶的纯度及其所来源的物种不同，会对毒素的降解效果产生影响。不同物种来源的酶在结构、催化机制和底物特异性上可能存在差异，这些差异会导致酶在相同反应条件下的催化效率、稳定性和产物特异性有所不同^[30−32]。BsDyP在反应初期降解DON速度较慢，6 h降解1.99%，12 h后降解速度加快，24 h内降解46.56%^[33]。BaDyP对DON的降解率从6 h的10.69%增至48 h的72.98%^[34]。这表明不同来源的酶在降解DON方面表现出了不同的效率和动力学特性。

2.4　酶学性质表征

酶的作用机制涉及将底物分子结合到其活性中心。活性中心的三维结构对于催化反应至关重要，而pH的变化能够影响氨基酸残基的电荷状态，进而改变活性中心的构型^[35]。在25 ℃条件下，研究不同pH对酶活性的影响，发现在pH为4.5时酶活性最高，而在pH6时，GsLiP和CrMnp两种酶残余酶活降至最大值的33.37%和42.27%（图4a）。在pH4.5时，考察20~40 ℃温度范围内酶活性的变化，结果显示，两种酶在30 ℃时活性最强，而随着温度的升高或是降低，酶活性逐渐减弱，当温度升至40 ℃时，两种酶的剩余活性仅剩最大值的34.46%和41.98%（图4b）。

如图4c所示，在pH3~6范围内，两种降解酶在不同的pH下对DON具有相似的降解率，在pH3~4.5时，随着pH的升高，酶活性不断提高，DON的降解率也逐渐提高。在pH4.5时，GsLiP和CrMnp对DON的降解率分别达到50.49%±1.29%和53.90%±1.62%。当pH超过4.5后，降解率随着pH的提高不断下降；在pH为5.5和6条件下孵育24 h后，两种降解酶对DON的降解效果相当。GsLiP和CrMnp在pH3~6条件下对DON都有降解效果，表明该两种酶在较宽的pH范围内具有一定的适应性。

在pH4.5，温度20~80 ℃范围内，考察温度对DON降解率的影响，结果如图4d所示。GsLiP和CrMnp在30 ℃时降解活性最高，对DON的降解率达到52.69%±0.71%和55.11%±0.50%，并且在20 ℃表现出20%以上的降解率。GsLiP和CrMnp在温度高于40 ℃时活性急剧下降，说明其对高温敏感。当温度超过60 ℃后，GsLiP和CrMnp对DON几乎无降解活性，这与其他木质素降解酶相似，在低温和酸性条件下酶活性达到最佳^[36−37]。

2.5　分子对接结合模型

为了阐明本研究中所使用的酶与底物结合模式，对降解酶和DON进行分子对接，通过分析结合模式和关键氨基酸残基来研究相互作用机制。GsLiP和CrMnp均能与DON相互作用，其结合能分别为−34.78 kcal/mol和−33.38 kcal/mol。相较于之前研究的白腐真菌杂色木霉产生的漆酶53739，其对DON的降解效率为40%，结合能为−6.26 kcal/mol^[38]。较低的结合能通常表示配体与受体之间的结合更为紧密，亲和力越高，这意味着更强的催化活性^[39]。实验证实了本研究中的两种酶展现出了更低的结合能，显示出更强的降解能力。

DON降解的差异主要与残基的相互作用有关。DON与GsLiP和CrMnp亲和力越高，其催化能力就越强。分子对接结果如图5a、c所示；在酶GsLiP中，由ARG63、HIS67、PRO162、ILE171、HIS193形成的活性口袋紧密地包围DON分子（图5b），而DON在酶CrMnp中与HIS67、PRO163、PRO165、HIS194、PHE211、LEU260的侧链形成六个氢键（图5d）。这些参与氢键结合的氨基酸残基对于酶与其底物之间的相互作用至关重要。此外，GsLiP和CrMnp对接的氨基酸残基差异如图5a、c所示。DON与GsLiP的Asp233以及CrMnp的Asp233形成的氢键长度均为1.9 Å。这与DON的羟基与漆酶53739的Glu142形成的氢键长度一致，这些长度都比DON的氧原子与Aolac2的Asp233形成的氢键长度要短，较短的氢键长度有助于增强酶与毒素的结合力^[38]，氢键越短，相互作用越强，从而增强了酶与DON之间的反应。氢键和范德华力对酶及真菌毒素的稳定性具有显著的影响^[39]。

2.6　 GsLiP和CrMnp终产物对细胞的毒性评价

本试验采用经过降解酶处理和未处理的不同浓度的DON毒素单独染毒 Caco-2细胞，结果如图6所示。随着DON刺激浓度的不断升高，毒素对细胞生长的抑制越来越明显，在DON染毒浓度为1 μg/mL时，抑制率在20%左右，经GsLiP和CrMnp两种酶处理的1 μg/mL的DON的降解产物，对细胞活性的抑制率为9.51%±1.22%和8.27%±1.48%。当染毒浓度达到2 μg/mL，细胞抑制率达到35.70%±0.64%。而2 μg/mL浓度的DON经过降解后对细胞活性的抑制率都在20%以下；尽管GsLiP和CrMnp对5 μg/mL的DON降解率为50%左右，但降解后样品的细胞活性的抑制率仍维持在20%以上。实验结果表明，DON毒素对Caco-2人克隆结肠腺癌细胞培养有显著性抑制作用，而酶降解DON毒素后，对Caco-2人克隆结肠腺癌细胞活性抑制率降低。由此推测，DON经过酶处理后其产物毒性部分降低。

2.7　酶促降解小麦中DON残留效率

在30 ℃，pH4.5条件下研究降解酶对小麦中DON残留量随时间变化的影响。结果如图7所示，受污染小麦的DON初始含量在2.11~2.22 μg/mL之间，随着反应时间的推移，两种酶均能逐渐降低受污染小麦中的DON残留量。具体来说，经过12 h的处理，GsLiP和CrMnp处理的样品中DON残留量相近，分别为1.88 μg/mL和1.89 μg/mL，对应的降解率分别为13.45%±0.42%和11.29%±0.18%。在12~24 h时间段内，DON降解速率有所减缓，24 h后GsLiP和CrMnp对DON的降解率分别达到23.07%±0.59%和24.63%±0.20%。尽管两种酶均显示出对DON的降解能力，但相较于电化学法在60 min后降解了 49.36%±0.81%的DON仍有差距^[40]，可能与食品的含水量^[41]和形态复杂性^[42]有关。

3　结论

收起

本研究筛选了来源于Gelatoporia subvermispora的木质素过氧化物酶GsLiP和来源于Ceriporiopsis rivulosa的锰过氧化物酶CrMnp，皆在评估其对DON的降解能力、降解产物的细胞毒性以及在食品中的应用潜力。结果表明，这两种酶对5 μg/mL的DON处理24 h后降解率达到50%以上，在常温（30 ℃）、酸性（pH4.5）条件下表现出最佳活性。分子对接技术进一步揭示了两种酶的活性位点氨基酸残基与DON之间形成了强氢键，证实了其高效的降解机制。此外，经酶处理的DON降解产物对Caco-2细胞的毒性部分降低，且在DON阳性小麦样本中，GsLiP和CrMnp对DON的降解率超过20%。综上所述，GsLiP和CrMnp对DON的高效降解能力及降解产物的低毒性，为去除小麦中的呕吐毒素提供了新的策略。

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2026年第47卷第3期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010109

接收时间：2025-01-14
首发时间：2026-10-25
出版时间：2026-02-01

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收稿日期：2025-01-14

基金

作者信息

¹江南大学食品学院，江苏无锡 214122

²国家市场监督管理总局重点实验室（食品安全风险物质甄别与防控），江苏无锡 214122

³江苏集萃未来食品技术研究所有限公司，江苏宜兴 214200

通讯作者:

叶永丽（1990−），女，博士，副研究员，研究方向：食品安全与质量控制，E-mail：yyly0222@jiangnan.edu.cn。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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