食品工业科技

水平	因素
−1	85	1.5	1	10
0	90	2.0	2	20
1	95	2.5	3	30

水平	因素
−1	85	1.5	1	10
0	90	2.0	2	20
1	95	2.5	3	30

引物名称	引物序列
β-actin-F	CACTGTCGAGTCGCGTCC
β-actin-R	TCATCCATGGCGAACTGGTG
MITF-F	GGGAGCTCACAGCGTGTATT
MITF-R	AGCTCCTTAATGCGGTCGTT
ENK-F	GCAATGGTCTGATTCAGGGCT
ENK-R	AGGCTTCCAGATGCGTTCAC
p38 MAPK-F	GGACACCCCCTGCTTATCTC
p38 MAPK-R	TCCAGTAGGTCGACAGCCAG
CREB-F	CCGTCTCCTTTAGCACAGGT
CREB-R	TGTATCCGAGGCCAAAGTCG
TYR-F	TGACAAAGCCAAAACCCCCA
TYR-R	CAGCCATTGTTCAAAAATACTTCCA
TRP-1-F	ACCTCTGCTGCAAGTAGCCT
TRP-1-R	TGGGCAACCATCACTCTGCT

引物名称	引物序列
β-actin-F	CACTGTCGAGTCGCGTCC
β-actin-R	TCATCCATGGCGAACTGGTG
MITF-F	GGGAGCTCACAGCGTGTATT
MITF-R	AGCTCCTTAATGCGGTCGTT
ENK-F	GCAATGGTCTGATTCAGGGCT
ENK-R	AGGCTTCCAGATGCGTTCAC
p38 MAPK-F	GGACACCCCCTGCTTATCTC
p38 MAPK-R	TCCAGTAGGTCGACAGCCAG
CREB-F	CCGTCTCCTTTAGCACAGGT
CREB-R	TGTATCCGAGGCCAAAGTCG
TYR-F	TGACAAAGCCAAAACCCCCA
TYR-R	CAGCCATTGTTCAAAAATACTTCCA
TRP-1-F	ACCTCTGCTGCAAGTAGCCT
TRP-1-R	TGGGCAACCATCACTCTGCT

实验号	A：提取温度（℃）	B：提取时间（h）	C：提取次数（次）	D：料液比（g/mL）	Y：得率（%）
1	85	1.5	2	1:20	4.57
2	95	1.5	2	1:20	4.65
3	85	2.5	2	1:20	4.51
4	95	2.5	2	1:20	4.89
5	90	2.0	1	1:10	4.99
6	90	2.0	3	1:10	4.64
7	90	2.0	1	1:30	4.92
8	90	2.0	3	1:30	5.09
9	85	2.0	2	1:10	4.19
10	95	2.0	2	1:10	4.56
11	85	2.0	2	1:30	4.60
12	95	2.0	2	1:30	5.16
13	90	1.5	1	1:20	5.10
14	90	2.5	1	1:20	4.8
15	90	1.5	3	1:20	4.62
16	90	2.5	3	1:20	5.19
17	85	2.0	1	1:20	4.58
18	95	2.0	1	1:20	4.95
19	85	2.0	3	1:20	4.62
20	95	2.0	3	1:20	5.01
21	90	1.5	2	1:10	4.59
22	90	2.5	2	1:10	4.73
23	90	1.5	2	1:30	4.79
24	90	2.5	2	1:30	4.99
25	90	2.0	2	1:20	5.95
26	90	2.0	2	1:20	5.88
27	90	2.0	2	1:20	6.00

实验号	A：提取温度（℃）	B：提取时间（h）	C：提取次数（次）	D：料液比（g/mL）	Y：得率（%）
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27	90	2.0	2	1:20	6.00

项目	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	4.93	14	0.35	39.13	<0.0001	**
A-提取温度	0.39	1	0.39	42.81	<0.0001	**
B-提取时间	0.052	1	0.052	5.78	0.0333	*
C-提取次数	2.408×10⁻³	1	2.408×10⁻³	0.27	0.6143
D-料液比	0.29	1	0.29	31.7	0.0001	**
AB	0.023	1	0.023	2.5	0.1398
AC	1.000×10⁻⁴	1	1.000×10⁻⁴	0.011	0.9178
AD	9.025×10⁻³	1	9.025×10⁻³	1	0.3363
BC	0.19	1	0.19	21.03	0.0006	**
BD	9.000×10⁻⁴	1	9.000×10⁻⁴	0.1	0.7572
CD	0.068	1	0.068	7.51	0.0179	*
A²	2.74	1	2.74	304.1	<0.0001	**
B²	1.76	1	1.76	195.14	<0.0001	**
C²	1.03	1	1.03	114.11	<0.0001	**
D²	1.9	1	1.9	210.74	<0.0001	**
残差	0.11	12	8.997×10⁻³
失拟项	0.1	10	0.01	2.77	0.2942	不显著
净误差	7.267×10⁻³	2	3.633×10⁻³
总误差	5.04	26
拟合度			0.9786
矫正决定系数			0.9284

项目	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	4.93	14	0.35	39.13	<0.0001	**
A-提取温度	0.39	1	0.39	42.81	<0.0001	**
B-提取时间	0.052	1	0.052	5.78	0.0333	*
C-提取次数	2.408×10⁻³	1	2.408×10⁻³	0.27	0.6143
D-料液比	0.29	1	0.29	31.7	0.0001	**
AB	0.023	1	0.023	2.5	0.1398
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AD	9.025×10⁻³	1	9.025×10⁻³	1	0.3363
BC	0.19	1	0.19	21.03	0.0006	**
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D²	1.9	1	1.9	210.74	<0.0001	**
残差	0.11	12	8.997×10⁻³
失拟项	0.1	10	0.01	2.77	0.2942	不显著
净误差	7.267×10⁻³	2	3.633×10⁻³
总误差	5.04	26
拟合度			0.9786
矫正决定系数			0.9284

松茸多糖制备及抑制UVB诱导黑色素生成和分子机制

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高筱雅 ¹ , 牟海津 ¹ , 郁东兴 ² , 刘家鸣 ² , 李东钰 ¹^,^*

食品工业科技 | 研究与探讨 2026,47(4): 143-153

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食品工业科技 |研究与探讨 2026 , 47 (4) : 143 -153

松茸多糖制备及抑制UVB诱导黑色素生成和分子机制

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高筱雅¹, 牟海津¹, 郁东兴², 刘家鸣², 李东钰¹^,^*

作者信息

¹中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266000

²山东省宏福慧科技有限公司，山东临沂 276000

通讯作者:

李东钰（1992−），女，博士，讲师，研究方向：海洋活性成分功效评价，E-mail：ldy1516@ouc.edu.cn。

作者简介:

高筱雅（1999−），女，硕士研究生，研究方向：食品科学与工程，E-mail：18368908167@163.com

Preparation, UVB-induced Melanogenesis Inhibition and Mechanistic Elucidation of Tricholoma matsutake Polysaccharides

Xiaoya GAO¹, Haijin MOU¹, Dongxing YU², Jiaming LIU², Dongyu LI¹^,^*

Affiliations

¹College of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao 266000, China

²Shandong Searsport Biotechnology Company, Linyi 276000, China

出版时间: 2026-02-15 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030386

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摘要

收起

为探究松茸多糖抑制UVB辐射诱导的黑色素生成作用及其分子机制，本研究以松茸（Tricholoma matsutake，TM）为原料，采用热水浸提法制备松茸多糖（Tricholoma matsutake polysaccharides，TMP），经工艺优化和DEAE Sepharose Fast Flow纯化后得到松茸多糖TMP-N，通过建立小鼠黑色素瘤细胞（Mouse melanoma cells，B16-F10）模型探究了松茸多糖TMP-N抑制UVB诱导黑色素生成的分子机制。结果表明，松茸多糖TMP-N的分子量为7819.5 Da，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和岩藻糖组成；使用TMP-N孵育B16-F10细胞能够有效抑制酪氨酸酶活性，增强细胞的抗氧化能力，减少UVB诱导的黑色素生成；荧光定量PCR测定结果表明，该活性可通过调控PKA和MAPK通路中关键基因的表达而实现。本研究解析了松茸多糖TMP-N调控黑色素生成的机制，为天然活性成分替代化学合成光保护剂提供了理论支撑，对UVB辐射损伤的安全高效防护具有重要应用价值。

关键词

松茸 / 多糖 / UVB / 抗氧化 / 黑色素生成

Abstract

收起

In order to investigate the inhibitory effect of Tricholoma matsutake polysaccharides (TMP) on UVB radiation-induced melanogenesis and the molecular mechanism of melanin synthesis. The study used Tricholoma matsutake as raw material and a new polysaccharide TMP-N was prepared by hot water extraction and DEAE Sepharose Fast Flow purification. The mouse melanoma cells (B16-F10) were utilised as a model to evaluate the effects of TMP-N on melanin content, antioxidant capacity and related gene expression levels after UVB irradiation. The results demonstrated that the molecular weight of TMP-N was 7819.5 Da, mainly composed of glucose, galactose, mannose and fucose. Cellular experimentation demonstrated that the treatment of TMP-N could effectively reduce melanogenesis by inhibiting tyrosinase activity and enhancing the antioxidant capacity of B16-F10 cells. The analysis of the fluorescence quantitative PCR assay demonstrated that TMP-N functioned by downregulating melanogenic pathways through modulation of both PKA and MAPK signalling cascades. This study elucidates the mechanism by which the T. matsutake polysaccharide TMP-N regulates melanin production, providing theoretical support for replacing chemically synthesized photoprotective agents with natural bioactive compounds. The results have significant application value in terms of providing safe and effective protection against UVB radiation damage.

Key words

Tricholoma matsutake / polysaccharides / UVB / antioxidant activity / melanogenesis

引用本文

高筱雅, 牟海津, 郁东兴, 刘家鸣, 李东钰. 松茸多糖制备及抑制UVB诱导黑色素生成和分子机制. 食品工业科技, 2026 , 47 (4) : 143 -153 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030386

Xiaoya GAO, Haijin MOU, Dongxing YU, Jiaming LIU, Dongyu LI. Preparation, UVB-induced Melanogenesis Inhibition and Mechanistic Elucidation of Tricholoma matsutake Polysaccharides[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (4) : 143 -153 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030386

正文

收起

紫外线（UV）照射会对皮肤健康造成许多不利影响，如黑色素积累^[1]、光老化^[2]、细胞凋亡^[3]等，根据生物效应及波长，紫外线可划分为Ultraviolet A（UVA，320~400 nm）、Ultraviolet B（UVB，280~320 nm）和Ultraviolet C（UVC，100~280 nm）三种类型。近年来，由于臭氧层的消耗与破坏，中波段紫外线UVB的辐射显著增强，研究表明，UVB可直达皮肤的真皮层和表皮层，诱导黑色素的合成^[4]，这不仅会造成色素沉积，还被证实会造成光老化^[5]、光致癌^[6]等严重后果。

黑色素的生成是一个复杂的过程，需要多种因子的协同参与。其中，酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白-1（TRP-1）和酪氨酸酶相关蛋白-2（TRP-2）在这一过程中发挥着重要作用^[7]，酪氨酸酶是黑色素合成过程中关键步骤的限速酶^[8]。研究表明，酪氨酸酶的酶活主要受小眼畸形相关转录因子（MITF）的调控^[9]，紫外线的刺激能够激活MITF的表达，从而促进其与TYR的启动子结合，最终促进黑色素生成^[10]。此外，抗氧化能力在抑制黑色素生成的过程中具有重要意义^[11]。紫外线辐射能够诱导褐黑素通过刺激脂质过氧化而产生大量自由基^[12]，这些自由基在黑色素生成的最后阶段通过加速二羟基吲哚和吲哚醌之间的反应来刺激黑色素生成，进而造成黑色素的积累^[13]。

松茸（T. matsutake，TM）又称松口蘑、松蕈，是一种名贵的食药用真菌^[14]。松茸多糖在抗黑色素生成和抗氧化^[15]、美白^[16]活性方面的研究受到广泛关注。研究表明，松茸菌丝体多糖具有清除自由基与抗脂质过氧化的能力，还能通过抑制酪氨酸酶的活性从而展示出美白的潜能^[16]。安全等^[17]研究了松茸多糖的提取精制工艺以及美白功效，结果显示松茸多糖粗提物和精制物均对酪氨酸酶有一定的抑制作用；程华等^[18]对松茸多糖提取物进行分离纯化，得到了具有美白功效的松茸多糖TMSP-6Ⅱ，实验表明TMSP-6Ⅱ对酪氨酸酶活性的半抑制浓度（IC₅₀）为136.4 mg/L；王琪等^[19]的研究进一步表明松茸多糖能够抑制TYR、MITF等与酪氨酸酶生成相关的主要因子的基因表达水平，从而抑制酪氨酸酶的活性，进而影响黑色素的形成。Yang等^[20]的研究探讨了松茸多糖提取物PETM的安全性和脱色作用，通过体外和临床实验表明PETM显著抑制了8-MOP诱导的小鼠黑色素瘤细胞中的黑色素生成，抑制了相关关键因子的表达。综上可知，松茸多糖已被证实具有抗氧化与抗黑色素生成的活性，但其在UVB诱导下活性的效果以及抗黑色素生成的详细机制研究还不明确。因此，本研究通过热水浸提法提取松茸多糖TMP-N，并测定其基本结构组成，以小鼠黑色素瘤细胞B16-F10构建UVB损伤模型，结合抗氧化能力评价来探究TMP-N抗UVB诱导的黑色素生成作用及其机制，为松茸多糖的进一步开发利用提供参考。

1　材料与方法

收起

1.1　材料与仪器

新鲜松茸　威海迪普森生物科技有限公司；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）　大连美仑生物技术有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）　上海梯希爱化成工业发展有限公司；小鼠黑色素瘤细胞B16-F10　中科院上海细胞库；酪氨酸酶活性检测试剂盒、丙二醛检测试剂盒（细胞用）　北京索莱宝科技有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒　南京建成生物工程研究所；BCA蛋白检测试剂盒　上海源叶生物科技有限公司；SYBR green荧光染料　上海翌圣公司；反转录试剂盒　加拿大ABMgood公司；其他试剂均为国产分析纯。

ELx800酶标仪　美国Biotek公司；1260 Infinity高效液相色谱仪　美国Agilent公司；Nexus470红外光谱仪　美国Thermo Scientific公司；CB-型超净工作台　北京东联哈尔仪器制造有限公司；308 nm UVB照射灯　上海宝山顾村电光仪器厂；HXMETE紫外辐射照度计　贵州嘉乐岛电子科技有限公司；Wonbio-96c型高通量细胞破碎仪　上海万柏生物科技有限公司；Gene AmpR PCR仪　美国ABI公司；2720 Thermal Cycler型PCR仪　德国Eppendorf公司。

1.2　实验方法

1.2.1　样品制备

新鲜松茸洗净、冻干，粉碎后过50目筛网，加入95%乙醇搅拌脱色6 h，沉淀物在50 ℃烘干。按照1:20的料液比称取松茸粉和去离子水，在80 ℃下，水浴搅拌2 h，上清液中加入3倍体积的95%乙醇，充分混匀后在4 ℃下静置12 h以上。离心，沉淀用少量超纯水复溶后，冻干得到松茸粗多糖（TMP），其得率的计算公式为：

$ \rm{\text{W}}(\text{%})=\frac{m_1}{m_2}\times100 $

式中：W为粗多糖得率，%；m₁为冻干得到的粗多糖重量，mg；m₂为称取的松茸粉末重量，mg。

1.2.2　单因素实验

以温度80 ℃，提取时间2 h，提取次数1次，料液比1:20为基本实验条件，以1.2.1的方法作为基本实验方案。通过控制单一变量，以去离子水为溶剂，松茸多糖得率为指标，从提取温度、提取时间、提取次数、料液比四个方面考察对得率的影响。在单因素实验中，设置提取温度为75、80、85、90、95 ℃；提取时间为1、1.5、2、2.5、3 h；提取次数1、2、3、4、5次；料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL。

1.2.3　响应面优化松茸粗多糖提取工艺

根据单因素实验优化结果，选择各个因素的合适范围，以松茸粗多糖得率为响应值，设计四因素三水平的Box-Behnken试验，确定松茸多糖提取的最佳条件。试验设计因素及水平见下表1。

1.2.4　粗多糖的纯化

使用DEAE Sepharose Fast Flow柱对松茸粗多糖进行纯化洗脱^[21]。将粗多糖配制为10 mg/mL的溶液，过0.22 μm水相滤膜。纯化时单次上样量3 mL，用0.2 mol/L的NaCl溶液洗脱。流速为1 mL/min，洗脱液每2 min收集一管。苯酚硫酸法检测每管的总糖含量，检测490 nm处的吸光值，做洗脱曲线图。收集主要组分，透析除盐，冷冻干燥收集样品。

1.2.5　总糖与总蛋白测定

将纯化后的多糖配制为1 mg/mL的溶液。以葡萄糖为标准品，采用苯酚硫酸法测定总糖含量，方法参照国标GB/T 15672-2009食用菌中总糖含量的测定进行^[22]。采用BCA蛋白含量试剂盒测定总蛋白含量，按照试剂盒中提示的方法进行。

1.2.6　松茸多糖结构表征

1.2.6.1　分子量测定

使用Telgsk G4000 PWXL柱测定相对分子量。流动相A为0.2 mol/L NaNO₃，流动相B为0.01 mol/L NaH₂PO₄，流动相比例为1:1。使用不同分子量的葡萄糖标准品绘制标准曲线，横坐标为lg（Mw），纵坐标为保留时间。

1.2.6.2　单糖组成测定

采用高效液相色谱（HPLC）测定单糖组成^[23]。称取适量样品加72%硫酸水解，PMP柱前衍生法进行上样前处理。流动相A：15%乙腈（采用0.05 mol/L的KH₂PO₄稀释，pH=6.8），流动相B：40%乙腈（由0.05 mol/L的KH₂PO₄稀释，pH=6.8）。按照流动相A 100%-92%-63%-100%（0-8-37-50 min）进行梯度洗脱。

1.2.6.3　傅里叶变换红外光谱测定

将多糖样品和光谱级KBr以1:100的比例混合研磨，波数范围4000~400 cm⁻¹，使用FT-IR进行红外分析^[24]。

1.2.7　体外抗氧化能力检测

1.2.7.1　ABTS⁺自由基清除率

参考Yuan等^[25]的方法稍作修改。将7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液以1:1的体积比混合，室温避光放置14 h，得到ABTS母液。实验进行时，用适量去离子水稀释得到ABTS工作液。配制不同浓度的TMP-N溶液，96孔板上加入200 μL ABTS工作液，再加入10 μL样品，轻轻混匀后室温孵育10 min，测定734 nm处的吸光度。用去离子水代替样品为空白组，对照组用去离子水代替ABTS工作液，V_C为阳性对照。

$ \text{ABTS}^+自由基清除率(\text{%})=\frac{\text{A}_{\text{0}}-(\text{A}_{\text{i}}-\text{A}_{\text{s}})}{\text{A}_{\text{0}}}\times\text{100} $

式中：A₀为超纯水代替样品时的吸光值；A_i为样品组吸光值；A_s为去离子水代替ABTS后的吸光值。

1.2.7.2　DPPH自由基清除率

参考Ribeiro等^[26]的方法稍作修改。配制不同浓度的松茸多糖溶液，取上述多糖溶液0.1 mL分别加入0.1 mL的DPPH溶液（浓度为0.125 mg/mL，用75%乙醇溶解）。混匀后室温避光静置30 min，于517 nm处测吸光度。空白组用去离子水代替样品，75%的乙醇代替DPPH工作液为对照组，V_C为阳性对照。

$ \text{DPPH}自由基清除率(\text{%})=\frac{\text{A}_{\text{0}}-(\text{A}_{\text{i}}-\text{A}_{\text{s}})}{\text{A}_{\text{0}}}\times\text{100} $

式中：A₀为超纯水代替样品时的吸光值；A_i为样品组吸光值；A_s为75%乙醇代替DPPH后的吸光值。

1.2.7.3　羟自由基清除率

参考李菀等^[27]的方法稍作修改。配制不同浓度的松茸多糖溶液，取0.1 mL多糖溶液，加入0.1 mL硫酸亚铁溶液（9 mmol/L）和0.1 mL水杨酸乙醇溶液（9 mmol/L）；混合均匀后立即加入0.1 mL过氧化氢溶液（9 mmol/L），最后加入1.2 mL去离子水作为参比溶液；混合均匀，37 ℃下恒温水浴60 min；于510 nm处测吸光度。空白组用去离子水代替样品，对照组用去离子水代替过氧化氢，以V_C为阳性对照。

$ 羟自由基清除率(\text{%})=\frac{\text{A}_{\text{0}}-(\text{A}_{\text{i}}-\text{A}_{\text{s}})}{\text{A}_{\text{0}}}\times\text{100} $

式中：A₀为超纯水代替样品时的吸光值；A_i为样品组吸光值；A_s为超纯水代替过氧化氢后的吸光值。

1.2.8　B16-F10细胞实验

1.2.8.1　细胞培养方式与UVB损伤模型建立方法

B16-F10细胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的DMEM培养基中培养。建立UVB损伤模型时，在96孔板的每个孔中加入100 μL细胞悬液，约含有1×10⁴个细胞。培养12 h后，取出培养基，用PBS洗涤细胞3次。随后将细胞暴露于6 W，302 nm的UVB灯下进行照射，根据紫外照度计上显示的示数记录照射强度，当强度显示为100 mJ/cm²关闭UVB灯，满足这一照射强度的时间约为10 min，照射后的细胞在显微镜下观察形态正常，未出现明显的细胞碎片。

1.2.8.2　松茸多糖对B16-F10细胞增殖的影响

首先通过MTT法检测不同浓度TMP-N对B16-F10细胞活力的影响^[11]。将未经UVB照射的B16-F10细胞接种到96孔培养板中，37 ℃恒温培养箱培养24 h；随后用PBS洗涤，每孔分别加入100 μL不同浓度的TMP-N，37 ℃再孵育24 h。孵育结束后每孔中加入50 μL 2 mg/mL的MTT溶液，37 ℃下孵育3 h，孵育结束后吸干每孔的培养基并加入200 μL DMSO，避光水浴振荡3 h，酶标仪在波长540 nm处检测各孔吸光度。以空白组为对照，计算细胞存活率。

$ 细胞存活率(\text{%})=\frac{\text{A}_{\text{2}}-\text{A}_{\text{0}}}{\text{A}_{\text{1}}-\text{A}_{\text{0}}}\times\text{100} $

式中：其中A₀、A₁和A₂分别为溶剂空白组、阴性对照组和样品组的吸光值。

1.2.8.3　对黑色素生成相关参数的影响

收集UVB照射（100 mJ/cm²）后的细胞，用不同浓度的松茸多糖处理24 h，然后收集细胞。检测B16-F10细胞的黑色素含量的变化，采用氢氧化钠裂解法^[28]，将细胞样品溶解在含有10% DMSO的1 mol/L NaOH中，80 ℃下溶解1 h。用酶标仪在405 nm处测量吸光度。

使用酪氨酸酶检测试剂盒测定细胞内酪氨酸酶活性，按照试剂盒的指示，在细胞样品中按照比例加入提取液，用细胞破碎仪辅助破碎细胞（功率200 W，超声3 s，间隔10 s，重复30次），离心后取上清进行测定。

1.2.8.4　对细胞的抗氧化作用

收集造模后经不同浓度的松茸多糖孵育24 h的细胞，离心去上清，按照一定的比例加入少量PBS，用细胞破碎仪辅助破碎（功率200 W，超声3 s，间隔10 s，重复30次）。使用细胞丙二醛（MDA）含量检测试剂盒，检测B16-F10细胞中的脂质氧化水平。同样的方法收集并处理细胞，使用ABTS和FRAP总抗氧化能力检测试剂盒检验B16-F10细胞的总抗氧化能力（T-AOC）。

1.2.8.5　相关基因表达水平的变化

以不同浓度松茸多糖处理的B16-F10细胞的总RNA逆转录得到的cDNA第一链产物为模板，向体系中依次加入SYBR染色液、去酶水、模板、引物，反应体系为20 μL，混合均匀后放入q-PCR仪中进行分析。以β-actin基因作为内参，根据每个基因的Ct值，计算ΔΔCt数值和差异倍数（2^−ΔΔCt），评估不同组间基因转录水平的差异，分析黑色素生成过程中相关基因的表达水平^[19]。引物名称与序列见表2。

1.3　数据处理

所有实验均重复3次，实验结果以平均值±标准差表示，使用SPSS 26、Design Expert 8.0、Origin 2025软件进行数据统计分析和制图。

2　结果与分析

收起

2.1　多糖提取单因素实验结果

图1显示着单因素优化结果。从图1A中可知，多糖得率随着温度升高，85 ℃以上得率趋于稳定，90 ℃时得率达到了5.60%±0.13%。图1B显示随提取时间延长，多糖得率先上升后下降，并在2 h处得到最大得率为5.23%±0.08%，2 h之后多糖的得率下降，这可能是由于长时间处在高温环境中引起了部分多糖的降解^[29]。图1C中，多糖得率在提取2次时达到5.06%±0.06%，而继续增加提取次数多糖得率则有所降低，这可能与反复提取使得细胞被破坏地更加完全从而导致其他成分的溶出有关^[30]。料液比对于松茸粗多糖得率的影响如图1D所示，料液比为1:20（g/mL）时得率最高，为4.90%±0.11%。适宜量的溶剂有利于多糖的提取，但当料液比较大时也会导致部分非多糖物质的析出，影响多糖得率^[31]。

2.2　响应面试验优化提取工艺结果

2.2.1　响应面模型设计方案与实验结果

参考单因素实验结果，以松茸多糖得率为响应值，提取温度、提取时间、提取次数、料液比四个因素为自变量，采用Design Expert 8.0软件设计响应面试验方案，确定最佳条件。根据软件的设计方案，按照表3中的因素水平分别进行实验，中心点处重复3次，分别计算松茸多糖得率。

表4中可以看出，模型极显著（P<0.0001）且失拟项（P>0.05）不显著，模型拟合系数为0.9786，校正决定系数为0.9284，以上数据表明回归方程与实际情况拟合度高，本模型中C.V%=1.93<10，表明实验的可信度和精确度高^[30]。提取温度和料液比对得率（Y）有极显著影响（P<0.01），提取时间也有显著的影响（P<0.05），各因素对多糖得率的影响顺序为：提取温度>料液比>提取时间>提取次数。根据各项的回归系数，并舍掉不显著项后，得到模型的回归方程为：

Y(%)=5.94+0.18A+0.066B+0.15D+0.22BC+0.13CD−0.72A²−0.57B²−0.44C²−0.60D²

2.2.2　曲面交互作用分析

图2A反映整个响应面模型的拟合趋势，点均匀分布在线上，显示出较好的拟合状态。图2B中的响应曲面图显示了交互作用显著的BC组（P<0.05）和CD组（P<0.01）的响应面等高图和3D图。从图2中可以看出，BC和CD所形成的响应面曲面坡度较陡，等高线椭圆明显，表示交互作用明显，与方差分析结果一致。

2.2.3　最佳提取条件的确定和验证

基于上述模型，预测松茸粗多糖的最佳提取条件为：提取温度90.66 ℃，提取时间2.04 h，提取次数2.02次，料液比1:21.38 g/mL，得率为5.97%。考虑可行性后将条件调整为：提取温度91 ℃，提取时间2 h，提取次数2次，料液比1:21 g/mL。在此条件下进行了三次平行实验验证，实际得率分别为5.93%、5.85%、5.74%，平均值为5.84%±0.09%，与模型预测值较为接近，当前文献中所报道的松茸多糖得率大多介于3%^[21]到9%^[15]之间，得率的差异可能与松茸样品的种类和处理方式有关。以上结果证明用响应面方法所优化的松茸多糖提取条件对实际提取工艺具有较高的参考价值。

2.3　松茸粗多糖纯化结果

粗多糖经过DEAE Sepharose Fast Flow柱洗脱出两个组分，洗脱曲线如图3A所示。收集主要组分并将其命名为TMP-N，进行后续实验。同时，为验证多糖的纯化水平，测定了纯化后TMP-N的总糖与总蛋白含量。经实验计算，其总糖和总蛋白含量分别为89%、6%，这说明TMP-N中可能还存在一些连接比较紧密的糖蛋白，无法通过DEAE柱的洗脱将其全部除去。

2.4　松茸多糖初级结构表征

2.4.1　相对分子量

相对分子量计算的标准曲线为：y=−0.2415x+10.021，R²=0.9911。根据图3B计算得到TMP-N的分子量Mw为7819.5 Da。

2.4.2　单糖组成

松茸多糖TMP-N的液相色谱图如图3D所示。TMP-N主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖4种组分构成，各单糖组成的摩尔质量比分别为1.66:26.3:5.2:1，其中葡萄糖为主要成分。这与目前已经报道的松茸多糖单糖组成的结果基本一致^[32]，但单糖组成的摩尔比存在差异。

2.4.3　红外光谱

TMP-N的红外光谱图如图4所示，参考文献的报道对其进行分析^[33]，1450~1200 cm⁻¹附近的吸收峰为多糖的特征吸收峰，1660 cm⁻¹附近的峰表明多糖中具有酰胺键。1200~1000 cm⁻¹区间的特征峰可用来鉴别糖环部分的大小^[21]，吡喃糖在此区域出现两个吸收峰，而呋喃糖只有一个吸收峰，图中在此区域有明显的两个峰，表明松茸多糖是吡喃型的多糖。此外，图4中3000~2800 cm⁻¹区的吸收峰由C-H的伸缩振动引起，而3600~3100 cm⁻¹区的宽强峰由多糖分子内的O-H键或分子间氢键的伸缩振动引起^[33]。876 cm⁻¹的吸收峰代表TMP-N具有β-糖苷键^[21]。因此，结合上述分析可知，松茸多糖TMP-N可能是含有β-糖苷键的吡喃型多糖。

2.5　松茸多糖体外抗氧化能力

UVB诱导的损伤与ROS介导的氧化应激紧密相关，体外抗氧化能力的检测可以初步验证松茸多糖清除自由基的生物学活性，为后续实验提供参考依据，本研究通过三项自由基清除实验评估松茸多糖的体外抗氧化效果，实验结果如图5所示。

结果可知，松茸多糖TMP-N清除ABTS⁺、DPPH、羟自由基的IC₅₀分别为1.41、1.51、3.49 mg/mL，这与郑爽等^[16]、梁双敏等^[15]对松茸多糖体外抗氧化能力的检测结果相似，证明TMP-N具备体外抗氧化能力，不同自由基IC₅₀值的差异可能与自由基的性质以及不同的抗氧化机理有关^[30]。上述结果表明，松茸多糖具备体外抗氧化效果，但对不同自由基的清除效果存在差异。

2.6　松茸多糖对B16-F10细胞增殖的影响

通过检测TMP-N对B16-F10的细胞毒性来评估松茸多糖是否能抑制黑色素瘤细胞的增殖。实验结果如图6A所示，松茸多糖TMP-N在浓度大于25 μg/mL时对黑色素瘤细胞增殖有显著的抑制作用，这在一定程度上证实了Yang等^[34]报道的松茸多糖对黑色素瘤的抗肿瘤效果。TMP-N在浓度小于25 μg/mL时表现出较低的细胞毒性，这一浓度低于王琪^[19]、Yang等^[20]的报道，说明TMP-N可能具有更强的生物利用度，这可能与其分子量较低有关。因此，结合实验结果，选择在细胞毒性较低范围内的6、12、25 μg/mL三个浓度进行进一步的实验。

2.7　松茸多糖对UVB诱导的B16-F10细胞中黑色素生成相关参数的影响

酪氨酸酶是催化黑色素合成中限速步骤的关键酶，UVB的照射会刺激酪氨酸酶酶活增强，引起黑色素大量生成，通过抑制酪氨酸酶的酶活可以抑制黑色素的生成^[28]。如图6B显示，UVB诱导后，细胞内酪氨酸酶的酶活与空白对照组相比增加了31.1%，而TMP-N干预后的三个浓度组均表现出显著的抑制酪氨酸酶活的效果（P<0.01）。

酪氨酸酶的酶活直接影响着细胞内黑色素的含量^[16]。如图6C所示，B16-F10细胞在经过UVB诱导后，细胞内的黑色素含量显著增加（P<0.001），这说明UVB诱导了黑色素的大量生成。不同浓度TMP-N的处理均降低了细胞内的黑色素含量，与UVB诱导组相比，12 μg/mL和25 μg/mL的TMP-N干预使黑色素含量分别降低20.0%和42.3%（P<0.01）。这一结果说明，TMP-N的干预能够抑制UVB诱导后酪氨酸酶的活性增加，能够减少细胞内黑色素的含量^[13]，且与目前文献[16−18,19]中报道过的有效浓度相比，TMP-N能够在更低浓度下发挥抑制酪氨酸酶活性和减少黑色素生成的效果。

2.8　松茸多糖对B16-F10细胞的抗氧化作用

皮肤中的黑色素主要分为真黑素和褐黑素两种类型，它们的比例决定着皮肤的颜色^[13]。当紫外线照射后，褐黑素通过刺激脂质过氧化而产生大量自由基，能够加速黑色素的合成并导致其他不良反应^[35]。丙二醛（MDA）是脂质过氧化的产物，这是过量活性氧的积累而造成的损害的一个典型性指标，实验通过检测细胞内MDA的含量来评估脂质过氧化损伤的程度。

如图6D所示，UVB诱导后B16-F10细胞的MDA水平与空白组相比显著升高（P<0.001），TMP-N的干预能够降低MDA水平，在25 μg/mL时的效果极显著（P<0.001）。说明TMP-N有抗脂质过氧化的效果，且作用效果与浓度呈正相关，这与文献[16]报道的松茸多糖可缓解脂质过氧化的结果一致。

黑色素合成的本质是一个氧化过程^[13]，提高抗氧化能力对降低UVB辐射后细胞中黑色素的合成也具有重要意义。实验分别使用ABTS法和FRAP法检测了B16-F10细胞的总抗氧化能力（图6E和图6F）。与空白对照组相比，UVB照射后B16-F10细胞的总抗氧化能力均显著下降（P<0.001）。在ABTS法的实验中，与UVB诱导组相比，各组TMP-N的处理均显著恢复了细胞的抗氧化能力（P<0.05），其中25 μg/mL组的总抗氧化能力提升了2倍左右，抗氧化能力优于空白对照组。在FRAP法的检测结果中，仅在25 μg/mL的TMP-N干预下显示出抗氧化能力的极显著提升（P<0.001）。总抗氧化能力提升这一结果与TMP-N在体外具备清除自由基的抗氧化能力相印证，表明松茸多糖TMP-N能够缓解UVB诱导的氧化应激。通过提高细胞的总抗氧化能力，从而降低黑色素细胞氧化应激的损伤^[11]，防止黑色素的进一步合成与积累。

2.9　黑色素合成相关基因表达水平的变化

黑色素的合成是一个复杂的机制，其产生过程涉及多条信号通路^[13]。据报道，黑色素的合成主要受酪氨酸酶（TYR）和酪氨酸酶相关蛋白（TRP-1/2）的调控^[1]。在黑色素细胞中，酪氨酸酶及其相关蛋白的表达水平受到小眼相关转录因子（MITF）的调控。MITF是黑色素细胞的主要调控因子，它控制着对色素合成、黑色素细胞周期进程和分化至关重要的基因的表达^[9]，其表达水平与PKA和MAPK通路密切相关^[11]。因此，为了说明TMP-N抑制UVB诱导的黑色素生成机制，本实验通过q-PCR检测了PKA和MAPK通路中关键因子表达水平的变化，结果如图7所示。

q-PCR的实验结果显示，与空白对照组相比，UVB照射诱导后，B16-F10细胞中CREB、p38 MAPK、MITF、TYR和TRP-1基因的表达水平上调，且除TRP-1外，表达水平的变化均具有显著性（P<0.05）。TMP-N干预后，有5个基因的表达水平显示出下调趋势。与UVB诱导组相比，在25 μg/mL的TMP-N干预下，CREB、p38 MAPK和MITF、TYR、TRP-1的基因表达水平均显著下调（P<0.05）。同时，UVB照射抑制了ERK基因的表达，25 μg/mL的TMP-N干预上调ERK基因的表达水平为极显著（P<0.001）。

PKA信号通路在黑素生成过程中起着重要作用^[36]。当受到紫外线刺激时，这条通路上的关键因子CREB将会被激活，进而上调MITF的表达。MITF将结合并触发TYR启动子进行TYR基因的转录，以此来增加黑色素的合成^[37]。由实验结果可知，UVB诱导后，CERB的表达水平相比于空白对照组上调了2.6倍，MITF的表达水平相比与空白对照组上调了2.2倍，均显著增强（P<0.01），12 μg/mL和25 μg/mL组TMP-N的干预均显著下调了CERB和MITF的表达（P<0.05），表明PKA信号通路受到抑制。

MITF也受到MAPK信号通路的调节^[38]。当UVB照射刺激细胞时，MAPK信号通路上的ERK表达被抑制，它与MITF之间存在着一种负反馈调节机制^[39]，而同在MAPK通路上的p38 MAPK基因的表达将会在UVB的照射后增加，其表达水平相比于空白对照组上调了4.34倍，这一结果与空白组相比极显著（P<0.001），p38 MAPK蛋白的磷酸化可以激活MITF，以此进一步增加黑色素的合成^[40]。12 μg/mL和25 μg/mL组TMP-N的干预均能显著上调ERK的基因表达（P<0.05），抑制p38 MAPK基因的表达，这表明TMP-N的干预也能够调控MAPK信号通路。

实验结果可知，TMP-N的干预能够恢复由UVB照射引起的CREB、p38 MAPK、JNK的转录水平异常，并激活ERK的表达，表明TMP-N能够调控PKA和MAPK通路。这一结果与Hu等^[41]关于灵芝多糖抑制UVB诱导的黑色素生成实验结果一致，在松茸中验证了真菌多糖抑制黑色素生成的机制涉及PKA和MAPK通路的调节。ERK的激活以及CREB等基因的下调将抑制MITF基因的转录水平，从而抑制TYR基因的表达水平，影响酪氨酸酶的活性，降低TRP-1的表达，最终减少黑色素的生成。在现有的研究中，王琪等^[19]使用未经外界刺激诱导的基础模型研究松茸多糖的美白活性，结果表明松茸多糖TMSP-5亚组分Ⅱ可以通过降低MITF和TYR基因的表达水平来减少黑色素的生成；Yang等^[20]通过体外和临床试验探讨了松茸多糖PETM的安全性和脱色作用，表明PETM显著抑制了8-MOP诱导的B16-F10细胞中的黑色素生成，抑制了JNK介导的相关途径中关键因子的表达，但基础细胞模型与8-MOP的刺激无法对机体造成氧化应激，因此该模型与真实皮肤应激状态存在差异。本研究证实了松茸多糖TMP-N能够在B16-F10细胞中抑制UVB诱导的黑色素生成，这一模型更加切合真实皮肤受到紫外刺激后的状态，且TMP-N在比TMSP-5亚组分Ⅱ与PETM更低的浓度状态下就能表现出抑制相关基因的表达与减少黑色素生成的效果。以上结果表明，TMP-N的干预可以有效抑制UVB诱导的黑色素大量合成，这一活性是通过调控PKA和MAPK通路关键基因的表达水平来实现的。

3　结论

收起

多种真菌多糖已被报道能够通过抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、调控黑色素生成相关通路等方式来抑制UVB诱导的黑色素生成。本研究通过热水浸提与纯化得到松茸多糖TMP-N，这是一种由β-糖苷键连接的吡喃型多糖，分子量Mw为7819.5 Da，单糖组成主要为葡萄糖、半乳糖、甘露糖和岩藻糖。在UVB照射损伤的B16-F10细胞模型中，25 μg/mL的TMP-N可以有效抑制酪氨酸酶的活性、减少黑色素含量，同时能够缓解脂质过氧化，提高细胞的抗氧化能力。q-PCR的实验结果进一步表明，TMP-N抑制UVB照射诱导的黑色素生成是通过调控PKA和MAPK通路上关键基因表达水平的变化来实现的。综上，本研究验证了松茸多糖TMP-N抗UVB诱导的黑色素生成作用，为松茸多糖在减少色素沉积、修复UVB损伤等光保护领域的应用提供了理论参考。未来将借助皮肤模型进一步探究松茸多糖抑制黑色素的分子机制和构效关系，以期为天然成分用作光保护剂的开发与结构优化提供精准指导。

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

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2026年第47卷第4期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030386

接收时间：2025-04-01
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-02-15

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出版历史

收稿日期：2025-04-01

基金

作者信息

¹中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266000

²山东省宏福慧科技有限公司，山东临沂 276000

通讯作者:

李东钰（1992−），女，博士，讲师，研究方向：海洋活性成分功效评价，E-mail：ldy1516@ouc.edu.cn。

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/spgykj/CN/10.13386/j.issn1002-0306.2025030386

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

水平	因素
−1	85	1.5	1	10
0	90	2.0	2	20
1	95	2.5	3	30

水平

因素

A：提取温度（℃）

B：提取时间（h）

C：提取次数（次）

D：料液比（g/mL）

−1

1.5

2.0

2.5

引物名称	引物序列
β-actin-F	CACTGTCGAGTCGCGTCC
β-actin-R	TCATCCATGGCGAACTGGTG
MITF-F	GGGAGCTCACAGCGTGTATT
MITF-R	AGCTCCTTAATGCGGTCGTT
ENK-F	GCAATGGTCTGATTCAGGGCT
ENK-R	AGGCTTCCAGATGCGTTCAC
p38 MAPK-F	GGACACCCCCTGCTTATCTC
p38 MAPK-R	TCCAGTAGGTCGACAGCCAG
CREB-F	CCGTCTCCTTTAGCACAGGT
CREB-R	TGTATCCGAGGCCAAAGTCG
TYR-F	TGACAAAGCCAAAACCCCCA
TYR-R	CAGCCATTGTTCAAAAATACTTCCA
TRP-1-F	ACCTCTGCTGCAAGTAGCCT
TRP-1-R	TGGGCAACCATCACTCTGCT

引物名称

引物序列

β-actin-F

CACTGTCGAGTCGCGTCC

β-actin-R

TCATCCATGGCGAACTGGTG

MITF-F

GGGAGCTCACAGCGTGTATT

MITF-R

AGCTCCTTAATGCGGTCGTT

ENK-F

GCAATGGTCTGATTCAGGGCT

ENK-R

AGGCTTCCAGATGCGTTCAC

p38 MAPK-F

GGACACCCCCTGCTTATCTC

p38 MAPK-R

TCCAGTAGGTCGACAGCCAG

CREB-F

CCGTCTCCTTTAGCACAGGT

CREB-R

TGTATCCGAGGCCAAAGTCG

TYR-F

TGACAAAGCCAAAACCCCCA

TYR-R

CAGCCATTGTTCAAAAATACTTCCA

TRP-1-F

ACCTCTGCTGCAAGTAGCCT

TRP-1-R

TGGGCAACCATCACTCTGCT

实验号	A：提取温度（℃）	B：提取时间（h）	C：提取次数（次）	D：料液比（g/mL）	Y：得率（%）
1	85	1.5	2	1:20	4.57
2	95	1.5	2	1:20	4.65
3	85	2.5	2	1:20	4.51
4	95	2.5	2	1:20	4.89
5	90	2.0	1	1:10	4.99
6	90	2.0	3	1:10	4.64
7	90	2.0	1	1:30	4.92
8	90	2.0	3	1:30	5.09
9	85	2.0	2	1:10	4.19
10	95	2.0	2	1:10	4.56
11	85	2.0	2	1:30	4.60
12	95	2.0	2	1:30	5.16
13	90	1.5	1	1:20	5.10
14	90	2.5	1	1:20	4.8
15	90	1.5	3	1:20	4.62
16	90	2.5	3	1:20	5.19
17	85	2.0	1	1:20	4.58
18	95	2.0	1	1:20	4.95
19	85	2.0	3	1:20	4.62
20	95	2.0	3	1:20	5.01
21	90	1.5	2	1:10	4.59
22	90	2.5	2	1:10	4.73
23	90	1.5	2	1:30	4.79
24	90	2.5	2	1:30	4.99
25	90	2.0	2	1:20	5.95
26	90	2.0	2	1:20	5.88
27	90	2.0	2	1:20	6.00

实验号

A：提取温度
（℃）

B：提取时间
（h）

C：提取次数
（次）

D：料液比
（g/mL）

Y：得率（%）

1.5