食品工业科技

酶	突变体	K_m （mmol/L）	k_cat （s⁻¹）	k_cat/K_m（L·mmol⁻¹·s⁻¹）
WT	none	14.76±1.24^a	205.75±4.03^a	13.94±1.18^a
M1	T276F	20.93±1.96^b	396.73±9.42^b	18.95±0.91^b
M2	T276F/T34V	22.67±1.56^b	501.39±7.95^c	22.11±0.80^c
M3	T276F/T34V/Q90R	22.15±1.32^b	804.01±10.34^f	36.30±1.02^e
M4	T276F/T34V/Q90R/S53F	23.47±1.18^b	778.93±8.54^e	33.16±0.93^d
M5	T276F/T34V/Q90R/S53F/S74T	21.87±1.67^b	755.06±7.50^d	34.52±1.48^de

酶	突变体	K_m （mmol/L）	k_cat （s⁻¹）	k_cat/K_m（L·mmol⁻¹·s⁻¹）
WT	none	14.76±1.24^a	205.75±4.03^a	13.94±1.18^a
M1	T276F	20.93±1.96^b	396.73±9.42^b	18.95±0.91^b
M2	T276F/T34V	22.67±1.56^b	501.39±7.95^c	22.11±0.80^c
M3	T276F/T34V/Q90R	22.15±1.32^b	804.01±10.34^f	36.30±1.02^e
M4	T276F/T34V/Q90R/S53F	23.47±1.18^b	778.93±8.54^e	33.16±0.93^d
M5	T276F/T34V/Q90R/S53F/S74T	21.87±1.67^b	755.06±7.50^d	34.52±1.48^de

半理性设计提升葡萄糖氧化酶活性与热稳定性

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李荷月 ¹^,² , 郭煜辉 ¹^,² , 裴雯雯 ¹^,² , 王倩 ¹^,² , 李娇 ² , 赵伟 ⁴ , 秦慧民 ¹ , 孙媛霞 ²^,³ , 陈朋 ²^,³^,^*

食品工业科技 | 研究与探讨 2026,47(4): 59-68

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食品工业科技 |研究与探讨 2026 , 47 (4) : 59 -68

半理性设计提升葡萄糖氧化酶活性与热稳定性

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李荷月¹^,², 郭煜辉¹^,², 裴雯雯¹^,², 王倩¹^,², 李娇², 赵伟⁴, 秦慧民¹, 孙媛霞²^,³, 陈朋²^,³^,^*

作者信息

¹天津科技大学生物工程学院，天津 300457

²中国科学院天津工业生物技术研究所，工业酶国家工程研究中心，天津 300308

³中国科学院天津工业生物技术研究所，低碳合成工程生物学全国重点实验室，天津 300308

⁴山东福洋生物科技股份有限公司，山东德州 253100

通讯作者:

陈朋（1988−），男，博士，副研究员，研究方向：糖生物学，E-mail：chen_p@tib.cas.cn。

作者简介:

李荷月（1996−），男，硕士研究生，研究方向：酶工程，E-mail：liheyue@tib.cas.cn

Enhancing the Activity and Thermostability of Glucose Oxidase Through Semi-rational Design

Heyue LI¹^,², Yuhui GUO¹^,², Wenwen PEI¹^,², Qian WANG¹^,², Jiao LI², Wei ZHAO⁴, Huimin QIN¹, Yuanxia SUN²^,³, Peng CHEN²^,³^,^*

Affiliations

¹School of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China

²National Engineering Research Center for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

³Key Laboratory of Engineering Biology for Low-Carbon Manufacturing, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

⁴Shandong Fuyang Biological Starch Co., Ltd., Dezhou 253100, China

出版时间: 2026-02-15 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010032

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摘要

收起

本研究旨在通过半理性设计策略同时提高黑曲霉（Aspergillus niger）来源葡萄糖氧化酶（AnGOD）酶活性与热稳定性。基于FireProt在线工具与序列一致性分析设计突变位点，通过定点突变及两阶段组合突变筛选最优突变体，并利用分子动力学模拟解析其性能提升机制。结果表明，从83个设计位点中筛选出12个单点优势突变体，经两阶段组合突变获得最优突变体M5（T276F/T34V/Q90R/S53F/S74T）。M5的比酶活较野生型（WT）提高4.2倍，k_cat值为755.0 s⁻¹，催化效率（k_cat/K_m）为34.52 L·mmol⁻¹·s⁻¹，分别为WT的3.67、2.48倍。在65 ℃下，M5的半衰期为30 min，较WT（1 min）提高了30倍。分子动力学模拟表明，M5的RMSD均值与非催化区RMSF均值较WT分别降低了12.9%与12.4%，与底物及辅酶之间的氢键数量分别增加10.3%与8.8%，此外，S74T新增氢键网络，Q90R突变引入正电荷，增强表面静电互补，这些因素共同提升了AnGOD的热稳定性与催化活性。本研究通过半理性设计与组合突变策略，显著缓解了AnGOD酶改造中热稳定性与催化活性的权衡问题，为GOD的应用奠定了基础。

关键词

葡萄糖氧化酶 / 活性与稳定性权衡 / 半理性设计 / 一致性分析 / 分子动力学模拟

Abstract

收起

This study aimed to simultaneously enhance the enzymatic activity and thermostability of glucose oxidase (AnGOD) derived from Aspergillus niger through a semi-rational design strategy. Mutation sites were designed using the FireProt online tool and consensus sequences analysis, and the optimal mutant was screened via site-directed mutagenesis and a two-stage combinatorial mutation approach. Molecular dynamics simulations were then conducted to elucidate the mechanism of performance enhancement. Results showed that from the initial 83 designed sites, 12 single-point advantageous mutants were selected, and the optimal mutant M5 (T276F/T34V/Q90R/S53F/S74T) was obtained through two-stage combinatorial mutagenesis. Compared to the wild-type (WT), M5 exhibited a 4.2-fold increase in specific activity, with a k_cat value of 755.0 s⁻¹ and a k_cat/K_m value of 34.52 L·mmol⁻¹·s⁻¹, representing 3.67- and 2.48-fold enhancements over WT, respectively. At 65 ℃, the half-life of M5 was 30 min, representing a 30-fold increase compared to WT (1 min). Molecular dynamics simulations revealed that the average RMSD of M5 and the RMSF in non-catalytic regions were reduced by 12.9% and 12.4%, respectively, compared to the wild-type (WT). Additionally, the number of hydrogen bonds between M5 and the substrate/coenzyme increased by 10.3% and 8.8%, respectively. Notably, the S74T mutation introduced a novel hydrogen bond network, while the Q90R mutation introduced a positive charge, enhancing surface electrostatic complementarity. These synergistic effects collectively improved both the thermostability and catalytic activity of AnGOD. Through semi-rational design and combinatorial mutagenesis, this study significantly alleviated the stability-activity trade-off in AnGOD enzyme engineering, laying a foundation for the application of GOD.

Key words

glucose oxidase / activity-stability trade-off / semi-rational design / consensus sequences analysis / molecular dynamics simulation

引用本文

李荷月, 郭煜辉, 裴雯雯, 王倩, 李娇, 赵伟, 秦慧民, 孙媛霞, 陈朋. 半理性设计提升葡萄糖氧化酶活性与热稳定性. 食品工业科技, 2026 , 47 (4) : 59 -68 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010032

Heyue LI, Yuhui GUO, Wenwen PEI, Qian WANG, Jiao LI, Wei ZHAO, Huimin QIN, Yuanxia SUN, Peng CHEN. Enhancing the Activity and Thermostability of Glucose Oxidase Through Semi-rational Design[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (4) : 59 -68 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010032

正文

收起

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，EC 1.1.3.4，GOD）属于葡萄糖/甲醇/胆碱氧化还原酶超家族，为黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Denucleotide，FAD）依赖型氧化酶，能以氧气为电子受体，专一性氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，葡萄糖酸内酯进一步水解生成葡萄糖酸^[1]。

基于GOD的反应特性，其已成为食品、药物、医疗、饲料等行业使用最广泛的氧化还原酶之一^[2]。GOD可除去食品中的氧气和葡萄糖，减少食品的氧化，因而在食品行业有许多重要应用，包括烘焙行业、饮料生产及食品保鲜等^[3]。在医疗行业，基于GOD的葡萄糖生物传感器已广泛用于监测糖尿病患者的血糖水平^[4−5]，其也被用于肿瘤患者的饥饿治疗^[6]、糖尿病人伤口愈合^[7]等。作为一种新型饲料添加剂，GOD因其在改善动物肠道健康方面的有益功能而备受关注^[8−9]。此外，GOD是葡萄糖酸及其盐类工业生产的关键酶^[10]。

GOD在多种真菌中产生，主要存在于曲霉属和青霉属中^[11]。真菌工业生产GOD存在产率低、副产物多及对原材料中存在的金属离子高度敏感的问题^[12]。利用重组工程菌株异源表达GOD有助于解决这一问题，来源于黑曲霉的GOD已在解脂耶氏酵母^[13]、毕赤酵母^[14−16]等工程菌中实现异源高效表达。天然GOD存在酶活力低、热稳定性差等缺点，不能适用于GOD的所有应用场景。近年来，已有诸多报道通过酶工程改造获得性能优良的GOD，以扩大其应用范围。例如，Tu等^[17]对黑曲霉（Aspergillus niger）来源的GOD进行定向进化，获得突变体M4，与野生型GOD相比，其T_m值升高了7.5 ℃，在60 ℃和70 ℃下的半衰期分别提升了8.4倍和5.6倍。Ning等^[18]通过计算机辅助分子模拟分析预测了与青霉属葡萄糖氧化酶热稳定性密切相关的氨基酸，获得了两个热稳定性显著提高的突变体S100A和D408W，在相同温度下半衰期分别是野生型酶的5.13倍和4.41倍，但未报道活性变化。Mu等^[19]使用计算机模拟设计来增强黑曲霉GOD的稳定性，突变体的T_m值提升了8.5 ℃，葡萄酸的产量提升了2倍。Marín-Navarro等^[20]随机突变筛选出热稳定性提升的T554M突变体，理性设计在二聚体界面引入新盐桥，突变体Q90R/Y509E热稳定性显著提升，进一步通过组合突变获得热稳定提升3倍的T554M/Q90R/Y509E三重突变体。以上策略多聚焦于AnGOD的单一性能提升，提高热稳定性的过程中酶的活性通常会下降，稳定性与活性权衡问题尚未有效解决^[21]。目前，通过分子改造提升GOD活性的研究较少，因此，选择合理的蛋白质工程策略同时提高GOD的热稳定性和活性对扩大其应用范围至关重要。

本研究以黑曲霉（Aspergillus niger）来源的AnGOD为研究对象，采用FireProt在线网站工具与序列一致性分析等半理性手段设计突变位点，通过定点突变及两阶段组合突变获得活性与热稳定性同时提高的AnGOD突变体，为其工业应用提供更具潜力的酶制剂。进一步，利用分子动力学模拟手段解析其催化性能提升机理，为GOD的进一步改造提供理论借鉴。

1　材料与方法

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1.1　材料与仪器

大肠杆菌Escherichia coli DH5α、毕赤酵母Pichia pastoris X33、重组质粒pPICZα A-AnGOD　为本实验室保存；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase扩增试剂盒　南京诺唯赞生物科技股份有限公司；质粒小提试剂盒　Omega Bio-Tek公司；PCR产物纯化试剂盒　天根生物科技有限公司；SDS-PAGE试剂盒　天津润泰发展有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、葡萄糖氧化酶活性检测试剂盒、琼脂粉、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、D-无水葡萄糖　分析纯，北京索莱宝科技有限公司；邻联茴香胺、甲醇　分析纯，Sigma-Aldrich 公司；辣根过氧化物酶　上海麦克林生化科技有限公司；酵母膏、蛋白胨　英国OXOID公司；YNB　上海生工生物公司；无水乙醇、NaCl、K₂HPO₄、KH₂PO₄　分析纯，国药集团化学试剂有限公司；博来霉素　分析纯，杭州弗德生物科技有限公司；其他生化试剂均为国产分析纯；所用培养基为LB培养基、YPD培养基、BMGY培养基、BMMY培养基^[22]　实验室配制。

T100^TM聚合酶链式反应仪（Polymerase Chain Reaction Instrument，PCR仪）　伯乐生命医学产品（上海）有限公司；Sorvall Stratos高速冷冻离心机　Thermo Fisher Scientific公司；JN-MINI PRO低温超高压细胞粉碎仪　广州聚能纳米生物科技股份有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台　苏州安泰空气科技有限公司；DHP-9082电热恒温培养箱　上海一恒科技有限公司；ZWY-110X30恒温水平摇床　北京市六一仪器厂；UV-1900i紫外分光光度计　日本岛津公司；Synergy LX酶标仪　Biotek公司；SQ-510C台式高压灭菌锅　重庆雅马拓科技有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　突变位点设计

FireProt设计突变位点：从PDB数据库中获得AnGOD晶体结构（PDB ID:3QVP），将其提交至FireProt 2.0在线服务器（https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotweb/）^[23]，使用默认参数预测和设计预测潜在的有益突变位点。

序列一致性分析设计突变位点：将AnGOD的蛋白质序列提交至Uniprot数据库BLAST工具，使用默认参数获得250条蛋白质氨基酸序列。使用Jalview软件中Clustal工具进行全局序列比对及一致性分析，根据结果设计突变位点。

1.2.2　突变体构建

前期实验室保存有经密码子优化的pPICZα A-AnGOD，其C端含有6×His标签。设计包含突变位点氨基酸的两条互补引物，进行全质粒PCR，PCR产物通过琼脂糖核酸凝胶电泳进行验证，扩增成功的质粒用Dpn Ⅰ消化，转化至E. coli DH5α感受态细胞，37 ℃，200 r/min摇床孵育1 h后涂布到含有Zeocin抗性的LB平板上。37 ℃下恒温培养24 h，筛选得到转化子，挑取部分转化子至含有Zeocin抗性的LB液体培养基中进行培养，将培养菌液送至测序公司进行DNA测序验证。测序验证成功后，提取突变质粒并以其为模板，在启动子AOX1内部设计引物进行经PCR扩增（95 ℃预变性5 min、循环数1，95 ℃变性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s、循环数25，72 ℃最终延伸5 min、循环数1），用Dpn Ⅰ消化质粒模板，试剂盒纯化获得线性化质粒。采用电转化法将线性化质粒转化至毕赤酵母P. pastoris X33感受态细胞并涂布到含有100 µg/mL Zeocin抗性的YPD平板上，30 ℃下恒温培养48 h。设计AnGOD 特异性引物，挑取单菌落进行PCR扩增（95 ℃预变性5 min、循环数1，95 ℃变性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s、循环数25，72 ℃最终延伸5 min、循环数1），PCR产物通过琼脂糖核酸凝胶电泳进行验证，大小正确则证明获得AnGOD突变体重组表达菌株。

1.2.3　酶的异源表达与纯化

对AnGOD突变体重组表达菌株进行诱导表达，具体方法参照毕赤酵母表达手册（Invitrogen，K171001）^[24]。诱导表达结束后，离心收集发酵上清液。通过Ni-NTA亲和层析对粗酶上清液进行纯化。先用含有20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、30 mmol/L（pH7.0）咪唑的结合缓冲液洗涤杂蛋白，再用含有20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、500 mmol/L（pH7.0）咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白获得纯酶液。将纯酶液转移至30 kDa截留分子量的超滤管中，用100 mmol/L CH₃COOH-CH₃COONa缓冲液（pH5.5）在4 ℃、4000 r/min下离心30 min进行脱盐处理，重复洗脱3次。纯化后的蛋白经SDS-PAGE鉴定：采用12%分离胶与5%浓缩胶，上样量10 µg/孔，电泳缓冲液为25 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、0.1% SDS，初始电压80 V（浓缩胶阶段），分离胶阶段调整为120 V，电泳时间1.5 h。凝胶经考马斯亮蓝R-250染色并脱色至背景清晰。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定目的蛋白浓度，将样品稀释到同一浓度测定酶活。

1.2.4　酶活测定

对传统邻联茴香胺显色法^[25]加以改进。用100 mmol/L CH₃COOH-CH₃COONa缓冲溶液稀释过氧化氢溶液至不同浓度，取200 µL反应体系（含6.67 µL过氧化氢稀释液、193.33 µL经40 ℃预热显色液）混匀后在460 nm测吸光度，绘制过氧化氢标准曲线。用同样方法测定稀释后的反应液，采用动力学方法每隔30 s测定460 nm处吸光值，时长2 min，获得拟合曲线，依其斜率与标准曲线计算过氧化氢生成速率及酶活力。在pH5.5、40 ℃下每分钟氧化1 μmol β-D-葡萄糖的酶量为一个活力单位。

1.2.5　酶学性质

1.2.5.1　最适pH的测定

40 ℃条件下，测定酶在不同pH缓冲液（CH₃COOH-CH₃COONa pH3.0~6.0；KH₂PO₄-K₂HPO₄ pH6.0~8.0；Glycine-NaOH pH8.0~10.0）中的活性，将酶活性最高值定义为100%，计算各pH条件下相对酶活力，确定最适pH。

1.2.5.2　最适温度的测定

在最适pH条件下，测定酶在20、30、40、50、60、70 ℃下的酶活力，将酶活性最高值作为100%，计算各温度条件下相对酶活力，确定最适温度。

1.2.5.3　热稳定性的测定

在最适pH条件下，将酶在55、65、75 ℃下恒温保持，不同时间取样测定酶活力，以0 h 时测定的酶活为 100%，计算不同取样时间残余酶活力，评估酶的热稳定性。

1.2.5.4　金属依赖性的测定

在pH5.5的反应体系中分别添加终浓度2 mmol/L的Ba²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺，测定酶活力，不添加金属离子时的酶活为100%，计算添加其他金属离子时的酶活力，研究不同金属离子对酶活的影响。

1.2.5.5　酶动力学参数的测定

用pH5.5、100 mmol/L CH₃COOH-CH₃COONa缓冲液配制含不同浓度葡萄糖溶液（25、50、75、100、125、150 mmol/L）的酶反应体系，以葡萄糖为底物，在最适反应温度40 ℃下反应，计算酶活力。使用GraphPad Prism 9.3.0软件拟合酶活力随葡萄糖浓度变化的非线性回归曲线，得到函数拟合Michaelis-Menten方程，获得酶动力学参数K_m和V_max，通过计算获得k_cat及k_cat/K_m值。

1.2.6　分子动力学模拟

为了探究GOD热稳定性与活性提高的分子机制，在AnGOD野生型的晶体结构（PDB ID:3QVP）基础上，利用pymol突变T276F、T34V、Q90R、S53F和S74T获得突变体M5的立体结构。利用薛定谔软件将底物β-D-glucose对接至酶活性位点中，并选择符合催化机理的对接结果（GlcO1与His520Nε2、His563Nδ1间距离相等且均为2.8 Å^[26−27]）进行动力学模拟。分别利用Amber 18中的GAFF2和Amber ff14SB力场。系统置于8 Å的正六面体的TIP3P水模型中。加入Na⁺和Cl⁻中和系统的总电荷。利用最陡下降法和共轭梯度算法对整个系统进行优化、能量最小化。随后，在313 K的恒温温度和1.0 atm的压力下，使用Langevin-hermostat（ntt=3）以2 ps⁻¹的碰撞频率和1 ps压力松弛时间将系统保持50 ps的密度平衡。随后，将系统进一步平衡10 ns，以获得稳定的压力和温度。最终，在313 K、1.0 atm的压力下，每个系统进行100 ns的最终模拟。在整个模拟过程中，使用SHAKE算法对氢键进行限制。所有MD模拟的收敛性均通过均方根偏差（RMSD）分析进行评估。使用Maestro-Schrödinger 12.9做分子对接，PyMOL展示蛋白三维结构，Amber 2018进行分子动力学模拟。

1.3　数据处理

所有试验重复3次，使用FireProt 2.0和Jalview的多序列比对预测突变位点。对酶学性质研究实验中，每个实验做3个平行，使用软件Graphpad Prism 9.3.0进行数据统计分析并做图。

2　结果与分析

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2.1　半理性设计突变位点

FireProt 2.0网络服务器结合了基于能量、进化和祖先重建的策略，是预测和设计热稳定突变体的有效工具，可以设计单点突变体，也可以通过单点变体的合理组合策略预测多点突变体^[28]。将AnGOD晶体结构提交至FireProt 2.0在线服务器进行计算分析，结果显示共有53个可设计位点。为更精准定位优势突变体并减少工作量，基于能量策略，选择FoldX和Rosetta折叠自由能均小于等于零的位点，基于进化策略，选择保守性小于7的位点，进一步选择能量或进化为YES选项的位点，共获得35个预测位点。

以共识概念为指导的突变设计：共识概念是一种基于生物信息学的蛋白质设计方法，通过目标酶序列与其对应序列之间的多重序列比对，用相应位置出现频率最高的氨基酸替换目标酶中与其不一致的氨基酸^[29]。将AnGOD的氨基酸序列在Uniprot数据库进行BLAST检索，获得250条蛋白质氨基酸序列，使用Clustal进行序列比对，首先选择单个氨基酸出现频率大于40%的位点，进一步选出AnGOD序列中与出现频率最高的氨基酸不一致的位点，共获得58个位点，其中10个位点与FireProt 2.0预测位点重复，因此结合两种策略共获得83个设计位点，如图1A所示。

2.2　优势单点突变体筛选

根据设计的突变位点，构建表达载体及重组菌株，诱导表达纯化获得重组葡萄糖氧化酶。将酶稀释至相同浓度，测定其比酶活。经实验验证，野生型的酶活在55 ℃下的半衰期约为40 min，因此将其与重组酶在55 ℃下保温40 min，测定保温前后酶活性，计算残余酶活。结果如图1A所示，最终从83个突变体中获得12个比酶活不低于野生型90%且55 ℃处理40 min残余酶活高于野生型的优势单点突变体。其中T30V、T276F、D315K、T389A为FireProt 2.0在线网络服务器设计所获位点，V20Y、S53F、S74T、Q90R、H277F、V541T为一致性分析所获位点，T34V、V106I为两种策略重复设计的位点。

由图1C可知，突变体T276F酶活提高最为明显，达到野生型的2.1倍，S74T、T34V、D315K酶活力为野生型的1.8~2.0倍，T30V、S53F、Q90R、T389A酶活力为野生型的1.3倍，V20Y、V106I、H277F、V541T的酶活未见明显提升。稳定性方面，突变体S53F稳定性提高最为明显，能够保持80%以上的初始活性。T30V、T34V、S74T、V106I、T276F、H277F、V541T能够保持60%~70%以上的初始活性；V20Y、Q90R、D315K、T389A热稳定性提升效果不明显。

FireProt 2.0在线设计工具结合了多种计算工具，提供了基于能量、进化及祖先重建三种策略，可设计单点突变体及多点组合突变体，仅需要设计者提供蛋白质序列或三维结构。已有腈水合酶^[30]、蔗糖磷酸化酶^[31]、羰基还原酶^[32]、菊粉蔗糖酶^[33]等多种酶的催化性能通过FireProt策略获得了提升。一致性分析是一种基于生物信息学的蛋白质设计方法，它用蛋白质家族中该位置最常出现的氨基酸替换特定的氨基酸，仅依赖于序列信息，可以通过目标酶序列与其对应序列之间的多重序列比对来实现，简单高效^[34]。基于一致性分析，超氧物歧化酶^[35]、纳豆激酶^[36]、腈水解酶^[37]等多种酶的热稳定性与酶活性得以提高。

2.3　组合突变体筛选

在蛋白质工程领域，酶的热稳定性与活性之间的权衡问题是一个巨大的挑战。为同时提高AnGOD的酶活性与热稳定性，分阶段进行组合突变。

第一阶段以酶活性提高为筛选标准，由图1C可知，T276F比酶活为野生型（WT）的2.1倍，为比酶活最高的单点优势突变体，同时55 ℃下处理40 min残余酶活为67.3%，因此在T276F（M1）的基础上叠加其他11个单点突变体，获得两位点突变体（图2A）。结果显示，突变体M2（T276F/T34V）的比酶活较M1进一步提高，为野生型（WT）的2.6倍，55 ℃处理40 min残余酶活进一步提升至75%（图2B）。在M2的基础上叠加剩余10个单点突变体，获得三位点突变体（图2A）。突变体M3（T276F/T34V/Q90R）的比酶活为M2的1.7倍，为WT的4.3倍，其在55 ℃处理40 min残余酶活降至62.3%，但高于野生型51.1%的残余酶活（图2B）。

第二阶段以热稳定提升且同时保持酶活性基本不变为筛选标准，在M3的基础上叠加剩余单点突变体（图2C）。结果图2D所示，突变体M4（T276F/T34V/Q90R/S53F）55 ℃处理40 min残余酶活提升至89.2%，比酶活略有下降，原因可能是S53F位点是热稳定提升最明显的单点突变体，对M4热稳定性贡献较大。在M4基础上继续叠加其他单点突变体，突变体M5（T276F/T34V/Q90R/S53F/S74T）55 ℃处理40 min残余酶活提升至91.0%，同时比酶活较M4略有下降，为WT比酶活的4.1倍（图2D）。

在M5的基础上进一步叠加其他单点突变体，获得的突变体比酶活及热稳定性全部下降，由此确定最佳突变体为M5。M5突变体中仅T276F为FireProt 2.0所设计位点，T34V、Q90R、S53F、S74T位点均为序列一致性分析所设计位点。该结果表明，通过序列一致性分析完成单点突变，进一步通过简单的迭代组合突变可有效解决蛋白质工程改造过程中热稳定性和酶活性权衡问题，Charoenwongpaiboon等^[33]通过序列一致性分析获得酶活性与热稳定性同时提升的超氧物歧化酶。

2.4　突变酶与野生型葡萄糖氧化酶酶学性质分析

2.4.1　最适反应温度

在20~70 ℃下测定了AnGOD野生型与突变体的酶活力，结果如图3（A）所示，野生型与突变体M1~M5的最适反应温度基本一致，均为40 ℃，与文献[38]报道的黑曲霉来源葡萄糖氧化酶最适温度类似。

2.4.2　最适pH

在最适温度40 ℃下，测定AnGOD与突变体M1~M5在pH3.0~9.0条件下酶活力。结果如图3（B）所示，所有酶均在pH5.5时表现出最佳的催化活性，在pH4.0~6.5时催化活性保持在80%以上，pH低于4.0或高于6.5，酶活力下降明显，由此可知GOD适宜在pH4.5~6.0的偏酸性环境下进行催化反应。

2.4.3　金属离子对酶活的影响

测试了AnGOD野生型与突变体M5对金属离子的依赖性，结果如图3（C）。金属离子对突变前后GOD的酶活具有普遍的抑制作用，抑制程度基本一致。其中添加Ba²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺后，相对活性降低至60%~80%。Cu²⁺的抑制作用最强，使GOD相对活性不足5%。由此可知，GOD的催化活性不依赖于上述常见的金属离子。

2.4.4　热稳定性的分析

将野生型和各突变体稀释至相同蛋白浓度后，分别于55、65、75 ℃下保温，在不同时间取样测定残余酶活，结果如图3（D）~图3（F），M1~M5在以上各温度下的热稳定性均优于野生型，突变体酶的热稳定性排序为M5>M4>M2>M1>M3。以酶活为筛选标准，WT、M1、M2的热稳定逐渐提升，比酶活最高的M3热稳定性较M1、M2明显下降。以热稳定性为筛选标准，在M3的基础上叠加S53F突变体获得热稳定性大幅提升的M4，通过进一步叠加S74T获得热稳定进一步提升的M5突变体。

具体来看，WT在55 ℃下放置1 h，残余酶活降至40%以下，M1、M2、M3在55 ℃下的半衰期约为2 h。在55 ℃放置24 h，M4、M5的残余酶活分别达到60%与90%。在65 ℃条件下，WT的半衰期约为1 min，M5的半衰期约为30 min，较野生型提高了30倍。在75 ℃条件下，M5热稳定远高于WT及其他突变体，处理10 min残余酶活接近20%。Zhou等^[39]通过理性设计与组合突变，获得热稳定提升的葡萄糖氧化酶突变体，其在55 ℃下处理3 h残余酶活为37.5%。Peng等^[40]筛选尼崎青霉来源的葡萄糖氧化酶，通过计算机辅助设计获得突变体，在60 ℃下的半衰期提升了2.6倍。本研究获得的M5突变体，在55 ℃放置残余酶活可达90%，在65 ℃条件下的半衰期较野生型提高了30倍。

2.4.5　酶动力学参数

测定了AnGOD野生型与各组合突变体的酶动力学参数，结果如表1所示，野生型的K_m值为14.76 mmol/L，各突变体的K_m值均略有升高，范围在20.93~23.47 mmol/L之间，表明突变体与底物的亲和力略有降低。野生型的k_cat值为205.7 s⁻¹，以比酶活为筛选标准获得的M1、M2、M3突变体k_cat值逐渐升高，其中M3的k_cat值为804.0 s⁻¹，催化效率为36.30 L·mmol⁻¹·s⁻¹，分别为WT的3.90、2.60倍，为催化效率最高的突变体，但热稳定性显著下降，出现了酶活性与热稳定性权衡问题。进一步以热稳定性为筛选标准，最终获得M5突变体，k_cat值为755.0 s⁻¹，催化效率为34.52 L·mmol⁻¹·s⁻¹，分别为WT的3.67、2.48倍，仅比M3略微下降。

2.5　分子动力学模拟

为探究AnGOD突变体热稳定性与酶活性提高的分子机制，对野生型AnGOD与突变体M5进行了分子动力学模拟。首先分析其均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）和均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）值，在100 ns的模拟时间内，M5的RMSD均值为1.25 Å相较于野生型的1.55 Å降低了12.9%（图4A），说明突变体M5的整体分子结构变化程度较小，同时，M5在非催化区域的RMSF均值为0.404 Å相较于野生型的0.454 Å降低了12.4%（图4B），说明M5非催化区域的氨基酸波动程度较小，RMSD与RMSF值结果说明M5的稳定性增强，与实验结果相符。进一步对酶与底物、辅酶之间的氢键进行了分析，结果如图4C、图4D所示，野生型AnGOD与底物β-D-glucose的氢键数量平均为2.9条，与FAD的氢键数量为9.1条，M5与底物β-D-glucose的氢键数量平均为3.2条，与FAD的氢键数量为9.9条，较野生型分别增加了10.3%和8.8%。氢键是一种较强的非共价相互作用，当酶与底物、辅酶之间形成更多的氢键时，往往预示它们之间亲和力的增强^[41]。因此，相比野生型，M5与底物、辅酶间的亲和力更强，结合更为紧密，从而提升了酶活。

之后对WT与M5突变结果进行构象分析，如图4E，野生型中第74位的丝氨酸只与第71位的异亮氨酸和第77位的天冬氨酸间存在氢键，而突变后的苏氨酸与第76位的缬氨酸间形成了新的氢键，增强了该区域的稳定性，而将第90位的谷氨酰胺替换为带正电荷的精氨酸，则增强了该区域的静电相互作用，提高了GOD的热稳定性^[40−41]。以上结果表明突变体M5实现了刚性与活性的平衡，同时提升了热稳定性与催化活性，能够更好的满足了工业用酶需求。

Mu等^[19]利用FRESCO计算设计策略结合FoldX、Rosetta_ddg和ABACUS工具预测稳定突变，显著缩短实验筛选周期，获得突变体AnGOD-m，其T_m值提升8.5 ℃，并改善了pH耐受性，实现了葡萄糖到葡萄糖酸98%的转化。本研究通过FireProt、一致性分析等半理性设计实现AnGOD活性与热稳定性的协同提升，解决了传统酶工程中活性与稳定性的矛盾。通过分子动力学模拟，揭示了M5突变体结构波动减少、氢键增加的机制，为未来酶工程提供了理论基础。未来可借助FRESCO计算设计策略，进一步推动葡萄糖氧化酶的工程化改造。

3　结论

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本研究以来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶AnGOD为研究对象，通过FireProt与序列一致性分析设计83个突变位点，筛选获得12个酶活性与热稳定性同时提高的单点突变体。在此基础上，进行两阶段的组合突变。首先，以酶活性提高为筛选标准进行迭代组合突变，获得组合突变体M3（T26F/T34V/Q90R）。进一步，以热稳定性为筛选标准进行迭代组合突变，获得组合突变体M5（T276F/T34V/Q90R/S53F/S74T）。酶学性质研究表明，WT及各突变体的最适温度均为40 ℃、最适pH均为5.5、金属离子依赖性基本一致。M3的催化效率最高，为WT的4.3倍，但热稳定性提升不明显。M5的比酶活为WT的4.2倍，k_cat值为755.0 s⁻¹，催化效率为34.52 L·mmol⁻¹·s⁻¹，分别为WT的3.67、2.48倍。55 ℃下处理24 h残余酶活高达90%，65 ℃下的半衰期提升至WT的30倍。分子动力学模拟显示，突变体M5的RMSD和非催化结构RMSF值低于WT，结构稳定性增强，其与底物、辅酶氢键增多，亲和力提升，特定位置氨基酸突变增强区域稳定性和静电作用，实现热稳定性与催化活性同时提升。

综上，本研究基于半理性设计策略，通过两阶段组合突变，获得了酶活性与热稳定性同时提高的AnGOD突变体M5，克服了酶改造过程中的稳定性与活性的权衡难题，为葡萄糖氧化酶的进一步应用奠定了基础。尽管本研究成功提高了AnGOD的酶活性和热稳定性，但仍存在一些挑战，突变体的酶活与热稳定之间的平衡问题仍然需要进一步优化。未来的研究可以考虑通过更多的计算模拟与实验筛选，进一步挖掘新的突变位点，提升GOD的综合性能。与此同时，如何将这些改良的酶应用于更广泛的工业领域，仍是需要解决的重要问题。

参考文献

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文献

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排序方式：

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2026年第47卷第4期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010032

接收时间：2025-01-06
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-02-15

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收稿日期：2025-01-06

基金

作者信息

¹天津科技大学生物工程学院，天津 300457

²中国科学院天津工业生物技术研究所，工业酶国家工程研究中心，天津 300308

³中国科学院天津工业生物技术研究所，低碳合成工程生物学全国重点实验室，天津 300308

⁴山东福洋生物科技股份有限公司，山东德州 253100

通讯作者:

陈朋（1988−），男，博士，副研究员，研究方向：糖生物学，E-mail：chen_p@tib.cas.cn。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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