食品工业科技

名称	分组	引物	引物序列（5’→3’）	位置
虹鳟	第一组 Group1	F3-1	TGAGCCGGGATAGTAGGC	23~40
B3-1	TGGAGGGAGGAGTCAGAAG	253~271
FIP-1	ATGGGCTGTGACGATCACGTTCTACTGATTCGGGCGGAAC	71~52
BIP-1	ATCGGGGGCTTTGGAAACTGAGGAATGCCATATCAGGGGC	173~193
第二组 Group2	F3-2	CTTCTGGGGGATGACCAAAT	89~108
B3-2	ACAGGAGGAGGAGAAAGGAT	271~291
FIP-2	TCAGTTTCCAAAGCCCCCGATTAACGTGATCGTCACAGCC	130~112
BIP-2	TCCCCTAATAATCGGAGCCCCTGAGGGAGGAGTCAGAAGAT	199~222
大西洋鲑		F3	CCCTTCTGGGAGATGACCAA	87~106
B3	GGCTTCAACTCCAGATGAGG	291~310
FIP	AGTTTCCAAAGCCGCCGATCAT-ATTGTTACAGCCCATGCCTT	170~191 119~138
BIP	TCCTCTTATAATCGGGGCCCCC-AAGGAGGGAGGGAGAAGTC	199~220 258~276
LB	GACATAGCATTCCCCCGAATG	221~241

名称	分组	引物	引物序列（5’→3’）	位置
虹鳟	第一组 Group1	F3-1	TGAGCCGGGATAGTAGGC	23~40
B3-1	TGGAGGGAGGAGTCAGAAG	253~271
FIP-1	ATGGGCTGTGACGATCACGTTCTACTGATTCGGGCGGAAC	71~52
BIP-1	ATCGGGGGCTTTGGAAACTGAGGAATGCCATATCAGGGGC	173~193
第二组 Group2	F3-2	CTTCTGGGGGATGACCAAAT	89~108
B3-2	ACAGGAGGAGGAGAAAGGAT	271~291
FIP-2	TCAGTTTCCAAAGCCCCCGATTAACGTGATCGTCACAGCC	130~112
BIP-2	TCCCCTAATAATCGGAGCCCCTGAGGGAGGAGTCAGAAGAT	199~222
大西洋鲑		F3	CCCTTCTGGGAGATGACCAA	87~106
B3	GGCTTCAACTCCAGATGAGG	291~310
FIP	AGTTTCCAAAGCCGCCGATCAT-ATTGTTACAGCCCATGCCTT	170~191 119~138
BIP	TCCTCTTATAATCGGGGCCCCC-AAGGAGGGAGGGAGAAGTC	199~220 258~276
LB	GACATAGCATTCCCCCGAATG	221~241

鱼种	DNA提取方法	测定均值
虹鳟	磁珠法	3.599±0.142	1.764±0.031	2.04±0.063	299.316±17.484
快速提取法	1.59±0.274	0.824±0.054	1.93±0.038	94.263±8.319
大西洋鲑	磁珠法	8.795±0.161	4.649±0.275	1.89±0.037	516.384±14.761
快速提取法	3.049±0.075	1.654±0.013	1.84±0.034	113.472±8.237

鱼种	DNA提取方法	测定均值
虹鳟	磁珠法	3.599±0.142	1.764±0.031	2.04±0.063	299.316±17.484
快速提取法	1.59±0.274	0.824±0.054	1.93±0.038	94.263±8.319
大西洋鲑	磁珠法	8.795±0.161	4.649±0.275	1.89±0.037	516.384±14.761
快速提取法	3.049±0.075	1.654±0.013	1.84±0.034	113.472±8.237

食品中三文鱼源性成分等温快检方法建立

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彭博 ¹ , 洪麟 ² , 高世光 ³ , 陈文超 ² , 赵欣 ² , 刘彦泓 ²^,^* , 郑秋月 ¹^,^*

食品工业科技 | 分析检测 2026,47(4): 360-368

收起

食品工业科技 |分析检测 2026 , 47 (4) : 360 -368

食品中三文鱼源性成分等温快检方法建立

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彭博¹, 洪麟², 高世光³, 陈文超², 赵欣², 刘彦泓²^,^*, 郑秋月¹^,^*

作者信息

¹大连民族大学生命科学学院，生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁大连 116600

²大连市检验检测认证技术服务中心，国家市场监督管理总局技术创新中心（食用农产品安全快速检测与追溯），辽宁大连 116000

³丹东海关综合技术服务中心，辽宁丹东 118000

通讯作者:

刘彦泓（1976−），女，硕士，正高级工程师，研究方向：食品安全，E-mail：3252168072@qq.com。

郑秋月（1972−），女，博士，教授，研究方向：食品质量与安全，E-mail：zhengqy@dlnu.edu.cn。

作者简介:

彭博（2001−），女，硕士研究生，研究方向：水产品质量安全检测，E-mail：1921213830@qq.com

Establishment of Isothermal Rapid Detection Method for Salmon-derived Components in Food

Bo PENG¹, Lin HONG², Shiguang GAO³, Wenchao CHEN², Xin ZHAO², Yanhong LIU²^,^*, Qiuyue ZHENG¹^,^*

Affiliations

¹Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization of Ministry of Education, College of Life Science, Dalian Minzu University, Dalian 116600, China

²Dalian Center for Certification and Food and Drug Control, Technology Innovation Center of Rapid Screening and Traceability for Edible Agricultural Product Safety, State Administration for Market Regulation, Dalian 116000, China

³Dandong Customs Comprehensive Technical Service Center, Dandong 118000, China

出版时间: 2026-02-15 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030257

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摘要

收起

本文建立了虹鳟和大西洋鲑两种三文鱼源性成分可视化和荧光环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）及重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）快速检测方法。以COI基因作为靶标基因，设计筛选适于等温扩增的引物序列，开展等温扩增方法的特异性和灵敏度分析，同时比较基于快速DNA提取和磁珠提取DNA的LAMP方法的适用性。结果表明，所构建的LAMP和RPA等温扩增方法特异性强，使用磁珠法提取DNA的LAMP检测的灵敏度分别可达到2.99×10⁻¹ ng/μL和5.16×10⁻³ ng/μL，使用快速提取DNA的LAMP检测灵敏度分别可达到9.42×10⁰ ng/μL和1.13×10¹ ng/μL。同时制备模拟混合样品，发现虹鳟和大西洋鲑成分RPA等温扩增的灵敏度可达到0.1%（W/W），可视化LAMP等温扩增的灵敏度可稳定达到0.5%（W/W）。LAMP和RPA方法满足低技术要求、低设备成本以及检测时间短的快速检测要求。同时使用裂解液快速提取基因组DNA，可以在30~40 min之内完成检测，对于生产加工及市场等流通环节现场进行三文鱼成分真实性检测是一个很好的选择。

关键词

虹鳟 / 大西洋鲑 / 环介导等温扩增 / 重组酶聚合酶扩增

Abstract

收起

This article presented a visualization method for detecting salmon-derived components in Oncorhynchus mykiss and Salmo salar, based on fluorescence-labeled loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and recombinase polymerase amplification (RPA). The widely recognized COI gene was targeted to design and screen optimal primer sequences for isothermal amplification. The specificity and sensitivity of the isothermal amplification methods were analyzed, and the applicability of LAMP using rapid DNA extraction and magnetic bead-based DNA extraction techniques was compared. The results demonstrated that the constructed LAMP and RPA methods exhibited high specificity. The sensitivity of LAMP detection using magnetic bead-extracted DNA reached 2.99×10⁻¹ ng/μL and 5.16×10⁻³ ng/μL, respectively, whereas using rapid DNA extraction, sensitivity reached 9.42×10⁰ ng/μL and 1.13×10¹ ng/μL, respectively. Simulated mixed samples were prepared, and results showed that the sensitivity of RPA amplification for detecting Oncorhynchus mykiss and Salmo salar components reached 0.1% (w/w), while the sensitivity of visual LAMP amplification consistently reached 0.5% (w/w). Both LAMP and RPA methods met rapid detection requirements, characterized by low technical complexity, minimal equipment cost, and short detection time. Moreover, rapid DNA extraction using lysis solutions allowed the detection process to be completed within 30~40 min, making this approach an excellent choice for on-site authenticity testing of fish species in production, processing, and market circulation stages.

Key words

Oncorhynchus mykiss / Salmo salar / loop-mediated isothermal amplification / recombinase polymerase amplification

引用本文

彭博, 洪麟, 高世光, 陈文超, 赵欣, 刘彦泓, 郑秋月. 食品中三文鱼源性成分等温快检方法建立. 食品工业科技, 2026 , 47 (4) : 360 -368 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030257

Bo PENG, Lin HONG, Shiguang GAO, Wenchao CHEN, Xin ZHAO, Yanhong LIU, Qiuyue ZHENG. Establishment of Isothermal Rapid Detection Method for Salmon-derived Components in Food[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (4) : 360 -368 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030257

正文

收起

大西洋鲑（Salmo salar）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）是生产加工和市场流通领域最常见的三文鱼种类，因为营养丰富一直受到消费者欢迎^[1]。大西洋鲑主要指挪威三文鱼品种，目前国内尚未形成规模化养殖能力，主要依赖进口。同属鲑科的虹鳟作为北美原生淡水鱼种，凭借抗逆性强、肉质软嫩等优势，已成为我国重要水产养殖品种^[2]。伴随消费升级与国际贸易竞争加剧，三文鱼市场存在产品标签溯源混乱、产地信息模糊化标注、原料掺假等问题^[3−4]。虹鳟替代大西洋鲑的掺假事件屡有发生^[5]。部分商家通过模糊标注“三文鱼”诱导消费者误购，损害消费者权益。开发快速精准的三文鱼物种鉴别方法已成为保障食品安全、规范市场秩序的核心需求。

目前对大西洋鲑和虹鳟的鉴别主要有形态学和分子生物学技术。形态学方法主要依赖主观经验，而且鱼类加工后仅凭形态难以辨别^[6]。基于线粒体COI和Cytb基因的DNA条形码技术，通过基因条形码测序可以准确进行鱼种类鉴别^[7−13]，有效鉴别大西洋鲑与虹鳟^[14]。实时荧光定量PCR通过设计特异性引物进行物种真实性检测^[15−18]，已成为物种鉴定的金标准。但是基因条形码方法存在操作繁琐，需要PCR扩增、切胶回收纯化、测序、测序产物拼接比对，检测流程长（至少5~7 d）、需要配备基因测序仪，实时荧光PCR方法也需要实时荧光PCR扩增仪，对实验人员专业程度及实验室环境设备设施要求高等问题。罗娇依等^[19]应用生物质谱技术解析大西洋鲑中生物标志性肽段及过敏原特异性肽段，实现对大西洋鲑的物种鉴别，但质谱-组学等蛋白质技术也存在依赖昂贵仪器设备和专业化人员、检测成本高的难题^[20−21]。无法满足三文鱼生产加工企业检测原料真实性及市场流通监管部门进行鱼种真伪鉴别的现场快速检测需求。

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Gieroń等^[22]于2000年提出的核酸等温扩增技术，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（如Bst DNA聚合酶）和4~6条特异性引物，在60~65 ℃完成等温扩增反应。LAMP技术在鱼类鉴定中具有特异性好、灵敏度高，不需要昂贵的仪器，方便快捷等优势^[23]。重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）是由Piepenburg等^[24]于2006年提出的一种核酸等温扩增技术，可以在低温条件下进行高效DNA扩增。主要通过重组酶与引物结合形成的复合物在37~42 ℃下定位同源序列，结合单链结合蛋白和链置换型DNA聚合酶实现靶标序列扩增，仅需设计两条引物，在30 min内完成等温扩增。由于具有扩增速度快、扩增温度更接近常温，RPA技术已被广泛应用于病原快速诊断^[25−26]、食品安全快速检测等领域^[27−28]。

鱼种真实属性鉴别中，鱼类基因组DNA提取方法是影响检测结果准确性的关键步骤。新兴的环境DNA（Environmental DNA，eDNA）技术^[29]通过对水样进行真空过滤，利用特定孔径的过滤器捕获并有效富集水中的鱼类eDNA，减少杂质干扰，已成功应用于软骨鱼类种类的分布监测^[30]。新型的磁珠提取法利用磁珠与核酸的特异性结合能力^[31]，具有提取效率高、纯度好、能有效去除杂质等优点，并且可减少人为误差、实现提取样品基因组DNA浓度和纯度的标准化。配套自动化核酸提取仪，一次性可提取48~96个样品，适合大批量鱼类样本的DNA提取^[32−33]。磁珠提取法需要配套磁珠提取试剂盒和自动提取仪，更适用于较大型和专业的实验室使用，以提高提取效率。为了满足三文鱼种类现场快速检测的需求，本文探索采用快速DNA提取方法，使用裂解液裂解鱼类组织，释放核酸，无需进行耗时的醇类沉淀，整个提取过程只需15~20 min，可快速提取鱼类基因组DNA，为后续进行三文鱼现场等温扩增快检提供保障。

综上，本文基于等温扩增技术，建立三文鱼源性成分LAMP和RPA两种等温扩增快检方法，同时基于磁珠法提取DNA作比较，探讨快速提取鱼类基因组DNA的适用性，为食品中三文鱼成分的现场快速检测提供技术手段。

1　材料与方法

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1.1　材料与仪器

虹鳟、大西洋鲑、银鲑、粉鲑、红鲑、大马哈鱼样品　大连市瑞驰生产加工企业，物种真实性通过DNA条形码进行测序确认；DNA扩增试剂、动物组织基因组DNA快速提取试剂、显色液（SYBR GREEN I）　广州双螺旋基因技术有限公司；DNA 恒温快速扩增试剂（基础型）　潍坊安普未来生物科技有限公司；Maxwell ® RSC PureFood GMO and Authentication Kit Maxwell磁珠法核酸提取仪器、DNA磁珠提取试剂盒　普洛麦格（北京）生物技术有限公司；Micro Drop超微量分光光度计　上海宝予德科学仪器有限公司；ABI QuantStudio 7定量PCR仪　美国赛默飞世尔科技公司；AD160E 型Mupid-One核酸电泳仪　TaKaRa宝生物工程株式会社；Synergy H1多功能微孔板检测仪　博腾仪器公司；MINIT-100恒温金属浴　日本AS ONE CORPORATION公司。

1.2　实验方法

1.2.1　提取DNA方法比较

1.2.1.1　磁珠法提取DNA

取鱼肉组织样品200 mg，使用磁珠法提取试剂，应用核酸提取仪提取DNA。称取200 mg的鱼肉，无需进行破碎处理，转移至离心管中。按纯化试剂盒说明书进行纯化后，取出洗脱管，获得所提取鱼肉DNA，测定磁珠法提取的基因组DNA的核酸纯度和浓度。磁珠法提取基因组DNA总提取时间为90 min。

1.2.1.2　快速DNA提取法

称取5 g鱼肉，采用研钵进行破碎处理后，转移至无菌均质袋中，加入10 mL生理盐水进行均质混匀。取均质组织20~30 mg，转移至离心管A中，加入500 μL裂解缓冲液A，振荡混匀，80 ℃下热浴15 min后，取10 μL上清液至离心管B中，加入90 μL的缓冲液B中和混匀，得到基因组DNA，测定提取基因组DNA的核酸纯度和浓度。快速DNA提取方法提取基因组DNA时间为20 min。

1.2.1.3　基因组DNA的核酸纯度和浓度测定

采用超微量分光光度计测定提取基因组DNA的核酸纯度和浓度^[34]。取1 μL提取的基因组DNA测定DNA浓度。通过比较260 nm处的吸光度值（A260）与280 nm处的吸光度（A280）的比值评估提取DNA纯度。

1.2.2　引物设计及特异性比对

基于NCBI核苷酸数据库（www.NCBI.nlm.nih.gov/nucleoties），从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中检索虹鳟和大西洋鲑鱼的COI基因序列，选取具有代表性的基因序列，采用DNAStar软件（DNAStar公司，美国）分析种间的同源性。将COI基因序列用作blast搜索中的模板，从blast输出中，在方法开发中选择了得分最高的结果。此外，还检索了用于排他性测试的其他三文鱼的基因序列。使用MEGA 4.0对基因序列进行比对。最终选用虹鳟COI基因序列（LC050735.1）、大西洋鲑（MN850430.1）COI基因序列作为靶标基因，使用LAMP Primer Explorer 5软件（荣研EIKEN公司，日本）分别设计2组虹鳟LAMP引物及1组大西洋鲑LAMP引物，并评估了二级结构和可能的引物二聚体的存在，具体序列见表1。同时设计2组RPA引物，虹鳟RPA上游引物F：AGTAATTATCGGCATACGAAACCAG，虹鳟RPA下游引物R：GTTTCGATAATGATCAGTACTGGGATC，扩增产物长度为102 bp；大西洋鲑RPA上游引物F：ACGAAGGCATGGGCTGTAAC，大西洋鲑RPA下游引物R：GCACCGCCCTAAGTCTCTTG，扩增产物长度为103 bp。引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.3　LAMP等温扩增方法建立

1.2.3.1　可视化LAMP方法建立

可视化LAMP等温扩增在金属浴上进行。LAMP反应体系体积为26 µL，其中，虹鳟LAMP反应体系为：12.5 μL 等温扩增反应液，1 μL Bst聚合酶溶液，1 μL 二（4-羟基苯基）-6（4-甲氧基苯基）-三甲基吡啶三乙酸铵（SYBR GREEN I）显色液，1 μL （0.2 μmol/L）外引物F3+外引物B3，1 μL （1.6 μmol/L））内引物FIP+内引物BIP，0.5 μL荧光染料，7 μL无DNA酶的超纯水，2 μL DNA模板。

大西洋鲑反应体系为：12.5 μL 等温扩增反应液，1 μL Bst聚合酶溶液，1 μL SYBR GREEN I显色液，1 μL （0.2 μmol/L）外引物F3+外引物B3，1 μL （1.6 μmol/L）内引物FIP+内引物BIP，1 μL （0.4 μmol/L））环引物LB，0.5 μL荧光染料，6 μL无DNA酶的超纯水，2 μL DNA模板。

可视化LAMP的等温扩增程序：63 ℃于金属浴恒温孵育45 min，肉眼观察颜色变化。阳性反应将变成黄色，阴性对照保持为橙色。

1.2.3.2　荧光LAMP方法建立

荧光LAMP等温扩增在Flex QuantStudio TM7实时荧光PCR上进行。LAMP反应体系体积为25 µL，其中，虹鳟LAMP反应体系为：12.5 μL 等温扩增反应液，1 μL Bst聚合酶溶液，1 μL （0.2 μmol/L）外引物F3+外引物B3，1 μL （1.6 μmol/L）内引物FIP+内引物BIP，0.5 μL荧光染料，7 μL无DNA酶的超纯水，2 μL DNA模板。

大西洋鲑反应体系为：12.5 μL 等温扩增反应液，1 μL Bst聚合酶溶液，1 μL （0.2 μmol/L）外引物F3+外引物B3，1 μL （1.6 μmol/L）内引物FIP+内引物BIP，1 μL （0.4 μmol/L）环引物LB，0.5 μL荧光染料，6 μL无DNA酶的超纯水，2 μL DNA模板。

荧光LAMP等温扩增程序：63 ℃恒温反应45 min，通过实时荧光PCR仪来观察荧光扩增曲线。

1.2.4　RPA等温扩增方法建立

以提取的虹鳟和大西洋鲑的基因组DNA为模板，分别使用RPA引物进行RPA等温扩增。RPA反应体系（50 μL）：29.4 μL缓冲液A，2 μL上游引物（10 μmol/L），2 μL下游引物（10 μmol/L），11.1 μL ddH₂O，3 μL DNA模板，2.5 μL 激活液B。

RPA反应参数：金属浴38 ℃ 孵育20 min。反应结束后，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5　特异性分析

分别使用虹鳟和大西洋鲑的同属或近属的其他鱼种的基因组DNA进行交叉反应性分析，采用1.2.2中快速提取DNA法提取银鲑、粉鲑、红鲑、大马哈鱼的基因组DNA，用来评估虹鳟与大西洋鲑的可视化LAMP、荧光法LAMP、RPA方法的特异性。

1.2.6　基因组DNA灵敏度实验

以磁珠法提取的虹鳟基因组DNA（初始质量浓度2.99×10² ng/μL）为模板，进行10倍梯度稀释，分别制备2.99×10¹ ng/μL、2.99×10⁰ ng/μL、2.99×10⁻¹ ng/μL、2.99×10⁻² ng/μL总计4个浓度的DNA稀释液。以快速法提取的虹鳟基因组DNA（初始质量浓度9.42×10¹ ng/μL）为模板，进行10倍梯度稀释，分别制备9.42×10¹ ng/μL、9.42×10⁰ ng/μL、9.42×10⁻¹ ng/μL、9.42×10⁻² ng/μL总计4个浓度的DNA稀释液。分别测试荧光法LAMP、可视化LAMP方法的灵敏度。

以磁珠法提取的大西洋鲑基因组DNA（初始质量浓度5.16×10² ng/μL）为模板，进行10倍梯度稀释，分别制备5.16×10² ng/μL、5.16×10¹ ng/μL、5.16×10⁰ ng/μL、5.16×10⁻¹ ng/μL、5.16×10⁻² ng/μL、5.16×10⁻³ ng/μL、5.16×10⁻⁴ ng/μL总计7个浓度的 DNA 稀释液。以快速法提取的大西洋鲑基因组DNA（初始质量浓度1.13×10² ng/μL）为模板，进行10倍梯度稀释，分别制备1.13×10² ng/μL、1.13×10¹ ng/μL、1.13×10⁰ ng/μL、1.13×10⁻¹ ng/μL、1.13×10⁻² ng/μL、1.13×10⁻³ ng/μL、1.13×10⁻⁴ ng/μL总计7个浓度的DNA稀释液。分别测试荧光法LAMP、可视化LAMP方法的灵敏度。

1.2.7　鳕鱼基质添加样品灵敏度

为了更好评价所建立的等温方法适用性，采集虹鳟和大西洋鲑样品，置于电热恒温鼓风干燥箱中，105 ℃烘干，搅拌机打磨成干粉，分别与鳕鱼粉按照干重质量以不同比例混合，再置于搅拌机中充分打磨混合。虹鳟和大西洋鳟样品分别与鳕鱼粉样品按质量比例（50%、20%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%）进行混合，提取不同浓度混合样品的DNA作为模板，分别比较可视化LAMP和RPA检测模拟添加样品的灵敏度，评估建立的可视LAMP方法与RPA方法检测基质样品中的虹鳟和大西洋鲑源性成分的适用性。

1.3　数据处理

实验中统计学分析方法软件采用SPSS V27.0；采用独立样本t检验对样本进行显著性分析；图表绘制软件为Origin2021、Excel 2013。

2　结果与分析

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2.1　基因组DNA提取方法比较

分别采用快速法和磁珠法提取大西洋鲑和虹鳟基因组DNA，使用超微量分光光度计测定吸收值及计算浓度，核酸纯度及浓度测定结果（表2）。并通过SPSS进行了方差分析，计算得出虹鳟基于两种DNA提取方法的P=0.1052，大西洋鲑基于两种DNA提取方法的P=0.0636，二者均满足P>0.05，表明两种DNA提取方法之间无显著差异，满足后续核酸检测需求。

2.2　虹鳟LAMP引物筛选结果

通过荧光法LAMP对表1中设计的2组虹鳟LAMP引物进行筛选，分析荧光扩增曲线结果显示（图1），第1组引物阳性对照的出峰时间约为21 min，平行扩增曲线拟合度较好；第2组引物阳性对照的出峰时间约为24 min，平行扩增曲线重复性稍差，两组引物阴性对照均无扩增。因此选择出峰较早且重复性较好的虹鳟第1套引物（表1），用于建立虹鳟源性成分LAMP方法及特异性和灵敏度试验。

2.3　特异性分析

2.3.1　虹鳟LAMP方法优化及特异性测试

采用虹鳟源性成分优化筛选后的第1组LAMP引物进行特异性试验，对大西洋鲑、银鲑、粉鲑、红鲑、大马哈鱼的基因组DNA进行可视化和荧光法LAMP分析，通过颜色变化和荧光分析特异性。由图2（A）和图2（B）所示，LAMP反应40 min时，红鲑及银鲑出现交叉反应，荧光法LAMP也出现非特异性荧光扩增曲线，可视LAMP结果发生非特异性显色变化。为了降低交叉反应的发生，将LAMP等温扩增时间优化至30 min。结果表明，LAMP扩增30 min，荧光法LAMP只有虹鳟检出阳性的荧光扩增曲线，其他样品均为阴性（图2（C））；可视化LAMP仅虹鳟源性成分呈现出阳性反应的黄色，其他样品均为阴性反应的橙色（图2（D））。表明虹鳟源性成分采用LAMP等温扩增30 min具有良好特异性。据此以改进后的63 ℃、恒温孵育30 min，作为虹鳟可视化和荧光LAMP的等温扩增程序，用于后续实验。

2.3.2　大西洋鲑LAMP方法特异性测试及优化

采用大西洋鲑LAMP引物进行特异性试验，对虹鳟、银鲑、粉鲑、红鲑、大马哈鱼的基因组DNA进行可视化和荧光法LAMP分析，通过颜色变化和荧光分析检测特异性。在虹鳟LAMP实验基础上，为了避免发生非特异性扩增，将大西洋鲑LAMP反应初始时间更改为30 min进行初始反应。由图3（A）和图3（B）所示，发现LAMP扩增30 min时，可视LAMP扩增粉鲑发生非特异性显色变化，荧光法LAMP扩增粉鲑也发生非特异性荧光扩增曲线。本文进一步改进LAMP等温扩增条件，将等温扩增时间优化至15 min。经改进后，荧光法LAMP在反应15 min时只有大西洋鲑检出阳性的荧光扩增曲线，其他样品均为阴性（图3（C））；可视化法LAMP（图3（D））仅大西洋鲑呈现出阳性反应的黄色，其他样品均为阴性反应的橙色。证明大西洋鲑LAMP引物在等温扩增15 min时具有良好特异性。据此以改进后的63 ℃、等温扩增15 min，作为大西洋鲑可视化和荧光LAMP的等温扩增程序，用于后续实验。

2.4　LAMP方法检测基因组DNA的灵敏度

2.4.1　虹鳟源性成分基因组DNA灵敏度结果

对不同核酸提取方法获得的虹鳟DNA进行LAMP灵敏度实验。图4结果表明，磁珠法提取DNA进行LAMP扩增，最低检测浓度可达到2.99×10⁻¹ ng/μL（图4（B）），快速法提取DNA进行LAMP扩增，最低检测浓度可达到9.42×10⁰ ng/μL（图4（C）），荧光LAMP扩增均出现典型的阳性荧光扩增曲线且结果稳定，可视LAMP呈现明显颜色变化（图4（A））。使用SPSS软件进行统计分析，比较基于磁珠法提取DNA和以快速提取DNA建立的LAMP方法灵敏度的差异性，计算得到P = 0.281>0.05，证实两种虹鳟DNA提取方式的LAMP检测灵敏度结果没有显著性差异。

2.4.2　大西洋鲑源性成分基因组DNA的灵敏度

对不同核酸提取方法获得的大西洋鲑DNA进行LAMP的灵敏度实验。图5结果表明，磁珠法提取DNA进行LAMP扩增，最低检测浓度可达到5.16×10⁻³ ng/μL（图5（D）），快速法提取DNA进行LAMP扩增，最低检测浓度可达到1.13×10¹ ng/μL（图5（B）），荧光LAMP扩增均出现典型的阳性荧光扩增曲线且结果稳定，可视LAMP呈现明显颜色变化（图5（A）、图5（B））。比较基于磁珠法和快速提取法建立的LAMP方法灵敏度的差异性，计算得到P=0.611>0.05，证实两种大西洋鲑DNA提取方式的LAMP灵敏度结果没有显著性差异。

2.5　RPA方法检测结果

虹鳟和大西洋鲑的RPA等温扩增结果如图6所示。虹鳟及大西洋鲑成分均出现相应电泳条带，虹鳟的特异性扩增产物为102 bp，大西洋鲑的特异性扩增产物为103 bp。分别以虹鳟和大西洋鲑的引物检测银鲑、粉鲑、红鲑、大马哈鱼等近源或相关鱼种DNA，均未出现特异性扩增电泳条带。特异性实验结果表明，本文建立的大西洋鲑和虹鳟源性成分的RPA等温扩增方法具有良好特异性。

2.6　模拟添加样品灵敏度实验结果

模拟添加样品灵敏度实验结果如图7所示。虹鳟和大西洋鲑可视化LAMP等温方法的灵敏度可稳定达到0.5% （W/W）（图7（A）、图7（C））。虹鳟和大西洋鳟模拟添加样品的RPA等温方法的灵敏度可达到0.1% （W/W）（图7（B）、图7（D））。

3　结论

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本文进行了食品中主要两种三文鱼，大西洋鲑和虹鳟源性成分等温扩增方法研究，建立了两种三文鱼荧光LAMP和可视化LAMP方法以及RPA等温扩增方法。与虹鳟基于内引物和外引物的LAMP方法相比，大西洋鲑引入一对环引物，基于内引物、外引物和环引物组合可极大缩短LAMP反应时间，提高扩增效率，可在20 min内完成LAMP等温扩增检测，引入外引物极大提高LAMP等温扩增的灵敏度。同时，本文探讨了基于快速提取和磁珠法提取DNA的LAMP方法的检测效率，发现快速提取和磁珠法提取DNA适用于后续等温扩增检测三文鱼源性成分，都具有很好的特异性和灵敏度。两种DNA提取方法适合不同检测目的和检测场景需要，磁珠法提取DNA适合专业实验室大批量精准检测需要；基于快速DNA提取的可视化LAMP方法由于简化了样本预处理步骤，降低了检测成本，不需要复杂的仪器设备，具有稳定热源的设备即可进行反应，操作简便，更适合在养殖一线和生产流通场所进行现场快速检测。所建立的RPA等温扩增方法可以与胶体金试纸条或者CRISPR-Cas基因编辑技术联用，为等温扩增技术推广至更广泛的检测场景提供了可能。

参考文献

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参考文献引证文献

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2026年第47卷第4期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030257

接收时间：2025-03-19
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-02-15

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收稿日期：2025-03-19

基金

作者信息

¹大连民族大学生命科学学院，生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁大连 116600

²大连市检验检测认证技术服务中心，国家市场监督管理总局技术创新中心（食用农产品安全快速检测与追溯），辽宁大连 116000

³丹东海关综合技术服务中心，辽宁丹东 118000

通讯作者:

刘彦泓（1976−），女，硕士，正高级工程师，研究方向：食品安全，E-mail：3252168072@qq.com。

郑秋月（1972−），女，博士，教授，研究方向：食品质量与安全，E-mail：zhengqy@dlnu.edu.cn。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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鱼种	DNA提取方法	测定均值
鱼种	DNA提取方法	A260	A280	A260/A280比值	浓度（ng/μL）
虹鳟	磁珠法	3.599±0.142	1.764±0.031	2.04±0.063	299.316±17.484
虹鳟	快速提取法	1.59±0.274	0.824±0.054	1.93±0.038	94.263±8.319
大西洋鲑	磁珠法	8.795±0.161	4.649±0.275	1.89±0.037	516.384±14.761
大西洋鲑	快速提取法	3.049±0.075	1.654±0.013	1.84±0.034	113.472±8.237