食品工业科技

白芸豆抗氧化肽稳定性分析及其修复细胞氧化应激损伤的研究

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谢晓妍 ¹ , 张芸溪 ¹ , 王颖 ¹^,²^,³^,^* , 刘童 ¹ , 李思楠 ⁴ , 庞惟俏 ¹ , 佐兆杭 ¹ , 张璐 ⁴^,^* , 管骁 ⁵ , 赵自力 ⁶ , 李冰 ⁶

食品工业科技 | 营养与保健 2026,47(5): 417-427

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食品工业科技 |营养与保健 2026 , 47 (5) : 417 -427

白芸豆抗氧化肽稳定性分析及其修复细胞氧化应激损伤的研究

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谢晓妍¹, 张芸溪¹, 王颖¹^,²^,³^,^*, 刘童¹, 李思楠⁴, 庞惟俏¹, 佐兆杭¹, 张璐⁴^,^*, 管骁⁵, 赵自力⁶, 李冰⁶

作者信息

¹黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319

²国家杂粮工程技术中心，黑龙江大庆 163319

³厦门海洋职业技术学院，福建厦门 361100

⁴中国食品发酵工业研究院有限公司，功能主食创制与慢病营养干预北京市重点实验室，北京 100015

⁵上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093

⁶安徽省农业科学院皖北研究院，安徽阜阳 236600

通讯作者:

王颖（1979−），女，博士，教授，研究方向：农产品加工与贮藏工程及食品质量安全，E-mail：wychen156@163.com。

张璐（1987−），女，博士，高级工程师，研究方向：功能食品开发与精准营养及功效评价，E-mail：zhanglu8078@126.com。

作者简介:

谢晓妍（2000−），女，硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：xxy10750220@163.com

Stability Analysis and Oxidative Stress Mitigation Effects of White Kidney Bean Antioxidant Peptide on Cellular Damage

Xiaoyan XIE¹, Yunxi ZHANG¹, Ying WANG¹^,²^,³^,^*, Tong LIU¹, Sinan LI⁴, Weiqiao PANG¹, Zhaohang ZUO¹, Lu ZHANG⁴^,^*, Xiao GUAN⁵, Zili ZHAO⁶, Bing LI⁶

Affiliations

¹College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China

²National Coarse Cereals Engineering Center, Daqing 163319, China

³Xiamen Ocean Vocational College, Xiamen 361100, China

⁴China National Research Institute of Food and Fermentation Industries Co., Ltd., Beijing Key Laboratory of the Innovative Development of Functional Staple and the Nutritional Intervention for Chronic Disease, Beijing 100015, China

⁵School of Health Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China

⁶Anhui Academy of Agricultural Sciences Wanbei Research Institute, Fuyang 236600, China

出版时间: 2026-03-01 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030206

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摘要

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目的：以前期制备的Mw<3 kDa的白芸豆抗氧化肽（White kidney bean antioxidant peptides，WKBAPs）为原料探究其体外稳定性及对细胞损伤的保护作用。方法：通过测定WKBAPs体外DPPH自由基、ABTS⁺自由基、羟自由基清除率和总抗氧化能力分析pH、温度、金属离子、食品配料成分和体外消化对WKBAPs稳定性的影响，并利用偶氮二异丁基二盐酸盐（AAPH）诱导HepG2细胞建立氧化损伤模型研究WKBAPs对细胞氧化应激损伤的保护作用。结果：WKBAPs在不同处理条件下抗氧化活性有所波动，但整体表现稳定，仍能保持较高的抗氧化活性，经强酸、强碱、高温（>60 ℃）、高浓度Ca²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺及高质量分数的NaCl、柠檬酸和葡萄糖处理后，WKBAPs的抗氧化活性均显著降低（P<0.05），在K⁺浓度增加时，WKBAPs的DPPH和ABTS⁺自由基清除率先降低后逐渐保持稳定，羟自由基清除率和总抗氧化能力略有下降但不显著（P>0.05）；在肠消化阶段自由基清除率显著降低，但在肠消化终点（240 min）仍具有较好的抗氧化活性，其DPPH自由基、ABTS⁺自由基、羟自由基清除率和总抗氧化能力分别为78.03%±1.01%、94.05%±0.47%、74.75%±0.29%和0.76±0.02 mmol Fe²⁺/g。此外，WKBAPs能显著增加细胞的存活率、提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活力，减少活性氧（ROS）的产生、降低乳酸脱氢酶（LDH）水平、抑制丙二醛（MDA）的生成。结论：WKBAPs具有良好的体外稳定性并且能有效地修复细胞损伤，这一结果为其在食品保健领域的开发及应用提供了理论支持。

关键词

白芸豆抗氧化肽 / 抗氧化活性 / 稳定性 / 氧化损伤 / HepG2细胞模型

Abstract

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Objective: To investigate the in vitro antioxidant activity and stability of white kidney bean antioxidant peptides (WKBAPs). Method: In order to analyze the effects of pH, temperature, metal ions, food ingredient composition, and simulated gastrointestinal digestion on the stability of antioxidant peptides in white kidney beans, the DPPH free radical scavenging rate, ABTS⁺ free radical scavenging rate, hydroxyl free radical scavenging rate, and total antioxidant capacity were measured, and an oxidative damage model was established in HepG2 cells induced by 2,2'-azodiisobutyramidine dihydrochloride (AAPH) to explore the protective effect of WKBAPs on cellular oxidative damage. Results: Although the antioxidant activity of WKBAPs fluctuated under different processing conditions, the overall performance remained stable, still maintaining a high level of antioxidant activity. Only under strong acid, strong base, high temperatures (>60 ℃), high concentrations of Ca²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, and elevated levels of NaCl, citric acid, and glucose, the antioxidant activity of WKBAPs was significantly diminished (P<0.05). As the K⁺ concentration increased, the DPPH and ABTS⁺ radical scavenging capacities of WKBAPs initially decreased and subsequently stabilized. Meanwhile, the hydroxyl radical scavenging capacity and total antioxidant ability exhibited a slight but non-significant decline (P>0.05). During intestinal digestion, the DPPH and hydroxyl radical scavenging rates were significantly reduced, but the high antioxidant activity was still maintained. At the end of 240 minutes intestinal digestion process, its DPPH radical scavenging rate, ABTS⁺ radical scavenging rate, hydroxyl radical scavenging rate, and total antioxidant capacity were 78.03%±1.01%, 94.05%±0.47%, 74.75%±0.29%, and 0.76±0.02 mmol Fe²⁺/g, respectively. In the AAPH induced oxidative damage model of HepG2 cells, WKBAPs could increase the survival rate of HepG2 cells damaged by AAP oxidation. It significantly reduced the production of reactive oxygen species (ROS), dramatically decreased the release level of lactate dehydrogenase (LDH) into the cell culture supernatant due to membrane damage, inhibited the production of malondialdehyde (MDA), and enhanced the activity of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px). Conclusion: WKBAPs has good in vitro antioxidant activity and stability, providing a theoretical basis for its application and development in the field of food and healthcare.

Key words

white kidney bean antioxidant peptide / antioxidant activity / stability / oxidative damage / HepG2 cell model

引用本文

谢晓妍, 张芸溪, 王颖, 刘童, 李思楠, 庞惟俏, 佐兆杭, 张璐, 管骁, 赵自力, 李冰. 白芸豆抗氧化肽稳定性分析及其修复细胞氧化应激损伤的研究. 食品工业科技, 2026 , 47 (5) : 417 -427 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030206

Xiaoyan XIE, Yunxi ZHANG, Ying WANG, Tong LIU, Sinan LI, Weiqiao PANG, Zhaohang ZUO, Lu ZHANG, Xiao GUAN, Zili ZHAO, Bing LI. Stability Analysis and Oxidative Stress Mitigation Effects of White Kidney Bean Antioxidant Peptide on Cellular Damage[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (5) : 417 -427 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030206

正文

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氧化应激是由机体自由基生成与清除系统失衡引起的病理状态^[1]，与衰老、癌症、心血管疾病及神经退行性疾病等密切相关^[2−3]。自由基通过攻击生物大分子（如DNA、蛋白质和脂质），导致细胞功能紊乱甚至凋亡^[4]。因此，开发高效、安全的抗氧化剂以缓解氧化损伤已成为现代医学与食品科学的研究热点。传统合成的抗氧化剂（叔丁基-4-羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对甲酚等）虽效果显著，但潜在的毒副作用和生物利用度问题限制了其应用^[5]，天然来源的抗氧化活性物质因其安全性和多样性逐渐受到重视。

植物源性抗氧化肽因其分子量小、穿透性强、活性高且易于吸收的特点备受研究者青睐^[6]。近年来，众多学者致力于从植物资源中开发具有抗氧化活性的多肽，以期获得安全、高效的新型抗氧化剂。豆科植物中富含的生物活性肽可通过清除自由基、结合金属离子或激活内源性抗氧化酶系统发挥抗氧化作用^[7−8]。白芸豆作为我国传统药食两用资源，其营养丰富、价格低廉，蛋白质含量高且富含所有人体必需氨基酸^[9]，是制备抗氧化肽的理想植物原料。近年来，已有研究报道白芸豆多肽具有较好的体外抗氧化活性^[10]。抗氧化肽的实际应用价值与其环境稳定性密切相关，温度、pH、消化酶等因素可能引起肽链构象变化或降解，导致活性丧失^[11]。此外，在食品加工中，食品配料成分复杂多样，它们相互作用共同影响着食品的整体性质。杨涵^[12]发现大豆抗氧化肽在高温（>60 ℃）条件下活性稳定，但强碱性（pH>9）条件下活性显著下降，而李雪^[13]也证实外源因素会导致紫花芸豆肽的生物活性下降。目前，白芸豆源抗氧化肽在不同加工或生理条件下的稳定性尚未明确，这限制了其在功能食品或医药领域的进一步开发。此外，现有研究多聚焦于体外化学抗氧化模型，而关于其在细胞水平上对氧化损伤的干预效应的研究仍显不足。

基于此，本研究以白芸豆抗氧化肽（White kidney bean antioxidant peptides，WKBAPs）为原料，系统评价其在热处理、pH梯度变化、金属离子、食品配料浓度变化及体外消化条件下的活性稳定性，并采用偶氮二异丁基二盐酸盐（2,2'-Azodiisobutyramidine dihydrochloride, AAPH）诱导HepG2细胞氧化损伤模型，探究WKBAPs在细胞层面的抗氧化活性，以期为WKBAPs的加工工艺优化及新型天然抗氧化剂的开发提供理论依据。

1　材料与方法

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1.1　材料与仪器

白芸豆蛋白（纯度为89%）　实验室自提；枯草芽孢杆菌　中国工业微生物菌种保藏中心；HepG2细胞　中国食品发酵工业研究院有限公司保存；中性蛋白酶（50000 U/g）　北京Solarbio生物科技有限公司；维生素C（V_C）标准品、二甲基亚砜（DMSO）　上海麦克林生化科技有限公司；硫酸亚铁（FeSO₄）、水杨酸　分析纯，上海源叶生物科技有限公司；2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、偶氮二异丁基二盐酸盐（AAPH）　美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶消化液（5×10⁴ U）、α-MEM液体培养基　中科迈晨（北京）科技有限公司；CCK-8试剂盒（>99.0%）、BCA蛋白质浓度测定试剂盒　上海碧云天生物技术有限公司；ROS、MDA、LDH、SOD、GSH-Px活性测定试剂盒　南京建成生物工程研究所。

CHRIST真空冷冻干燥机　德国Christ公司；YXQ-100G高温高压灭菌锅　上海博迅医疗生物仪器有限公司；DL-CL-2ND超净工作台　哈东联电子技术有限公司；DNP-9052恒温培养箱　上海精宏实验设备公司；HZQ-A恒温摇床　常州市科迈实验仪器有限公司；Cf72-8YW酶联免疫检测仪　珀金埃尔默仪器有限公司；CKX41倒置式生物显微镜　OLYMPUS公司；E191IR CO₂培养箱　美国GOLD-SIM公司。

1.2　实验方法

1.2.1　WKBAPs制备

准确称取白芸豆蛋白5 g加入100 mL去离子水溶解，添加3000 U/g中性蛋白酶于53 ℃、pH为7条件下酶解2 h，121 ℃灭菌灭酶15 min进行后续发酵。加入5%枯草芽孢杆菌种子液（活菌数为1.0×10⁷ CFU/mL），37 ℃下发酵48 h，发酵完毕后离心（4000 r/min，15 min）收集上清液后采用分子量为3 kDa的超滤管进行超滤分离，得到分子量<3 kDa的组分，收集浓缩并冷冻干燥，得到WKBAPs。

1.2.2　抗氧化活性稳定性实验

1.2.2.1　pH对WKBAPs抗氧化活性的影响

参考Singh等^[14]方法，配制1 mg/mL WKBAPs溶液，分别将其pH调至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，于室温静置2 h后调至原始pH，并测其抗氧化活性。

1.2.2.2　温度对WKBAPs抗氧化活性的影响

参考王子俊等^[15]方法，配制1 mg/mL WKBAPs溶液，在20、40、60、80、100 ℃下分别保温2 h，每30 min测定一次抗氧化活性。

1.2.2.3　金属离子对WKBAPs抗氧化活性的影响

参考韦珍等^[16]方法并稍作修改，配制1 mg/mL WKBAPs溶液，分别向溶液中加入0、0.5、1、1.5、2 mmol/L的KCl、CaCl₂、CuSO₄、ZnSO₄，室温静置2 h后测其抗氧化活性。

1.2.2.4　食品配料成分对WKBAPs抗氧化活性的影响

参考杨艾华等^[17]方法并稍作修改，配制1 mg/mL的WKBAPs溶液，在溶液中分别添加质量分数分别为0、1%、2%、3%、4%的NaCl、葡萄糖、柠檬酸，室温放置2 h后，测定其抗氧化活性。

1.2.2.5　体外消化对WKBAPs抗氧化活性的影响

参照李思楠等^[18]的方法。在1 mg/mL WKBAPs样品溶液10 mL中加入10 mL胃液，振荡孵化1 h（37 ℃、200 r/min），随后迅速添加NaOH（2 mol/L）调节pH至7.0，以终止胃模拟消化。之后于消化体系中加入20 mL肠液，振荡孵育3 h（200 r/min、37 ℃）。分别于消化时间为0、20、40、60、80、100、120、150、180、210、240 min时吸取适量样品，沸水浴加热灭酶（100 ℃，10 min）后离心（5000 r/min，10 min）后取上清液，测定胃肠道消化对WKBAPs抗氧化活性的影响。

1.2.3　抗氧化活性测定

1.2.3.1　DPPH自由基清除率

参考Sun等^[19]方法，将WKBAPs溶液与0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液按1:1混合后暗反应（25 ℃，30 min），测定517 nm处OD值，根据公式（1）计算。

$\rm \mathrm{P}(\text{%})=\left[1-\frac{\left({A}_{i}-{A}_{j}\right)}{{A}_{0}}\right]\times 100 $

(1)

式中：P为自由基清除率；A_i为样品与显色剂混合液的吸光度；A_j为样品不加显色剂的吸光度；A₀为不加样品的吸光度。

1.2.3.2　ABTS⁺自由基清除率

参考沙玉欢等^[20]方法，取1.4 mL稀释后的ABTS工作液与0.1 mL WKBAPs溶液混匀，避光反应（25 ℃，6 min），测定734 nm处OD值，计算如公式（1）。

1.2.3.3　羟自由基清除率

参考夏吉安等^[21]方法。将WKBAPs溶液与FeSO₄·7H₂O溶液（6 mmol/L）和H₂O₂溶液（6 mmol/L）按1:1:1的体积比混匀后反应（37 ℃，10 min），接着向反应体系中加入1 mL水杨酸溶液（6 mmol/L），并充分混合，继续孵育（37 ℃，30 min），测定510 nm处OD值，计算如公式（1）。

1.2.3.4　总抗氧化能力

参考卢跃红等^[22]方法。取0.1 mL WKBAPs溶液加入0.5 mL FRAP试剂，37 ℃反应10 min，测定595 nm处OD值，铁离子还原能力以Fe_SO₄当量表示。Fe_SO₄标准曲线回归方程为：y=0.219x−0.0008，R²=0.9995。

1.2.4　HepG2细胞培养及分组

将HepG2细胞置于恒温培养箱（37 ℃，5% CO₂）中孵育24 h。当细胞密度接近80%时，移除旧培养液，用预冷PBS缓冲液（pH7.0）轻柔漂洗，随后加1 mL胰酶常温孵育1 min，传代培养。选取对数期状态良好的细胞悬液经细胞计数后均匀铺于细胞培养皿中，并对其进行分组。设置正常组（无酚红的纯培养基）、模型组（添加1.5 mmol/L AAPH溶液）、阳性对照组（将1.5 mmol/L AAPH与50 µg/mL V_C溶液混合干预）、试验组（将AAPH与WKBAPs溶液混合，WKBAPs终浓度为200~600 µg/mL）。

1.2.5　CCK-8法测定AAPH及WKBAPs对HepG2细胞的毒性作用

参照李海枝等^[23]的方法并稍加修改。在96孔板中加入100 μL细胞悬液（1×10⁵ cell/mL），于恒温培养箱（37 ℃，5% CO₂）培养24 h，吸去旧培养基，后加入不同浓度AAPH溶液（终浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 mmol/L）和WKBAPs溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）于恒温培养箱（37 ℃，5% CO₂）培养24 h，随后加入50 µL CCK-8试剂并孵育2 h，测定450 nm处OD值，按公式（2）计算细胞存活率。

$ \rm{\text{细胞存活率}}(\text{%})=\left[\frac{C_1-C_2}{C_3-C_2}\right]\times100 $

(2)

式中：C₁为样品孔的吸光度值；C₂为空白孔的吸光度值；C₃为对照孔的吸光度值。

1.2.6　AAPH诱导细胞氧化损伤模型的建立

将HepG2细胞以1×10⁶ cell/mL的密度接种至6孔板中，于恒温培养箱（37 ℃，5% CO₂）中孵育24 h，待细胞生长至80%左右时加入不同浓度的AAPH（0.5、1、1.5、2、2.5 mmol/L）诱导24 h，诱导结束后，使用PBS清洗，随后按照试剂盒方法，测定各组细胞SOD、GSH-Px、ROS和MDA水平。

1.2.7　WKBAPs对AAPH诱导HepG2细胞的氧化因子的影响

细胞培养分组同1.2.4处理细胞后，按照试剂盒方法，处理细胞并测定各组细胞SOD、GSH-GPx、ROS、LDH、MDA水平。

1.3　数据处理

采用Origin 2022软件进行制图，利用IBM SPSS statistics 21.0软件进行ANOVA显著性分析。每个样品均做3个平行，结果以平均值±标准误差表示。

2　结果与分析

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2.1　WKBAPs稳定性分析

2.1.1　pH 对WKBAPs抗氧化活性的影响

在食品加工过程中，pH是影响活性肽稳定性的重要因素之一。由图1可知，经强酸、强碱处理后，WKBAPs的抗氧化活性均显著降低（P<0.05），推测可能是在强酸或强碱条件下多肽空间结构发生变化^[24]，从而降低了其与自由基结合的能力，导致抗氧化活性下降，这一结果与唐宁等^[25]对玉米抗氧化肽稳定性的研究结果类似。综上所述，在食品加工过程中，应注意控制体系的pH应处于中性或偏碱性，以保持抗氧化肽的稳定性和活性。

2.1.2　温度对WKBAPs的抗氧化活性的影响

如图2所示，WKBAPs在20~40 ℃范围内抗氧化活性保持稳定，随着温度和加热时间的增加，抗氧化活性显著降低（P<0.05）。在温度为100 ℃处理2 h后，WKBAPs的抗氧化活性均显著降低（P<0.05），DPPH、ABTS⁺、羟自由基清除率和总抗氧化能力分别从87.51%下降至78.36%、90.80%下降至80.38%、85.68%下降至79.92%以及0.8052 mmol Fe²⁺/g下降至0.7431 mmol Fe²⁺/g。表明WKBAPs对温度变化的敏感度较高，可能是由于极端热环境诱发多肽链的构象重排，从而影响了其抗氧化活性，并且蛋白质结构易受高温影响而变性，导致抗氧化活性降低^[14]。结果表明，在加工过程中，应注意控制温度，以保持抗氧化肽的稳定性和活性。

2.1.3　金属离子对WKBAPs的抗氧化活性的影响

在食品加工、贮藏及运输环节中金属容器的使用是不可避免的，而金属离子的出现可能会对产品的质量及功效造成影响^[26]。金属离子对WKBAPs抗氧化活性的影响如图3所示，K⁺浓度增加时，WKBAPs的DPPH和ABTS⁺自由基清除率先降低后逐渐保持稳定，羟自由基清除率和总抗氧化能力略有下降，但总体影响不显著（P>0.05）。随着Ca²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺离子浓度的增加，WKBAPs的抗氧化活性显著下降（P<0.05），该趋势与张靖^[27]研究结论相似，推测可能是高浓度的金属离子干扰了活性肽分子中的电子和氢原子的转移，进而通过离子间的相互作用掩盖了肽的作用位点^[28]。因此，在WKBAPs加工贮藏过程中要尽量避免接触金属离子，以保持其活性。

2.1.4　食品配料成分对WKBAPs的抗氧化活性的影响

在食品加工中，NaCl、葡萄糖及柠檬酸为代表的常规添加剂，其离子强度与分子构型会影响多肽的抗氧化活性^[29]。NaCl对WKBAPs的抗氧化活性的影响如图4所示，随着NaCl质量分数的增加，WKBAPs的抗氧化活性显著下降（P<0.05）。WKBAPs在低质量分数状态下抗氧化活性均较稳定，原因可能是NaCl在水溶液中电离的Na⁺和Cl⁻能中和WKBAPs表面电荷，当NaCl添加量超过临界阈值时，溶液的离子强度增加并改变肽分子的电荷状态，从而干扰了肽与自由基之间的相互作用^[30]。因此，在WKBAPs的加工与应用中可适量添加NaCl。

从图4可以看出，高浓度的柠檬酸对抗氧化活性均有显著抑制作用（P<0.05），原因可能是柠檬酸降低了体系的pH，影响WKBAPs的供电子能力，导致抗氧化活性下降^[31]。研究结果与刘帅言等^[32]研究结果中柠檬酸对ABTS⁺自由基清除活性有明显抑制作用相一致，这可能是由于WKBAPs富含多种具有抗氧化特性的氨基酸，而这些氨基酸在酸性环境下容易发生构象变化或降解，从而影响其抗氧化性能，还可能通过与抗氧化氨基酸的羧基或氨基发生相互作用^[33]，进一步削弱其抗氧化活性。因此，在WKBAPs的加工、储存及应用过程中，应严格控制柠檬酸等酸性物质的添加量，以避免抑制WKBAPs的抗氧化活性。

如图4所示，在不同浓度的葡萄糖条件下，WKBAPs的抗氧化活性显著降低（P<0.05），这可能是由于葡萄糖与WKBAPs发生非酶促褐变反应，生成了不具有抗氧化活性的产物^[34]。因此，在WKBAPs的加工和应用过程中，同样需要严格控制葡萄糖等还原糖的添加量，以保持其良好的抗氧化活性。

2.1.5　体外消化对WKBAPs抗氧化活性的影响

抗氧化肽在消化酶作用下，结构会发生改变，从而影响其抗氧化活性^[35]。如图5所示，在0~60 min的胃液消化阶段，随着消化时间的延长，DPPH自由基清除率先下降后趋于平稳，总抗氧化能力较稳定，可能是由于胃蛋白酶主要作用于蛋白质的多肽链，将大分子的蛋白质水解为小分子的肽和氨基酸^[36]，而WKBAPs本身分子量较小，结构较为简单，因此在胃蛋白酶的作用下结构相对稳定，抗氧化活性也未发生明显变化；在60~240 min的肠消化阶段，DPPH和羟自由基清除率显著降低（P<0.05），但在肠消化终点（240 min）仍具有较好的抗氧化活性，其DPPH自由基、ABTS⁺自由基、羟自由基清除率和总抗氧化能力分别为78.03%±1.01%、94.05%±0.47%、74.75%±0.29%和0.76±0.02 mmol Fe²⁺/g。这可能是因为WKBAPs中的肽存在消化酶潜在结合位点，将小分子肽水解为无活性的游离氨基酸^[37–38]。综上，经模拟胃肠消化后，WKBAPs仍具有较高的抗氧化活性，说明WKBAPs具有一定的耐胃肠消化的能力。

2.2　WKBAPs对HepG2细胞氧化损伤的保护作用

2.2.1　不同浓度AAPH和WKBAPs对HepG2细胞活力的影响

AAPH是一种小分子偶氮引发剂，能够诱导过氧自由基的生成^[39]。如图6（A）所示，AAPH对细胞具有一定的损伤作用，随着AAPH浓度的增加，细胞存活率显著下降（P<0.05）。当AAPH浓度达到0.5 mmol/L时显著抑制细胞生长，因此选择浓度0.5~2.5 mmol/L进行后续实验。

图6（B）为WKBAPs对HepG2细胞毒性的影响，经不同浓度（0.2~1.0 mg/mL）的WKBAPs诱导细胞24 h后，结果表明，与未经WKBAPs处理的正常组细胞相比，在质量浓度为0.2~0.6 mg/mL时WKBAPs对HepG2细胞的增殖无显著抑制或促进作用（P>0.05）。因此，选择低剂量（0.2 mg/mL）、中剂量（0.4 mg/mL）和高剂量（0.6 mg/mL）3种浓度用于后续各实验组。

2.2.2　HepG2细胞氧化应激模型的建立

如图7（A）（B）所示，采用不同浓度的AAPH诱导HepG2细胞24 h，与正常组细胞相比，0.5~2.5 mmol/L的AAPH使细胞SOD和GSH-Px活性均显著降低（P<0.05），其中1.5 mmol/L浓度的AAPH处理SOD活性较正常组降低了41.73%，GSH-Px活性较正常组降低了34.09%。细胞内ROS的过度积累会引发细胞损伤，使细胞的还原氧化稳态失衡，进而引发氧化应激^[40–41]。因此，细胞内ROS水平可以作为细胞氧化损伤程度的直接指标。各组细胞在处理后的ROS水平如图7（C）所示，经过24 h处理后，随着AAPH浓度的提高，ROS含量也相应增加。在1.5 mmol/L的浓度下，ROS水平较正常组差异显著（P<0.05）。细胞中MDA含量能够显示出机体内脂质过氧化的水平，进而间接反映细胞氧化损伤程度^[42]。从图7（D）可以看出，与正常组细胞相比，随着AAPH浓度的增加，细胞内MDA含量显著升高（P<0.05），在1.5 mmol/L浓度下，MDA含量较正常组增加了303.94%。综上所述，当AAPH浓度为1.5 mmol/L时，细胞内抗氧化酶活性显著降低，ROS水平及MDA含量显著升高，表明该浓度AAPH能够成功诱导HepG2细胞产生氧化应激反应，且细胞存活率为68.19%，因此，采用1.5 mmol/L的AAPH建立HepG2细胞氧化损伤模型。

2.2.3　WKBAPs对AAPH诱导HepG2细胞氧化损伤的影响

细胞内存在的抗氧化酶系统是其抵御氧化应激损伤的重要防线，细胞内存在的抗氧化酶系统构成了其对抗氧化应激损伤的关键防御机制。因此，抗氧化酶活力的变化可反映物质的抗氧化活性^[43]。如图8（A）（B）所示，与正常组细胞相比，模型组的SOD和GSH-Px活力显著下降（P<0.05），表明建模成功。与模型组相比，低、中、高剂量组和阳性对照组的细胞内SOD和GSH-Px活力显著升高（P<0.05），且呈现浓度依赖性。其中，高剂量组的SOD活力接近正常组的水平，同时还能显著提高细胞内GSH-Px的活力，效果接近于50 µg/mL V_C组。

抗氧化剂在体内发挥抗氧化能力的方式有直接和间接两种，直接的抗氧化能力表现为抗氧化剂提供氢原子或电子，以清除细胞内的ROS^[44]。本研究中，测定了WKBAPs干预后HepG2细胞内ROS水平，结果如图8（C）所示，与正常组相比，模型组的ROS水平激增到正常组的1.9倍，说明细胞在AAPH干预后发生了显著的氧化应激反应；与模型组相比，经0.2、0.4和0.6 mg/mL的WKBAPs干预后ROS水平均显著降低（P<0.05），且呈现出剂量依赖性。结果表明WKBAPs能够有效清除细胞内的ROS，减轻氧化应激对细胞的损伤。

当细胞内ROS水平过高时会促进脂质过氧化反应，产生过氧化产物，其中MDA是细胞内脂质过氧化反应的关键产物之一^[45]。WKBAPs对AAPH诱导HepG2细胞中MDA含量的影响如图8（D）所示，与正常组相比，模型组细胞内MDA含量显著增加了273.12%（P<0.05），表明经AAPH诱导的HepG2细胞产生了大量的MDA。与模型组相比，经WKBAPs干预后MDA含量显著降低（P<0.05），且呈现剂量依赖性，说明WKBAPs能够有效抑制MDA的生成，进而减轻氧化应激对细胞的损伤。

LDH是一种细胞质酶，主要存在于细胞内，当细胞膜受损时会释放到培养基中，通过检测培养基中LDH的活力，可以判断细胞损伤情况^[46]。如图8（E）所示，与正常组相比，AAPH处理会导致细胞外LDH水平显著升高（P<0.05），表明HepG2细胞膜受到破坏，而WKBAPs的干预能显著降低这种趋势（P<0.05），其中，高浓度的WKBAPs干预后，细胞外LDH水平接近正常组，说明细胞结构得到了保护，且效果优于50 µg/mL V_C组。综上所述，WKBAPs的干预能修复HepG2细胞氧化损伤，清除细胞内多余自由基，保护细胞膜的完整性，提高细胞内抗氧化酶活力。

3　结论

收起

本实验使用前期制备的WKBAPs，验证其体外稳定性及对AAPH诱导的氧化损伤的改善作用。研究结果表明，WKBAPs具有较好的稳定性，虽然在不同加工条件下其抗氧化活性有所波动，但整体表现稳定，特别是在极端pH、高温、金属离子存在以及食品配料成分干扰的情况下，WKBAPs仍能保持一定的抗氧化能力；WKBAPs在肠消化阶段DPPH和羟自由基清除率显著降低，但仍保持较高的抗氧化活性。细胞实验结果显示，WKBAPs可以显著提升被AAPH氧化损伤的HepG2细胞的存活率，减少ROS的产生，并显著降低LDH的生成。此外，WKBAPs能够上调抗氧化酶SOD和GSH-Px的活力，抑制MDA的生成。综上所述，WKBAPs表现出良好的抗氧化活性和细胞修复作用，为其在食品、保健品及医药领域的进一步应用提供理论依据，也为保健产品的开发、疾病的预防提供了新思路，但当前的研究仅局限于体外活性表征，后续将基于动物实验进一步验证其在体内的生物学功能，为白芸豆作为功能性食品改善人体健康提供科学依据。

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2026年第47卷第5期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030206

接收时间：2025-03-17
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-03-01

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收稿日期：2025-03-17

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作者信息

¹黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319

²国家杂粮工程技术中心，黑龙江大庆 163319

³厦门海洋职业技术学院，福建厦门 361100

⁴中国食品发酵工业研究院有限公司，功能主食创制与慢病营养干预北京市重点实验室，北京 100015

⁵上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093

⁶安徽省农业科学院皖北研究院，安徽阜阳 236600

通讯作者:

王颖（1979−），女，博士，教授，研究方向：农产品加工与贮藏工程及食品质量安全，E-mail：wychen156@163.com。

张璐（1987−），女，博士，高级工程师，研究方向：功能食品开发与精准营养及功效评价，E-mail：zhanglu8078@126.com。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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