食品工业科技

家族	β-半乳糖苷酶晶体结构数量/家族总晶体数量	单体序列长度	催化结构域	单体中Domain 数量	聚合体形式	首个β-半乳糖苷酶晶体结构及发布时间
GH1	8/88	400~600 aa	TIM	−	二聚体^[12]/四聚体^[13−14]	1GOW（1996.9）
GH2	13/64	700~1000 aa	TIM	5	单体^[15−17]/二聚体^[18]/三聚体/四聚体^[19−20]/六聚体^[21]/八聚体^[22]	4V40（1994.4）
GH35	13/18	600~1000 aa	TIM	6	单体^[23−27]/二聚体^[28−29]/四聚体^[30−31]/十二聚体^[32]	1TG7（2004.5）
GH42	10/12	600~700 aa	TIM	3	三聚体^{[5−6,9,33−37]}/六聚体^[38]	1KWG，1KWK （2002.1）
GH50	0/4	−	−	−	−	−
GH59	0/1	−	−	−	−	−
GH154	1/2	398 aa	（α/α）₆	−	四聚体^[3]	8OI4（2024.1）

家族	β-半乳糖苷酶晶体结构数量/家族总晶体数量	单体序列长度	催化结构域	单体中Domain 数量	聚合体形式	首个β-半乳糖苷酶晶体结构及发布时间
GH1	8/88	400~600 aa	TIM	−	二聚体^[12]/四聚体^[13−14]	1GOW（1996.9）
GH2	13/64	700~1000 aa	TIM	5	单体^[15−17]/二聚体^[18]/三聚体/四聚体^[19−20]/六聚体^[21]/八聚体^[22]	4V40（1994.4）
GH35	13/18	600~1000 aa	TIM	6	单体^[23−27]/二聚体^[28−29]/四聚体^[30−31]/十二聚体^[32]	1TG7（2004.5）
GH42	10/12	600~700 aa	TIM	3	三聚体^{[5−6,9,33−37]}/六聚体^[38]	1KWG，1KWK （2002.1）
GH50	0/4	−	−	−	−	−
GH59	0/1	−	−	−	−	−
GH154	1/2	398 aa	（α/α）₆	−	四聚体^[3]	8OI4（2024.1）

来源微生物特点	来源微生物（酶代号）	PDB ID	催化氨基酸位点	序列相似性（%）	Cα RMSD （Ǻ）	催化特性
嗜热	Thermus sp. A4（A4-β-Gal）	1KWG 1KWK	E141 E312	100	0.00	三聚体；T_opt70 ℃，pH6.5；对乳糖亲和力弱。
G. stearothermophilus T-6 （GanB;Gan42B）	4OIF 4OJY 5DFA	E158 E323	26.3	1.98	三聚体；T_opt 53 ℃，pH6.0；无乳糖活性；无转糖苷活性；对GOS有催化活性。
嗜冷、嗜盐（来自南极冰湖）	H. lacusprofundi （Bga）	6LVW	E142 E312	45.4	1.44	三聚体；4 mol/L NaCl 或 KCl存在条件下，T_opt 50~55 ℃，pH6.5；4~10 ℃下可保留10%~13%活性。
嗜冷（来自南极）	Marinomonas ef1 （M-bgal）	6Y2K	E142 E314	54.0	0.96	六聚体；T_opt 5 ℃，37~50 ℃稳定；pH6.0。
嗜冷	Rahnella sp. R3 （R-β-Gal）	5E9A	E157 E314	30.6	1.90	三聚体；4 ℃活性高；作用温度4~35 ℃，pH6.5。
嗜碱	B. circulans sp. alkalophilus （Bcα-β-Gal）	3TTS 3TTY	E150 E307	29.2	1.75	六聚体；T_opt 55 ℃，最适作用pH6~7.5；对乳糖亲和力低，具有弱转糖苷活性。
肠道益生菌	B. animalis subsp. Lactis （Gal42A）	4UNI 4UOQ 4UOZ	E159 E323	27.3	1.86	三聚体；T_opt 45 ℃，pH5.5。
	B. bifidum S17（BbgII）	4UCF 4UZS	E161 E320	26.9	1.89	三聚体；T_opt 40 ℃， pH6.0；无GOS合成能力。
	B. animalis subsp. lactis Bl-04 （BlArap42B）	5XB7	E151 E311	25.7	1.91	三聚体；T_opt 30 ℃，pH6.5。
	B. longum subsp. infantis （BiBga42A）	8IBR 8IBS 8IBT	E160 E318	29.5	1.85	三聚体；T_opt 37 ℃，pH6.5；LNT利用能力。

来源微生物特点	来源微生物（酶代号）	PDB ID	催化氨基酸位点	序列相似性（%）	Cα RMSD （Ǻ）	催化特性
嗜热	Thermus sp. A4（A4-β-Gal）	1KWG 1KWK	E141 E312	100	0.00	三聚体；T_opt70 ℃，pH6.5；对乳糖亲和力弱。
G. stearothermophilus T-6 （GanB;Gan42B）	4OIF 4OJY 5DFA	E158 E323	26.3	1.98	三聚体；T_opt 53 ℃，pH6.0；无乳糖活性；无转糖苷活性；对GOS有催化活性。
嗜冷、嗜盐（来自南极冰湖）	H. lacusprofundi （Bga）	6LVW	E142 E312	45.4	1.44	三聚体；4 mol/L NaCl 或 KCl存在条件下，T_opt 50~55 ℃，pH6.5；4~10 ℃下可保留10%~13%活性。
嗜冷（来自南极）	Marinomonas ef1 （M-bgal）	6Y2K	E142 E314	54.0	0.96	六聚体；T_opt 5 ℃，37~50 ℃稳定；pH6.0。
嗜冷	Rahnella sp. R3 （R-β-Gal）	5E9A	E157 E314	30.6	1.90	三聚体；4 ℃活性高；作用温度4~35 ℃，pH6.5。
嗜碱	B. circulans sp. alkalophilus （Bcα-β-Gal）	3TTS 3TTY	E150 E307	29.2	1.75	六聚体；T_opt 55 ℃，最适作用pH6~7.5；对乳糖亲和力低，具有弱转糖苷活性。
肠道益生菌	B. animalis subsp. Lactis （Gal42A）	4UNI 4UOQ 4UOZ	E159 E323	27.3	1.86	三聚体；T_opt 45 ℃，pH5.5。
	B. bifidum S17（BbgII）	4UCF 4UZS	E161 E320	26.9	1.89	三聚体；T_opt 40 ℃， pH6.0；无GOS合成能力。
	B. animalis subsp. lactis Bl-04 （BlArap42B）	5XB7	E151 E311	25.7	1.91	三聚体；T_opt 30 ℃，pH6.5。
	B. longum subsp. infantis （BiBga42A）	8IBR 8IBS 8IBT	E160 E318	29.5	1.85	三聚体；T_opt 37 ℃，pH6.5；LNT利用能力。

GH42家族β-半乳糖苷酶结构生物信息分析

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郭铭菲 ¹ , 郑煜铭 ² , 顾海洋 ¹ , 王禄山 ³ , 董艺凝 ¹^,^*

食品工业科技 | 生物工程 2026,47(10): 175-184

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食品工业科技 |生物工程 2026 , 47 (10) : 175 -184

GH42家族β-半乳糖苷酶结构生物信息分析

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郭铭菲¹, 郑煜铭², 顾海洋¹, 王禄山³, 董艺凝¹^,^*

作者信息

¹滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州 239000

²安徽大学生命科学学院，安徽合肥 230000

³山东大学微生物技术国家重点实验室，山东青岛 266237

通讯作者:

董艺凝（1980−），女，博士，教授，研究方向：酶工程，E-mail：dong_yining@163.com。

作者简介:

郭铭菲（2001−），女，硕士研究生，研究方向：酶工程，E-mail：13526566335@163.com

Structural Bioinformatics Analysis of GH42 Family β-Galactosidases

Mingfei GUO¹, Yuming ZHENG², Haiyang GU¹, Lushan WANG³, Yining DONG¹^,^*

Affiliations

¹School of Biological Science and Food Engineering, Chuzhou University, Chuzhou 239000, China

²School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230000, China

³State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Qingdao 266237, China

出版时间: 2026-05-15 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025040365

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摘要

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目的：为解析GH42家族(Glycoside hydrolase family 42）β-半乳糖苷酶不同嗜极催化特性差异形成的分子结构原因，本研究以GH42家族已解析晶体结构为研究对象，系统分析其结构特征与催化性质之间的关系。方法：通过酶催化特性与其来源微生物相关性，并结合氨基酸组成、进化、疏水性及结构生物信息分析方法，对具有不同嗜极催化特性GH42家族β-半乳糖苷酶分子结构差异进行比较研究。结果：GH42家族β-半乳糖苷酶氨基酸组成具有偏好性，谷氨酸（E）含量高而赖氨酸（K）含量低，等电点（Isoelectric point，pI）偏低；酶的催化特性与其宿主微生物生长环境呈适应性关联。家族中耐热及耐低温酶存在“成对”进化现象。耐热酶分子结构内部疏水性高，而耐低温酶表面亲水性强。耐低温酶在TIM（Triose-phosphate isomerase，TIM）桶状催化结构域与Domain B链接处以及C-末端存在共性柔性差异显著区域；而耐热酶则通过提高氢键数量及氨基酸P含量增强单体刚性提高作用温度。结论：GH42家族以保守分子结构为基础，通过分子内部与外部疏水性差异分化出耐低温及耐热两类β-半乳糖苷酶。家族酶对温度的适应性是其单体分子结构柔性、氢键数量及聚合态共同作用的结果。本研究从家族进化关系出发，系统探讨了成员酶之间的结构差异及其催化特性分化，为GH42家族β-半乳糖苷酶嗜极性催化特性的深入研究及具有多元耐受特性工程酶的开发提供了通用性参考。

关键词

糖苷水解酶42家族（GH42） / β-半乳糖苷酶 / 结构生物信息 / 进化 / 嗜极催化特性

Abstract

收起

Objective: To elucidate the structural basis underlying the diverse extremophilic catalytic properties of β-galactosidases in the GH42 glycoside hydrolase family, enzymes with resolved crystal structures were systematically analyzed to reveal the relationship between structural features and catalytic characteristics. Methods: Correlation analysis between catalytic properties and microbial habitats was performed, combined with amino acid composition, phylogenetic evolution, hydrophobicity distribution, and structural bioinformatics approaches, to investigate the structural determinants responsible for catalytic diversity among GH42 β-galactosidases. Results: GH42 β-galactosidases exhibited a biased amino acid composition characterized by relatively high glutamate (E) content and low lysine (K) content, resulting in generally low isoelectric points (pI). The catalytic properties of these enzymes were adaptively correlated with the growth environments of their host microorganisms. A ''paired'' evolutionary pattern was observed between thermophilic and cold-adapted β-galactosidases within the family. Thermostable enzymes possessed higher internal hydrophobicity, whereas cold-adapted enzymes display stronger surface hydrophilicity. Cold-adapted enzymes exhibited significantly distinct flexible regions at the junction between the TIM-barrel domain and Domain B, as well as at the C-terminus. In contrast, thermostable enzymes enhanced structural rigidity by increasing hydrogen bond numbers and proline (P) content to improve their optimal temperature range. Conclusion: GH42 β-galactosidases shared a conserved molecular scaffold and diverged into cold-adapted and thermostable enzymes via differential internal and surface hydrophobicity. Temperature adaptation of these enzymes arised from the synergistic effects of monomer flexibility, number of hydrogen bonds, and oligomeric state. Based on the evolutionary relationships within the family, this study systematically explored the structural divergence and catalytic differentiation among GH42 enzymes. These findings provide a general reference for further investigations into extremophilic catalysis of GH42 β-galactosidases and the development of engineered enzymes with multi-tolerant properties.

Key words

glycoside hydrolase family 42 (GH42) / β-galactosidase / structural bioinformatics / evolution / polarophilic

引用本文

郭铭菲, 郑煜铭, 顾海洋, 王禄山, 董艺凝. GH42家族β-半乳糖苷酶结构生物信息分析. 食品工业科技, 2026 , 47 (10) : 175 -184 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025040365

Mingfei GUO, Yuming ZHENG, Haiyang GU, Lushan WANG, Yining DONG. Structural Bioinformatics Analysis of GH42 Family β-Galactosidases[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (10) : 175 -184 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025040365

正文

收起

β-半乳糖苷酶，全称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶（β-D-galactoside galacto hydrolase，EC 3.2.1.23）具有强水解和弱转糖苷双向催化功能^[1]。工业上以乳糖作为底物，利用β-半乳糖苷酶的转糖苷催化活性合成低聚半乳糖（galactooligosaccharide，GOS）^[2]。按照氨基酸序列相似性，β-半乳糖苷酶分属于GH1、GH2、GH35、GH42、GH50、GH59家族，并于2024年新增了GH154家族^[3]。1994年GH2家族首个β-半乳糖苷酶晶体结构（PDB:4V40）被报道。1996年，GH1家族中报道了具有半乳糖苷水解活性的多功能糖苷酶（PDB:1GOW）。截至目前，GH1和GH2两个家族中晶体结构总量明显多于其它五个家族，但其中β-半乳糖苷酶晶体结构数量并不多，研究相对缓慢；GH50和GH59家族中尚无β-半乳糖苷酶晶体结构发布。而GH42和GH35家族来源β-半乳糖苷酶因具有多样化催化特性及应用开发潜力，越来越受到关注，结构研究发展也相对较快，近二十年持续有新的酶晶体结构研究^[4−5]。

目前，仅GH42家族为全部由β-半乳糖苷酶组成的单一功能糖苷水解酶家族，其家族成员作用底物偏好低聚糖类，具有转糖苷催化合成益生元的应用开发潜力，并包含耐热、耐低温、耐盐、耐碱等多样化嗜极催化特性^[6−9]。系统研究这些具有进化关系，且分子结构保守的同源酶之间结构差异与功能分化之间的关系，对于β-半乳糖苷酶的应用开发和分子改造具有积极促进作用。因此，本研究以GH42家族β-半乳糖苷酶晶体结构为研究对象，通过结构生物信息分析，初步探讨了酶的结构差异及其对温度适应性的影响，为GH42家族β-半乳糖苷酶催化特性研究及多元耐受特性工程酶的开发提供参考。

1　材料与方法

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1.1　试验材料

数据来源于Carbohydrate-Active Enzymes （CAZY，http://www.cazy.org/）数据库中GH42家族已发布β-半乳糖苷酶晶体结构，包括Thermus sp. A4来源A4-β-Gal（PDB ID: 1KWG、1KWK）、Geobacillus stearothermophilus T-6来源GanB和Gan42B（PDB ID: 4OIF、4OJY和5DFA）、 Halorubrum lacusprofundi来源Bga （PDB ID: 6LVW）、Marinomonas ef1来源M-bGal（PDB ID: 6Y2K）、Rahnella sp. R3来源R-β-Gal（PDB ID: 5E9A）、Bacillus circulans subsp. alkalophilus 来源Bcα-β-Gal（PDB ID: 3TTS、3TTY）、Bifidobacterium animalis subsp. Lactis Bl-04来源Gal42A （PDB ID: 4UNI、4UOQ和4UOZ）、Bifidobacterium bifidum S17来源BbgII （PDB ID: 4UCF、4UZS）、B. animalis subsp. lactis Bl-04来源BlArap42B （PDB ID: 5XB7）、Bifidobacterium longum subspecies infantis来源BiBga42A（PDB ID: 8IBR、8IBS和8IBT）。

1.2　实验方法

1.2.1　GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶结构分析

利用Discovery Studio 2021对β-半乳糖苷酶三维结构进行比对，计算RMSD和序列相似度，并进行分子结构图形可视化处理。使用Composition Profiler（http://www.cprofiler.org）分析GH42家族，GH2家族，GH35家族及Swissport51结构数据之间氨基酸组成差异^[10]。利用BANΔIT（https://bandit.uni-mainz.de/）进行PDB结构B’-factor值计算及结构柔性比较^[11]。

1.2.2　进化分析

利用MEGA软件及TimeTree（http://www.timetree.org/）进行进化分析。

1.2.3　 β-半乳糖苷酶理化性质分析

将蛋白序列按.fasta文件格式或UniProtKB数据库编号输入ExPASy ProtParam Tool（https://web.expasy.org/protparam/），通过蛋白序列计算得出氨基酸组成比例、理论等电点（pI）、分子量（MW）及总疏水性（GRAVY）等。通过ChimeraX软件加载酶分子结构文件（.pdb）利用“hbonds”命令计算分子内氢键数量（Intra-model H-bonds）；调整分子显示模式后生成表面（Surface）并计算表面电荷、亲水性。

1.3　数据处理

原始蛋白质序列数据通过UniProt数据库和CAZY数据库获取，序列分析与理化性质计算采用ProtParamTool（ExPASy）。蛋白质结构分析在UCSF ChimeraX（version 1.6.1）中进行。使用Discovery Studio 2021和PyMOL 2.5进行分子结构可视化处理。采用Origin 2021软件进行数据处理及图形绘制。

2　结果与分析

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2.1　GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶催化特性与其来源微生物相关性分析

GH42家族现有β-半乳糖苷酶晶体结构12个，除去Planococcus sp. L4来源BgaP为低分辨率结晶体外，本研究以其余11个晶体结构作为家族成员酶代表进行分析，并以PDB ID作为本研究过程中酶代号。由表1可知，GH1、GH2、GH35和GH42家族中β-半乳糖苷酶均采用了TIM催化结构，但不同家族来源酶在单体序列长度、结构与组成及聚合形式上都有差异。GH42家族β-半乳糖苷酶单体序列长度为600~700 aa，大于GH1家族β-半乳糖苷酶序列长度，且略小于GH2和GH35家族。虽然目前已知β-半乳糖苷酶聚合态存在单体、二聚体、三聚体、四聚体、六聚体、八聚体和十二聚体七种形式，但GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶主要以较稳定的三聚体形式存在。这可能是由于这些β-半乳糖苷酶多来源于嗜极性微生物，需要更稳定的聚合态形式以适应催化环境，如嗜热菌Thermus sp. A4和G. stearothermophilus T-6，嗜冷菌Marinomonas ef1和Rahnella sp. R3，嗜冷兼嗜盐菌H. lacusprofundi和Planococcus sp. L4，嗜碱菌B. circulans sp. alkalophilus。

同时，如表2所示，这些β-半乳糖苷酶的催化特性也与其来源微生物生存环境相适应。如嗜热菌Thermus sp. A4来源β-半乳糖苷酶1KWG最适作用温度为70 ℃；嗜冷嗜盐菌H. lacusprofundi来源β-半乳糖苷酶6LVW在低温条件（4~10 ℃）下仍然有活性。另外，GH42家族多为中性β-半乳糖苷酶，最适作用pH为6.5，而嗜碱菌B. circulans sp. alkalophilus来源β-半乳糖苷酶3TTS的pH作用范围可达6~7.5；肠道益生菌属Bifidobacterium来源β-半乳糖苷酶4UNI、4UCF、5XB7及8IBR作用温度范围为30~45 ℃，最适作用pH为5.5~6.5，适合肠道环境。由于乳糖不是嗜极微生物及肠道微生物进化过程中的常用及主要碳水化合物，因此与目前用于乳糖水解的商品化β-半乳糖苷酶不同，GH42家族β-半乳糖苷酶多不擅长利用乳糖，对乳糖亲和力较弱。如表2所示，部分GH42家族成员酶甚至没有乳糖水解活性，包括1KWG、4OIF和3TTS（3TTY）。但是，GH42家族部分成员酶具有低聚糖大分子利用能力及转糖苷活性。如3TTS具有转糖苷活性；4OIF能够利用低聚半乳糖；8IBR能够利用乳四糖（LNT）。已有研究显示，GH42家族可以利用与其基因组比邻的GH53家族先行降解的低聚糖分子^[39]。由此表明，β-半乳糖苷酶催化特性与其来源微生物生存环境及其碳水化合物利用形式紧密相关，并且可能是造成β-半乳糖苷酶催化特性差异产生的重要因素。

GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶氨基酸序列相似性差异较大。以Thermus sp. A4来源1KWG为参照，其它成员酶与其序列相似性一致性均为30%左右，但Cα原子RMSD值差异均小于2，最低为0.96，表明酶分子结构进化保守性较高。值得关注的是，耐热酶1KWK与同为耐热酶的4OIF氨基酸序列相似性最低、RMSD值最大，反而与耐低温β-半乳糖苷酶6Y2K氨基酸序列相似度最高，RMSD值最小。由此推测6Y2K可能与1KWK在进化时间上更接近。同时也表明，除了对环境温度的适应性，造成催化功能进化分歧产生因素还有多种，如GH42家族肠道微生物来源的多个β-半乳糖苷酶之间就具有对底物识别的差异性分化，这也与肠道复杂的碳水化合物存在环境相符合。

2.2　GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶氨基酸组成分析

对比不同糖苷水解酶家族β-半乳糖苷酶氨基酸组成可以发现，GH42家族和GH35家族具有较明显的高含量区（蓝色）和低含量区（红色），而GH2家族氨基酸组成在含量上无明显分化（图1）。GH42家族与GH2、GH35家族和蛋白结构数据库（Swissprot51）相比（图2），含量上调氨基酸为A、D、E、H、R和W；含量下调氨基酸为I、K、N、S和T。表明GH42家族β-半乳糖苷酶氨基酸组成具有偏好性。另外，带短侧链的脂肪族氨基酸A和G在三个家族中含量均较高；氨基酸C和M在三个家族中普遍较低。而与GH2家族和GH35家族相比，GH42家族中酸性、带负电荷的氨基酸E含量高,而带正电荷的碱性氨基酸K含量低。同时，GH42家族β-半乳糖苷酶pI相对低于其它两个家族，其中GH42家族平均pI为5.41，GH35家族平均pI为5.95，而GH2家族平均pI为5.80。有研究表明，蛋白质进化过程中可以通过氨基酸替换促使pI发生改变^[40]。由此推测，GH42家族E含量高、K含量低的特点可能是其pI值相对其它家族较低的原因。另有关于嗜极性酶分子进化的研究结果显示，低pI值、酸性酶蛋白更适应高盐环境^[41]。GH42家族具有多种来源于嗜极性细菌和古细菌的β-半乳糖苷酶，对早期地球环境的进化适应可能是形成这一氨基酸组成特点的原因。

另外，GH42家族β-半乳糖苷酶中氨基酸T、S、P和R含量差异较大。其中，P含量较高的1KWK、6LVW和6Y2K均具有较好的热稳定性。如，1KWK为耐热酶；6LVW兼具热稳定性及耐低温催化特性；耐低温的6Y2K与6LVW相似，均具有良好的热稳定性（37~50 ℃）。现有研究结果表明P含量高，可增强酶分子结构刚性^[42]。但是，同为耐热酶的4OIF中出现例外，其P含量较低。由此表明，P含量不是决定GH42家族β-半乳糖苷酶分子结构热稳定性的唯一因素。

2.3　GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶进化分析

对GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶的进化分析结果如图3所示。与预期假设不同，进化并未按照酶来源微生物对环境的适应性进行聚类。相反地，Marinomonas ef1来源耐低温酶6Y2K与Thermus sp. A4来源耐热酶1KWG，以及Rahnella sp. R3来源耐低温酶5E9A与G. stearothermophilus T-6来源耐热酶4OIF，分别表现出较近的进化关系。有研究表明，酶的嗜冷与嗜盐功能进化存在结构上的矛盾性，多数低温海水环境（即耐盐耐低温环境）中的微生物来源酶往往具有中温适应性^[43]。还有研究认为，耐低温特性需要通过损失热稳定性来获取^[44]。这也可能是GH42家族耐热与耐低温β-半乳糖苷酶进化上相近的原因。基于耐低温酶与耐热酶在不同时期、“成对”进化现象，结合这两类酶分子Cα骨架具有较高的保守性，本研究推测，GH42家族耐低温及耐热β-半乳糖苷酶可能是基于相对保守的分子结构，通过氨基酸突变分化出与其来源微生物生长环境温度相适应的稳定性和作用温度范围。有关GH42家族β-半乳糖苷酶对环境温度的适应性进化机制还有待深入探讨。

此外，现有研究认为蛋白质表面非保守氨基酸是其在相对拥挤细胞环境中相互“碰撞”产生的进化结果，表面电荷是影响酶蛋白对盐耐受性的重要因素^[41,45]。本研究观察并分析了GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶进化过程中表面电荷的变化情况，发现处于进化早期的H. lacusprofundi来源6LVW，表面电荷明显低于进化后期家族成员。有研究表明，蛋白质表面电荷影响其在细胞中与其它蛋白质的相互作用，并且在不同宿主细胞中存在较大差异。而嗜极性微生物来源的酶蛋白表面电荷往往变异较大，以更好地适应其所在的细胞环境^[46−47]。由此推测，6LVW表面电荷明显较低可能正是对其所处细胞环境的一种适应性表现。同时，另有研究显示，微生物种群能够根据其内含蛋白质的表面电荷进行聚类，同类微生物其内含蛋白质具有相近的表面电荷，但是同一微生物种属间也存在进化差异^[48]。GH42家族β-半乳糖苷酶表面电荷符合上述规律，如Bifidobacterium来源β-半乳糖苷酶5XB7、8IBR和4UCF表面电荷都为−5左右，但B. animalis subsp. Lactis Bl-04来源4UNI为−1.77，在研究对象中表面电荷最高，也是研究对象中已知唯一的弱耐酸性酶。由此表明，蛋白质结构表面带电氨基酸突变也是GH42家族β-半乳糖苷酶获得相应细胞环境适应性的进化途径。

2.4　GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶疏水性特性（RGAVY）分析

如图4所示，对比耐热酶与耐低温发现，二者GRAVY没有规律性差异，但耐低温酶分子结构表面GRAVY值（Surface-GRAVY）和内部GRAVY值（以TIM桶状结构域8个β-片层计，β₈-GRAVY）均低于耐热酶。符合耐低温酶表面亲水性较强，耐热酶内部疏水性较强的规律^[49−52]。由此推测，GH42家族β-半乳糖苷酶最适作用温度与Surface-GRAVY值及β₈-GRAVY值相关。进一步分析发现，在序列相似度较高的情况下，内部β₈结构域疏水性高，分子表面亲水性高的酶最适作用温度高，如4UNI（T_opt 45 ℃）与4UCF（T_opt 40 ℃）；具有相似β₈-GRAVY值，Surface-GRAVY值的酶最适作用温度相近。例如，来自嗜碱性微生物的3TTS与耐热酶4OIF，二者序列相似度高，β₈-GRAVY值及Surface-GRAVY值均接近，即内部疏水性及表面亲水性相似，则二者最适作用温度亦相似，分别是53和55 ℃。GH42家族相对其它含β-半乳糖苷酶的糖苷水解酶家族，具有典型的TIM桶状结构域，这可能是部分序列相似度高、分子结构RMSD差异小的家族成员最适作用温度与Surface-GRAVY值和β₈-GRAVY值相关的原因。

2.5　GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶结构差异分析

GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶分子结构之间差异相对较小，RMSD值均在1.5左右。但其对温度的适应性却呈现出耐高温、耐低温及兼具耐低温和热稳定性的多元化特性。已有研究表明，耐热酶分子具有较高的刚性，而耐低温酶分子结构柔性较大^[53−55]。因此，本研究以表征分子结构柔性的B-factor为主要指标，通过对比归一化B-factor（即B’-factor）分析结构差异产生的空间位置及与温度适应性之间的关系。

2.5.1　嗜冷微生物来源β-半乳糖苷酶分子结构对比

6LVW、6Y2K和5E9A同为GH42家族嗜冷微生物（H. lacusprofundi、Marinomonas ef1、Rahnella sp. R3）来源β-半乳糖苷酶，但三者作用温度范围差异较大。如图5所示，三者柔性从大到小依次为5E9A>6Y2K>6LVW。在GH42家族β-半乳糖苷酶包含的三个结构域（Domain A、Domain B和Domain C）中^[6]，6LVW、6Y2K和5E9A柔性差异在C-末端最明显，位于Domain C。同时，三者在400 aa氨基酸位点附近，即Domain A与Domain B链接处存在明显差异。其中，6Y2K与5E9A相比，二者最适作用温度相近（均为4~5 ℃），但ΔB’-factor相差较大（±10）。现有研究表明，6Y2K作用温度范围广、热稳定性高，并以六聚体形态存在，使其成为少见地兼具低温催化活性和热稳定性的酶^[38]。但本研究对比6Y2K和5E9A结构发现，6Y2K分子结构中的氢键数约为5E9A的6倍，其单体结构刚性大于5E9A。同时，6Y2K在Domain A与Domain B链接处的柔性大于5E9A，而在C-末端柔性显著低于5E9A。由此可知，除了氢键数目、单体聚合形态这两个影响酶分子结构稳定性的普遍因素外，C-末端对稳定性的影响为GH42家族特有因素。6LVW与6Y2K相比，6Y2K氢键数量是6LVW的6.7倍，但其分子柔性仍大于6LVW。这与二者的温度适应特性相符，6LVW虽来自嗜冷微生物，且低温下可以保持活性，但其最适作用温度范围为50~55 ℃，与耐热酶相似，表明6LVW单体分子结构刚性是其获得耐热特性的主要因素。6LVW与5E9A相比，ΔB’-factor相差较小（±5），结构柔性整体较相似。除了Domain A与Domain B链接处、C-末端，二者在Domain A上增加了柔性显著的区域，但仅C-末端的柔性降低对6LVW刚性提高具有正向作用。通过上述对比分析可知，GH42家族嗜冷微生物来源β-半乳糖苷酶，在Domain A与Domain B链接处以及C-末端存在共性的柔性差异显著位点区域，其中，C-末端对耐低温酶稳定性影响作用为GH42家族特有因素。另外，Domain A主要由保守的TIM桶状催化结构域构成，是糖苷水解酶家族保守的祖先分子，Domain A与Domain B链接处的柔性差异在进化上的作用和意义有待深入探讨。

2.5.2　耐热酶β-半乳糖苷酶分子结构对比

1KWK和4OIF同为GH42家族耐热β-半乳糖苷酶，并均以三聚体形态存在，但二者最适作用温度相差较大，1KWK最适作用温度为70 ℃，高于4OIF最适作用温度（53 ℃）。现有研究表明，提高分子刚性可以提高酶的耐热性^[53]，由此推测1KWK分子刚性大于4OIF，即4OIF分子柔性大于1KWK。而对二者结构柔性差异分析结果发现（图6），1KWK分子结构柔性大于4OIF，特别是Domain A区域较显著。这似乎与二者耐热特性不符。但进一步分析可以发现，1KWK氢键数量为4OIF 3.7倍。同时，4OIF分子中提高分子结构刚性的氨基酸P含量相对减少。由此可知，与4OIF相比，1KWK通过提高氢键数量及氨基酸P含量增强分子刚性，并表现出更高的最适作用温度。

另外，4OIF、3TTS和6LVW三者最适作用温度较接近，分别是53、55、55 ℃。其中，3TTS来自B. circulans菌属，但却是目前家族中与4OIF序列相似度最高的结构，进化时间也较接近（图3）。3TTS单体分子结构柔性虽然大于4OIF，但其以六聚体形态存在，提高稳定性。二者比较结果表明，六聚体形态弥补了单体结构刚性不足，使3TTS与耐热酶4OIF具有相同的最适作用温度。4OIF与6LVW结构相比，4OIF结构柔性虽然大于6LVW，但氢键数量为后者的1.35倍。单体结构柔性与氢键数量综合作用结果为，4OIF最适作用温度与6LVW接近并略低于后者。相反地，将4OIF与最适作用温度较低家族成员4UCF（40 ℃）和5XB7（30 ℃）相比，4OIF单体结构柔性仍大于二者，但其氢键数量在三者中最高，提高了4OIF分子结构稳定性，使其最适作用温度高于4UCF和5XB7。由此可知，耐热酶对温度的适应性是由单体结构柔性、氢键数量及聚合态形式共同作用的效果。提高酶结构单体分子刚性，增大聚合态单体数量及氢键数量，可以成为提高GH42家族β-半乳糖苷酶耐热性的有效策略。

2.5.3　成对进化耐热与耐低温β-半乳糖苷酶之间分子结构比较

6Y2K与1KWG，5E9A与4OIF分别是进化不同时期“成对”出现且具有较高结构相似度的耐低温和耐热β-半乳糖苷酶（图3）。“成对”酶之间表面电荷无明显差异，由于表面电荷影响酶蛋白对盐的耐受程度，由此推测“成对”酶耐盐特性可能比较接近，但目前尚无相关研究数据报道验证。6Y2K-1KWG与进化后期出现的5E9A-4OIF相比，进化前期的“成对酶”柔性大且氢键数量多。两组成对进化酶中，耐低温酶分子结构柔性均大于耐热酶。表明对于同期进化、具有保守分子结构的耐低温和耐热酶而言，分子结构柔性程度是造成酶对温度产生适应性分化的主要因素。其中，6Y2K-1KWG柔性差异波动在Domain B和Domain C区域起伏较大，且在Domain A与Domain B链接处，C-末端柔性差异较显著；5E9A-4OIF在Domain A区域柔性差异较明显，且同样在C-末端存在显著性差异，但Domain A与Domain B链接处未出现显著差异（图7）。另外，耐热酶相对于其成对进化的耐低温酶，均在Domain A的300 aa位点附近，即TIM桶状结构域第6和第7个β-片层之间，存在耐热酶柔性异常增大的位点。

3　结论

收起

本研究结果显示，与其它糖苷水解酶家族相比，GH42家族β-半乳糖苷酶氨基酸组成具有偏好性。其中，酸性、带负电荷的氨基酸E含量高，而带正电荷的碱性氨基酸K含量低，使GH42家族β-半乳糖苷酶具有相对较低pI，更适应其所来源的嗜极性细菌和古细菌所处早期高盐进化环境。与预期假设不同，GH42家族β-半乳糖苷酶进化并未按照来源微生物对环境的适应性进行聚类。相反地，Marinomonas ef1来源耐低温酶6Y2K与Thermus sp. A4来源耐热酶1KWG，以及Rahnella sp. R3来源耐低温酶5E9A与G. stearothermophilus T-6来源耐热酶4OIF，分别在不同时期呈现出“成对”进化现象。“成对”进化的耐热酶与耐低温酶相比，耐低温酶分子结构表面GRAVY值和内部GRAVY值均低于耐热酶，符合耐低温酶表面亲水性较强，耐热酶分子内部疏水性较强的规律。结合“成对”酶分子骨架Cα的较高保守性，表明GH42家族可以基于保守分子结构，通过分子内部与外部的疏水性差异分化出耐低温及耐热β-半乳糖苷酶。同时，GH42家族耐低温β-半乳糖苷酶，在TIM催化结构域与Domain B链接处以及C-末端存在共性的柔性差异显著区域；而耐热酶则通过提高氢键数量及氨基酸P含量增强单体刚性，并提高作用温度。因此，GH42家族酶分子对温度的适应性是其结构柔性、氢键数量及聚合态共同作用的结果。

本研究以GH42家族已知晶体结构β-半乳糖苷酶为研究对象，基于家族酶分子结构进化保守性，分析成员酶之间催化特性差异产生的结构原因，为GH42家族β-半乳糖苷酶嗜极性催化特性的进化机制研究及多元耐受特性的工程酶开发提供通用性参考。

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2026年第47卷第10期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025040365

接收时间：2025-04-30
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-05-15

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收稿日期：2025-04-30

基金

作者信息

¹滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州 239000

²安徽大学生命科学学院，安徽合肥 230000

³山东大学微生物技术国家重点实验室，山东青岛 266237

通讯作者:

董艺凝（1980−），女，博士，教授，研究方向：酶工程，E-mail：dong_yining@163.com。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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家族	β-半乳糖苷酶晶体结构数量/家族总晶体数量	单体序列长度	催化结构域	单体中Domain 数量	聚合体形式	首个β-半乳糖苷酶晶体结构及发布时间
GH1	8/88	400~600 aa	TIM	−	二聚体^[12]/四聚体^[13−14]	1GOW（1996.9）
GH2	13/64	700~1000 aa	TIM	5	单体^[15−17]/二聚体^[18]/三聚体/四聚体^[19−20]/六聚体^[21]/八聚体^[22]	4V40（1994.4）
GH35	13/18	600~1000 aa	TIM	6	单体^[23−27]/二聚体^[28−29]/四聚体^[30−31]/十二聚体^[32]	1TG7（2004.5）
GH42	10/12	600~700 aa	TIM	3	三聚体^{[5−6,9,33−37]}/六聚体^[38]	1KWG，1KWK （2002.1）
GH50	0/4	−	−	−	−	−
GH59	0/1	−	−	−	−	−
GH154	1/2	398 aa	（α/α）₆	−	四聚体^[3]	8OI4（2024.1）

家族

β-半乳糖苷酶晶体结构数量/家族总晶体数量

单体序列长度

催化结构域

单体中Domain
数量

聚合体形式

首个β-半乳糖苷酶晶体结构
及发布时间

GH1

8/88

400~600 aa

TIM

−

二聚体^[12]/四聚体^[13−14]

1GOW（1996.9）

GH2

13/64

700~1000 aa

TIM

单体^[15−17]/二聚体^[18]/三聚体/四聚体^[19−20]/六聚体^[21]/八聚体^[22]

4V40（1994.4）

GH35

13/18

600~1000 aa

TIM

单体^[23−27]/二聚体^[28−29]/四聚
体^[30−31]/十二聚体^[32]

1TG7（2004.5）

GH42

10/12

600~700 aa

TIM

三聚体^{[5−6,9,33−37]}/六聚体^[38]

1KWG，1KWK
（2002.1）

GH50

0/4

−

GH59

0/1

−

GH154

1/2

398 aa

（α/α）₆

−

四聚体^[3]

8OI4（2024.1）

来源微生物特点	来源微生物（酶代号）	PDB ID	催化氨基酸位点	序列相似性（%）	Cα RMSD （Ǻ）	催化特性
嗜热	Thermus sp. A4（A4-β-Gal）	1KWG 1KWK	E141 E312	100	0.00	三聚体；T_opt70 ℃，pH6.5；对乳糖亲和力弱。
G. stearothermophilus T-6 （GanB;Gan42B）	4OIF 4OJY 5DFA	E158 E323	26.3	1.98	三聚体；T_opt 53 ℃，pH6.0；无乳糖活性；无转糖苷活性；对GOS有催化活性。
嗜冷、嗜盐（来自南极冰湖）	H. lacusprofundi （Bga）	6LVW	E142 E312	45.4	1.44	三聚体；4 mol/L NaCl 或 KCl存在条件下，T_opt 50~55 ℃，pH6.5；4~10 ℃下可保留10%~13%活性。
嗜冷（来自南极）	Marinomonas ef1 （M-bgal）	6Y2K	E142 E314	54.0	0.96	六聚体；T_opt 5 ℃，37~50 ℃稳定；pH6.0。
嗜冷	Rahnella sp. R3 （R-β-Gal）	5E9A	E157 E314	30.6	1.90	三聚体；4 ℃活性高；作用温度4~35 ℃，pH6.5。
嗜碱	B. circulans sp. alkalophilus （Bcα-β-Gal）	3TTS 3TTY	E150 E307	29.2	1.75	六聚体；T_opt 55 ℃，最适作用pH6~7.5；对乳糖亲和力低，具有弱转糖苷活性。
肠道益生菌	B. animalis subsp. Lactis （Gal42A）	4UNI 4UOQ 4UOZ	E159 E323	27.3	1.86	三聚体；T_opt 45 ℃，pH5.5。
	B. bifidum S17（BbgII）	4UCF 4UZS	E161 E320	26.9	1.89	三聚体；T_opt 40 ℃， pH6.0；无GOS合成能力。
	B. animalis subsp. lactis Bl-04 （BlArap42B）	5XB7	E151 E311	25.7	1.91	三聚体；T_opt 30 ℃，pH6.5。
	B. longum subsp. infantis （BiBga42A）	8IBR 8IBS 8IBT	E160 E318	29.5	1.85	三聚体；T_opt 37 ℃，pH6.5；LNT利用能力。

来源微生物
特点

来源微生物
（酶代号）

PDB ID

催化氨基酸位点

序列相
似性（%）

Cα RMSD （Ǻ）

催化特性

嗜热

Thermus sp. A4（A4-β-Gal）

1KWG
1KWK

E141
E312

100

0.00

三聚体；T_opt70 ℃，pH6.5；对乳糖亲和力弱。

G. stearothermophilus T-6 （GanB;Gan42B）

4OIF
4OJY
5DFA

E158
E323

26.3

1.98

三聚体；T_opt 53 ℃，pH6.0；无乳糖活性；无转糖苷活性；对GOS有催化活性。

嗜冷、嗜盐（来自南极冰湖）

H. lacusprofundi （Bga）

6LVW

E142
E312

45.4

1.44

三聚体；4 mol/L NaCl 或 KCl存在条件下，T_opt 50~55 ℃，pH6.5；4~10 ℃下可保留10%~13%活性。

嗜冷
（来自南极）

Marinomonas ef1 （M-bgal）

6Y2K

E142
E314

54.0

0.96

六聚体；T_opt 5 ℃，37~50 ℃稳定；pH6.0。

嗜冷

Rahnella sp. R3 （R-β-Gal）

5E9A

E157
E314

30.6

1.90

三聚体；4 ℃活性高；作用温度4~35 ℃，pH6.5。

嗜碱

B. circulans sp. alkalophilus （Bcα-β-Gal）

3TTS
3TTY

E150
E307

29.2

1.75

六聚体；T_opt 55 ℃，最适作用pH6~7.5；对乳糖亲和力低，具有弱转糖苷活性。

肠道益生菌

B. animalis subsp. Lactis （Gal42A）

4UNI
4UOQ
4UOZ

E159
E323

27.3

1.86

三聚体；T_opt 45 ℃，pH5.5。

B. bifidum S17（BbgII）

4UCF
4UZS

E161
E320

26.9

1.89

三聚体；T_opt 40 ℃， pH6.0；无GOS合成能力。

B. animalis subsp. lactis Bl-04
（BlArap42B）

5XB7

E151
E311

25.7

1.91

三聚体；T_opt 30 ℃，pH6.5。

B. longum subsp. infantis （BiBga42A）

8IBR
8IBS
8IBT

E160
E318

29.5

1.85

三聚体；T_opt 37 ℃，pH6.5；LNT利用能力。