食品工业科技

样品	总糖（%）	糖醛酸（%）	甘露糖	葡萄糖醛酸	葡萄糖	半乳糖	阿拉伯糖
PNSK	69.94±3.75	17.08±0.75	0.22	0.06	0.40	0.21	0.12
PNSK-SeNP	71.93±1.16	17.57±0.73	0.20	0.07	0.40	0.21	0.13

样品	总糖（%）	糖醛酸（%）	甘露糖	葡萄糖醛酸	葡萄糖	半乳糖	阿拉伯糖
PNSK	69.94±3.75	17.08±0.75	0.22	0.06	0.40	0.21	0.12
PNSK-SeNP	71.93±1.16	17.57±0.73	0.20	0.07	0.40	0.21	0.13

葛仙米多糖纳米硒结构表征及其体外抗氧化、抑制癌细胞活性

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陈野 ¹^,² , 寇德正 ² , 商龙臣 ² , 李伟 ² , 程超 ¹^,²^,^*

食品工业科技 | 研究与探讨 2026,47(10): 120-129

收起

食品工业科技 |研究与探讨 2026 , 47 (10) : 120 -129

葛仙米多糖纳米硒结构表征及其体外抗氧化、抑制癌细胞活性

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陈野¹^,², 寇德正², 商龙臣², 李伟², 程超¹^,²^,^*

作者信息

¹硒资源研究与生物应用湖北省重点实验室（湖北民族大学），湖北恩施 445000

²湖北民族大学生物与食品工程学院，湖北恩施 445000

通讯作者:

程超（1976−），女，博士，教授，研究方向：食品化学，E-mail：chengchaolw@126.com。

作者简介:

陈野（2001−），男，硕士研究生，研究方向：食品化学，E-mail：1297175142@qq.com

Structure Characteristic, in Vitro Antixodant and Anticancer Activityof Polysaccharide of Nostoc sphaeroides Kützing Nano-Selenium Particles

Ye CHEN¹^,², Dezheng KOU², Longchen SHANG², Wei LI², Chao CHENG¹^,²^,^*

Affiliations

¹Hubei Key Laboratory of Selenium Resource Research and Biological Application (Hubei Minzu University), Enshi 445000, China

²College of Biological and Food Engineering, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China

出版时间: 2026-05-15 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025050233

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摘要

收起

目的：探究葛仙米多糖（Polysaccharide of Nostoc sphaeroides Kützing，PNSK）对纳米硒（Nano-Selenium Particles，SeNP）的稳定修饰作用机制及修饰前后生理活性的变化。方法：以PNSK为原料，采用亚硒酸钠（Na₂SeO₃）-抗坏血酸（V_C）氧化还原法制备葛仙米多糖纳米硒（Polysaccharide of Nostoc sphaeroides Kützing Nano-Selenium Particles，PNSK-SeNP），通过紫外可见光谱、高效液相色谱、X射线衍射、红外光谱、X射线光电子能谱等对PNSK及PNSK-SeNP的结构进行了表征，并对比分析了PNSK及PNSK-SeNP的抗氧化、抑制癌细胞活性。结果：PNSK-SeNP的硒含量为52.03±0.20 mg/g，粒径为166.83±4.51 nm，PNSK-SeNP制备前后的单糖摩尔比变化不显著。PNSK-SeNP的X射线光电子能谱图中具有Se 3d信号峰，硒元素以0价态存在，红外光谱和X射线光电子能谱图均表明PNSK-SeNP中葛仙米多糖的主要结构和官能团未发生变化，纳米硒与PNSK间未形成新的化学键。抗氧化测定发现，PNSK和PNSK-SeNP对羟自由基（·OH）的半抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）分别为4.45和0.55 mg/mL，对2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（ABTS⁺）的IC₅₀值分别为4.58和0.79 mg/mL，对A549肺癌细胞的IC₅₀分别为0.87和0.06 mg/mL，同时PNSK-SeNP可以有效抑制A549肺癌细胞迁移，诱导其凋亡。相关性分析发现PNSK-SeNP的硒含量与其抗氧化、抑癌作用具有显著相关性。结论：PNSK可有效稳定纳米硒，且PNSK-SeNP的体外抗氧化、抑制癌细胞活性较PNSK均显著增加。

关键词

葛仙米多糖 / 纳米硒 / 结构表征 / 抗氧化 / 抑制癌细胞

Abstract

收起

Objective: To explore the stabilization and modification mechanisms of Polysaccharide of Nostoc sphaeroides Kützing (PNSK) on nano-selenium particles (SeNP), and the changes in biological activity before and after modification. Method: Using polysaccharide of PNSK as the raw material, Polysaccharide of Nostoc sphaeroides Kützing nano-selenium particles (PNSK-SeNP) was prepared by the sodium selenite (Na₂SeO₃) and ascorbic acid (V_C) redox method. The structure of PNSK and PNSK-SeNP were characterized by UV-Vis spectroscopy, high-performance liquid chromatography, X-ray diffraction, infrared spectroscopy, and X-ray photoelectron spectroscopy. The antioxidant and anticancer activity of PNSK and PNSK-SeNP were comparatively analyzed. Results: The selenium content of PNSK-SeNP was 52.03±0.20 mg/g and the particle size was 166.83±4.51 nm. No obvious difference was observed in the molar ratio of monosaccharides of PNSK-SeNP before and after preparation. The presence of a Se 3d signal peak in the X-ray photoelectron spectroscopy of PNSK-SeNP, and the selenium element existed in the 0-valent state. Both infrared spectroscopy and X-ray photoelectron spectroscopy indicated that the main structure and functional groups of PNSK were preserved in PNSK-SeNP, and no new chemical bonds were formed between SeNP and PNSK. The antioxidant assay found that the IC₅₀ of PNSK and PNSK-SeNP for hydroxyl radical (·OH) were 4.45 and 0.55 mg/mL, respectively, and for 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), diammonium salt radicals (ABTS⁺) were 4.58 and 0.79 mg/mL, respectively, and for the A549 lung cancer cells were 0.87 and 0.06 mg/mL, respectively. Meanwhile, the migration of A549 lung cancer cells could be effectively inhibited by PNSK-SeNP, and apoptosis could also be induced. A significant correlation between the selenium content of PNSK-SeNP and its antioxidant and anticancer effects were revealed by correlation analysis. Conclusion: Nano-selenium can be effectively stabilized by PNSK, and the in vitro antioxidant and anti-cancer activities of PNSK-SeNP can be significantly enhanced compared with PNSK.

Key words

polysaccharide of Nostoc sphaeroides Kützing / nano-selenium / structure characteristic / antixodant / anticancer

引用本文

陈野, 寇德正, 商龙臣, 李伟, 程超. 葛仙米多糖纳米硒结构表征及其体外抗氧化、抑制癌细胞活性. 食品工业科技, 2026 , 47 (10) : 120 -129 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025050233

Ye CHEN, Dezheng KOU, Longchen SHANG, Wei LI, Chao CHENG. Structure Characteristic, in Vitro Antixodant and Anticancer Activityof Polysaccharide of Nostoc sphaeroides Kützing Nano-Selenium Particles[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (10) : 120 -129 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025050233

正文

收起

硒是人体必需的微量营养元素之一，对维持机体正常生命活动至关重要^[1]。纳米硒（Selenium nanoparticles，SeNP）是硒的一种新形式，具有较好的生物相容性和较低的毒性，因此众多科研工作者聚焦纳米硒的制备及活性研究。目前常用抗坏血酸（V_C）还原亚硒酸盐来制备SeNP，然而SeNP在常温下不稳定，因此需要加入稳定剂来提高SeNP的稳定性。多糖的长链或支链结构可以为单质硒原子簇提供有利微环境，使单质硒沿链形成多糖纳米硒，因此多糖是SeNP理想的修饰剂和稳定剂^[2]。与此同时，多糖与纳米硒的互补性结合，提高了多糖纳米硒（Polysaccharide-SeNP）的生物学活性，如靶向肿瘤细胞、智能调控血糖、提高机体的抗氧化能力等^[2]。

不同来源的多糖修饰纳米硒的方式不同。如猴头菇多糖可通过-OH、-C=O等基团与纳米硒结合^[3]，黄精多糖可与纳米硒形成新的亚硒酸酯键^[4]，霍山石斛多糖与纳米硒形成Se-O 键^[5]，龙须菜多糖和纳米硒之间通过物理吸附作用相结合^[6]，而岩藻多糖的-OH 通过共轭效应与硒结合修饰稳定分散纳米硒^[7]。此外超支化葡聚糖酸化处理后会自聚形成规则的球形颗粒，将亚硒酸钠（Na₂SeO₃）包裹在内部空腔中，经V_C原位还原形成纳米硒，而天然超支化多糖是由V_C边还原边将纳米硒进行包裹^[8]。此外，多糖纳米硒结合产物的生物活性较天然多糖的变化也有差异，如猴头菇多糖纳米硒对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）的清除能力是多糖的4倍^[3]；8 mg/mL的霍山石斛多糖纳米硒对羟自由基的清除能力是天然多糖的8倍^[5]；桔梗多糖纳米硒对MGC-803和 BGC-823胃癌细胞的抑制率是天然多糖的2倍^[9]。

葛仙米（Nostoc sphaeroides Kützing）是一种低等单细胞蓝藻，多糖含量为47.56%^[10]。莫开菊^[11]发现葛仙米多糖主要以多分支的柔性长链、无分支或分支较少的刚性支链等形态存在，部分支链具有单螺旋结构，且具有一定的抗氧化和抑制肿瘤细胞生长的能力。Tang等^[12]发现葛仙米多糖（Polysaccharide of Nostoc sphaeroides Kützing，PNSK）可有效清除超氧阴离子自由基、羟自由基等，且资料报道多糖纳米硒的抗氧化和抑制癌细胞活性均较天然多糖有所提高^[3,5,9]，但PNSK是否对SeNP具有修饰稳定效果且修饰后的葛仙米多糖纳米硒功能如何尚属未知，因此本文以PNSK为原料，采用Na₂SeO₃-V_C氧化还原法制备多糖纳米硒，通过对其结构表征来初步明确葛仙米多糖对纳米硒的修饰稳定方式，并对比分析葛仙米多糖和葛仙米多糖纳米硒（Polysaccharide of Nostoc sphaeroides Kützing Nano-Selenium Particles，PNSK-SeNP）的体外抗氧化和抑制癌细胞活性，探究SeNP对PNSK生物活性的影响，从而进一步丰富稳定修饰纳米硒的多糖来源，同时也为葛仙米资源的深度开发利用奠定基础。

1　材料与方法

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1.1　材料与仪器

葛仙米　购于恩施市享买乐超市；正丁醇、亚硒酸钠、硝酸、硼氢化钾、三氯化铁、无水醋酸钠、冰醋酸、碳酸氢钠、过硫酸钾、乙酸铵、溴化钾、碘化丙啶、过氧化氢　分析纯（AR），国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶（1:250）　美国Amresco；鲁米诺（GR）　西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（ABTS）、2,4,6-三（2-吡啶基）-1,3,5-三嗪（TPTZ）　梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）　成都西亚化工股份有限公司；人肺癌细胞A549　中国科学院细胞库公司。

UV9000S紫外可见分光光度计　上海元析仪器有限公司；FD8-8冷冻干燥机　瑞士布奇公司；AFS-930d原子荧光光度仪　北京吉天仪器有限公司；Nicolet is5傅里叶红外光谱仪、K-alpha X射线光电子能谱仪　美国赛默飞世尔科技有限公司；LabRAM HR Evolution拉曼光谱仪　日本HORIBA集团；D8 Advance X射线衍射仪　德国Bruker科技有限公司；Nano-ZS ZEN3600纳米粒度分析仪　英国Malvern仪器有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　PNSK的制备

以蒸馏水为溶剂，固液比1:100，浸提温度100 ℃，浸提时间1 h的条件提取PNSK，使用200目尼龙布过滤，收集滤液，滤渣相同条件重复提取一次，收集滤液，两次滤液混合后，10000 r/min离心12 min，收集上清液，浓缩、醇沉（乙醇最终浓度为80%），冷冻干燥得葛仙米粗多糖。而后按多糖:Sevage=4:1除蛋白，充分振摇20~30 min，蛋白质与三氯甲烷、正丁醇生成凝胶物而分离，随后离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质^[10]。重复上述操作直至无蛋白层，冷冻干燥。

1.2.2　PNSK-SeNP的制备

将10 mL、20 mmol/L亚硒酸钠与10 mL、8 mmol/L的V_C溶液混合，然后缓慢滴入50 mL质量浓度为2.0 mg/mL的PNSK溶液和30 mL蒸馏水，40 ℃磁力搅拌反应4 h，用3 kDa透析袋透析，直到用抗坏血酸法检测不到游离亚硒酸钠（反应溶液由红色变为无色）^[13]，冷冻干燥。

1.2.3　硒含量测定

采用原子荧光分光光度法^[14]测定硒含量。配制50 μg/mL硒标液，而后稀释成不同浓度硒溶液，取各稀释液1 mL分别置于消解管中，分别加入8 mL浓硝酸及2 mL高氯酸，石墨消解炉中消解，消解完全后在140 ℃赶酸至1 mL，添加5 mL 50%的盐酸，100 ℃继续加热至溶液剩余1 mL，定容至25 mL，使用原子荧光分光光度仪进行测定，以硒含量（μg/mL）为横坐标，以荧光强度A为纵坐标绘制标准曲线。拟合得回归方程为：y=131.4x−20.639，R²=0.9998。配制1 mg/mL的PNSK、PNSK-SeNP溶液，充分溶解后，取1 mL放入消解管中，按标准曲线的方式进行消解和测定，硒含量按照公式（1）计算。

$ \mathrm{硒含量}(\text{mg}/\mathrm{g})=\frac{\mathrm{A}+20.639}{131.4\times 1000\times \mathrm{M}}\times \mathrm{V} $

(1)

式中：V：样品总体积（mL）；M：样品重量（g）。

1.2.4　总糖含量测定

采用苯酚-硫酸法^[15]测定总糖含量。配制0.1 mg/mL的标准葡萄糖溶液，吸取不同体积的标准葡萄糖溶液于具塞试管中，加蒸馏水补至1 mL，后分别加入2 mL 6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸，充分混匀后，沸水浴20 min，冷却后于490 nm处测定吸光值。以标准葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，A₄₉₀吸光值为纵坐标绘制标准曲线，拟合得回归方程：y=0.7371x+0.0014，R²=0.9994。分别配制0.1 mg/mL的PNSK、PNSK-SeNP的溶液，取1 mL溶液按标准曲线的方法测定。总糖含量按照公式（2）计算。

$\rm 总糖含量(\text{%})=\frac{A_{490}-0.0014}{0.7371\times M}\times V \times 100$

(2)

式中：V：样品总体积（mL）；M：样品重量（mg）。

1.2.5　糖醛酸含量测定

采用间羟基联苯法^[16]测定糖醛酸含量。配制0.1 mg/mL的葡萄糖醛酸标准溶液，吸取不同体积的此标准溶液于具塞试管中，添加蒸馏水至1 mL，预冷后加入四硼酸钠-硫酸溶液6 mL，充分混匀，沸水浴15 min，冷却至室温后加入0.15%间羟基联苯80 μL混匀，静置30 min，于525 nm处测定吸光值，以葡萄糖醛酸含量（mg/mL）为横坐标，以吸光值A₅₂₅为纵坐标绘制标准曲线。拟合得回归方程为：y=0.8078x-0.0016，R²=0.9997。分别配制0.1 mg/mL样品溶液，取1 mL按标准曲线的方法进行测定。糖醛酸含量按照公式（3）计算。

$ \mathrm{糖醛酸含量}(\text{%})=\frac{{\mathrm{A}}_{525}+0.0016}{0.8078\times \mathrm{M}}\times \mathrm{V}\times 100 $

(3)

式中：V：样品总体积（mL）；M：样品重量（mg）。

1.2.6　单糖组成分析

将100 μL质量分数为5 mg/mL样品溶液与100 μL浓度为4 mol/L的三氟乙酸混合，110℃水解5 h。将水解后的样品和单糖标准品按照莫开菊^[11]的方法进行衍生，然后利用高效液相色谱仪进行检测。

HPLC分析条件：色谱柱：C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A相乙腈，B相50 mmol/L乙酸铵；0~60 min：梯度洗脱，流速1 mL/min，进样量 10 μL，检测波长250 nm，柱温为30 ℃^[11]。以摩尔浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，单糖物质的量按照公式（4）计算。

$ \mathrm{n}=\frac{\mathrm{S}-\text{b}}{\mathrm{a}\times \mathrm{M}}\times 0.01 $

(4)

式中：n为单糖物质的量；S为单糖峰面积；b为纵截距；a为斜率；M为摩尔质量。

1.2.7　PNSK和PNSK-SeNP的结构表征

1.2.7.1　粒径分布测定

配制1 mg/mL样品溶液，充分溶解后，采用纳米粒度仪测定其粒度分布^[5]。

1.2.7.2　紫外光谱扫描

配制1 mg/mL样品溶液，使用紫外-可见分光光度计进行200~800 nm波长扫描^[17]。

1.2.7.3　拉曼光谱分析

使用拉曼光谱仪进行扫描，测试条件：波长633 nm，波长范围0~4000 nm，间隔5 μm，分辨率2 cm⁻¹，采光时间1 s，激光功率10%^[18]。

1.2.7.4　傅里叶红外光谱分析

KBr压片法：将少量样品与KBr混合，研磨均匀后压片，在4000~400 cm⁻¹范围内扫描^[19]。

1.2.7.5　X射线衍射（XRD）分析

X射线衍射仪测试条件：Cu-kα辐射，2θ为5°~40°，管流40 mA、管压40 kV，扫描速率4°/min^[20]，结晶度计算见式（5）。

$ \mathrm{结晶度}(\text{%})=\frac{\mathrm{A}}{\mathrm{A}+\mathrm{B}}\times 100 $

(5)

式中：A为结晶区面积；B为无定形区面积。

1.2.7.6　X射线光电子能谱（XPS）测定

称取适量多糖样品进行X射线光电子能谱测定，以Mg Kα线作为激发源，能量为29.35 eV，样品仓压力为2.67×10⁻⁷ Pa，电压为15 kV，功率为200 W，结合能测试精度为0.3 eV，定标物为碳^[21]。

1.2.8　PNSK和PNSK-SeNP的抗氧化活性

1.2.8.1　PNSK和PNSK-SeNP对羟自由基的清除能力

采用流动注射发光法^[22]，分别配制0.1 mmol/L鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液、4×10⁻⁸ mol/L的FeSO₄和0.15%的H₂O₂溶液，1、2、3、4、5 mg/mL的PNSK和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的PNSK-SeNP溶液。将FeSO₄:H₂O₂溶液按1:1（V:V）混合即·OH产生溶液。通过副蠕动泵通道将鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液和·OH产生溶液输入混合、分析系统，基线稳定后，主蠕动泵分别将蒸馏水、样品溶液泵入，混合器混合后测定其发光强度，以鲁米诺-H₂O₂-FeSO₄-蒸馏水发光强度为空白。参数：点压400 V，增益1，频率50 Hz，频次20次/s。按式（6）计算清除率。

$ \text{清除率}( \text{%}) =\frac{{\text{F}}_{\text{a}}-{\text{F}}_{\text{b}}}{{\text{F}}_{\text{a}}}\text{×100} $

(6)

式中：F_a表示空白发光强度；F_b表示样品发光强度。

1.2.8.2　PNSK和PNSK-SeNP对ABTS⁺自由基的清除能力

将7 mmol/L ABTS 溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，室温避光反应12~16 h，得ABTS⁺自由基储备液，使用磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH7.4）将储备液稀释至734 nm处吸光值为0.70±0.02，得ABTS⁺自由基工作液。配制1、2、3、4、5 mg/mL的PNSK和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的PNSK-SeNP溶液，分别取此样品溶液1 mL，加入3 mL ABTS⁺自由基工作液，暗处反应5 min，测定A₇₃₄^[23]，按式（7）计算清除率。

$\rm \mathrm{清除率}(\text{%})=\left(1-\frac{{\mathrm{A}}_{i}-{A}_{j}}{{A}_{0}}\right)\times 100 $

(7)

式中：A_i为样品组吸光度；A_j为空白组的吸光度；A₀为ABTS⁺自由基工作液吸光度。

1.2.8.3　PNSK和PNSK-SeNP的总还原力

总还原力通过铁离子还原法（FRAP）测定，将300 mmol/L、pH3.6醋酸缓冲液、10 mmol/L的TPTZ溶液、20 mmol/L的FeCl₃溶液以10:1:1（V:V:V）配制成FRAP工作液，分别取50、100、200、400、600、800和1000 μmol/mL Trolox溶液0.1 mL于试管中，加入2.9 mL FRAP工作液、37 ℃水浴10 min，测定593 nm吸光度，同时以0.1 mL蒸馏水加入2.9 mL FRAP工作液作对照^[23]，以Trolox浓度为横坐标，A₅₉₃吸光值为纵坐标绘制Trolox标准曲线，标准曲线为y=0.0034x+0.0055，R²=0.9991；配制1、2、3、4、5 mg/mL的PNSK和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的PNSK-SeNP溶液，分别取此样品溶液0.1 mL，加入2.9 mL FRAP工作液，37 ℃水浴10 min，测定A₅₉₃。根据吸光度计算Trolox当量（Trolox equivalent antioxidant activity，TEAC），以TEAC值表示FRAP，μmol/mL。

1.2.9　PNSK和PNSK-SeNP的抑制癌细胞活性测定

1.2.9.1　A549肺癌细胞悬液制备

将长势良好的A549肺癌细胞配成2×10⁴ cells/mL 细胞悬液备用。

1.2.9.2　PNSK和PNSK-SeNP对A549肺癌细胞增殖抑制效果

取100 μL A549肺癌细胞悬液加入96孔培养板，培养箱培养24 h（37 ℃，5% CO₂），而后分别加入用完全培养基配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的PNSK和0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL的PNSK-SeNP溶液，继续孵育24 h。将CCK-8:培养基=1:9配制成工作液，每孔加入100 μL工作液，在培养箱内孵育30 min（37 ℃，5% CO₂），用酶标仪测定450 nm处的吸光度^[24]。

1.2.9.3　PNSK和PNSK-SeNP对A549肺癌细胞迁移效果

取2 mL A549肺癌细胞悬液加入6孔培养板中，培养箱培养24 h（37 ℃，5% CO₂），在细胞汇合度为90%后，用枪头在六孔板中划痕，用预冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗掉细胞碎片，而后分别加入不同浓度样品溶液，拍照并标记划痕观察点。而后在培养箱中继续培养，隔12、24 h在固定划痕位置拍照，并测量划痕宽度计算细胞迁移率^[24]。

1.2.9.4　PNSK和PNSK-SeNP对A549肺癌细胞凋亡影响

取A549肺癌细胞悬液2 mL加入6孔培养板中，在培养箱预培养24 h（37 ℃，5% CO₂）。分别加入不同浓度的样品溶液处理24 h，胰酶消化离心后，用预冷的PBS洗两次后，加1 mL Binding buffer 重悬细胞，重悬液中吸取100 µL先加入5 µL AnnexinV-FITC染液，再加入5 µL碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染液，在室温下避光染色15 min。充分混匀后上机检测细胞的凋亡情况，统计早期凋亡、晚期凋亡的细胞比例计算凋亡率^[24]。

1.3　数据处理

所有实验均重复3次，实验结果采用平均值±标准差表示，并通过SPSS26.0 软件进行显著性检验，显著性差异水平设为P<0.05。利用Origin2025、Flowjo-v10.8.1和MestReNova-11.0.4等软件绘图。

2　结果与分析

收起

2.1　PNSK和PNSK-SeNP的硒含量、化学成分、单糖组成及粒径

原子荧光分光光度计测定发现PNSK不含硒元素，PNSK-SeNP的硒含量为52.03±0.20 mg/g，说明纳米硒颗粒引入到多糖中。由表1及图1可以看出，PNSK-SeNP与PNSK的主要化学成分差异不显著，单糖组成与比例差异不明显，说明纳米硒制备过程中并未改变多糖的单糖组成，这与Wang等^[25]研究的枯草芽孢杆菌壳聚糖纳米硒与枯草芽孢杆菌壳聚糖具有相似的单糖组成而在含量方面略有差异的结果一致。另外，粒度仪测定PNSK粒径为350.23±12.03 nm，PNSK-SeNP粒径为166.83±4.51 nm，PNSK-SeNP粒径仅为PNSK的47.63%，说明PNSK-SeNP的稳定性高于PNSK。

2.2　PNSK和PNSK-SeNP的结构表征

2.2.1　PNSK和PNSK-SeNP的紫外可见光谱和拉曼光谱分析

PNSK和PNSK-SeNP的紫外可见和拉曼光谱如图2、图3所示，图2发现PNSK-SeNP在253 nm出现了明显吸收峰，表明纳米硒与PNSK发生了相互作用^[8]。在图3的PNSK和PNSK-SeNP的拉曼光谱中也发现PNSK-SeNP中增加了258 cm⁻¹吸收峰，这是硒单质的标记带^[26]，说明PNSK-SeNP中以硒单质形式存在。

2.2.2　PNSK和PNSK-SeNP的红外光谱分析

通过红外光谱研究了PNSK与PNSK-SeNP的相互作用机制。如图4所示，与PNSK相比，PNSK-SeNP中未出现新的吸收峰，仅部分峰发生轻微移动，表明PNSK的主要结构和官能团未发生变化，PNSK与PNSK-SeNP未形成新的化学键^[4]。PNSK中约3358 cm⁻¹处的强吸收峰归因于O-H伸缩振动，PNSK-SeNP中的-OH基团的吸收波长红移到3277 cm⁻¹，此外，PNSK中1606 cm⁻¹处的C=O吸收峰在PNSK-SeNP中红移到1596 cm⁻¹，1041 cm⁻¹附近的C-O-H吸收峰红移到1038 cm⁻¹，与PNSK相比，O-H特征吸收峰的红移较大，约为81 cm^-1，说明多糖中的-OH受纳米硒的诱导作用最大^[14,27]，PNSK-SeNP的傅里叶变换红外光谱吸收峰较PNSK发生红移，可能是由于PNSK与纳米硒颗粒之间以物理吸附或弱化学作用如氢键、静电吸引等为主，陈博文等^[7]也发现岩藻多糖纳米硒的部分吸收峰红移，二者结果相似。

2.2.3　PNSK和PNSK-SeNP的X射线衍射分析

通过计算发现PNSK、PNSK-SeNP的结晶度分别为13.65%、8.31%，同时图5的X-射线衍射结果显示二者均为宽泛的衍射峰，PNSK在2θ为19°处衍射峰明显。与PNSK相比，PNSK-SeNP的XRD图更为平缓，表明PNSK-SeNP结晶度小于PNSK，主要以无定形态为主。同样Wang等^[28]也发现甜玉米芯多糖纳米硒的衍射峰增宽、结晶度下降。

2.2.4　PNSK和PNSK-SeNP的X射线能谱（XPS）

通过XPS进一步表征PNSK-SeNP中硒元素的价态以及PNSK与纳米硒之间的相互作用。图6A的XPS全谱扫描发现，PNSK-SeNP中出现了Se 3d信号峰^[15,29]，表明硒元素已成功引入PNSK中，并且PNSK-SeNP的全谱在55.02 eV处出现了新增峰，表明PNSK-SeNP中的硒元素是以0价态存在，此外，在PNSK-SeNP全能谱59.1 eV处未观察到电子结合峰，说明反应体系中的所有Se⁴⁺均被还原为Se⁰^[30]。同时图6B的硒谱也可看出，PNSK中并未出现Se 3d信号峰，但PNSK-SeNP在54.88 eV和55.48 eV分别出现了Se 3d 5/2和Se 3d 3/2的信号峰^[28]。

为了分析SeNP与PNSK之间的相互作用，研究了O 1s光谱。如图6C所示，PNSK中的O 1s结合能为532.38 eV，反应后PNSK-SeNP的O 1s结合能（532.38 eV）并未发生改变，所以在PNSK-SeNP中纳米硒并未与PNSK之间形成新的化学键^[31]，PNSK可能与纳米硒颗粒是物理吸附。同时PNKS和PNSK-SeNP的C 1s光谱中观察到多个能量状态的碳（图6D），PNSK的C 1s光谱拟合出三个峰，分别位于287.58 eV、286.08 eV和284.48 eV，分别对应C-H、C-OH和C=O的光电子发射^[19]。与PNSK相比，PNSK-SeNP三个峰并未发生明显变化，说明纳米硒与多糖并未形成新的化学键，这与傅里叶变换红外光谱的分析结果一致。

2.3　PNSK和PNSK-SeNP的体外抗氧化活性分析

实验对比分析了PNSK和PNSK-SeNP对羟自由基和ABTS⁺自由基的清除能力，同时比较了二者的总还原力，结果见图7。由图7可以看出，PNSK和PNSK-SeNP的体外抗氧化活性均具有剂量效应关系，且PNSK-SeNP的体外抗氧化活性强于PNSK。当二者浓度为1.0 mg/mL时，PNSK和PNSK-SeNP对·OH的清除率分别为7.28%±0.52%和68.69%±1.63%，对ABTS⁺自由基的清除率分别为20.60%±1.24%和69.71%±5.02%，总还原力TEAC值分别为2.23±0.27和75.07±4.82 μmol/mL。PNSK和PNSK-SeNP对·OH清除的IC₅₀值分别为4.45和0.55 mg/mL，对ABTS⁺自由基清除的IC₅₀值分别为4.58和0.79 mg/mL，PNSK-SeNP对·OH和ABTS⁺自由基的清除活性是PNSK的8.09和5.80倍。此外，PNSK、PNSK-SeNP的TEAC10（TEAC值为10 μmol/mL时的样品浓度）分别为3.26和0.22 mg/mL，PNSK-SeNP的还原力是PNSK的14.39倍。说明PNSK与纳米硒结合成为PNSK-SeNP后，能够显著提高其抗氧化能力，这与硫磺菌多糖纳米硒能显著提高天然多糖抗氧化能力^[32]的结果一致。

2.4　PNSK和PNSK-SeNP的抑制癌细胞活性分析

2.4.1　PNSK和PNSK-SeNP对A549肺癌细胞的抑制效果

不同浓度PNSK及PNSK-SeNP对A549肺癌细胞的抑制率如图8所示，由图8可以看出，PNSK和PNSK-SeNP对A549肺癌细胞的抑制能力具有剂量效应关系，且PNSK-SeNP的抑制癌细胞活性强于PNSK。0.60 mg/mL的PNSK及PNSK-SeNP对A549肺癌细胞抑制率分别为31.19%±5.97%和89.71%±5.70%，PNSK和PNSK-SeNP对A549肺癌细胞的抑制的IC₅₀值分别为0.87 mg/mL和0.06 mg/mL，而PNSK-SeNP对A549肺癌细胞的抑制率是PNSK的14.5倍。

2.4.2　PNSK和PNSK-SeNP对A549肺癌细胞的迁移抑制效果

如图9所示，不同浓度的PNSK及PNSK-SeNP对A549肺癌细胞迁移均表现出抑制作用。对照组随处理时间延长，A549癌细胞迁移率逐渐上升，在12 h和24 h的细胞迁移率分别为48.22%和69.65%。经200 μg/mL PNSK处理12 h和24 h后，细胞迁移率分别降至37.55%和52.67%，相应的细胞迁移抑制率达到22.12%和24.38%。而采用50 μg/mL PNSK-SeNP处理相同时间后，A549癌细胞迁移率显著（P<0.05）降低，分别为6.56%（12 h）和27.36%（24 h），抑制率分别高达86.39%和60.71%。结果表明，低浓度PNSK-SeNP即可显著抑制A549细胞迁移，其效果明显优于PNSK。该发现与陈雪花等^[33]报道一致，即硫酸软骨素纳米硒对Hela宫颈癌细胞迁移的抑制作用强于硫酸软骨素本身。

2.4.3　PNSK和PNSK-SeNP对A549肺癌细胞凋亡影响

采用流式细胞术探讨了PNSK和PNSK-SeNP对A549肺癌细胞凋亡的影响，结果见图10。在对照组中，99.8%的细胞正常生长，0.04%的细胞处于细胞凋亡初期，0.05%的细胞处于细胞凋亡晚期。200 μg/mL PNSK处理组中2.65%的细胞处于凋亡初期，5.85%的细胞处于凋亡晚期，凋亡率为8.50%，显著（P<0.05）高于对照组。50 μg/mL的PNSK-SeNP处理组早期、晚期凋亡细胞比例分别为21.6%和5.94%，凋亡率为27.54%。

2.5　PNSK和PNSK-SeNP成分及表征与其抗氧化、抑制癌细胞活性的相关性分析

葛仙米纳米硒多糖的成分与其抗氧化活性、抑制癌细胞活性之间的关系趋势见图11。由图11可以看出，PNSK-SeNP的硒含量对ABTS⁺自由基抑制率IC₅₀、肺癌细胞抑制率的IC₅₀、TEAC10具有显著负影响（P<0.05），说明随着硒含量增加，对ABTS⁺自由基清除率、肺癌细胞抑制率的IC₅₀越小，其抗氧化能力越大，总还原力越强。同时Se含量对细胞凋亡率、细胞迁移抑制率具有显著正影响，此外PNSK-SeNP的硒含量还显著影响其结晶度（P<0.05），随着纳米硒中硒含量增加，多糖纳米硒的结晶度会越小。

3　结论

收起

本研究采用Na₂SeO₃/V_C氧化还原法，以PNSK作为稳定剂成功构建了PNSK-SeNP。实验结果发现，所制备的PNSK-SeNP 硒含量达52.03±0.20 mg/g，粒径为166.83±4.51 nm。单糖组成分析说明，多糖纳米硒制备前后单糖摩尔占比无显著差异，但PNSK-SeNP结晶度仅为8.31%，较PNSK显著降低。X射线光电子能谱图清晰呈现Se 3d信号峰，确证硒元素以0价态稳定存在。红外光谱及X射线光电子能谱图联合证实，PNSK-SeNP中多糖主体结构与官能团未发生改变，纳米硒与PNSK间可能未形成新的化学键。

在抗氧化活性评估中，PNSK-SeNP对·OH、ABTS⁺自由基的清除活性分别达 PNSK 的8.09倍与5.80倍，抗氧化性能显著提升。针对A549肺癌细胞的抑制实验显示，其抑制率是PNSK的14.5倍，并且PNSK-SeNP能显著抑制A549肺癌细胞迁移，诱导细胞凋亡。斯皮尔曼相关性分析进一步深化研究揭示PNSK-SeNP的硒含量与ABTS⁺自由基清除率、还原力、对A549肺癌细胞抑制的IC₅₀呈显著负相关，而与A549肺癌细胞凋亡率和迁移抑制率呈显著正相关，这一发现为优化其功能应用提供了关键量化依据。

综上所述，PNSK可以有效地稳定纳米硒，并且PNSK-SeNP的体外抗氧化、抑制癌细胞活性均有明显提升，丰富了稳定纳米硒的多糖来源，但PNSK-SeNP的其他生理活性、体内稳定性、体内抗氧化、抑制癌细胞活性机制仍需进一步探索。

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2026年第47卷第10期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025050233

接收时间：2025-05-26
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-05-15

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收稿日期：2025-05-26

基金

作者信息

¹硒资源研究与生物应用湖北省重点实验室（湖北民族大学），湖北恩施 445000

²湖北民族大学生物与食品工程学院，湖北恩施 445000

通讯作者:

程超（1976−），女，博士，教授，研究方向：食品化学，E-mail：chengchaolw@126.com。

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鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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