食品工业科技

基因名称	引物序列（5’-3’）
miR-1-3p	F：GCGCTGGAATGTAAAGAAGTATG
miR-1-5p	F：ACAUACUUCUUUAUAUGCCCAU
miR-145-5p	F：CAGTCTTGTCCAGTTTTCCCAG
miR-125b-1-3p	F：ACGGGTTAGGCTCTTGGGAGCT
miR-125b-2-3p	F：ACAAGTCAGGCTCTTGGGAC
miR-125b-5p	F：TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA
miR-133b	F：CTCAGCTTTGGTCCCCTTCAAC
miR-125a-3p	F：GCGCACAGGTGAGGTTCTTG
miR-125a-5p	F：GCGCTCCCTGAGACCCTT
miR-133a-3p	F：GCCTTTGGTCCCCTTCAAC
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U6	F：CTCGCTTCGGCAGCACA
U6	R: AACGCTTCACGAATTTGCGT
egfr	F：AGGCACGAGTAACAAGCTCAC
egfr	R: ATGAGGACATAACCAGCCACC
β-actin	F：TCCAGCCTTCCTTCTTGGGT
β-actin	R: GCACTGTGTTGGCATAGAGGT

基因名称	引物序列（5’-3’）
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miR-145-5p	F：CAGTCTTGTCCAGTTTTCCCAG
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DEGs	miRNA	miRNA序列
pim1、met	miR-1-3p	UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU
met	miR-1-5p	ACAUACUUCUUUAUAUGCCCAU
egfr	miR-125a-3p	ACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCC
egfr	miR-125a-5p	UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA
egfr	miR-125b-1-3p	ACGGGUUAGGCUCUUGGGAGCU
egfr	miR-125b-2-3p	UCACAAGUCAGGCUCUUGGGAC
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mcl1、bcl2l2	miR-133a-3p	UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG
mcl1、bcl2l2	miR-133a-5p	AGCUGGUAAAAUGGAACCAAAU
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DEGs	miRNA	miRNA序列
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基于转录后调控筛选蛹虫草靶向作用egfr的miRNA

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崔明辉 ¹ , 张奇 ¹ , 陈俊颖 ¹ , 王多 ¹ , 王升厚 ²^,³ , 逄洪波 ¹ , 王泽 ¹^,²^,³^,^*

食品工业科技 | 营养与保健 2026,47(8): 427-436

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食品工业科技 |营养与保健 2026 , 47 (8) : 427 -436

基于转录后调控筛选蛹虫草靶向作用egfr的miRNA

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崔明辉¹, 张奇¹, 陈俊颖¹, 王多¹, 王升厚²^,³, 逄洪波¹, 王泽¹^,²^,³^,^*

作者信息

¹沈阳师范大学生命科学学院，辽宁沈阳 110034

²辽宁省功能性蛹虫草重点实验室，辽宁沈阳 110034

³沈阳市功能性蛹虫草产业技术研究院，辽宁沈阳 110034

通讯作者:

王泽（1979−），女，博士，副教授，研究方向：药用真菌资源研究与开发，E-mail：26186987@qq.com。

作者简介:

崔明辉（2001−），女，硕士研究生，研究方向：药用真菌资源研究与开发，E-mail：2567617421@qq.com

Investigating the Post-transcriptional Regulation of egfr in Non-small Cell Lung Cancer A549 Cells by Cordyceps militaris Based on miRNA

Minghui CUI¹, Qi ZHANG¹, Junying CHEN¹, Duo WANG¹, Shenghou WANG²^,³, Hongbo PANG¹, Ze WANG¹^,²^,³^,^*

Affiliations

¹College of Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China

²Liaoning Key Laboratory of Functional Cordyceps militaris, Shenyang 110034, China

³Industrial Technology Research Academy for Cordyceps militaris with Functional Value of Shenyang,Shenyang 110034, China

出版时间: 2026-04-15 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025040012

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摘要

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目的：旨在获得蛹虫草抗肿瘤机制中转录后靶向调控egfr的miRNA。方法：通过水浴浸提结合真空冷冻干燥技术制备蛹虫草水提物。4 mg/mL蛹虫草处理A549细胞24 h后转录组测序，根据KEGG通路富集分析结果获得候选miRNAs。瞬时转染miRNA mimics构建功能获得模型，MTT法及Annexin V-FITC/PI双染法检测miRNAs对细胞活力的影响。同时，采用瞬时转染miRNA inhibitor构建功能缺失模型，联用蛹虫草提取物处理，MTT法检测蛹虫草-miRNA轴对细胞活力的影响，qRT-PCR和免疫细胞化学染色法分析该调控轴对A549细胞EGFR转录水平和蛋白水平的影响。结果：共获得7211个DEGs，并在“MicroRNAs in cancer”信号通路显著富集（排序3）。筛选到与肺腺癌预后相关的miRNAs共11个，其中6个与egfr存在靶向调控关系，且低表达水平的肺腺癌患者预后较差（P<0.05）。蛹虫草处理可诱导miR-125b-1-3p、miR-125b-5p和miR-145-5p表达水平显著上调（P<0.01），且种子序列与egfr 3'UTR区存在潜在结合位点。3个miRNAs的促增殖活性具有肿瘤特异性，高表达状态可诱导A549细胞发生更高比例的早期凋亡。蛹虫草可通过促进miR-125b-1-3p、miR-125b-5p和miR-145-5p的表达（P<0.05），靶向下调EGFR蛋白的表达（P<0.05），抑制肺癌A549细胞的增殖。结论：蛹虫草具有靶向调控miRNAs（miR-125b-1-3p、miR-125b-5p和miR-145-5p）-EGFR轴的抗肿瘤活性，本研究为蛹虫草开发为辅助肿瘤治疗的功能性食品提供了理论支撑。

关键词

蛹虫草 / 表皮生长因子受体 / 转录后调控 / 微小核糖核酸 / 非小细胞肺癌细胞

Abstract

收起

Objective: To identify the miRNAs that post-transcriptionally target the regulation of egfr in the antitumor mechanism of Cordyceps militaris. Methods: An aqueous extract of Cordyceps militaris was prepared using water-bath extraction combined with vacuum freeze-drying. Transcriptome sequencing was performed on A549 cells after 24 h treatment with 4 mg/mL Cordyceps militaris extract. Candidate miRNAs were selected on the basis of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis. Functional gain models were constructed by transient transfection of miRNA mimics, and the effects of miRNAs on cell viability were assessed using the MTT assay and Annexin V-FITC/PI double staining. Functional loss models were established by transient transfection of miRNA inhibitors, in combination with Cordyceps militaris extract treatment. The effect of Cordyceps-miRNA axis on cell viability was evaluated using the MTT assay, and its regulatory effects on EGFR transcription and protein levels in A549 cells were analyzed using qRT-PCR and immunocytochemical staining. Results: A total of 7211 DEGs were obtained and significantly enriched in the "MicroRNAs in cancer" signaling pathway (Sort 3). Eleven miRNAs were screened for their association with lung adenocarcinoma prognosis, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p and miR-145-5p were all associated with egfr in a target-regulatory manner, and patients with lung adenocarcinomas that showed low expression levels had a poorer prognosis (P<0.05). Cordyceps militaris treatment induced significant upregulation of miR-125b-1-3p, miR-125b-5p and miR-145-5p expression levels (P<0.01), and the seed sequences had potential binding sites with the egfr 3'-UTR region. miR-125b-1-3p, miR-125b-5p, and miR-145-5p exhibited tumor-specific pro-proliferative activities, and their high expression status induced a higher percentage of early apoptosis in A549 cells. Cordyceps militaris inhibited the proliferation of lung cancer A549 cells by promoting the expression of miR-125b-1-3p, miR-125b-5p, and miR-145-5p (P<0.05) and downregulating the expression of EGFR (P<0.05). Conclusion: Cordyceps militaris exerts anti-tumor activity by targeting and regulating the miRNAs (miR-125b-1-3p, miR-125b-5p and miR-145-5p)-EGFR axis, providing theoretical support for its development as a novel functional food for adjuvant tumor therapy.

Key words

Cordyceps militaris / epidermal growth factor receptor / post-transcriptional regulation / microRNA / non-small cell lung cancer cells

引用本文

崔明辉, 张奇, 陈俊颖, 王多, 王升厚, 逄洪波, 王泽. 基于转录后调控筛选蛹虫草靶向作用egfr的miRNA. 食品工业科技, 2026 , 47 (8) : 427 -436 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025040012

Minghui CUI, Qi ZHANG, Junying CHEN, Duo WANG, Shenghou WANG, Hongbo PANG, Ze WANG. Investigating the Post-transcriptional Regulation of egfr in Non-small Cell Lung Cancer A549 Cells by Cordyceps militaris Based on miRNA[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (8) : 427 -436 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025040012

正文

收起

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是全球致死率最高的癌症之一，约占肺癌患者的85%^[1]。非小细胞肺癌因其细胞分裂慢、扩散转移较晚、症状不典型、缺乏早期诊断依据等恶性状，约75%的非小细胞肺癌患者被发现时已处于癌症中晚期，5年生存率极低^[2]。microRNA（miRNA）是进化上保守的一类小型调节性非编码RNA，研究表明，miRNA介导的转录后调控异常是肿瘤形成与发展的重要机制和标志^[3]，数百种miRNAs已被证实能够显著增强肿瘤治疗的敏感性，在临床应用中展现出作为新型治疗策略的巨大潜力^[4−5]。miR-125a-3p是非小细胞肺癌化疗的重要预后生物标志物，过表达miR-125b-1-3p可以抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭，主要通过抑制S1PR1诱导凋亡的发生，在NSCLC中起到抑癌基因的作用^[6]。miR-125a-3p在癌旁组织中的表达水平高于NSCLC组织，化疗后miR-125a-3p的高表达水平可延长患者总体生存率和无病生存率^[7−8]。miR-133a-3p的过表达可抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移，且通过负调节ERBB2的表达而起到抑癌作用，miR-133a-3p/ERBB2轴已成为诊断和治疗NSCLC的新型药物靶点^[9]。因此，基于miRNA介导的转录后调控开展抗肿瘤药物筛选，为癌症治疗提供了新的研究方向。

表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）隶属于酪氨酸激酶受体ErbB家族。egfr突变在肺腺癌中是最常见的基因突变之一，egfr基因突变，如外显子19缺失、L858R点突变会导致激酶域持续活化，约占东亚人群肺腺癌的30%~40%^[10]。egfr信号通路的异常激活可诱导肺癌细胞增殖、转移和侵袭，参与肿瘤细胞免疫逃逸，在肺癌的发生和发展过程中起推动作用，与肺癌的恶性程度和预后不良密切相关。目前，临床针对NSCLC的靶向治疗中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂已发展至第三代，egfr已成为抗肺癌药物研发的重要靶点^[11−13]。蛹虫草作为新资源食品，富含具有多靶点调控特性的天然活性成分，已成为抗肿瘤药物研发的重要药用真菌资源。本实验室前期结果显示，蛹虫草可以抑制人肺癌细胞A549、人胃癌细胞BGC-823、人乳腺癌细胞MCF-7的细胞增殖活性，并对凋亡、铁死亡等RCD信号通路具有调控作用^[14]。已有研究显示，虫草素处理可抑制人肺腺癌H1975细胞egfr、AKT和ERK1/2的磷酸化水平，发挥抗肿瘤作用^[15]。egfr突变的细胞对虫草素处理具有高敏感性，且虫草素的体内、外抗癌效果甚至优于NSCLC临床治疗靶向药物吉非替尼^[16]。但蛹虫草是否可以通过egfr的转录后调控影响NSCLC的发生发展，目前仍缺乏系统性的研究证据。因此，本研究整合转录组测序数据与生物信息学分析，结合分子生物学验证实验，首次从miRNA-egfr轴的视角探究蛹虫草的抗肿瘤机制，为其辅助肺癌靶向治疗的研发提供重要的理论依据。

1　材料与方法

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1.1　材料与仪器

人肺癌细胞株A549 人肺正常上皮细胞BEAS-2b　武汉博士德生物工程有限公司；F-12K完全培养液　武汉美仑生物技术有限公司；胎牛血清　北京四季青生物工程材料有限公司；功能性蛹虫草品系（专利号：ZL201310728874.4）　辽宁省功能性蛹虫草重点实验室栽培提供； KEL^TM RNA Transfection Reagent　美国KEL Biotech公司；miRNA mimics miRNA inhibitor　苏州吉玛基因股份有限公司；FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit　南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PrimeScript RT试剂盒　日本TaKaRa公司；miRNA Purification Kit、0.25%胰蛋白酶（1:200）　北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；SuperStar miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit　北京康为世纪生物科技股份有限公司；Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix　上海翌圣生物科技股份有限公司；二甲基亚砜　美国Sigma-Aldrich公司；egfr多克隆抗体　沈阳万类生物技术有限公司；SABC法免疫组化染色试剂盒　武汉博士德生物工程有限公司；引物序列由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成（表1）。

JTY-2电热恒温鼓风培养箱　上海龙联科仪器有限责任公司；JF-200高速粉碎机　奥特莱斯（北京）商业管理有限公司；SCIENTZ-10nd超低温冷冻干燥机　宁波新芝生物科技股份有限公司；JC-6000超净工作台　上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；HH.CP-7 CO₂细胞恒温培养箱　德国Heraeus公司；5424-R高速冷冻离心机　德国Eppendorf公司；QuantShudio™ 3实时荧光定量PCR仪　美国Applied Biosystems公司；N50 Touch超微量紫外分光光度计　德国Implen公司；Infinite F50酶标仪　瑞士Tecan公司；ICX41倒置生物/荧光显微镜　宁波舜宇光学科技（集团）有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　蛹虫草水提物制备

蛹虫草子实体（XG）60 ℃烘干至恒重，机械粉碎后过80目筛网，获得蛹虫草干粉，85 ℃水浴浸提3.5 h，4000 r/min离心10 min，上清液真空冷冻干燥过夜，获得冻干粉^[17]。以F-12K完全培养基制备4 mg/mL蛹虫草工作液，0.22 μm过滤除菌，4 ℃密封保存。

1.2.2　转录组测序分析

实验组（XG组）为A549细胞5×10⁵个以4 mg/mL蛹虫草工作液处理24 h，对照组（CK组）以完全培养基处理，收集细胞后委托广州基迪奥生物科技有限公司构建文库并开展转录组测序分析^[18]。以P<0.05且|log₂FC|>1为标准，筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），通过KEGG数据库（https://www.kegg.jp/）进行通路富集分析，根据“MicroRNAs in cancer”信号通路（ko05206）的Lung cancer模块，获得与“survival”相关DEGs存在靶向关系的候选miRNAs。利用Kaplan-Meier plotter数据库（https://kmplot.com/）^[19]，对候选miRNAs的表达水平与患者生存率间进行关联分析。

1.2.3　qRT-PCR检测EGFR mRNA表达量

根据各试剂盒指导要求，提取XG组和CK组细胞的mRNA，逆转录合成cDNA，逆转录反应体系（20 μL）：2× miRNA RT Mix 10 μL，miRNA Enzyme Mix 1.5 μL，总RNA 4 μg，补充RNase-free水至20 μL。反应程序：37 ℃ 60 min；85 ℃ 5 min。cDNA产物于−20 ℃保存。qPCR反应体系（20 μL）：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μmol/L，cDNA模板2 μL，补充RNase-free水至20 μL。反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。以β-actin为内参基因，采用2^−△△Ct计算egfr的相对表达量。

1.2.4　qRT-PCR检测miRNA表达量

根据各试剂盒指导要求，提取XG组和CK组细胞的miRNAs，合成miRNA第一链cDNA，反应体系（20 μL）：2×miRNA RT Mix 10 μL，miRNA Enzyme Mix 1.5 μL，总RNA 4 μg，补充RNase-free水至20 μL。反应程序：37 ℃ 60 min；85 ℃ 5 min。cDNA产物于−20 ℃保存。qPCR反应体系及反应程序同1.2.3，以U6 snRNA为内参，采用2^−ΔΔCt法计算各miRNAs的相对表达量。

1.2.5　miRNA功能获得实验

1.2.5.1　瞬时转染miRNA mimics

A549细胞以5×10⁵个/mL密度、BEAS-2B细胞以4×10⁴个/mL密度接种于6孔板，2 mL/孔，设置空白组、NC组（阴性对照组，转染阴性对照序列）和mimics组（转染miRNA mimics），常规培养12 h后进行转染。参照转染试剂盒说明书进行以下操作，试剂A：KEL^TM RNA Transfection Reagent 7.5 μL与200 μL Opti-MEM室温孵育5 min；试剂B：阴性对照序列或miRNA mimics（终浓度50 nmol/L）与200 μL Opti-MEM混合。NC组和mimics组分别加入A与B混合液400 μL/孔，空白组加入等体积完全培养基，培养6 h后各组更换完全培养基，继续培养24 h。qRT-PCR检测各组miRNAs表达量，方法同1.2.4。

1.2.5.2　MTT法检测

细胞转染后常规培养24 h，加入5 mg/mL MTT溶液，20 μL/孔，37 ℃孵育4 h。弃上清后每孔加入150 μL DMSO，室温振荡，酶标仪检测各孔的OD_{492 nm}值。抑制率计算：抑制率（%）=（OD_对照孔−OD_实验孔）/（OD_对照孔−OD_空白孔）×100。

1.2.5.3　Annexin V-FITC/PI染色

细胞转染后常规培养24 h，预冷PBS洗涤1次，依次加入500 μL 1×Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，室温避光孵育10 min。4%多聚甲醛固定10 min，倒置荧光显微镜下观察，并采集图像，ImageJ软件计算各组随机10个视野荧光强度。

1.2.6　miRNA功能缺失实验

1.2.6.1　瞬时转染miRNA inhibitor及检测

设置NC组（阴性对照组，转染阴性对照序列）、Inhibitor组（转染miRNA inhibitor）、Inhibitor+XG组（转染miRNA inhibitor+4 mg/mL蛹虫草处理），参照转染试剂盒说明书进行转染。转染6 h后，NC组和Inhibitor组更换为完全培养基，Inhibitor+XG组更换为4 mg/mL蛹虫草工作液，继续培养24 h。qRT-PCR法检测各组3个miRNAs的表达量，方法同1.2.4，MTT法检测细胞抑制率，方法同1.2.5.2。

1.2.6.2　免疫细胞化学染色

设置NC组（阴性对照组，转染阴性对照序列）、NC+XG组（4 mg/mL蛹虫草处理）、inhibitor组（转染miRNA inhibitor）、inhibitor+XG组（转染miRNA Inhibitor+4 mg/mL蛹虫草处理），细胞处理后常规培养24 h，经冷丙酮固定10 min，根据试剂盒要求进行SABC免疫组织化学染色，其中每个样本滴加EGFR抗体工作液（1:100稀释）50 μL，37 ℃孵育2 h，DAB显色2 min后，普通光学显微镜下观察，并采集图像，采用ImageJ软件计算随机10个视野灰度值。

1.3　数据处理

所有实验均进行三次独立生物学重复，每个实验设置至少三次技术重复。实验数据以mean±SD表示。数据统计分析采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和组间比较分析（Tukey's HSD检验），显著性检验水平α=0.05（*P<0.05，**P<0.01）。通过GraphPad Prism 8和基迪奥生物信息云平台（https://www.omicshare.com/）完成绘图及生物信息学分析。

2　结果与分析

收起

2.1　蛹虫草调控A549细胞生长活性目标miRNA的筛选

2.1.1　生信分析预测蛹虫草参与调控的候选miRNA

基于CK组基因表达量，XG组共筛选到7211个DEGs，并在“MicroRNAs in cancer”信号通路（ko05206）显著富集，列第3位（图1A），与肺癌“survival”相关的DEGs共5个，查询到11个与上述DEGs存在调控关系的候选miRNAs（表2），其中miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-145-5p皆与egfr存在调控关系。Kaplan-Meier生存分析中，上述6个miRNAs的生存曲线风险比（hazard ratio，HR）均<1，其中，miR-1、miR-125a、miR-125b、miR-133a、miR-145的P<0.05。提示在相同的时间段内，这些miRNAs的低表达与肺腺癌患者的不良预后显著相关（图2）。

2.1.2　蛹虫草对A549细胞miRNA表达水平的影响

11个候选miRNAs中，仅miR-125b-1-3p、miR-125b-5p和miR-145-5p在蛹虫草处理后表达水平显著上调（P<0.01），miR-125b-5p的2^−∆∆Ct均值达3.509±0.503，miR-125b-1-3p为2.548±0.19，miR-145-5p为1.709±0.131（图3），说明蛹虫草处理可以影响人肺癌细胞A549上述3个miRNAs的表达。序列匹配分析进一步确认，miR-145-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-5p的种子序列与egfr的3'UTR区皆存在特异性结合位点（图4），因此被筛选为后续研究的目标miRNA。

2.1.3　目标miRNA对A549细胞增殖活性的影响

如图5A所示，转染特异性miRNA mimics后，A549细胞miR-145-5p、miR-125b-1-3p和miR-125b-5p的表达量均显著升高（P<0.01），并均表现出显著的抑制细胞增殖作用（P<0.05），其中，miR-125b-1-3p的抑制率最高，达32.19%（P<0.01），miR-145-5p的抑制率最低，为11.41%（P<0.05）（图5B），但是对人肺上皮细胞BEAS-2B增殖活性均无明显影响（图5C），提示3个miRNAs的促增殖作用具有肿瘤特异性。Annexin V-FITC染色可使早期凋亡细胞膜呈现绿色荧光，PI染色可使中、晚期凋亡细胞呈现红色荧光，如图5D和图5E显示，各转染组绿色荧光信号强度均大于红色荧光，说明3个miRNAs的过表达均主要诱导A549细胞发生早期凋亡。

2.2　蛹虫草通过目标miRNA介导egfr的转录后调控

2.2.1　蛹虫草-miRNA调控轴对A549细胞增殖的影响

如图6A所示，转染特异性miRNA的inhibitor后，miR-145-5p和miR-125b-1-3p的表达水平无显著变化（P>0.05），inhibitor处理未显著抑制miRNA的表达量。同时miR-125b-5p下调显著（P<0.05），说明miRNA inhibitor与miR-125b-5p互补结合后，不仅阻断成熟miRNA的功能，也可能触发了miRNA的核酸酶降解等机制。如图6B所示，与NC组相比，miRNA功能抑制对A549细胞增殖活性呈现促进作用，其中miR-145-5p inhibitor组的促增殖活性具有显著性（P<0.05）。同时3种miRNA inhibitor转染均可显著削弱蛹虫草的抗肿瘤作用（P<0.05），表明miR-145-5p、miR-125b-1-3p和miR-125b-5p是蛹虫草发挥抗肿瘤活性的关键环节。

2.2.2　蛹虫草-miRNA调控轴对A549细胞egfr表达的影响

转录组测序及qRT-PCR检测结果显示，蛹虫草处理可显著下调A549细胞egfr mRNA的表达量（P<0.01）（图7A）。同时，相对于NC组，miRNA inhibitor处理后，蛹虫草未能诱导egfr mRNA表达量发生显著变化（P>0.05）（图7B）。同时各miRNA inhibitor处理组EGFR蛋白质表达水平上调明显（P<0.05），inhibitor+XG联合处理可显著抑制EGFR蛋白的表达量（P<0.05），且高于NC+XG组（P<0.05）（图7C~图7D）。提示蛹虫草不仅可以抑制egfr mRNA的表达，同时可以通过miR-145-5p、miR-125b-1-3p和miR-125b-5p实现对egfr的转录后调控，进而降低EGFR蛋白的表达量发挥抗肿瘤活性。

3　讨论与结论

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miRNA在肿瘤细胞的发生发展中扮演着复杂的角色，可以通过调控代谢相关基因，改变肿瘤细胞的代谢途径、调控肿瘤微环境，影响其生长和存活。本实验通过分析转录组原始数据发现，蛹虫草诱导肺癌细胞A549产生的DEGs在“MicroRNAs in cancer”信号通路显著富集，55%候选miRNAs的调控靶基因为egfr。其中有3个miRNAs（miR-125b-1-3p、miR-125b-5p和miR-145-5p）的表达量在蛹虫草处理后显著上调（P<0.01）。在生物医学研究中，TCGA、GEO和EGA是三大常用的公共数据库，分别存储不同类型的组学数据、基因表达数据和受控访问等关键数据，特别是TCGA数据库储存有2.5 PB的数据，对超过1.1万多名患者的肿瘤组织及配对正常组织进行了描述，目前已被广泛应用于患者生存期、病理分型、治疗响应等研究领域。通过数据库查询及比对分析发现，上述3个miRNAs高表达肺腺癌患者的预后情况要优于低表达患者。因此，推测在蛹虫草的抗肿瘤机制中，3个miRNAs对A549细胞的egfr可能存在一定的调控关系，作为本研究的目标miRNAs进行后续深入研究。

为了进一步确认上述3个miRNAs在肺癌细胞A549生长中扮演的角色，功能获得实验结果显示，过表达miR-125b-1-3p、miR-125b-5p和miR-145-5p均显著抑制肺癌细胞A549的增殖并发生凋亡（P<0.05），且egfr的3'UTR区域与3个miRNAs的种子序列均存在特异性结合位点。种子序列是miRNA功能的核心区域，是miRNA识别靶标的核心，依赖种子序列可以预测miRNA的靶基因。同时，虽然中子序列短小，但其高度特异性使得单个miRNA可调控数百个基因，构成复杂的基因调控网络。Zhang等^[6]研究发现过表达miR-125b-1-3p可抑制NSCLC细胞增殖，通过靶向调控S1PR1在NSCLC细胞中发挥抗肿瘤功能。miR-125b-5p在肝癌细胞中表达降低，且过表达miR-125b-5p可抑制HepG2和Huh-7细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导凋亡^[20]。研究表明miR-145-5p在肺腺癌的临床标本中表达量下调，且可阻断肺腺癌细胞的恶性能力，如增殖、迁移、侵袭等行为^[21]。因此，miR-125b-1-3p、miR-125b-5p和miR-145-5p可能通过调控特定的信号通路或靶基因参与抑制肺癌生长过程，可能成为治疗非小细胞肺癌的潜在靶点。

蛹虫草富含虫草素等多种生物活性成分，具有显著的抗炎、抗衰老、抑制肿瘤生长及免疫调节等作用，在肿瘤辅助治疗领域展现出广阔的应用前景^[22−24]。MTT检测结果显示，转染miR-125b-1-3p、miR-125b-5p和miR-145-5p inhibitor后，A549细胞的增殖活性均增强，miR-125b-1-3p、miR-125b-5p和miR-145-5p功能的缺失能够削弱蛹虫草对A549细胞增殖的抑制作用。虫草素与顺铂均能上调miR-126、miR-145、miR-205、miR-429和miR-499a的表达，且两者联用表现出协同抗肿瘤效应^[25]。Zhang等^[26]研究发现虫草素通过miR-33b减弱了黑色素瘤的迁移和侵袭性。进一步证实蛹虫草需要上述miRNAs的参与才能发挥更好的抗肿瘤活性。

EGFR基因是一种膜结合型酪氨酸激酶受体，egfr激活后，通过RAS/RAF/MAPK、PI3K/AKT/mTOR等通路，促进细胞周期的进展，通过激活SNAIL、SLUG等转录因子，诱导上皮-间质转化，促进肿瘤细胞侵袭和转移。同时，egfr是多种恶性肿瘤中高度表达的驱动因子^[27−28]，参与多种恶性肿瘤的细胞增殖、存活、迁移、侵袭和血管生成等生物学过程，是重要的肿瘤治疗靶点^[29]。Hsu等^[30]研究发现虫草素可抑制egfr的信号传导，且显著降低口腔癌组织中egfr的表达量（P<0.05）。本研究结果显示，蛹虫草处理可显著下调A549细胞中egfr表达量。转染miRNA inhibitor后，各Inhibitor+XG组的EGFR蛋白表达量均显著低于单独Inhibitor组（P<0.05）。以上结果表明，蛹虫草可以通过转录和转录后调控两个水平影响靶基因egfr的表达，进而发挥抗肿瘤活性。

综上，本研究基于生物信息学预测分析，通过整合实验验证与转录后调控机制，成功鉴定出蛹虫草-egfr调控轴上一组具有显著调控活性的miRNAs，从转录后调控的角度进一步丰富了蛹虫草的抗肿瘤机制。研究结果不仅从表观遗传调控角度为蛹虫草的药用价值提供了新的科学依据，也为miRNA在肿瘤治疗中的应用提供了潜在的靶点。

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2026年第47卷第8期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025040012

接收时间：2025-04-03
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-04-15

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收稿日期：2025-04-03

基金

作者信息

¹沈阳师范大学生命科学学院，辽宁沈阳 110034

²辽宁省功能性蛹虫草重点实验室，辽宁沈阳 110034

³沈阳市功能性蛹虫草产业技术研究院，辽宁沈阳 110034

通讯作者:

王泽（1979−），女，博士，副教授，研究方向：药用真菌资源研究与开发，E-mail：26186987@qq.com。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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