食品工业科技

引物名称	引物序列（5’→3’）
β-Actin	F：TCAAGAAAGGGTGTAACGCAACTA
R：CGACAGGATGCAGAAGGAGAT
C/EBPα	F：TGGACAAGAACAGCAACGAGTA
R：ATTGTCACTGGTCAGCTCCAG
PPARγ	F：AGGCCTTGGAAGCCCTACTA
R：CAGCAACCTCTGCGAGTCTC
SREBP-1c	F：GTGGAGAGAAGCGCACAG
R：TGTTGCAGAAAGCGAATGTAG
FAS	F：CTAGGTTTGATGCCTCCTTCTT
R：ATGGCTTCATAGGTGACTTCC

引物名称	引物序列（5’→3’）
β-Actin	F：TCAAGAAAGGGTGTAACGCAACTA
R：CGACAGGATGCAGAAGGAGAT
C/EBPα	F：TGGACAAGAACAGCAACGAGTA
R：ATTGTCACTGGTCAGCTCCAG
PPARγ	F：AGGCCTTGGAAGCCCTACTA
R：CAGCAACCTCTGCGAGTCTC
SREBP-1c	F：GTGGAGAGAAGCGCACAG
R：TGTTGCAGAAAGCGAATGTAG
FAS	F：CTAGGTTTGATGCCTCCTTCTT
R：ATGGCTTCATAGGTGACTTCC

组别	MDA（nmol/mg, pro）	SOD（U/mg, pro）	CAT（U/mg, pro）
Control	0.039±0.001	1.733±0.069	0.158±0.006
Model	0.241±0.004^###	1.050±0.064^###	0.079±0.003^###
FFA+SV	0.217±0.008^**	1.449±0.094^**	0.096±0.005
FFA+ORE-L	0.238±0.001	1.337±0.079^**	0.101±0.005^*
FFA+ORE-M	0.211±0.009^**	1.393±0.010^**	0.137±0.009^***
FFA+ORE-H	0.210±0.003^**	1.246±0.090	0.091±0.007

组别	MDA（nmol/mg, pro）	SOD（U/mg, pro）	CAT（U/mg, pro）
Control	0.039±0.001	1.733±0.069	0.158±0.006
Model	0.241±0.004^###	1.050±0.064^###	0.079±0.003^###
FFA+SV	0.217±0.008^**	1.449±0.094^**	0.096±0.005
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FFA+ORE-H	0.210±0.003^**	1.246±0.090	0.091±0.007

组别	C/EBPα	PPARγ	SREBP-1c	FAS
Control	1.142±0.088	1.001±0.003	1.003±0.004	1.057±0.086
Model	3.381±1.007^##	2.345±0.053^###	1.761±0.128^###	6.161±0.476^###
FFA+SV	1.526±0.198^**	1.271±0.487^**	0.900±0.099^**	2.218±0.131^***
FFA+ORE-L	1.385±0.171^**	1.151±0.153^**	1.170±0.089^**	1.388±0.094^***
FFA+ORE-M	1.127±0.173^**	0.872±0.182^**	0.881±0.194^**	1.686±0.364^***
FFA+ORE-H	1.683±0.275^**	0.990±0.405^**	0.607±0.137^**	2.508±0.124^***

组别	C/EBPα	PPARγ	SREBP-1c	FAS
Control	1.142±0.088	1.001±0.003	1.003±0.004	1.057±0.086
Model	3.381±1.007^##	2.345±0.053^###	1.761±0.128^###	6.161±0.476^###
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黑皮鸡枞菌提取物改善游离脂肪酸诱导的HepG2细胞脂质代谢及氧化应激异常

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吴川 ¹ , 王雯曦 ¹ , 王潇萌 ¹ , 黄少林 ¹ , 王浩楠 ¹ , 阴文娅 ¹ , 黄藩 ²^,^*

食品工业科技 | 营养与保健 2026,47(10): 447-455

收起

食品工业科技 |营养与保健 2026 , 47 (10) : 447 -455

黑皮鸡枞菌提取物改善游离脂肪酸诱导的HepG2细胞脂质代谢及氧化应激异常

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吴川¹, 王雯曦¹, 王潇萌¹, 黄少林¹, 王浩楠¹, 阴文娅¹, 黄藩²^,^*

作者信息

¹四川大学华西公共卫生学院/华西第四医院，四川成都 610041

²四川省农业科学院茶叶研究所，四川成都 610066

通讯作者:

黄藩（1989−），女，硕士，副研究员，研究方向：营养与食品卫生学，E-mail：474844276@qq.com。

作者简介:

吴川（2002−），男，硕士研究生，研究方向：营养与疾病，E-mail：wuchuan1@stu.scu.edu.cn

Oudemansiella raphanipies Extract Ameliorates Free Fatty Acid-induced Abnormallities of Lipid Metabolism and Oxidative Stress in HepG2 Cells

Chuan WU¹, Wenxi WANG¹, Xiaomeng WANG¹, Shaolin HUANG¹, Haonan WANG¹, Wenya YIN¹, Fan HUANG²^,^*

Affiliations

¹West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China

²Tea Research Institute of Sichuan Academy of Agricultural Science, Chengdu 610066, China

出版时间: 2026-05-15 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025050117

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摘要

收起

目的：揭示黑皮鸡枞菌提取物（Oudemansiella raphanipies extract，ORE）改善脂代谢紊乱的潜力和作用机制。方法：采用游离脂肪酸（Free fatty acids，FFA）诱导HepG2细胞脂质堆积模型，研究ORE对肥胖相关肝脂肪变性的影响。利用油红O染色法检测细胞内脂滴形成情况，生化试剂盒法检测各组细胞相关指标，同时利用qRT-PCR和Western Blotting进一步探索ORE改善脂质代谢的分子机制。结果：ORE能减少HepG2细胞的脂质积累，使C/EBPα、PPAR-γ、SREBP-1c、FAS等脂肪生成相关基因以及蛋白的表达减少，此外ORE降低了活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的水平并提高了超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）以及过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性。结论：ORE能够改善脂质沉积HepG2细胞的脂质代谢水平，其机制可能是通过下调C/EBPα、PPAR-γ从而进一步抑制SREBP-1c/FAS合成通路。同时ORE也改善了HepG2细胞的氧化应激水平，可能与清除ROS、MDA并提高SOD以及CAT活性从而调节细胞氧化还原系统有关。

关键词

黑皮鸡枞菌 / HepG2细胞 / 游离脂肪酸 / 脂质代谢 / 氧化应激

Abstract

收起

Objective: This study aimed to investigete the potential and molecular mechanisms of Oudemansiella raphanipies extract (ORE) in ameliorating lipid metabolism dysregulation. Methods: A lipid accumulation model was established in HepG2 cells using free fatty acids (FFA) to investigate the effects of ORE on obesity-associated hepatic steatosis. Oil red O staining were used to detect lipid deposition within cells. Relevant cellular parameters were measured using biochemical assay kits. Furthermore, quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blotting were employed to elucidate the molecular mechanisms underlying ORE's improvement of lipid metabolism. Results: ORE effectively reduced lipid accumulation in HepG2 cells. It significantly downregulated the expression of adipogenesis-related genes and proteins, including C/EBPα, PPARγ, SREBP-1c, and FAS. Additionally, ORE significantly reduced reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) levels while enhanced the activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). Conclusion: ORE can improve the lipid metabolism level of lipid-deposited HepG2 cells. The underlying mechanism may be achieved by downregulating C/EBPα and PPAR-γ to further inhibit the SREBP-1c/FAS synthesis pathway. Concurrently, ORE alleviates oxidative stress in HepG2 cells, potentially through reducing ROS, MDA, enhancing SOD and CAT activities, thereby modulating the cellular redox system.

Key words

Oudemansiella raphanipies / HepG2 cells / free fatty acids / lipid metabolism / oxidative stress

引用本文

吴川, 王雯曦, 王潇萌, 黄少林, 王浩楠, 阴文娅, 黄藩. 黑皮鸡枞菌提取物改善游离脂肪酸诱导的HepG2细胞脂质代谢及氧化应激异常. 食品工业科技, 2026 , 47 (10) : 447 -455 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025050117

Chuan WU, Wenxi WANG, Xiaomeng WANG, Shaolin HUANG, Haonan WANG, Wenya YIN, Fan HUANG. Oudemansiella raphanipies Extract Ameliorates Free Fatty Acid-induced Abnormallities of Lipid Metabolism and Oxidative Stress in HepG2 Cells[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (10) : 447 -455 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025050117

正文

收起

肥胖已经成为全球性的公共卫生问题，肥胖者由于体内脂肪组织过度积累扩张，脂肪细胞的脂解活性会显著增强，从而释放大量游离脂肪酸（Free fatty acids，FFA）入血，其中约60%的肝脏脂质是来源于外周脂肪组织的脂解产物^[1−2]。大量的FFA通过门静脉系统后优先进入肝脏，当摄入量超过肝脏氧化和极低密度脂蛋白（Very low-density lipoprotein，VLDL）输出能力时，导致TG在肝细胞内异位沉积，逐渐形成非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD），其核心病理机制涉及FFA过度摄取导致脂质蓄积与氧化应激失衡^[3−5]。据统计，中国的NAFLD患病率已接近30%，且患病率在逐年上升^[6−7]。目前，治疗像NAFLD这类脂代谢相关疾病常常需要长期用药来控制血脂水平。但药物的副作用也难以避免，例如他汀类、贝特类等调脂药物会导致肝功能损害^[8]，而黑皮鸡枞菌提取物因富含多糖、黄酮、多酚等多种天然活性成分，可以通过清除自由基、抑制脂质过氧化及调控抗氧化酶活性改善细胞的氧化应激状态^[9−10]，是除了常规药物治疗外，能够同时兼顾疗效与安全的天然物质，在辅助降脂方面具有巨大的潜力。魏奇等^[11]发现黑皮鸡枞菌多糖可通过上调SOD活性，降低脂质过氧化物MDA含量，从而减少脂质堆积细胞的氧化应激，保护肝脏和其他器官免受氧化损伤。此外，其通过减轻肝纤维化和脂肪变性，可以改善NAFLD^[12]。张晨^[13]发现黑皮鸡枞菌乙酸乙酯层提取物中富含甲基橙皮苷、根皮素、漆黄素和木犀草素等黄酮类成分，可以通过下调SREBP-1c、FAS等基因的表达，减少肝脏TG和TC的合成。

近年来，HepG2细胞因其保留的肝细胞代谢特征和操作可控性，已成为解析脂毒性机制及筛选干预手段的重要体外细胞平台^[4,14]。李娟等^[15]发现，棕榈酸（PA）与油酸（OA）以1:2~2:1比例联合刺激可模拟体内脂质代谢紊乱环境，通过抑制脂肪酸β氧化、上调SREBP-1c/FAS等合成通路，诱导细胞内TG蓄积及ROS水平升高。因此本研究采用PA:OA为1:2的0.5 mmol/L FFA诱导HepG2细胞24 h构建脂肪堆积模型^[16−17]，通过油红O定量、TG/TC、HDL-C/LDL-C微量法检测脂质代谢相关指标，同时检测ROS/MDA/SOD/CAT等氧化应激相关指标，并对相关基因及蛋白表达进行测定，探究ORE改善脂质代谢的作用通路，系统评价ORE对脂质代谢以及氧化应激的双向调节作用，为ORE在改善脂质堆积和氧化应激方面的研究提供一定理论依据。

1　材料与方法

收起

1.1　材料与仪器

HepG2细胞　由四川大学生物治疗国家重点实验室馈赠于课题组，并保种置于−80 ℃冰箱中；黑皮鸡枞菌　盛宝阁食品有限公司；油酸　美国Sigma-Aldrich贸易有限公司；辛伐他汀（Simvatatin）　北京索莱宝科技有限公司；噻唑蓝（MTT）　德国BIO-Froxx公司；DMEM高糖培养基　美国 Hyclone公司；胎牛血清　美国ZETA Life公司；棕榈酸、油红O染色试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）试剂盒　北京索莱宝科技有限公司；谷丙转氨酶（Alanine Transaminase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）试剂盒　南京建成科技有限公司；ABScript Neo RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover　武汉爱博泰克生物科技有限公司；荧光定量PCR-AceQ qPCR SYBR Green MasterMix　南京诺维赞生物科技有限公司；RIPA裂解液及抑制剂　上海碧云天生物技术有限公司；Ulrasignal 超敏ECL化学发光底物　北京四正柏生物科技有限公司；抗体：SREBP-1c、PPARγ、FAS　购自杭州华安生物技术有限公司；抗体C/EBPα　购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin和山羊抗兔/鼠IgG　购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1510全波长酶标仪　德国Thermo Fisher公司；VCX130超声波破碎仪　美国SONICS公司；Centrifuge 5424 R离心机　德国Eppendorf公司；Eclipse Ti-U倒置荧光显微镜　日本Nikon公司；9505水浴锅　美国Poly Science公司；CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪　美国BIO-RAD；Cavoy Mini P-4蛋白质电泳槽及电泳电源　北京凯元信瑞仪器有限公司；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统　美国BIO-RAD公司；SCIENTZ-50F/A真空冷冻干燥机　宁波新芝生物科技股份有限公司；SCIENTZ-SB25-12DTD超声波仪　宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　ORE的提取制备

将黑皮鸡枞菌用真空冷冻干燥机进行干燥，粉碎并通过40目筛后按料液比1:42（g/mL）将其粉末与82%乙醇混合。随后参考栗铭鸿等^[18]以及苗晶囡等^[19]提取方法使用超声波仪（300 W，40 kHz）在70 ℃下提取117 min。结束后，将上清液过滤以获得粗提物，通过旋转蒸发去除乙醇后，再用石油醚和二氯甲烷提取。提取结束后合并有机相，通过真空去除溶剂后，依次用溶剂A（石油醚:乙酸乙酯，5:1，v/v）和溶剂B（二氯甲烷:甲醇，9:1，v/v）让其通过硅胶柱色谱进行洗脱。最后，将洗脱液合并，通过真空去除溶剂并冻干后获得最终的提取物。

1.2.2　细胞培养与分组

HepG2细胞用含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素溶液的高糖DMEM培养基，在37 ℃、5% CO₂条件下培养。将细胞分别记为空白对照组（Control），模型组（Model），辛伐他汀组（FFA+SV），ORE低、中、高剂量组（依次记为FFA+ORE-L、FFA+ORE-M、FFA+ORE-H）。空白对照组仅加入含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素溶液的完全培养基；模型组加入终浓度0.5 mmol/L FFA溶液；辛伐他汀组：同时加入终浓度0.5 mmol/L FFA和40 μmol/L的辛伐他汀^[20]；ORE-L、ORE-M、ORE-H同时加入终浓度0.5 mmol/L FFA以及不同浓度ORE溶液，培养24 h进行后续实验，除空白对照组外的其余各组溶液均由含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素溶液的完全培养基进行配制。

1.2.3　MTT法检测细胞存活率

取对数生长期HepG2细胞以1×10⁵/mL浓度接种于96孔板，培养24 h，分别加入不同终浓度（5、10、15、20、25、30、35、40、45 μg/mL）ORE处理，37 ℃、5%二氧化碳培养24 h；培养时间结束后，取出96孔板，超净工作台中避光条件下向每孔加入20 μL MTT溶液，放入细胞培养箱中继续避光培养2~4 h。培养完成后，沿边缘吸出孔中原有培养基，并加入150 μL DMSO，放置于摇床上振荡10 min，使得孔板底部结晶溶解，待溶解完全后，将96孔板置于酶标仪中，设置波长为570 nm测定其吸光度值。细胞存活率计算公式如下：

$ \rm{细}胞存活率(\text{%})=\frac{OD实验组}{OD对照组}\times100 $

式中，OD_实验组表示不同浓度ORE组的吸光度；OD_对照组表示对照组的吸光度。

1.2.4　细胞油红O染色

按“1.2.2”项方法诱导HepG2脂肪堆积细胞模型以及分组加样干预，孵育完成后取出六孔板，弃去原有培养基，PBS清洗两次后，吸除培养液，4%多聚甲醛放置 30 min，加入60%异丙醇漂洗20~30 s；吸除多余异丙醇，再加入500 μL油红O染色液，染色30 min；弃去染液后加入1 mL蒸馏水清洗2~5次清除多余的染液后重新加入500 μL蒸馏水覆盖细胞，于显微镜下观察细胞内脂滴染色情况；观察结束后弃去蒸馏水，加入500 μL DMSO，置于摇床上10 min，待染料溶解后，以每孔100 μL加入96孔板，每组三个复孔，酶标仪于490 nm处测吸光度值。

1.2.5　细胞内ATL、AST含量测定

按“1.2.2”项方法诱导HepG2脂肪堆积细胞模型以及分组加样干预，孵育完成后取出六孔板，弃去原有培养基，PBS清洗两次后每孔加入1 mL PBS，用细胞刮刀将大部分细胞刮落，随后将细胞悬液转入离心管内，进行离心（1000 r/min，10 min），完成后弃去上清，加入1 mL PBS重悬，离心（1000 r/min，10 min），重复两次，弃上清，获得细胞沉淀。向管内加入100 μL PBS，冰水浴下超声制备匀浆液。然后按照试剂盒说明书检测各组细胞内ATL、AST含量。

1.2.6　细胞内TC、TG含量测定

按照“1.2.5”的方法处理细胞后，按照试剂盒说明书检测各组细胞内TC、TG含量。

1.2.7　细胞内HDL-C、LDL-C含量测定

按“1.2.2”项方法诱导HepG2脂肪堆积细胞模型以及分组加样干预，孵育完成后取出六孔板，弃去原有培养基，PBS清洗两次后每孔加入1 mL PBS，用细胞刮刀将大部分细胞刮落，随后将细胞悬液转入离心管内，进行离心（1000 r/min，10 min），完成后弃去上清，获得细胞沉淀，加入提取液冰水浴下超声制备匀浆液后离心（10000 r/min，10 min），取上清液按照试剂盒检测各组细胞内HDL-C、LDL-C含量。

1.2.8　细胞内ROS水平测定

按“1.2.2”项方法诱导HepG2脂肪堆积细胞模型以及分组加样干预，孵育完成后取出六孔板，弃去原有培养基，PBS清洗三次后，每孔加入1 mL稀释好的DCFH-DA探针溶液，37 ℃细胞培养箱内孵育25 min后用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，每孔加入1 mL PBS后在倒置荧光显微镜观察并拍照。

1.2.9　细胞内MDA含量及SOD、CAT活性测定

按“1.2.2”项方法诱导HepG2脂肪堆积细胞模型以及分组加样干预，孵育完成后取出六孔板，按照试剂盒说明书对细胞内MDA含量及SOD、CAT活性进行检测。

1.2.10　RT-qPCR检测目的基因相对表达

按“1.2.2”项方法诱导HepG2脂肪堆积细胞模型以及分组加样干预，孵育完成后取出六孔板，收集细胞，提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书逆转录得到互补cDNA，以此为模板于荧光定量PCR仪分别检测脂质代谢相关基因的mRNA相对表达量，以β-actin为内参。采用2^−△△Ct方法计算目的基因相对表达量，引物序列如表1所示。

1.2.11　Western blotting检测相关蛋白的表达

按“1.2.2”项方法诱导HepG2脂肪堆积细胞模型以及分组加样干预孵育完成后取出六孔板，弃去原有培养基，PBS清洗两次后，每孔加入1 mL PBS，用细胞刮刀将大部分细胞刮落，随后将细胞悬液转入离心管内，进行离心（1000 r/min，10 min），完成后弃去上清，每孔加入RIPA裂解液100 μL，冰上裂解30 min，每隔10 min涡旋一次，然后在冰水浴中超声裂解细胞直至液体澄清，超声完成后，离心（13500 r/min，10 min，4 ℃），吸取管中上清液保存用于进行蛋白定量。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗涤3次，根据分子量裁剪条带并分别加入β-actin（1:10000）、PPARγ（1:1000）、C/EBPα（1:1000）、SREBP-1c（1:2000）、FAS（1:5000）抗体中，4 ℃孵育过夜，取出条带TBST洗涤3次，二抗（1:10000）室温孵育1 h，TBST洗涤3次，加入ECL显影液后在曝光仪进行曝光。

1.3　数据处理

所有结果以平均值±标准差（X±SD）表示，每个实验至少重复三次。数据统计分析以及图表通过Excel、GraphPad Prism9.5、Image J完成。通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和Dunnett’s t检验分析组间差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果与分析

收起

2.1　ORE对HepG2细胞存活率的影响

MTT实验结果显示，ORE浓度在5~25 μg/mL范围内时HepG2细胞的细胞存活率保持在95%以上，而当ORE溶液浓度达到30 μg/mL后细胞存活率显著下降至85%以下（P<0.001），对细胞产生损害，见图1。结合MTT实验结果并参考刘亚迪等^[21]用芦丁干预HepG2细胞的剂量，最终选择了5、10、20 μg/mL三个浓度分别作为低、中、高剂量进行后续干预实验。

2.2　ORE对HepG2细胞脂肪积累的影响

如图2A所示，与空白对照组相比，模型组细胞内脂滴数量增多，颜色明显，ORE干预后细胞内脂滴数量减少，红色较模型组变浅。阳性药辛伐他汀干预后，细胞内脂滴数量也有减少，颜色变浅。如图2B所示，对各组细胞内染料的含量进行定量分析发现结果与显微镜下观察基本一致，模型组染料的吸光度较空白对照组明显增加（P<0.001），而ORE干预后能够显著降低FFA干预后细胞内脂质的积累（P<0.01，P<0.001，P<0.05），其染料吸光度分别下降28.61%、30.32%、19.91%。

2.3　ORE对HepG2细胞损伤的影响

细胞中脂质的积累会损害细胞功能，造成细胞损伤。通过检测细胞中ALT和AST的含量来评估ORE对细胞损伤的作用。ALT和AST是肝损伤的生物标志物，当肝细胞受损时，ALT和AST含量会显著升高，因此被广泛应用于肝损伤评价^[22−23]。图3结果显示，FFA诱导使得细胞内ALT、AST含量上升（P<0.001），造成细胞损伤，而不同剂量ORE干预后ALT含量分别下降了11.86%、27.41%、18.28%，AST含量分别下降了34.54%、21.21%、11.88%，ORE中、高剂量显著降低了细胞内ALT和AST含量（P<0.05，P<0.01），从而产生了细胞保护作用。

2.4　ORE对FFA干预后HepG2细胞中TG、TC水平的影响

为了明确ORE的降脂作用，对细胞内TG和TC的含量进行了测定。图4结果表明，与对照组相比，模型组细胞内TG、TC的含量显著增加（P<0.001）；而与模型组相比，低、中、高剂量ORE干预后TG含量分别下降了66.05%、69.27%、63.42%，能够显著降低TG的含量（P<0.01）。同时中、高剂量的ORE干预后TC含量分别下降了50.91%、47.41%，能够显著降低细胞内的TC含量（P<0.05）。

2.5　ORE对FFA干预后HepG2细胞中的LDL-C以及HDL-C水平的影响

HDL-C主要作用是将周围组织的胆固醇运送到肝脏进行分解，对机体有一定的保护作用，而LDL-C的作用则相反^[24]。为深入探究ORE的降脂作用，检测了细胞内HDL-C和LDL-C的含量。结果表明，与空白对照组相比，模型组HDL-C含量降低了37.34%，LDL-C含量增加了23.61%；而与模型组相比，低、中、高剂量组的HDL-C含量分别升高了52.76%、55.05%、62.82%，LDL-C含量分别下降了11.13%、30.15%、26.17%，逆转了模型组的趋势。结果表明ORE可缓解FFA引起的HepG2细胞内HDL-C和LDL-C水平的异常变化，同时可以看出中等剂量的ORE在降低LDL-C含量上表现出更好的效果（P<0.001），维持细胞内胆固醇水平的相对恒定（图5）。

2.6　ORE对FFA干预后HepG2细胞中的ROS水平的影响

ROS会攻击多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）的双键，生成MDA，破坏膜结构并引发炎症，而在肥胖和糖尿病中，脂肪组织中ROS水平升高会导致脂解异常，如游离脂肪酸释放过多和胰岛素信号通路受损^[25−26]。如图6A所示，与空白对照组相比，模型组细胞的荧光强度显著增强；与模型组相比，ORE各剂量组的荧光强度都有不同程度的下降，且相较于辛伐他汀组效果更明显。图6B是用Image J软件对各组荧光强度进行定量分析，结果与倒置荧光显微镜下观察的一致，模型组ROS荧光强度较空白对照组显著升高（P<0.001）；与模型组相比，辛伐他汀组以及ORE各剂量组的ROS荧光强度分别降低了25.44%、42.54%、59.11%、52.45%，相对于低剂量和高剂量，中剂量的ORE展现出较好的降低ROS活性氧的能力（P<0.001）。

2.7　ORE对HepG2细胞内MDA水平及SOD、CAT活性的影响

如表2所示，与空白对照组相比，模型组细胞内的MDA含量显著升高（P<0.001），SOD、CAT活性显著下降（P<0.001）。与模型组相比，辛伐他汀组以及ORE中、高剂量组的MDA含量显著下降（P<0.01），低剂量没有显著性差异；辛伐他汀组以及ORE低、中剂量组能显著升高SOD的活性（P<0.01），高剂量组没有显著性差异；ORE低、中剂量组能显著升高CAT的活性（P<0.05），辛伐他汀以及高剂量组没有显著性差异。

2.8　ORE对HepG2细胞内脂质代谢相关基因的影响

如表3的RT-qPCR结果所示，与空白对照组相比，模型组C/EBPα、PPARγ、SREBP-1c、FAS基因的mRNA水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，辛伐他汀组以及ORE各处理组PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c、FAS基因的mRNA水平均显著下降（P<0.01）。

2.9　ORE对HepG2细胞内脂质代谢相关蛋白的影响

基于RT-qPCR的结果，对相应的蛋白表达进行了检测，如图7A、图7B所示，与空白对照组相比，模型组C/EBPα、PPARγ的蛋白水平显著上升（P<0.05）；与模型组相比，辛伐他汀组以及ORE各处理组显著降低了细胞内C/EBPα、PPARγ、蛋白的表达（P<0.01）。为了进一步探究C/EBPα、PPARγ的变化是否对SREBP-1c以及FAS的蛋白表达产生影响，利用蛋白免疫印迹法对SREBP-1c、FAS的蛋白表达水平进行了检测，如图7C、图7D所示，与空白对照组相比，模型组SREBP-1c、FAS的蛋白水平显著上升（P<0.01）；与模型组相比，辛伐他汀组以及ORE各处理组显著降低了细胞内SREBP-1c、FAS蛋白的表达（P<0.01）。

3　讨论与结论

收起

C/EBPα、PPARγ是脂质合成启动的两个关键基因，李蓉等^[27]和Alcalde等^[28]发现，C/EBPα通过其启动子的C/EBP结合位点自我激活并持续表达，进而刺激PPARγ的转录，在C/EBPα缺失的脂肪细胞中，PPARγ无法被诱导，导致脂滴积累减少和胰岛素信号缺陷。同时，C/EBPα和PPAR-γ在脂肪分化过程中能形成正反馈环路，Han等^[29]发现，C/EBPα通过结合PPARγ启动子直接诱导其表达，而PPARγ激活后进一步增强C/EBPα的转录。同时Pettinelli等^[30]发现PPAR-γ还可通过结合FAS启动子上的PPAR反应元件直接诱导其表达，也能通过上调SREBP-1c的表达增强脂质合成。结果表明，与模型组比较，ORE各处理组C/EBPα、PPARγ基因以及蛋白的表达水平在FFA诱导的脂肪堆积HepG2细胞中被显著抑制，并进一步抑制了SREBP-1c、FAS基因以及蛋白的表达，从而抑制了脂质的生成。

同时有文献表明，氧化应激是脂质代谢紊乱的重要驱动因素之一，氧化应激会增加ROS的产生，导致脂质过氧化、细胞毒性、线粒体功能障碍等，从而加剧脂质代谢紊乱^[31−32]，而ROS会激活SREBP-1c，进一步促进脂肪酸合成酶FAS的表达，增加脂质合成并进一步加剧线粒体氧化应激^[33]。与此同时，ROS会攻击细胞膜中的PUFA，引发脂质过氧化链式反应，生成终产物MDA。MDA作为脂质过氧化的核心生物标志物，其水平升高直接反映氧化应激程度，同时也与NAFLD的严重程度成正相关^[25−26,34]，而SOD是清除超氧阴离子的关键酶，其活性下降，会削弱细胞清除ROS的能力^[35]。实验结果显示，与模型组比较，ORE能够提高SOD、CAT活性，并降低MDA、ROS的水平，从而改善FFA诱导的HepG2细胞的氧化应激水平。值得探讨的一个点是，在大部分结果中ORE的剂量与其效应并非呈现一种剂量效应依赖关系，而是中等剂量效果更好，比如在油红O染色结果以及TG、TC、ALT、LDL-C和氧化应激等相关指标中相较于低剂量和高剂量，中等剂量的ORE处理细胞后表现出更好的效果。某些生物过程可能涉及多步骤或非线性机制，使得中等剂量更有效，同时脂质代谢的调控涉及多个基因、信号通路和代谢途径，其调控机制复杂，可能涉及非线性调控、反馈回路或信号交叉作用。因此，ORE的剂量效应关系可能呈现“抛物线”的形式，涉及非线性调控、反馈回路或信号交叉作用，所以呈现出低剂量和高剂量的效应不如中等剂量。

综上，本研究为ORE改善脂质堆积作用提供了基本的理论依据，其能够改善FFA诱导的脂质堆积HepG2细胞的脂质代谢水平，其机制可能是通过下调C/EBPα、PPAR-γ从而进一步抑制SREBP-1c/FAS合成通路来实现的，同时也改善了HepG2细胞的氧化应激水平，可能与清除ROS、提高SOD以及CAT活性从而调节细胞氧化还原系统有关。然而本文只从脂质合成方面探究了ORE改善HepG2细胞脂质代谢的机制，后续可以在脂质分解以及脂肪酸β氧化等方面探索其可能的潜在作用机制，同时进一步研究其改善HepG2细胞氧化应激水平的关键蛋白以及相关上下游信号因子的表达，阐明ORE基于基因-蛋白-代谢物层面调控氧化应激的作用机制。

参考文献

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参考文献引证文献

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2026年第47卷第10期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025050117

接收时间：2025-05-14
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-05-15

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收稿日期：2025-05-14

基金

作者信息

¹四川大学华西公共卫生学院/华西第四医院，四川成都 610041

²四川省农业科学院茶叶研究所，四川成都 610066

通讯作者:

黄藩（1989−），女，硕士，副研究员，研究方向：营养与食品卫生学，E-mail：474844276@qq.com。

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/spgykj/CN/10.13386/j.issn1002-0306.2025050117

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

引物名称	引物序列（5’→3’）
β-Actin	F：TCAAGAAAGGGTGTAACGCAACTA
R：CGACAGGATGCAGAAGGAGAT
C/EBPα	F：TGGACAAGAACAGCAACGAGTA
R：ATTGTCACTGGTCAGCTCCAG
PPARγ	F：AGGCCTTGGAAGCCCTACTA
R：CAGCAACCTCTGCGAGTCTC
SREBP-1c	F：GTGGAGAGAAGCGCACAG
R：TGTTGCAGAAAGCGAATGTAG
FAS	F：CTAGGTTTGATGCCTCCTTCTT
R：ATGGCTTCATAGGTGACTTCC

引物名称

引物序列（5’→3’）

β-Actin

F：TCAAGAAAGGGTGTAACGCAACTA

R：CGACAGGATGCAGAAGGAGAT

C/EBPα

F：TGGACAAGAACAGCAACGAGTA

R：ATTGTCACTGGTCAGCTCCAG

PPARγ

F：AGGCCTTGGAAGCCCTACTA

R：CAGCAACCTCTGCGAGTCTC

SREBP-1c

F：GTGGAGAGAAGCGCACAG

R：TGTTGCAGAAAGCGAATGTAG

FAS

F：CTAGGTTTGATGCCTCCTTCTT

R：ATGGCTTCATAGGTGACTTCC

组别	MDA（nmol/mg, pro）	SOD（U/mg, pro）	CAT（U/mg, pro）
Control	0.039±0.001	1.733±0.069	0.158±0.006
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FFA+SV	0.217±0.008^**	1.449±0.094^**	0.096±0.005
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组别

MDA（nmol/mg, pro）

SOD（U/mg, pro）

CAT（U/mg, pro）

Control

0.039±0.001

1.733±0.069

0.158±0.006

Model

0.241±0.004^###

1.050±0.064^###

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FFA+SV

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FFA+ORE-H

0.210±0.003^**

1.246±0.090

0.091±0.007

组别	C/EBPα	PPARγ	SREBP-1c	FAS
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组别

C/EBPα

PPARγ

SREBP-1c

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2.508±0.124^***