食品工业科技

因素	变量	水平
A	温度（℃）	28	31	34
B	初始pH	5	6	7
C	接种量（%）	2	3	4

因素	变量	水平
A	温度（℃）	28	31	34
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因素	变量	水平
A	温度（℃）	28	31	34
B	初始pH	5	6	7
C	接种量（%）	3	4	5

因素	变量	水平
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B	初始pH	5	6	7
C	接种量（%）	3	4	5

生理生化试验	GXUN-XS3	生理生化试验	GXUN-XS8
葡萄糖	+	葡萄糖	+
麦芽糖	+	麦芽糖	+
蔗糖	+	蔗糖	+
乳糖	+	乳糖	−
淀粉	−	淀粉	+
氧化-发酵试验	发酵型	氧化-发酵试验	发酵型
甲基红试验	+	甲基红试验	−
明胶液化试验	+	明胶液化试验	+
硫化氢试验	−	硫化氢试验	−
石蕊牛奶试验	酸凝固	石蕊牛奶试验	产酸
靛基质试验	+	靛基质试验	−

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试验号	A温度（℃）	B初始pH	C接种量（%）	DM（%）
1	34	6	4	94.71
2	34	7	3	93.38
3	31	5	4	95.36
4	28	5	3	95.02
5	31	6	3	95.85
6	34	6	2	92.77
7	28	7	3	93.67
8	31	5	2	93.72
9	31	7	2	93.65
10	28	6	4	94.67
11	28	6	2	94.46
12	31	6	3	95.54
13	31	7	4	93.46
14	31	6	3	95.69
15	34	5	3	94.14
16	31	6	3	96.19
17	31	6	3	95.82

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5	31	6	4	95.74
6	28	6	5	92.75
7	34	6	5	91.27
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12	34	7	4	92.88
13	34	5	4	93.98
14	31	6	4	95.99
15	34	6	3	92.94
16	31	5	5	92.27
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来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	17.01	9	1.89	40.62	<0.0001	**
A	0.9941	1	0.9941	21.37	0.0024	**
B	2.08	1	2.08	44.74	0.0003	**
C	1.62	1	1.62	34.83	0.0006	**
AB	0.0870	1	0.0870	1.87	0.2136
AC	0.7482	1	0.7482	16.09	0.0051	**
BC	0.8372	1	0.8372	18.00	0.0038	**
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B²	3.68	1	3.68	79.18	<0.0001	**
C²	2.94	1	2.94	63.16	<0.0001	**
残差	0.3256	7	0.0465
失拟项	0.0925	3	0.0308	0.5291	0.6859	不显著
纯误差	0.2331	4	0.0583
总误差	17.33	16

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来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	37.07	9	4.12	41.10	<0.0001	**
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A²	4.37	1	4.37	43.56	0.0003	**
B²	3.99	1	3.99	39.80	0.0004	**
C²	20.44	1	20.44	203.96	<0.0001	**
残差	0.7015	7	0.1002
失拟项	0.0569	3	0.0190	0.1178	0.9450	不显著
纯误差	0.6445	4	0.1611
总误差	37.77	16

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样品	灰分含量（%）	DM（%）
SSP	31.62±0.45	−
SSP-3	2.69±0.07	96.09±0.10
SSP-8	2.96±0.04	95.74±0.12

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虾壳高效脱灰分菌株的筛选及发酵工艺的优化

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潘小卓 , 谢勇俊 , 尹凯波 , 郑子露 , 王一兵 ^*

食品工业科技 | 工艺技术 2026,47(1): 279-288

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食品工业科技 |工艺技术 2026 , 47 (1) : 279 -288

虾壳高效脱灰分菌株的筛选及发酵工艺的优化

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潘小卓（1999−），女，硕士研究生，研究方向：海洋微生物资源的开发与利用，E-mail：zhuo1861work@163.com

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潘小卓, 谢勇俊, 尹凯波, 郑子露, 王一兵^*

作者信息

广西民族大学海洋与生物技术学院，广西多糖材料与改性重点实验室，广西南宁 530008

通讯作者:

王一兵（1974−），女，博士，研究员，研究方向：海洋微生物资源开发与利用，E-mail：wybgxun@163.com。

作者简介:

潘小卓（1999−），女，硕士研究生，研究方向：海洋微生物资源的开发与利用，E-mail：zhuo1861work@163.com

Screening and Optimization of High-efficiency Demineralization Bacterial Strains for Shrimp Shell Fermentation

Xiaozhuo PAN, Yongjun XIE, Kaibo YIN, Zilu ZHENG, Yibing WANG^*

Affiliations

School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi Minzu University, Guangxi Key Laboratory for Polysaccharide Materials and Modifications, Nanning 530008, China

出版时间: 2026-01-01 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024120364

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摘要

收起

虾壳是目前几丁质的最主要来源，对虾壳脱灰分是制备几丁质的关键步骤。本研究从废弃虾塘中分离到两株产酸菌株GXUN-XS3和GXUN-XS8，运用形态学及分子生物学方法对其进行鉴定，通过单因素实验及响应面试验优化菌株的最优发酵工艺，利用SEM对发酵产物进行表征分析。结果表明，GXUN-XS3和GXUN-XS8分别为粪肠球菌和海岸微小杆菌。优化后GXUN-XS3在含2%虾壳粉、3%葡萄糖、1%氯化钠的培养基中以温度30.5 ℃、初始pH5.6、接种量3.3%条件下发酵3 d，虾壳脱灰分率达到96.09%，较优化前提高6.29%。GXUN-XS8在含2%虾壳粉、2%麦芽糖、1%氯化钠的培养基中以温度30.7 ℃、初始pH5.7、接种量3.9%条件下发酵4 d，虾壳脱灰分率达到95.73%，较优化前提高6.17%。SEM分析发现，产物的微观结构均呈现出纤维状态并带有孔隙，与酸碱法制备的工业几丁质相比，其纤维组织更加完整。本研究为微生物发酵法降解虾壳废弃物提供了菌株资源和有益参考。

关键词

虾壳 / 产酸菌 / 脱灰分 / 工艺优化 / 响应面法

Abstract

收起

Shrimp shells are currently the primary source of chitin, and demineralization of shrimp shells is a key step in the preparation of chitin. In this study, two acid-producing strains, GXUN-XS3 and GXUN-XS8, were isolated from abandoned shrimp ponds. They were identified through morphological and molecular methods. The optimal fermentation conditions were optimized using single-factor and response surface experiments. SEM analysis was used to characterize the fermentation products. The results showed that the isolated strains GXUN-XS3 and GXUN-XS8 were identified as Enterococcus faecalis and Exiguobacterium aestuarii, respectively. The optimized GXUN-XS3 was fermented in a medium containing 2% shrimp shell powder, 3% glucose, and 1% sodium chloride at a temperature of 30.5 ℃, an initial pH of 5.6, and an inoculum size of 3.3% for 3 days. The demineralization of shrimp shell reached 96.09%, which was an increase of 6.29% compared to before optimization. The optimized GXUN-XS8 fermented in a medium containing 2% shrimp shell powder, 2% maltose, and 1% sodium chloride at a temperature of 30.7 ℃, an initial pH of 5.7, and an inoculum size of 3.9% for 4 days. The demineralization of shrimp shell reached 95.73%, which was an increase of 6.17% compared to before optimization. SEM analysis revealed that the products had a fibrous structure with pores, more intact than industrial chitin produced by acid-alkali methods. This study provides microbial resources and references for the microbial fermentation degradation of shrimp shell waste.

Key words

shrimp shell / acid-producing bacteria / demineralization / process optimization / response surface methodology

引用本文

潘小卓, 谢勇俊, 尹凯波, 郑子露, 王一兵. 虾壳高效脱灰分菌株的筛选及发酵工艺的优化. 食品工业科技, 2026 , 47 (1) : 279 -288 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2024120364

Xiaozhuo PAN, Yongjun XIE, Kaibo YIN, Zilu ZHENG, Yibing WANG. Screening and Optimization of High-efficiency Demineralization Bacterial Strains for Shrimp Shell Fermentation[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (1) : 279 -288 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2024120364

正文

收起

南美白对虾是我国养殖虾类的主导品种之一，其具有生长快、适应性强和营养价值高等优势^[1]。在2021年，仅广西地区对虾产量就超过29万吨^[2]。对虾在整个生命周期中需蜕十几次壳，由此产生的虾壳废弃物约占整虾质量的40%~60%^[3]。虾壳主要由灰分（30%~50%）、蛋白质（15%~50%）和几丁质（15%~30%）组成^[4]，对其脱灰分（demineralization，DM）是制备几丁质的关键步骤。在该处理过程中仅需添加少量碱液，即可获得几丁质^[5]。几丁质具有抗菌、免疫调节等生物活性^[6−7]，在生物医药和食品等领域具有广泛的应用潜力^[8]，对其进行制备有助于虾壳的高值化利用^[9]。

现阶段虾壳DM的主要方法为酸碱法和微生物发酵法^[10]。其中，酸碱法DM废水处理成本高，环境危害大，不利于功能物质的回收。而微生物发酵法主要利用微生物代谢过程中产生的有机酸及蛋白酶去除虾壳中的矿物质和蛋白质^[11]，从而获得几丁质。Cira等^[12]通过利用一种乳酸杆菌对虾壳进行发酵处理，结果表明虾壳矿物质去除率达到了85%，而蛋白质去除率为87.6%。张婧^[13]通过嗜热链球菌发酵虾头，使用10%的虾头和5%的葡萄糖，在发酵64 h后，达到了94.15%的蛋白质去除率和83.27%的脱灰分率。虽然上述研究具有条件温和、环境友好等优点，但仍面临菌株选择有限和工艺复杂等问题，这影响了微生物发酵法在降解虾壳及制备几丁质中的进一步应用^[14]。

因此，本研究希望从北部湾地区废弃虾塘池淤泥中筛选出能够高效脱除虾壳灰分的菌株，运用形态学及分子生物学进行菌种鉴定，通过单因素及响应面试验，确定菌株DM最优发酵工艺条件，并对所得几丁质进行表征分析，拟开发绿色高效的虾壳灰分脱除技术。以期为虾壳废弃物资源化利用提供新的菌种，并为微生物发酵法降解虾壳废弃物制备几丁质提供实验基础。

1　材料与方法

收起

1.1　材料与仪器

采集广西北部湾地区废弃虾塘淤泥样品，将样品放入无菌样品袋中，提前准备好的干冰置于泡沫箱中与样品袋一起送回实验室。网上购入已剔除虾肉水洗后烘干的对虾壳，经粉碎，过65目筛（直径250 μm）；种子液培养基（g/L）：MRS肉汤培养基52.2 g，虾壳粉5.0 g。pH5.7±0.2，118 ℃灭菌15 min；发酵培养基（g/L）：虾壳粉20.0 g、葡萄糖20.0 g、氯化钠10.0 g。pH自然，121℃灭菌20 min。

GI54DS高压蒸汽灭菌锅　厦门致微仪器有限公司；LEGEND MICR017微量台式离心机　美国Thermo Scientific公司；Bio Rad T100 Mastercycler nexus聚合酶链式反应仪　美国Bio-Rad公司；ZXMP-A1230电热恒温培养箱　上海智城分析仪器制造有限公司；HNYC 1102智能恒温培养振荡器　天津欧诺仪器有限公司；PHS-3Cb pH计　上海越平科学仪器有限公司；SUPRA 55 Sapphire扫描电子显微镜（SEM）　德国卡尔蔡司公司。

1.2　实验方法

1.2.1　菌株筛选

1.2.1.1　初筛

取2 g淤泥样品置入18 mL无菌水中，34 ℃、180 r/min培养12 h。取其上清液稀释成10⁻³、10⁻⁴和10⁻⁵ 3个梯度菌悬液，将该悬液涂布于添加2%碳酸钙的MRS固体培养基上，34 ℃倒置培养3~5 d。将此期间产生透明圈的菌株，接种至30 mL发酵培养基中，34 ℃、180 r/min培养24 h。在培养期间，每2 h测定一次发酵液pH，筛选出pH较低的菌株进行复筛，并置甘油管中-20 ℃保藏。

1.2.1.2　复筛

挑取初筛所得菌株，接种至30 mL种子液培养基中，34 ℃、180 r/min摇床中活化18 h，其OD₆₀₀为0.8~1.0。再以3%接种量，接种至50 mL发酵培养基中，34 ℃、180 r/min培养6 d后，4 ℃ 4000 r/min离心10 min，取沉淀，去离子水反复清洗两到三遍，直到沉淀物中没有明显杂质，置于65 ℃下烘干至恒重^[15]。测定沉淀物中灰分含量，并以DM%为筛选标准。

1.2.2　菌株鉴定

1.2.2.1　菌株形态及生理生化

将筛选出的菌株接种到MRS固体培养基上，34 ℃恒温培养48 h，观察菌株的菌落形态及进行革兰氏染色。生理生化试验：参考《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，对筛选菌株进行糖类代谢试验、氧化-发酵试验、甲基红试验、明胶液化试验、硫化氢试验、石蕊牛奶试验、靛基质试验。

1.2.2.2　菌株16S rDNA序列分析及系统发育树构建

按照张奇等^[16]的方法进行菌株16S rDNA扩增，并将PCR扩增产物送于生工生物工程（上海）股份有限公司测序。所得序列提交Ezbiocloud，并与数据库中同源性较高的序列进行比对。使用MEGA 11软件进行16S rDNA序列的比对分析，并构建系统发育树。

1.2.3　单因素实验

初始发酵培养基：2%虾壳粉、2%葡萄糖、1%氯化钠。初始发酵条件：3%接种量，初始pH为7，34 ℃、180 r/min摇床发酵。

1.2.3.1　发酵时间优化

在初始发酵培养基及初始发酵条件基础上，优化发酵时间因素1、2、3、4、5、6 d。发酵结束后，4 ℃ 4000 r/min离心10 min，取沉淀，去离子水反复清洗两到三遍，直到沉淀中没有明显杂质，置于65 ℃下烘干至恒重，计算虾壳粉DM%，并在发酵过程中参照GB 12456-2021《食品中总酸的测定》中酸碱指示剂滴定法测定发酵液中总酸浓度（total acid，TTA）^[17]。

1.2.3.2　发酵培养基优化

在发酵时间优化及初始发酵条件基础上，优化初始发酵培养基中a.虾壳粉浓度（w/v）：1%、2%、3%、4%、5%；b.碳源种类：乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉；c.在碳源种类优化的基础上进行碳源浓度优化（w/v）：1%、2%、3%、4%、5%。发酵结束后，离心，取沉淀，去离子水反复清洗，置于65 ℃下烘干至恒重，计算虾壳粉DM%。

1.2.3.3　发酵条件优化

在发酵时间优化及发酵培养基优化基础上，优化初始发酵条件中a.接种量（v/v）：1%、2%、3%、4%、5%；b.初始pH：4、5、6、7、8；c.发酵温度：28、31、34、37、40 ℃。发酵结束后，离心，取沉淀，去离子水反复清洗，置于65 ℃下烘干至恒重，计算虾壳粉DM%。

1.2.4　响应面试验

采用Box-Behnken中心组合试验进行条件优化，以温度（A）、初始pH（B）、接种量（C）为变量，以DM（Y）为响应值设计3因素3水平试验，试验方案中的各因素和水平如表1和表2所示。

1.2.5　灰分含量测定

准确称取0.2 g样品（精确至0.0001 g），并参照GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》中总灰分法测定虾壳粉中灰分含量^[18]。灰分脱除率计算公式：

$ {\mathrm{DM}}({\text{%}}) = \frac{{{\mathrm{C}}_0 \times {\mathrm{M}}_0 - {\mathrm{C}}_1 \times {\mathrm{M}}_1}}{{{\mathrm{C}}_0 \times {\mathrm{M}}_0}} \times 100 $

式中：DM表示灰分脱除率，%；C₀表示发酵前虾壳粉中灰分含量，%；C₁表示发酵后虾壳粉中灰分含量，%；M₀表示发酵前虾壳粉质量，g；M₁表示发酵后虾壳粉质量，g。

1.2.6　几丁质表征分析

利用扫描电子显微镜（SEM）观察未处理虾壳与所得几丁质表面形态，并进行比较。

1.3　数据处理

所有实验均为三组平行，实验结果以平均值±标准差（S.D.）表示。利用IBM SPSS Statistics 21对实验数据通过单因素方差分析方法（One-way analysis of variance，one-way ANOVA）进行显著性差异分析（P<0.05）。采用Design-Expert 13软件，依据Box-Behnken中心组合原则，进行三因素三水平设计。图表绘制使用Origin 64软件。

2　结果与分析

收起

2.1　菌株的筛选与鉴定

2.1.1　菌株的筛选

本实验从广西北部湾地区废弃虾塘池淤泥中共筛选出8株产酸的菌株。其发酵过程中pH变化如图1A所示，GXUN-XS1、GXUN-XS3、GXUN-XS4和GXUN-XS8较于其他菌株pH下降快，降到相同pH时所用时间短，当发酵16 h后，pH逐步趋于稳定并维持在4.5~4.7，远低于其他菌株pH。在发酵过程中pH的降低通常表明有微生物产生了有机酸，而这些酸性物质的产生往往与菌株发酵潜力密切相关^[19]。为了进一步筛选出产酸能力强的菌株，对上述4株菌进一步筛选，其虾壳DM%结果如图1B所示，GXUN-XS3和GXUN-XS8的DM%分别达到90.40%±0.02%、90.18%±0.50%，显著（P<0.05）高于其他两种菌株。因此，结合发酵液pH及虾壳DM%结果，最终选定GXUN-XS3和GXUN-XS8为虾壳降解菌。

2.1.2　菌株的鉴定

GXUN-XS3菌落形态如图2A所示，为乳白色、周边整齐的圆形、湿润光滑且不透明，经革兰氏染色结果如图2B所示，为阳性，通过镜检观察，细菌均呈单个、成双或短链排列的卵圆形球菌，无芽孢、无鞭毛，该菌可初步鉴定为肠球菌^[20]；GXUN-XS8菌落形态如图2C所示，为浅橙色、周边整齐的圆形、湿润光滑且不透明，经革兰氏染色结果如图2D，为阳性，细菌早期均呈杆状，后期部分呈球状，无芽孢、无鞭毛，该菌可初步鉴定为微小杆菌^[21]。两株菌生理生化试验结果见表3。GXUN-XS3具有乳糖发酵能力、甲基红试验阳性、靛基质还原能力、酸性牛奶反应，表现出较强的酸性代谢特性，且能分解较多种糖类。而GXUN-XS8没有乳糖发酵能力，但能发酵淀粉，且没有靛基质还原能力，显示出不同的代谢特征，可能在代谢产物和酶的生产上与GXUN-XS3有所不同。

GXUN-XS3系统发育树如图3A所示，GXUN-XS3与粪肠球菌AT CC 19433（Enterococcus faecalis）同源性为100%，同时，结合该微生物的菌落形态及生理生化鉴定结果，认定GXUN-XS3为粪肠球菌；GXUN-XS8系统发育树如图3B所示，GXUN-XS8与海岸微小杆菌TF-16（Exiguobacterium aestuarii）同源性为100%，同时，结合该微生物的菌落形态及生理生化鉴定结果，认定GXUN-XS8为海岸微小杆菌。

2.2　单因素实验结果与分析

2.2.1　最佳发酵时间的确定

GXUN-XS3发酵时间对虾壳DM%影响如图4A所示，1~3 d时，其DM%快速增长，存在显著性差异（P<0.05），DM%在发酵第3 d达到最大90.60%±0.02%，在发酵时间3 d后趋于稳定，没有显著变化（P>0.05）；TTA在发酵2 d后，随着发酵时间的延长显著增加（P<0.05）。原因在于发酵过程中pH逐渐降低，过酸环境造成细胞膜受损，细胞内糖酵解酶活性降低，菌株分解代谢速率减慢^[22]。GXUN-XS8发酵时间对虾壳DM%影响如图4B所示，1~4 d时，随着发酵时间延长其DM%快速增长，存在显著性差异（P<0.05），DM%在第4 d达到最大90.34%±0.48%，之后趋于稳定，没有显著变化（P>0.05），说明菌株的代谢效率和干物质分解能力已经达到了最佳状态。TTA在发酵过程中虽然出现了短期波动，但从整体来看，TTA在虾壳DM%达到最大后继续上升，说明该菌的代谢活动在这个时间段稳定且持续产酸，这与屈晓伟^[23]研究结果类似。发酵初期，虾壳中的微生物菌株通过代谢活动产生有机酸，这些有机酸与虾壳中的矿物质发生反应，导致矿物质的溶解和脱除^[24]。此时发酵液中的有机酸积累较少，因此TTA较低且增长缓慢；当虾壳DM%达到最大时，有机酸的积累逐渐稳定，TTA快速增长，此时TTA增长较DM%具有滞后性。因此经优化后，GXUN-XS3和GXUN-XS8发酵时间分别为3 d和4 d。

2.2.2　最佳发酵培养基的确定

虾壳中丰富的蛋白质可作为菌株发酵过程中的唯一氮源。由图5A、图6A可知，不同虾壳粉浓度组间差异显著（P<0.05），当虾壳粉添加浓度为发酵液体积的2%时，GXUN-XS3（图5A）和GXUN-XS8（图6A）有最大DM%分别为90.37%±0.24%和90.02%±0.67%。之后随着虾壳粉浓度的增加DM%逐渐降低，这是由于虾壳粉浓度增加，导致发酵液中蛋白浓度也增加，蛋白具有黏性，将虾壳粉吸附并包裹，使有机酸较难进入虾壳内部与灰分反应^[25]。碳源的选择和优化对发酵效率和产物生成具有显著影响。GXUN-XS3（图5B）以葡萄糖为碳源时DM%最高，当葡萄糖添加量为发酵液体积的3%时（图5C），其DM%可达到93.93%±0.58%，与优化前（90.40%±0.02%）相比，提高了3.91%。GXUN-XS8（图6B）在发酵过程中可以利用葡萄糖和麦芽糖，其DM%之间存在显著性（P<0.05）差异，但以麦芽糖为碳源时有最高DM%为91.21%±0.38%，当麦芽糖的添加量为发酵液体积的2%和3%时（图6C），两个浓度之间DM%无显著性（P>0.05）差异，考虑成本因素，最终选择麦芽糖浓度为2%。与Duan等^[26]报道中添加15%碳源结果相比，本实验所需碳源浓度更低，有望在后续工业化应用中低碳排放，达到绿色环保的生产要求。

经单因素优化，GXUN-XS3发酵培养基优化为：2%虾壳粉、3%葡萄糖、1%氯化钠；GXUN-XS8发酵培养基优化为：2%虾壳粉、2%麦芽糖、1%氯化钠。

2.2.3　最佳发酵条件的确定

菌株接种量的变化对虾壳DM%的影响较大。由图7A、图8A可知，不同接种量各组之间存在显著差异（P<0.05）。GXUN-XS3（图7A）接种量在3%（v/v）时，虾壳DM%最大为93.10%±1.26%；GXUN-XS8（图8A）接种量在4%（v/v）时，虾壳DM%最大为95.31%±0.72%。接种量过低，菌株产酸速率较慢，发酵时间延长；接种量过高，菌株快速消耗营养物质，优先用于繁殖而非产酸。随着初始pH的降低，GXUN-XS3（图7B）和GXUN-XS8（图8B）发酵虾壳DM%均呈现先增加后降低的趋势，与Rao等^[27]报道结果相一致，在降解过程中较高初始pH（6.5）拥有比较低初始pH（5.5）更高的DM%。GXUN-XS3（图7B）在初始pH为6的条件下，发酵虾壳DM%达到最大值93.89%±0.31%；GXUN-XS8（图8B）在初始pH为5和6时，发酵虾壳DM%无显著（P>0.05）差异。培养基未调节时pH为6.7±0.2，调节到更低pH则需消耗更多试剂，经优化GXUN-XS3和GXUN-XS8初始pH均为6。发酵温度是影响菌株酸性代谢能力的关键因素之一^[28]。随着温度的升高，GXUN-XS3（图7C）和GXUN-XS8（图8C）发酵虾壳DM%均呈现先增加后降低的趋势，在温度为31 ℃时，两株菌具有最大DM%分别为95.61%±0.43%和93.40%±0.66%，显著（P<0.05）高于其他温度。

2.3　响应面试验结果与分析

2.3.1　Box-Behnken试验设计与结果分析

在单因素实验结果基础上，探究各因素间的交互作用对虾壳DM%的影响。采用Design-Expert 13对表4和表5中试验结果进行多元回归方程拟合，得到GXUN-XS3回归方程：Y=95.82+0.3525A−0.5100B+0.4500C+0.1475AB+0.4325AC−0.4575BC−0.8302A²−0.9352B²−0.8353C²；GXUN-XS8回归方程：Y=95.68−0.3100A−0.5050B+0.4350C−0.1125AB−0.3825AC+0.3925BC−1.02A²-0.9732B²−2.20C²。

GXUN-XS3回归模型方差分析结果见表6，模型中A、B、C、AC、BC、A²、B²、C²对Y值影响极显著，其余影响不显著。模型P<0.01，表明模型极显著；失拟项P>0.05，表明模型拟合度良好；R²_Adj=0.9571，表明95.71%的响应值变化可以通过该模型进行解释；R²=0.9812，介于0到1之间，表明实际值与预测值相关程度高。因此，该模型可应用于实际GXUN-XS3发酵虾壳DM的预测与分析。

GXUN-XS8回归模型方差分析结果见表7，该模型中B、C、A²、B²、C²对Y值影响极显著，A、AC、BC对Y值影响显著，其余影响不显著。模型P<0.01，表明模型极显著；失拟项P>0.05，表明模型拟合度良好；R²_Adj=0.9575，表明95.75%的响应值变化可以通过该模型进行解释；R²=0.9814，介于0到1之间，表明实际值与预测值相关程度高。因此，该模型可应用于实际GXUN-XS8发酵虾壳DM的预测与分析。

响应曲面坡度的陡峭与平缓可直接反映出3个因素对虾壳DM%的影响。由图9可知，GXUN-XS3的3个因素所呈现的图像均为凸型，反映了极高的响应值，较为陡峭的曲面坡度说明各因子之间交互作用复杂，除AB项外的其余交互因素对虾壳DM%的影响均达到极显著水平。由图10可知，GXUN-XS8的AB交互作用不显著，AC、BC交互显著。响应面图的结果与表6、表7中的数据有着较好的一致性。

2.3.2　验证实验

利用Design-Expert 13软件分析，得到GXUN-XS3最佳DM%参数：温度30.525 ℃、初始pH5.634、接种量3.328%，此时虾壳DM%预测值为96.013%，根据实际的实验条件，将工艺条件修改为温度30.5 ℃，初始pH5.6，接种量3.3%，实际虾壳DM%为96.09%±0.10%，与理论值接近，较优化前（90.40%±0.02%）提高了6.29%；得到GXUN-XS8最佳DM%参数：温度30.653 ℃、初始pH5.724、接种量3.887%，此时虾壳DM%预测值为95.796%，根据实际的实验条件，将工艺条件修改为温度30.7 ℃，初始pH5.7，接种量3.9%，实际虾壳DM%为95.74%±0.12%，与理论值接近，较优化前（90.18%±0.50%）提高了6.17%。与Sedaghat等^[29]使用铜绿假单胞菌对废弃虾壳进行发酵处理，接种量为20%，发酵时间6 d，DM%为82%的结果相比，GXUN-XS3和GXUN-XS8的虾壳脱灰分率更高，且接种量更低，发酵时间短，有望在工业化生产过程中通过减少对原料的消耗，来降低生产成本，提高资源利用率。

2.4　样品中物质含量

GXUN-XS3和GXUN-XS8在最优发酵工艺条件下发酵虾壳结果如表8所示。本实验发酵菌株具有高DM%分别为96.09%±0.10%和95.74%±0.12%，说明该发酵工艺对虾壳废弃物处理效果良好。且发酵后灰分含量分别为2.69%±0.07%和2.96%±0.04%，该含量符合SC/T 3403-2018《甲壳素、壳聚糖》中工业几丁质标准（≤3.0%），避免了过高的矿物质残留对产品品质的影响，保证了产品的质量。这些结果表明，本实验的发酵工艺具有良好的竞争力，能够为虾壳脱灰分的绿色生产提供有效支持。

2.5　几丁质表征分析

SEM照片如图11所示，可以看出四种样品的显微结构明显不同。未处理的虾壳粉（图11A）表面粗糙且多孔，且附着有矿物质和蛋白质微粒，展现出典型的天然生物材料特征。经GXUN-XS3发酵后所得几丁质（图11B）表面孔径变多变密集了，经GXUN-XS8发酵后所得几丁质（图11C）也发生了明显变化，孔径变大，表面颗粒物已被去除，呈现多孔性的纤维组织结构，与Daraghmeh等^[30]研究结果相符。微生物发酵法所得几丁质与酸碱法制备的工业几丁质（图11D）相比，其纤维组织更加完整，原因在于强酸、强碱使几丁质发生脱乙酰化和解聚反应，导致纤维组织出现断裂。

3　结论

收起

本研究筛选出两株高效脱除虾壳灰分的菌株GXUN-XS3和GXUN-XS8，经鉴定为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和海岸微小杆菌（Exiguobacterium aestuarii）。通过单因素及响应面试验，确定两株菌最优的虾壳DM发酵工艺。GXUN-XS3优化的发酵培养基为2%虾壳粉、3%葡萄糖、1%氯化钠，发酵温度30.5 ℃、初始pH5.6、接种量3.3%、时间3 d，在该条件下虾壳DM%为96.09%±0.10%。GXUN-XS8优化的发酵培养基为2%虾壳粉、2%麦芽糖、1%氯化钠，发酵温度30.7 ℃、初始pH5.7、接种量3.9%、发酵时间4 d。在该条件下虾壳DM%为95.74%±0.12%。GXUN-XS3和GXUN-XS8发酵后所得几丁质纤维组织更加完整，呈现明显的多孔特征，相较于工业法制备的几丁质性能更优越。综上，与已报道的菌株相比，本研究中的GXUN-XS3和GXUN-XS8在虾壳脱灰分方面展现出了一定的优势，为实现微生物发酵法工业化制备几丁质提供参考依据。

参考文献

收起

文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2026年第47卷第1期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024120364

接收时间：2024-12-30
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-01-01

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收稿日期：2024-12-30

基金

作者信息

广西民族大学海洋与生物技术学院，广西多糖材料与改性重点实验室，广西南宁 530008

通讯作者:

王一兵（1974−），女，博士，研究员，研究方向：海洋微生物资源开发与利用，E-mail：wybgxun@163.com。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

因素	变量	水平
A	温度（℃）	28	31	34
B	初始pH	5	6	7
C	接种量（%）	2	3	4

因素

变量

水平

−1

温度（℃）

初始pH

接种量（%）

因素	变量	水平
A	温度（℃）	28	31	34
B	初始pH	5	6	7
C	接种量（%）	3	4	5

因素

变量

水平

−1

温度（℃）

初始pH

接种量（%）

生理生化试验	GXUN-XS3	生理生化试验	GXUN-XS8
葡萄糖	+	葡萄糖	+
麦芽糖	+	麦芽糖	+
蔗糖	+	蔗糖	+
乳糖	+	乳糖	−
淀粉	−	淀粉	+
氧化-发酵试验	发酵型	氧化-发酵试验	发酵型
甲基红试验	+	甲基红试验	−
明胶液化试验	+	明胶液化试验	+
硫化氢试验	−	硫化氢试验	−
石蕊牛奶试验	酸凝固	石蕊牛奶试验	产酸
靛基质试验	+	靛基质试验	−

生理生化试验

GXUN-XS3

生理生化试验

GXUN-XS8

葡萄糖

麦芽糖

蔗糖

乳糖

−

淀粉

−

淀粉

氧化-发酵试验

发酵型

氧化-发酵试验

发酵型

甲基红试验

−

明胶液化试验

硫化氢试验

−

硫化氢试验

−

石蕊牛奶试验

酸凝固

石蕊牛奶试验

产酸

靛基质试验

−

试验号	A温度（℃）	B初始pH	C接种量（%）	DM（%）
1	34	6	4	94.71
2	34	7	3	93.38
3	31	5	4	95.36
4	28	5	3	95.02
5	31	6	3	95.85
6	34	6	2	92.77
7	28	7	3	93.67
8	31	5	2	93.72
9	31	7	2	93.65
10	28	6	4	94.67
11	28	6	2	94.46
12	31	6	3	95.54
13	31	7	4	93.46
14	31	6	3	95.69
15	34	5	3	94.14
16	31	6	3	96.19
17	31	6	3	95.82

试验号

A温度（℃）

B初始pH

C接种量（%）

DM（%）

94.71

93.38

95.36

95.02

95.85

92.77

93.67

93.72

93.65

94.67

94.46

95.54

93.46

95.69

94.14

96.19

95.82

试验号	A温度（℃）	B初始pH	C接种量（%）	DM（%）
1	31	7	3	91.96
2	28	5	4	94.28
3	31	7	5	91.91
4	28	6	3	92.89
5	31	6	4	95.74
6	28	6	5	92.75
7	34	6	5	91.27
8	28	7	4	93.63
9	31	6	4	95.02
10	31	6	4	96.01
11	31	5	3	93.89
12	34	7	4	92.88
13	34	5	4	93.98
14	31	6	4	95.99
15	34	6	3	92.94
16	31	5	5	92.27
17	31	6	4	95.66

试验号

A温度（℃）

B初始pH

C接种量（%）

DM（%）

91.96

94.28

91.91

92.89

95.74

92.75

91.27

93.63

95.02

96.01

93.89

92.88

93.98

95.99

92.94

92.27

95.66

来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	17.01	9	1.89	40.62	<0.0001	**
A	0.9941	1	0.9941	21.37	0.0024	**
B	2.08	1	2.08	44.74	0.0003	**
C	1.62	1	1.62	34.83	0.0006	**
AB	0.0870	1	0.0870	1.87	0.2136
AC	0.7482	1	0.7482	16.09	0.0051	**
BC	0.8372	1	0.8372	18.00	0.0038	**
A²	2.90	1	2.90	62.40	<0.0001	**
B²	3.68	1	3.68	79.18	<0.0001	**
C²	2.94	1	2.94	63.16	<0.0001	**
残差	0.3256	7	0.0465
失拟项	0.0925	3	0.0308	0.5291	0.6859	不显著
纯误差	0.2331	4	0.0583
总误差	17.33	16

来源

平方和

自由度

均方

F值

P值

显著性

模型

17.01

1.89

40.62

<0.0001

0.9941

21.37

0.0024

2.08

44.74

0.0003

1.62

34.83

0.0006

0.0870

1.87

0.2136

0.7482

16.09

0.0051

0.8372

18.00

0.0038

A²

2.90

62.40

<0.0001

B²

3.68

79.18

<0.0001

C²

2.94

63.16

<0.0001

残差

0.3256

0.0465

失拟项

0.0925

0.0308

0.5291

0.6859

不显著

纯误差

0.2331

0.0583

总误差

17.33

来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	37.07	9	4.12	41.10	<0.0001	**
A	0.7688	1	0.7688	7.67	0.0277	*
B	2.04	1	2.04	20.36	0.0028	**
C	1.51	1	1.51	15.11	0.0060	**
AB	0.0506	1	0.0506	0.5052	0.5002
AC	0.5852	1	0.5852	5.84	0.0463	*
BC	0.6162	1	0.6162	6.15	0.0422	*
A²	4.37	1	4.37	43.56	0.0003	**
B²	3.99	1	3.99	39.80	0.0004	**
C²	20.44	1	20.44	203.96	<0.0001	**
残差	0.7015	7	0.1002
失拟项	0.0569	3	0.0190	0.1178	0.9450	不显著
纯误差	0.6445	4	0.1611
总误差	37.77	16

来源

平方和

自由度

均方

F值

P值

显著性

模型

37.07

4.12

41.10

<0.0001

0.7688

7.67

0.0277

2.04

20.36

0.0028

1.51

15.11

0.0060

0.0506

0.5052

0.5002

0.5852

5.84

0.0463

0.6162

6.15

0.0422

A²

4.37

43.56

0.0003

B²

3.99

39.80

0.0004

C²

20.44

203.96

<0.0001

残差

0.7015

0.1002

失拟项

0.0569

0.0190

0.1178

0.9450

不显著

纯误差

0.6445

0.1611

总误差

37.77

样品	灰分含量（%）	DM（%）
SSP	31.62±0.45	−
SSP-3	2.69±0.07	96.09±0.10
SSP-8	2.96±0.04	95.74±0.12

样品

灰分含量（%）

DM（%）

SSP

31.62±0.45

−

SSP-3

2.69±0.07

96.09±0.10

SSP-8

2.96±0.04

95.74±0.12