食品工业科技

试剂	体积（μL）
模板	1
DmpA-F	1
DmpA-R	1
2×Phanta Master Mix	10
dd H₂O	Up to 20

试剂	体积（μL）
模板	1
DmpA-F	1
DmpA-R	1
2×Phanta Master Mix	10
dd H₂O	Up to 20

程序	时间	循环数
预变性95 ℃	5 min	1
变性95 ℃	15 s	30
退火55 ℃	15 s	30
延伸72 ℃	1 min 20 s	30
终延伸72 ℃	5 min	1
16 ℃	∞	1

程序	时间	循环数
预变性95 ℃	5 min	1
变性95 ℃	15 s	30
退火55 ℃	15 s	30
延伸72 ℃	1 min 20 s	30
终延伸72 ℃	5 min	1
16 ℃	∞	1

引物名称	引物序列（5’-3’）	大小（bp）
DmpA-F	CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTATGGAA CGTAAACGTATCCGCG	43
DmpA-R	ATGGGTCGCGGATCCGAATTCTTAGTAAG CATGGCGGGTCACG	43
PD-F	CGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTT	22
PD-R	GCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAAT	26
MD-F	GCTTTCTGGTATGCCGTGCGTA	22
MD-R	CCTCAAGACCCGTTTAGAGGCC	22

引物名称	引物序列（5’-3’）	大小（bp）
DmpA-F	CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTATGGAA CGTAAACGTATCCGCG	43
DmpA-R	ATGGGTCGCGGATCCGAATTCTTAGTAAG CATGGCGGGTCACG	43
PD-F	CGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTT	22
PD-R	GCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAAT	26
MD-F	GCTTTCTGGTATGCCGTGCGTA	22
MD-R	CCTCAAGACCCGTTTAGAGGCC	22

试剂	体积
单菌落	牙签挑取涂于PCR管壁
PD-F	1 μL
PD-R	1 μL
2×Flash Hot Start Master Mix	10 μL
dd H₂O	Up to 20 μL

试剂	体积
单菌落	牙签挑取涂于PCR管壁
PD-F	1 μL
PD-R	1 μL
2×Flash Hot Start Master Mix	10 μL
dd H₂O	Up to 20 μL

程序	时间	循环数
预变性95 ℃	5 min	1
变性95 ℃	15 s	30
退火55 ℃	15 s	30
延伸72 ℃	2 min	30
终延伸72 ℃	5 min	1
16 ℃	∞	1

程序	时间	循环数
预变性95 ℃	5 min	1
变性95 ℃	15 s	30
退火55 ℃	15 s	30
延伸72 ℃	2 min	30
终延伸72 ℃	5 min	1
16 ℃	∞	1

酶	L-肌肽产量（g/L）	特点
L-氨基酸连接酶^[15]	2.58	合成L-肌肽的反应是单向的，但反应需要ATP的参与
粘质沙雷氏菌来源二肽水解酶SmPepD^[16]	15.2	需Mn²⁺激活
产气荚膜梭菌来源二肽水解酶CpPepD^[17]	15.16	−
Sphingosinicella xenopeptidilytica来源氨肽酶BapA^[19]	3.7	产率高达71%
新型氨肽酶^[20]	2.26	−
β-酯酰基转移酶（作为DmpA）^[21]	23.75	底物特异性高
Cystobasidium minutum MCA 4210来源的DmpA	55.72	产量为目前报道最高，反应条件简单温和

酶	L-肌肽产量（g/L）	特点
L-氨基酸连接酶^[15]	2.58	合成L-肌肽的反应是单向的，但反应需要ATP的参与
粘质沙雷氏菌来源二肽水解酶SmPepD^[16]	15.2	需Mn²⁺激活
产气荚膜梭菌来源二肽水解酶CpPepD^[17]	15.16	−
Sphingosinicella xenopeptidilytica来源氨肽酶BapA^[19]	3.7	产率高达71%
新型氨肽酶^[20]	2.26	−
β-酯酰基转移酶（作为DmpA）^[21]	23.75	底物特异性高
Cystobasidium minutum MCA 4210来源的DmpA	55.72	产量为目前报道最高，反应条件简单温和

重组微小囊担子菌氨肽酶DmpA高效催化生产L-肌肽

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孙晓瑄 ¹^,² , 张瑞婕 ² , 孙雯 ¹^,² , 陈凌宇 ¹^,² , 朱显峰 ¹^,^* , 张保国 ²^,^*

食品工业科技 | 生物工程 2026,47(1): 226-235

收起

食品工业科技 |生物工程 2026 , 47 (1) : 226 -235

重组微小囊担子菌氨肽酶DmpA高效催化生产L-肌肽

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孙晓瑄¹^,², 张瑞婕², 孙雯¹^,², 陈凌宇¹^,², 朱显峰¹^,^*, 张保国²^,^*

作者信息

¹河南大学生命科学学院，微生物研究所，河南开封 475004

²中国科学院上海高等研究院，上海 201210

通讯作者:

朱显峰（1973−），男，博士，教授，研究方向：食品和药用微生物，E-mail：zhuxf73@163.com。

张保国（1977−），男，博士，研究员，研究方向：微生物代谢与调控，E-mail：zhangbg@sari.ac.cn。

作者简介:

孙晓瑄（1999−），女，硕士研究生，研究方向：食品和药用微生物，E-mail：sxxnn630@163.com

Recombinant Cystobasidium minutum Aminopeptidase DmpA Efficiently Catalyzes the Production of L-Carnosine

Xiaoxuan SUN¹^,², Ruijie ZHANG², Wen SUN¹^,², Lingyu CHEN¹^,², Xianfeng ZHU¹^,^*, Baoguo ZHANG²^,^*

Affiliations

¹Institute of Microbial Engineering, School of Life Sciences, Henan University, Kaifeng 475004, China

²Shanghai Advanced Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201210, China

出版时间: 2026-01-01 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010059

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摘要

收起

本实验研究了一种来自微小囊担子菌MCA4210（Cystobasidium minutum MCA 4210）的氨肽酶基因dmpA催化合成L-肌肽的能力，构建基因工程菌株，以L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐为底物催化合成L-肌肽，旨在提高L-肌肽的合成效率。将Cystobasidium minutum MCA 4210来源的DmpA经密码子优化后在大肠杆菌BL21(DE3)（Escherichia coli BL21(DE3)）中异源表达，并通过与麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein，MBP）进行融合表达提高目的蛋白可溶性表达和粗酶活性，构建重组菌株BL21(DE3)-MBP-DmpA，对重组菌株进行诱导表达条件和转化条件的探究。结果表明，实验成功将目的基因片段与MBP相连得到重组菌株BL21(DE3)-MBP-DmpA，经诱导条件优化粗酶活达到了145 U；经转化条件优化L-肌肽产量高达55.72 g/L，产率达54.54%。本研究将具有L-肌肽合成功能的Cystobasidium minutum MCA 4210来源的DmpA在大肠杆菌中异源表达，通过添加助溶标签和条件优化实现了L-肌肽的高效生产，所得L-肌肽的产量为目前报道最高，为基因工程菌工业化生产L-肌肽提供了实验基础，具有良好的应用前景。

关键词

氨肽酶DmpA / L-肌肽 / 麦芽糖结合蛋白 / 异源表达 / 酶催化转化

Abstract

收起

This experiment investigated the ability of an aminopeptidase gene dmpA from microcyst basidiomycete MCA 4210 (Cystobasidium minutum MCA 4210) to catalyze the synthesis of L-carnosine, and constructed a genetically engineered strain to catalyze the synthesis of L-carnosine with L-histidine and β-alanine methyl ester hydrochloride as substrates, aiming to improve the synthesis efficiency of L-carnosine. Codon-optimized DmpA was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and adding a maltose binding protein (MBP) tag further improved solubility and enzyme activity, yielding BL21 (DE3)-MBP-DmpA. Then the recombinant strain BL21(DE3)-MBP-DmpA was further investigated to optimize induced expression and transformation conditions. The results indicated that the target gene fragment was successfully fused with MBP, yielding the recombinant strain BL21(DE3)-MBP-DmpA. After optimization of the induction conditions, the crude enzyme activity reached 145 U. Through optimization of the transformation conditions, the L-carnosine production reached as high as 55.72 g/L, with a yield of 54.54%. This study successfully expressed DmpA from Cystobasidium minutum MCA 4210 in E. coli, demonstrating its L-carnosine synthesis capability. The MBP tag and condition optimizations significantly improved production, achieving the highest L-carnosine yield reported to date. These findings provided a strong foundation for industrial-scale L-carnosine production using genetically engineered bacteria and highlighted promising application potential.

Key words

aminopeptidase DmpA / L-carnosine / maltose binding protein / heterologous expression / enzymatic catalytic conversion

引用本文

孙晓瑄, 张瑞婕, 孙雯, 陈凌宇, 朱显峰, 张保国. 重组微小囊担子菌氨肽酶DmpA高效催化生产L-肌肽. 食品工业科技, 2026 , 47 (1) : 226 -235 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010059

Xiaoxuan SUN, Ruijie ZHANG, Wen SUN, Lingyu CHEN, Xianfeng ZHU, Baoguo ZHANG. Recombinant Cystobasidium minutum Aminopeptidase DmpA Efficiently Catalyzes the Production of L-Carnosine[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (1) : 226 -235 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010059

正文

收起

L-肌肽（L-Carnosine，L-Car）是由L-组氨酸和β-丙氨酸两种氨基酸组成的二肽，在动物体内可以合成，它最早由Gulewitsch和Amiradzibi于1900年在鉴定牛肉组织时发现^[1]，是目前为止发现广泛存在的活性肽之一。自该活性肽发现以来，已有大量的研究证明其有多种生物学功能。L-肌肽能够中和体内的活性氧分子，从而减少氧化应激对细胞结构和功能的损害^[2]，延缓细胞衰老^[3]、调节细胞内pH稳态辅助肿瘤治疗^[4]。因其具有强大的抗氧化性能，被用作天然抗氧化剂添加到食品中，以延长食品保质期并保持食品的新鲜度。L-肌肽具有多种健康益处，如增强免疫力、抗炎^[5]、缓解糖尿病并发症^[6]、治疗心血管疾病^[7]等，因此常被添加到营养补充品、运动饮料和保健品中。且由于其具有丰富的生理活性，L-肌肽的应用和合成研究备受关注。

目前，国内外L-肌肽的合成方法分为化学合成法和生物合成法。化学合成法工艺较为复杂^[8−9]，但依然是目前工业生产最为常用的方法，如邻苯二甲酸酐法^[10]和混合酸酐法^[11]，具有副产物多，溶剂消耗较大，环境污染严重等缺点。L-肌肽的生物合成主要为酶催化法，酶法相较于传统的化学合成方法，具有反应条件温和、产物纯度高、收率高、环境污染小等优点。目前，已有多种生物酶被用于L-肌肽的合成，如L-氨基酸连接酶^[12]、二肽水解酶^[13]和氨肽酶^[14]等。2018年，Kino等^[15]在枯草芽孢杆菌中发现L-氨基酸连接酶可以用于L-肌肽的合成，但反应需要等摩尔量ATP参与，成本较高。Yin等^[16]通过基因组挖掘获得来自粘质沙雷氏菌的二肽水解酶SmPepD，经优化后的酶可以催化得到L-肌肽15.20 g/L；Zhang等^[17]对产气荚膜梭菌二肽酶基因CpPepD进行突变，获得了合成活性提高2.2倍的突变体，在底物浓度为6 mol/L β-丙氨酸和0.2 mol/L L-组氨酸时，生产15.16 g/L L-肌肽。研究报道微生物氨肽酶具有催化合成L-肌肽的功能^[18]，例如，Jan等^[19]在大肠杆菌中过表达来自Ochrobactrum anthropi的DmpA和来自Sphingosinicella xenopeptidilytica的BapA氨肽酶，得到L-肌肽3.70 g/L，产率高达71%；She等^[20]通过深海沉积物宏基因组筛选得到一种合成L-肌肽的新型氨肽酶，合成了2.26 g/L L-肌肽；Xing等^[21]基于定点突变提高了β-酯酰基转移酶（作为DmpA）合成L-肌肽的底物特异性，当L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度分别为140 mmol/L和210 mmol/L时，L-肌肽的浓度达到23.75 g/L；郭宝松等^[22]也从郫县豆瓣中分离获得了一株高产氨肽酶菌株B. subtilis LBJ4-5，经发酵后酶活达到179.23 U/mL。氨肽酶是一类能从蛋白质和多肽N端选择性切除氨基酸残基产生游离氨基酸的外切蛋白酶^[23]，绝大部分属于碱性氨肽酶^[24]。微生物氨肽酶可以应用于氨基酸和多肽的合成^[25]，β-氨肽酶^[26]具有催化水解β-肽和α，β混合肽的功能，还可以催化逆向反应生成肽类，在动力学控制^[27]下L-肌肽可以由β-氨肽酶逆向催化合成，图1为氨肽酶催化合成L-肌肽的反应式。

氨肽酶相较于其他酶具有反应条件更温和、处理多样化的肽链更灵活等优势，且生物界广泛存在，来源丰富，通过筛选比较不同来源的氨肽酶发现，来源于Cystobasidium minutum MCA4210的氨肽酶DmpA可以在异源系统中高效表达，且通过初步实验表明，该来源的氨肽酶在特定条件下表现出更高的催化效率。鉴于此，本研究将来源于Cystobasidium minutum MCA4210的氨肽酶DmpA在E. coli BL21（DE3）中异源表达，构建重组菌株BL21（DE3）-DmpA。但许多重组蛋白在大肠杆菌表达系统中容易形成不溶性的包涵体，除了改变诱导条件还可以通过添加助溶标签来改善这一问题，麦芽糖结合蛋白（MBP）能够显著提高目标蛋白的溶解性，因为它自身具有高度可溶的特点，并且可以促进目标蛋白正确折叠，从而可能增加酶的活性。其机制包括提供结构稳定性、屏蔽疏水区域以及促进有利的分子伴侣交互，这些都有助于维持或增强蛋白质的功能状态^[28]。因此为进一步提高蛋白表达水平和粗酶活，本研究将MBP与目的蛋白融合表达，构建重组菌株BL21（DE3）-MBP-DmpA，利用SDS-PAGE检验蛋白表达情况，并以L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐作为底物，用粗酶液进行催化转化反应，对重组菌株的诱导条件和转化条件进行探究，以期提高L-肌肽的产量和产率。本研究首次利用微小囊担子菌来源的氨肽酶催化合成L-肌肽，旨在为开发更多具有L-肌肽合成功能的酶资源提供参考，通过蛋白融合表达有效提高酶的活性，为构建稳定高效生产L-肌肽的重组菌株提供实验基础。

1　材料与方法

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1.1　材料与仪器

大肠杆菌DH5α感受态、大肠杆菌BL21（DE3）感受态、同源重组试剂盒、高保真酶2×Phanta Max Master Mix、2×Flash Hot Start Master Mix　诺唯赞生物科技（南京）股份有限公司；pET28a质粒、含MBP标签的pET28a质粒　实验室保存；限制性核酸快切酶Q.Cut EcoR Ⅰ（酶活为10~20 U/μL）、Q.Cut Hind Ⅲ（酶活为10~20 U/μL）、10×Q.Cut Buffer、DNA Marker 5000　TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、PCR产物清洁试剂盒　康宁生命科学（吴江）有限公司；SDS-PAGE试剂盒、Protein Marker10~18 kDa、50×TAE Buffer、琼脂糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）　生工（生物）上海有限公司；甘油、十二水磷酸氢二钠、氯化铵、七水硫酸镁、氯化钠、氯化锌、乙酸、甲醇　上海泰坦科技股份有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水硫酸钠、β-丙氨酸甲酯盐酸盐、硫酸卡那霉素　上海麦克林生化科技有限公司；L-组氨酸、氯化镁、氯化钙、氯化锰、三氯化铁　阿达玛斯试剂有限公司；L-肌肽标准品　上海源叶生物科技有限公司；考马斯亮蓝快速染料　擎科生物科技有限公司。LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，固体培养基在此基础上加入琼脂粉15 g/L。发酵培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，甘油10 mL/L，十二水磷酸氢二钠17.9 g/L，磷酸二氢钾6.8 g/L，氯化铵5.3 g/L，无水硫酸钠1.4 g/L，七水硫酸镁1 g/L，消泡剂0.5 mL/L。

H1750R高速台式冷冻离心机　湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DK-8D型三孔电热恒温水浴锅　上海飞域实业国际贸易有限公司；EPS-100核酸电泳仪　上海天能科技有限公司；GET3XG基因扩增仪　杭州柏恒科技有限公司；LC-20A高效液相色谱仪　Shimadzu（日本）公司；MLS-3780高压蒸汽灭菌器　SANYO（日本）公司；ZQZY-78BES振荡培养箱、ZCPS-600细胞超声破碎仪　上海知楚仪器有限公司；InertSustain NH₂ 5 μm液相色谱柱（4.6 I.D.×250 mm）　技尔（上海）商贸有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　微小囊担子菌来源的DmpA氨肽酶基因的获得

本实验委托上海生工生物工程有限公司对来自微小囊担子菌MCA4210（Cystobasidium minutum MCA4210）的氨肽酶基因dmpA的氨基酸序列（GeneBank：XP_066821481.1）根据大肠杆菌偏好性进行目的基因密码子优化，并构建到PUC57质粒上得到克隆载体PUC57-DmpA。

1.2.2　重组菌株BL21（DE3）-DmpA和BL21（DE3）-MBP-DmpA的构建

以质粒pET28a作为表达载体，用限制性快切酶EcoR I和Hind Ⅲ双酶切质粒，酶切体系如下：质粒pET28a 2 μL，酶切缓冲液2 μL，限制性快切酶EcoR I和Hind Ⅲ各1 μL，无菌水14 μL，将上述酶切体系放入37 ℃水浴中酶切1 h，用AxyPrep PCRTM清洁试剂盒对上述酶切产物进行纯化回收。在基因dmpA的5’和3’分别设计带有载体pET28a同源臂15 bp和酶切位点EcoR I和Hind Ⅲ的引物DmpA-F、DmpA-R，以公司合成的菌株BL21（DE3）-PUC57-DmpA为模板，扩增dmpA基因，PCR扩增体系见表1，扩增程序见表2，引物序列见表3。

PCR产物进行纯化回收后和线性化载体pET28a通过无缝克隆连接，无缝克隆反应体系如下：纯化后的PCR片段20~200 ng，线性化载体pET28a 50~200 ng，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL，Exnase Ⅱ 2 μL，ddH₂O加至终体积20 μL，将体系混匀后置于37 ℃精确反应30 min，然后置于冰上终止反应，得到重组质粒pET28a-DmpA。取重组质粒10 μL加入100 μL大肠杆菌DH5α感受态中，于冰上放置30 min，42 ℃水浴90 s，再于冰上放置5 min，加入500 μL LB培养基，37 ℃，200 r/min恢复培养45 min，8000 r/min，25 ℃离心1 min去上清，涂布于含25 μg/mL含卡那霉素的LB抗性平板上，37 ℃过夜培养。

得到重组质粒pET28a-DmpA后，在目的基因dmpA前后150 bp处分别设计验证引物PD-F、PD-R，引物序列见表3，挑取上述步骤所得大肠杆菌单菌落作为模板，进行菌落PCR，PCR体系见表4，程序见表5，验证目的基因片段与质粒连接情况，并送至上海杰李生物技术有限公司测序。

挑取测序正确的单菌落，在LB培养基中37 ℃过夜培养，用质粒提取试剂盒提取pET28a-DmpA质粒，取质粒10 μL加入100 μL E. coli BL21（DE3）感受态中，热激转化，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上过夜培养。挑取单菌落进行验证及测序，构建好的重组菌株命名为BL21（DE3）-DmpA。

将目的基因按照上述无缝克隆的方法与含有MBP助溶标签的pET28a质粒相连，分别在目的基因前后约150 bp处设计引物MD-F、MD-R验证并测序，PCR反应体系同表4，反应程序同表5，引物序列见表3，构建好的重组菌株命名为BL21（DE3）-MBP-DmpA。

1.2.3　重组菌株BL21（DE3）-DmpA和BL21（DE3）-MBP-DmpA的生长情况测定

参照刘帆^[29]的方法，从甘油管中分别蘸取重组菌株BL21（DE3）-DmpA和BL21（DE3）-MBP-DmpA划线至含卡那霉素抗性的LB固体平板上，37 ℃过夜培养；挑取单菌落接种至4 mL抗性LB液体培养基中，于37 ℃，200 r/min培养12 h，得到一级种子液；按体积分数1%的接种量将两重组菌分别接种至发酵培养基中，37 ℃，200 r/min培养，接种后开始测定两重组菌的生长曲线，在发酵的前2 h，每隔20 min取一次样测定OD₆₀₀处的吸光值，2 h后，每隔1 h取一次样测定OD₆₀₀，取至16 h，比较两重组菌的生长情况。

1.2.4　两重组菌的诱导表达及SDS-PAGE检测

按体积分数1%的接种量将重组菌株BL21（DE3）-DmpA和BL21（DE3）-MBP-DmpA分别接种至发酵培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD₆₀₀=3.8~4.0，降温至25 ℃，添加终浓度0.2 mmol/L的IPTG，25 ℃，200 r/min诱导12 h，8000 r/min，4 ℃离心10 min收集菌体，用pH7.4的磷酸盐缓冲液清洗菌体2遍。

湿菌体按终浓度100 g/L用50 mmol/L pH8.0的Tris-HCl重悬菌体，在冰水浴条件下进行超声波破碎，超声参数为：超声4 s，间隔5 s，功率为150 W，共进行15 min，破碎液12000 r/min，4 ℃离心处理30 min，所得上清即为粗酶液。沉淀用Tris-HCl重悬，分别吸取40 μL破碎前的全细胞、上清液和沉淀与10 μL 5×蛋白上样缓冲液混合后100 ℃加热10 min，每孔添加5 μL样品到蛋白胶上样孔中。电泳条件为160 V电泳45 min。电泳结束后使用考马斯亮蓝溶液染色1 h，随后使用脱色液进行过夜脱色处理。

1.2.5　粗酶转化合成L-肌肽的反应体系和粗酶活测定

按照1.2.4的方法制备粗酶液，转化反应体系为10 mL：L-组氨酸0.5 g，β-丙氨酸甲酯盐酸盐1.0 g，9 mL粗酶液，并用纯水定容至10 mL，在pH8.0，20 ℃，150 r/min条件下反应10 min，滴加2 mol/L HCl终止反应。转化产物离心取上清液，用流动相稀释制成待测样品：转化产物12000 r/min离心5 min，取上清液10 μL，加入流动相A 171.5 μL，流动相B 318.5 μL混合均匀，0.22 μm微孔滤膜过滤处理。HPLC进行检测，酶活定义为：每分钟生成1 μmol L-肌肽定义为一个酶活单位（U），酶活计算公式为：

$ \rm U = \frac{{{\text{c}} \times {\text{V}}}}{{\text{T}}} $

式中：U为酶活力（μmol/min），c为产物L-肌肽的浓度（μmol/mL），V为反应总体积（mL），T为反应时间（min）。

1.2.6　重组菌BL21（DE3）-MBP-DmpA的诱导表达条件优化

在大肠杆菌的诱导表达过程中，有多种条件会影响酶的表达，选取不同的诱导剂添加时间（1、2、3、4、5、6 h）添加0.2 mmol/L IPTG，25 ℃诱导12 h；不同诱导温度（16、20、25、30、37 ℃），在最优的添加时间加入0.2 mmol/L IPTG诱导12 h；不同诱导剂浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L），在最优添加时间和最适温度下加入诱导剂诱导12 h；诱导时间（8、12、16、20、24、28 h），在以上三个最优条件下进行诱导。测定粗酶活，选取最优诱导条件。

1.2.7　重组菌BL21（DE3）-MBP-DmpA的转化条件优化

以最优诱导条件对BL21（DE3）-MBP-DmpA诱导表达得到粗酶液，反应体系10 mL，选取不同转化温度（10、15、20、25、30、35 ℃），添加L-组氨酸0.5 g、β-丙氨酸甲酯盐酸盐1.0 g，粗酶液9 mL，纯水定容至10 mL，用氨水调pH8.0进行转化反应；不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），在最适温度条件下进行转化；添加不同金属离子（Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺），以不添加金属离子的反应体系作为对照，终浓度均为1 mmol/L，在最适温度和pH环境下反应；在确定最适温度、pH后，改变L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐的投料量（g）（L-组氨酸：β-丙氨酸甲酯盐酸盐=0.2:0.4、0.4:0.4、0.5:0.5、0.5:1.0、0.6:1.0、0.7:1.0、0.8:1.0）进行探究。

1.2.8　L-肌肽含量的测定

高效液相色谱条件：色谱柱：InertSustain NH₂柱，进样量20 μL，流速为0.7 mL/min，柱温35 ℃，紫外检测波长为215 nm。流动相A：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液，磷酸调pH4.0，抽滤并超声脱气，流动相B:乙腈（A:B=35:65）。

L-肌肽标准曲线：L-肌肽标准曲线线性回归方程为y=49461x+320278，相关系数R²=0.9993，x为L-肌肽的浓度，y为测得峰面积，标准曲线线性回归方程的相关系数大于0.999。

反应样品经HPLC检测，由所得L-肌肽峰面积代入L-肌肽标曲中计算产量；以L-组氨酸的投量为标准计算L-肌肽的产率，产率计算公式如下：

$\rm 产率(\text{%})=\frac{{c}_{L-肌肽产量}\times {M }_{L-组氨酸}}{{c }_{L-组氨酸投量}\times {M }_{L-肌肽}} \times 100$

式中：c_{L-肌肽产量}为产物L-肌肽的浓度（g/L）；M_L-组氨酸为L-组氨酸的相对分子质量；c_{L-组氨酸投量}为底物L-组氨酸的投料浓度（g/L）；M_L-肌肽为L-肌肽的相对分子质量。

1.3　数据处理

每组实验进行三次重复实验，采用Excel 2021进行数据统计，选择线性相关较高的数据，即R²在0.99~0.999之间，SPSS进行显著性分析，数据绘图采用Origin 2024软件，质粒绘图采用SnapGene和Adobe Illustrator CS5软件。

2　结果与分析

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2.1　重组菌株BL21（DE3）-DmpA和BL21（DE3）-MBP-DmpA的构建

重组质粒pET28a-DmpA和pET28a-MBP-DmpA的结构如图2所示，扩增出的DmpA基因片段条带大小约为1100 bp，与目的基因1152 bp大小吻合，证明扩增正确；双酶切pET28a质粒和目的基因同源重组后，挑取多个单克隆菌落进行PCR验证，均扩增出约为1452 bp的条带，且测序结果正确无突变，证明重组菌株BL21（DE3）-DmpA构建成功，结果见图3（a）。dmpA目的基因插入到pET28a-MBP质粒后进行验证，核酸胶条带大小在1500 bp附近，与预期大小1452 bp符合，且测序结果均正确，证明重组菌BL21（DE3）-MBP-DmpA构建成功，结果见图3（b）。

2.2　重组菌株BL21（DE3）-DmpA和BL21（DE3）-MBP-DmpA的生长情况对比

同时测定重组菌株BL21（DE3）-DmpA和BL21（DE3）-MBP-DmpA在转接100 mL发酵培养基后的OD₆₀₀吸光值，以时间为横坐标，OD₆₀₀测得吸光值为纵坐标，绘制生长曲线，由图4可知在发酵1 h后，两重组菌均进入对数生长期，发酵6 h后菌株生长速度减慢，BL21（DE3）-MBP-DmpA在4.5 h后生长趋势优于BL21（DE3）-DmpA，这可能是由于MBP标签增强了细胞稳定性，降低了细胞内蛋白质合成的代谢负担^[30]，使得BL21（DE3）-MBP-DmpA能够在更长时间内维持较高的生长速率。菌株的生长情况反映了菌体的生长规律，为添加诱导剂的时间提供了实验依据。

2.3　两重组菌株的诱导表达结果及粗酶活对比

对诱导后的重组菌BL21（DE3）-DmpA和BL21（DE3）-MBP-DmpA进行超声破碎处理，取破碎全细胞、破碎上清、破碎沉淀制成蛋白样品进行SDS-PAGE检测蛋白诱导表达效果，BL21（DE3）-DmpA目的蛋白大小为41.4 kDa，BL21（DE3）-MBP-DmpA目的蛋白大小为83.4 kDa，由图5（a）可知BL21（DE3）-MBP-DmpA上清液中含有几乎全部的目的蛋白，而沉淀中几乎没有检测到目的蛋白，表达效果明显优于BL21（DE3）-DmpA，这表明添加MBP标签显著提高了目的蛋白的可溶性表达，有效减少了包涵体的形成。分别取两重组菌的粗酶液进行转化反应，HPLC检测产物L-肌肽浓度，比较二者的粗酶活，结果如图5（b）所示，BL21（DE3）-MBP-DmpA的粗酶活高于BL21（DE3）-DmpA，且二者差异极显著（P<0.01），进一步证明了MBP标签对蛋白质功能性的积极影响。由于BL21（DE3）-MBP-DmpA的诱导表达效果和粗酶活性均优于BL21（DE3）-DmpA，本研究将选择重组菌株BL21（DE3）-MBP-DmpA进行后续诱导表达条件和转化条件的探究。

2.4　重组菌BL21（DE3）-MBP-DmpA的诱导表达条件对酶活力的影响

2.4.1　诱导剂添加时间对酶活力的影响

诱导剂的添加时机通常在菌体生长旺盛期，可以充分利用菌体生长过程中积累的底物和能量，促进目标产物的合成。根据重组菌BL21（DE3）-MBP-DmpA的生长情况，在菌株对数生长期选择了发酵1、2、3、4、5、6 h六个时间点添加诱导剂，图6为重组菌BL21（DE3）-MBP-DmpA在发酵不同时间添加诱导剂的粗酶酶活情况，发酵1 h时添加诱导剂的酶活最低，由图4可知此时菌体刚进入对数生长期，过早的加入IPTG影响了菌体生长；发酵4 h时加入诱导剂酶活最高，且4 h和1 h的酶活差异显著（P<0.05），说明发酵时间对粗酶活性具有重要影响，随着发酵时间继续增加，酶活反而呈下降趋势，可能是由于细胞老化和代谢减慢、营养物质耗尽等因素共同作用的结果，酶对诱导剂的响应能力减弱，不能充分发挥IPTG的作用^[31]。因此，发酵4 h时是加入诱导剂的最佳时间。

2.4.2　诱导温度对酶活力的影响

诱导温度对菌体的生长速率和酶活有着重要影响，在一定范围内随着温度的升高有利于菌体的生长和蛋白的表达，而超过此范围则会起到抑制作用。图7为重组菌株BL21（DE3）-MBP-DmpA在不同温度下诱导后的粗酶酶活情况，在较低的诱导温度16~20 ℃时，随着温度升高，酶活也有所提高，当温度为25 ℃时，酶活降低，30 ℃和37 ℃时酶活骤降，与20 ℃时活性差异显著（P<0.05），可能是由于温度过高影响了蛋白的正确折叠，导致菌体产生包涵体，降低可溶性酶的表达^[32]。由图7可知20 ℃为重组菌株BL21（DE3）-MBP-DmpA的最适诱导温度。

2.4.3　诱导剂浓度对酶活力的影响

诱导剂浓度对菌体生长有显著影响，诱导剂浓度低时可能不足以完全启动目标蛋白的表达，但对菌体生长的抑制作用较小，诱导剂浓度过高时其细胞毒性会抑制菌体的生长。分别添加0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG，比较BL21（DE3）-MBP-DmpA粗酶酶活，结果如图8所示，各条件下的粗酶活性具有明显差异，随着IPTG浓度的增加，酶活也随之提高，这是因为诱导剂浓度的增加可以促进目标蛋白基因的转录和翻译过程，从而提高蛋白表达水平；当IPTG为0.4 mmol/L时酶活最高，之后诱导剂浓度增加，酶活明显下降，因为较高浓度的诱导剂会导致蛋白合成速率过快，无法形成正确折叠，从而形成包涵体等无活性或低活性的蛋白聚集体，导致酶活力降低^[33]。

2.4.4　诱导时间对酶活力的影响

诱导时间影响菌体生长和酶活力，诱导时间过短不利于菌体的生长和蛋白的积累，诱导时间过长可能导致蛋白酶的释放，使表达的重组蛋白被部分降解，进一步导致蛋白表达量下降。图9为不同诱导时间下BL21（DE3）-MBP-DmpA的粗酶酶活，在诱导时间8~16 h之间，随着诱导时间的增加，酶活随之提高，16 h时酶活最高可达到约145 U，而诱导时间大于16 h后，可能是诱导时间过长影响菌体活性和蛋白表达，粗酶酶活下降，与16 h相比具有显著差异（P<0.05）。综上所述，诱导16 h为最优条件。经以上四个诱导条件的优化，重组菌株BL21（DE3）-MBP-DmpA粗酶液的酶活由115 U提高至145 U。

2.5　重组菌株BL21（DE3）-MBP-DmpA的转化条件优化结果

2.5.1　转化温度的优化

温度与酶催化反应速率和酶的稳定性密切相关，在一定温度范围内，酶促反应速率会随温度升高而加快，而温度过高则会对酶的活性产生影响。氨肽酶DmpA催化合成L-肌肽是一个可逆反应，该酶对温度敏感性高，若温度过高会导致酶活性降低且反应逆向进行。因此本研究探究了10~35 ℃时酶催化生成L-肌肽的产量和产率，图10表明当温度为15 ℃时L-肌肽的产量和产率最高，当温度高于15 ℃后，L-肌肽产量和产率都逐渐下降，20 ℃时的产量和15 ℃差异不显著，说明该酶在15~20 ℃范围内都具有较好的催化能力。35 ℃时产量仅有18.84 g/L，这可能是由于高温条件下，氨肽酶DmpA的活性显著下降，导致其对底物的利用率降低，减弱了合成L-肌肽的能力。因此15 ℃为转化反应的最适温度。

2.5.2　转化pH的优化

pH变化会改变酶分子和底物分子的带电状态，从而影响酶与底物的结合及催化。过高或过低的pH还可能影响酶的稳定性，导致酶分子构象的改变，甚至引起酶的变性，进而使酶丧失活性。为了使反应更高效，分别探究了在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的条件下重组菌株BL21（DE3）-MBP-DmpA生成L-肌肽的情况，图11结果显示，当pH偏酸性时，L-肌肽的产量和产率非常低，说明氨肽酶DmpA在酸性环境下酶活性下降，不利于催化反应的进行，随着pH升高，L-肌肽的产量和产率都随之增加，在pH为9.0时达到最大值，此后，随着pH升高但L-肌肽的产量和产率有所下降，但与pH9.0时的差异不显著。由结果可知，最适转化pH为9.0，此酶适宜偏碱性环境，且在酸性环境中转化效果差，因此在转化过程中要严格控制pH。

2.5.3　转化时添加金属离子种类的优化

酶催化反应中，金属离子可能会影响酶的活性、选择性以及底物的结合效果，且有文献报道某些生产L-肌肽的酶可通过添加金属离子来提高产量^[16]，为了探究本研究中的氨肽酶DmpA是否具有金属离子依赖性，分别在反应体系中添加了终浓度为1 mmol·L⁻¹的Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺，结果如图12所示，不同金属离子之间相比结果均无显著差异，且与未添加金属离子的对照组相比也无显著差异（P>0.05），表明该氨肽酶DmpA无金属离子依赖性，反应无需添加金属离子来激活。

2.5.4　L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐投料量的优化

L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐的投料量对酶催化反应有非常显著的影响，在保持酶浓度一致的条件下，底物浓度的改变会影响酶促反应速度和结果。本研究中保持总反应体系10 mL，添加粗酶液9 mL，改变L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐的投料量，结果如图13所示，当L-组氨酸为0.2 g，β-丙氨酸甲酯盐酸盐为0.4 g时，L-肌肽产量最低，提高底物浓度，L-肌肽的产量也随之增加，其中L-组氨酸为0.8 g，β-丙氨酸甲酯盐酸盐为1.0 g时有最高产量，但产率较其他条件低，而L-组氨酸为0.7 g，β-丙氨酸甲酯盐酸盐为1.0 g时的产率要高于它，且产量两组相差不大，说明投入L-组氨酸0.7 g时对底物的利用率更高，综合因素考虑，L-组氨酸0.7 g，β-丙氨酸甲酯盐酸盐1.0 g为最佳底物投料量。经过上述四个转化条件的优化，L-肌肽的产量达到55.72 g/L，产率约为54.54%。

将本实验所得L-肌肽产量与文献报道L-肌肽产量相比，具体见表6，氨肽酶与L-氨基酸连接酶和二肽水解酶相比，不需要ATP或Mn²⁺参与反应，能耗和成本较低；与其他来源氨肽酶相比，本文所用DmpA催化生产L-肌肽产量为目前报道最高。

3　结论

收起

本研究以大肠杆菌BL21（DE3）为表达宿主，成功构建了重组菌株BL21（DE3）-DmpA，为了提高蛋白的可溶性和粗酶活，进一步构建了重组菌株BL21（DE3）-MBP-DmpA。通过对两菌株的诱导表达及粗酶活测定验证，MBP标签的引入显著提高了DmpA蛋白的可溶性表达水平及粗酶活性。针对高效表达菌株BL21（DE3）-MBP-DmpA，研究完成了诱导条件优化，确定最优方案为：摇瓶发酵4 h后，添加0.4 mmol/L IPTG，20 ℃诱导16 h，酶活由115 U提高至145 U。在此基础上，进一步优化酶催化转化L-肌肽的反应条件，在10 mL总反应体系中，添加0.7 g L-组氨酸、1.0 g β-丙氨酸甲酯盐酸盐及9 mL粗酶液，于15 ℃、pH9.0的条件下反应，L-肌肽产量可达55.72 g/L，产率约为54.54%。此外，研究发现该DmpA氨肽酶的催化反应不受金属离子影响，无需额外添加金属离子激活酶活，有效降低了反应成本。本研究首次探究了微小囊担子菌来源的DmpA氨肽酶在L-肌肽生物合成中的应用，不仅为L-肌肽的生物催化合成提供了优质酶资源，且经多环节优化实现了高效生产，所得L-肌肽产量为目前已报道的最高水平，具备显著实用价值。由于本研究所投入的底物利用率仍有提升空间，为进一步实现L-肌肽的高效、经济转化，后续研究将在深化底物与菌体浓度优化、拓展酶学特性与催化机制研究等方面展开，通过调控关键物质浓度，最大化提升底物转化率。

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

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2026年第47卷第1期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010059

接收时间：2025-01-09
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-01-01

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收稿日期：2025-01-09

基金

作者信息

¹河南大学生命科学学院，微生物研究所，河南开封 475004

²中国科学院上海高等研究院，上海 201210

通讯作者:

朱显峰（1973−），男，博士，教授，研究方向：食品和药用微生物，E-mail：zhuxf73@163.com。

张保国（1977−），男，博士，研究员，研究方向：微生物代谢与调控，E-mail：zhangbg@sari.ac.cn。

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科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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试剂	体积（μL）
模板	1
DmpA-F	1
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试剂

体积（μL）

模板

DmpA-F

DmpA-R

2×Phanta Master Mix

dd H₂O

Up to 20

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引物名称

引物序列（5’-3’）

大小（bp）

DmpA-F

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MD-F

GCTTTCTGGTATGCCGTGCGTA

MD-R

CCTCAAGACCCGTTTAGAGGCC

试剂	体积
单菌落	牙签挑取涂于PCR管壁
PD-F	1 μL
PD-R	1 μL
2×Flash Hot Start Master Mix	10 μL
dd H₂O	Up to 20 μL

试剂

体积

单菌落

牙签挑取涂于PCR管壁

PD-F

1 μL

PD-R

1 μL

2×Flash Hot Start Master Mix

10 μL

dd H₂O

Up to 20 μL

程序	时间	循环数
预变性95 ℃	5 min	1
变性95 ℃	15 s	30
退火55 ℃	15 s	30
延伸72 ℃	2 min	30
终延伸72 ℃	5 min	1
16 ℃	∞	1

程序

时间

循环数

预变性95 ℃

5 min

变性95 ℃

15 s

退火55 ℃

15 s

延伸72 ℃

2 min

终延伸72 ℃

5 min

16 ℃

∞

酶	L-肌肽产量（g/L）	特点
L-氨基酸连接酶^[15]	2.58	合成L-肌肽的反应是单向的，但反应需要ATP的参与
粘质沙雷氏菌来源二肽水解酶SmPepD^[16]	15.2	需Mn²⁺激活
产气荚膜梭菌来源二肽水解酶CpPepD^[17]	15.16	−
Sphingosinicella xenopeptidilytica来源氨肽酶BapA^[19]	3.7	产率高达71%
新型氨肽酶^[20]	2.26	−
β-酯酰基转移酶（作为DmpA）^[21]	23.75	底物特异性高
Cystobasidium minutum MCA 4210来源的DmpA	55.72	产量为目前报道最高，反应条件简单温和

酶

L-肌肽产量（g/L）

特点

L-氨基酸连接酶^[15]

2.58

合成L-肌肽的反应是单向的，但反应需要ATP的参与

粘质沙雷氏菌来源二肽水解酶SmPepD^[16]

15.2

需Mn²⁺激活

产气荚膜梭菌来源二肽水解酶CpPepD^[17]

15.16

−

Sphingosinicella xenopeptidilytica来源氨肽酶BapA^[19]

3.7

产率高达71%

新型氨肽酶^[20]

2.26

−

β-酯酰基转移酶（作为DmpA）^[21]

23.75

底物特异性高

Cystobasidium minutum MCA 4210来源的DmpA

55.72

产量为目前报道最高，反应条件简单温和