食品工业科技

菌株	酶活力（U/mL）
2DB7	315.17±5.597^b
2DB15	340.99±9.795^a
2DBB20	293.88±6.455^c
2DBB51	324.37±4.037^b
3D183	282.65±4.643^d
2DBB34	250.03±7.277^e
2DBB36	255.47±4.126^e

菌株	酶活力（U/mL）
2DB7	315.17±5.597^b
2DB15	340.99±9.795^a
2DBB20	293.88±6.455^c
2DBB51	324.37±4.037^b
3D183	282.65±4.643^d
2DBB34	250.03±7.277^e
2DBB36	255.47±4.126^e

菌株名称	2DB7	2DB15	2DBB20	2DBB51
基因组大小（bp）	5688854	5922738	6120380	6129961
Contig	107	70	234	77
Contig N50（bp）	180322	470380	226780	221570
基因组GC含量（%）	44.12	44.03	44.15	43.95
编码基因个数	5204	5448	5730	5604
编码基因总长度（bp）	5045709	5256072	5418285	5408262
编码基因平均GC含量（%）	44.94	44.84	44.95	44.79
串联重复序列个数	70	35	114	59
rRNA个数	5	5	6	5
tRNA个数	68	89	78	83

菌株名称	2DB7	2DB15	2DBB20	2DBB51
基因组大小（bp）	5688854	5922738	6120380	6129961
Contig	107	70	234	77
Contig N50（bp）	180322	470380	226780	221570
基因组GC含量（%）	44.12	44.03	44.15	43.95
编码基因个数	5204	5448	5730	5604
编码基因总长度（bp）	5045709	5256072	5418285	5408262
编码基因平均GC含量（%）	44.94	44.84	44.95	44.79
串联重复序列个数	70	35	114	59
rRNA个数	5	5	6	5
tRNA个数	68	89	78	83

四株产琼胶酶弧菌的筛选鉴定、全基因组分析及其产酶酶学性质研究

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黄立群 ¹^,²^,³ , 张联平 ¹^,²^,³ , 范舒怡 ¹^,²^,³ , 姚丽玲 ¹^,²^,³ , 燕辰涛 ¹^,²^,³ , 郑旭蕾 ¹^,²^,³ , 刘斌 ¹^,²^,³^,⁴^,^* , 黄莹 ¹^,²^,³^,⁴^,^*

食品工业科技 | 生物工程 2026,47(11): 213-225

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食品工业科技 |生物工程 2026 , 47 (11) : 213 -225

四株产琼胶酶弧菌的筛选鉴定、全基因组分析及其产酶酶学性质研究

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黄立群¹^,²^,³, 张联平¹^,²^,³, 范舒怡¹^,²^,³, 姚丽玲¹^,²^,³, 燕辰涛¹^,²^,³, 郑旭蕾¹^,²^,³, 刘斌¹^,²^,³^,⁴^,^*, 黄莹¹^,²^,³^,⁴^,^*

作者信息

¹福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002

²闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心，福建福州 350002

³福建省农副产品保鲜技术开发基地，福建福州 350002

⁴福州海洋研究院，福建福州 350108

通讯作者:

刘斌（1969−），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：liubin618@hotmail.com。

黄莹（1984−），女，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail：yinghuangyh@126.com。

作者简介:

黄立群（1999−），男，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：15880408201@163.com

Screening, Identification, Whole Genome Analysis of Four Agarase-producing Vibrio Strains and Their Enzymatic Properties

Liqun HUANG¹^,²^,³, Lianping ZHANG¹^,²^,³, Shuyi FAN¹^,²^,³, Liling YAO¹^,²^,³, Chentao YAN¹^,²^,³, Xulei ZHENG¹^,²^,³, Bin LIU¹^,²^,³^,⁴^,^*, Ying HUANG¹^,²^,³^,⁴^,^*

Affiliations

¹College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

²Engineering Research Centre of Fujian-Taiwan Special Marine Food Processing and Nutrition, Ministry of Education, Fuzhou 350002, China

³Fujian Agricultural Products Preservation Technology Development Base, Fuzhou 350002, China

⁴Fuzhou Institute of Oceanography, Fuzhou 350108, China

出版时间: 2026-06-01 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025060176

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摘要

收起

为了丰富产高活性琼胶酶的菌株资源并挖掘与琼胶酶相关的基因资源，本文以鲍鱼内脏为菌株分离源，通过单一碳源培养基结合卢戈氏碘液法进行初筛，3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定酶活进行复筛，利用16S rDNA测序鉴定产酶菌株，并比较产酶菌株的基因组序列信息和酶学性质。筛选得到四株产高活性琼胶酶的地中海弧菌（2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51），它们所产琼胶酶粗酶液活性分别为315.17、340.99、293.88和324.37 U/mL。根据全基因组测序结果，2DB15、2DBB20、2DBB51编码较丰富的琼胶酶及其相关酶基因，包括GH16和GH50家族的β-琼胶酶、β-半乳糖苷酶和α-新琼脂二糖水解酶等。四株菌（2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51）所产琼胶酶分别在温度为45、40、45、45 ℃以及pH分别为8.0、7.0、8.0和7.0条件下，相对酶活最高，且均在40 ℃以下和pH5.0~9.0条件下有较好的稳定性。研究结果丰富了弧菌产琼胶酶的理论基础，可为琼胶寡糖的绿色生产提供优质酶资源。

关键词

琼胶酶 / 地中海弧菌 / 全基因组测序 / 酶学性质

Abstract

收起

In order to expand the reservoir of highly active agarase-producing strains and to mine agarase-related gene pools, this study isolated strains from abalone viscera. Primary screening was conducted using a single carbon source medium combined with Lugo's iodine staining, followed by rescreening via the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method to determine enzyme activity. Agarase-producing strains were identified by 16S rDNA sequencing, and their genomic sequences and enzymatic properties were compared. Four strains of Vibrio mediterranei (2DB7, 2DB15, 2DBB20 and 2DBB51) producing highly active agarases were screened. The activities of the crude enzyme solutions from these strains were 315.17, 340.99, 293.88, and 324.37 U/mL, respectively. Whole genome sequencing revealed that 2DB15, 2DBB20, and 2DBB51 encode relatively abundant agarase genes and related enzyme genes, including β-agarases (GH16 and GH50 families), β-galactosidase, and α-neoagarobiose hydrolase. The agarases produced by these four strains (2DB7, 2DB15, 2DBB20 and 2DBB51) reached their peak relative activity at 45, 40, 45, and 45 ℃, and at pH 8.0, 7.0, 8.0, and 7.0, respectively. Furthermore, all enzymes maintained good stability below 40 ℃ and within a pH range of 5.0 to 9.0. The research results could enrich the theoretical foundation for agarase production by Vibrio sp. and provide high-quality enzyme resources for the eco-friendly production of agar oligosaccharides.

Key words

agarase / Vibrio mediterranei / whole genome sequencing / enzymatic properties

引用本文

黄立群, 张联平, 范舒怡, 姚丽玲, 燕辰涛, 郑旭蕾, 刘斌, 黄莹. 四株产琼胶酶弧菌的筛选鉴定、全基因组分析及其产酶酶学性质研究. 食品工业科技, 2026 , 47 (11) : 213 -225 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025060176

Liqun HUANG, Lianping ZHANG, Shuyi FAN, Liling YAO, Chentao YAN, Xulei ZHENG, Bin LIU, Ying HUANG. Screening, Identification, Whole Genome Analysis of Four Agarase-producing Vibrio Strains and Their Enzymatic Properties[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (11) : 213 -225 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025060176

正文

收起

近年来，全球藻类资源的开发与利用已成为蓝色经济的重要增长点。根据联合国粮农组织（FAO）统计，2020年全球大型藻类养殖产量超3500万吨（湿重），其中红藻类占比超过40%^[1]。我国作为藻类养殖大国，藻类养殖产量占全球的一半以上。我国目前江蓠和石花菜等经济红藻类的年产量已突破75万吨，高值化加工利用率亟待提高^[2]。

琼胶，也称为琼脂，主要由琼脂糖和琼脂胶两部分组成。作为一种从江篱属和石花菜属等红藻的细胞壁中提取的水溶性胶体，琼胶凭借其独特的凝胶特性、优异的流变性能、良好的相容性及较低的成本，被广泛应用于食品加工、微生物培养基制备及药物载体开发等^[3]。然而，其高分子量导致的高粘度、低溶解度和低生物利用度限制了其在功能食品和药物递送系统中的高附加值应用^[4]。

与琼胶相比，琼胶的酶解产物琼胶寡糖分子量更小，溶解度更高，易于人体吸收^[5]。且琼胶寡糖具有多种生物活性，如调节肠道菌群、增强免疫力、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等^[6−11]。因此，将廉价且丰富的生物质藻类用于生产具有更高生理活性和市场价格的藻类寡糖，是藻类资源高值化利用的重要方向^[12]。目前工业级琼胶寡糖的生产主要依赖化学酸解法，虽然成本低廉，但存在产物异质性、副产物毒性及环境污染等缺点^[13]。相比之下，基于琼胶酶的酶解法具有产物可控、反应条件温和、碳排放量低等优势，符合绿色制造需求^[14]。

琼胶酶主要分为α-琼胶酶和β-琼胶酶，前者水解琼脂糖的α-1,3糖苷键，产生偶数的琼寡糖（agaroligo saccharides，AOS）；后者水解琼脂糖的β-1,4糖苷键，产生偶数的新琼寡糖（neoagarooligo saccharides，NAOS）。相比于β-琼胶酶，α-琼胶酶的研究起步较晚，相关研究较少^[15]。碳水化合物活性酶（CAZymes）是参与碳水化合物组装、修饰或解构的酶^[16]。根据氨基酸序列的相似性，CAZymes可分为糖苷水解酶（GH）、糖基转移酶（GT）、多糖裂解酶（PL）、碳水化合物酯酶（CE）、辅助氧化还原酶（AA）和碳水化合物结合模块（CBM）等^[17]，琼胶酶属于糖苷水解酶（GH）家族。

琼胶酶通常存在于依赖琼胶作为主要碳源的微生物体系中，这类微生物通常分布于富含琼胶的藻类表面或以海藻为食的海洋软体动物的消化系统内。目前研究的绝大多数琼胶酶都来自于海洋微生物，主要包括弧菌属（Vibrio sp.）^[18]、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas sp.）^[19]、噬琼胶菌属（Agarivorans sp.）^[20]、交替单胞菌属（Alteromonas sp.）^[21]、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）^[22]等。利用全基因组测序技术，可以较全面解析产酶菌株的遗传背景，也有助于发现新酶基因^[23]。

总体来看，现有琼胶酶资源尚不丰富，其产业化应用仍面临瓶颈，如酶活普遍偏低、催化稳定性差、产酶菌株遗传背景不明确、现有商业化酶制剂种类稀少等^[24−25]。因此，为了丰富产高活性琼胶酶的菌株资源并挖掘与琼胶酶相关的基因资源，本研究从鲍鱼消化系统中筛选鉴定具有高琼胶酶活性的菌株，结合全基因组测序分析产酶菌株的与琼胶酶相关的遗传信息，并考察比较它们所产琼胶酶的酶学性质。研究结果可为新型的、具有良好应用潜力的琼胶酶的开发挖掘提供参考。

1　材料与方法

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1.1　材料与仪器

5批次不同市场商户购买的鲍鱼　福州海鲜市场；筛选培养基、种子培养基、发酵培养基：2216E液体培养基　青岛海博生物技术有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐（4-（2-aminoethyl） benzenesulfonyl fluoride hydrochloride，AEBSF）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM）　生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA marker、Taq酶　宝生物工程（大连）有限公司；琼脂粉　北京索莱宝科技有限公司；氯化钾、氯化钙、氯化锰、氯化钴、硫酸镁、氯化锌、五水硫酸铜、氯化亚铁、六水三氯化铁、氯化钠　分析纯，国药集团化学试剂有限公司；细菌DNA提取试剂盒（磁珠法）　上海美吉逾华生物医药科技有限公司。

CY04-IS-RDV1型立式恒温振荡器　美国精骐有限公司；KUBOTA 6000型高速冷冻离心机　日本久保田公司；LRH-150型生化培养箱　上海一恒科学仪器有限公司；SpectraMax i3x型多功能酶标仪　美谷分子仪器（上海）有限公司；A24812型PCR扩增仪　美国生命技术公司；DYCP-31E型DNA凝胶电泳仪　北京六一生物科技有限公司；JXFSTPRP-32L型全自动样品快速研磨仪　上海净信实业发展有限公司；Covaris M220型基因组DNA片段化仪　基因有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　产琼胶酶菌株的筛选和鉴定

1.2.1.1　产琼胶酶菌株的平板分离与初筛

将鲍鱼内脏样品剪碎后，每3只鲍鱼的内脏样品混合作为一个样品，按固液比1:9加入生理盐水，均质30 min，涂布于筛选培养基（以琼脂为唯一碳源），置于30 ℃培养48 h。选取菌落周围产生明显凹陷圈的菌株，三区划线纯化后进一步采用卢戈氏碘液染色法进行筛查，染色后筛选透明圈直径大的菌株作为候选菌。

1.2.1.2　产琼胶酶菌株的酶活力测定复筛

将候选菌株接入含有0.2%琼脂（w/v）的种子培养基中，于30 ℃、150 r/min摇床培养24 h后，转接到含有0.2%琼脂（w/v）发酵培养基中，于30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，取菌液于8000 r/min离心10 min后，取上清液作为粗酶液，以DNS法测定琼胶酶活力，取酶活力最高的菌株进行后续实验。

1.2.1.3　琼胶酶活力测定

采用DNS法（3,5-二硝基水杨酸法）测定琼胶酶活力^[26]：取1 mL酶液和1 mL底物溶液（用0.02 mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液配制的0.5%（w/v）琼脂溶液）混合于试管内，在40 ℃反应30 min，加入1.5 mL DNS试剂，混合液在沸水中水浴5 min后用去离子水定容至25 mL，充分混匀后在540 nm处测定吸光度值，以灭活的酶液作为空白对照。绘制以D-半乳糖含量和OD_{540 nm}值分别为横纵坐标的D-半乳糖标准曲线，获得线性回归方程Y=0.3081X−0.008（R²=0.9984），根据标准曲线计算酶活力。酶活力单位（U）的定义：以1 mL酶液1 min产1 μg还原糖定义为1个活力单位。

1.2.1.4　产琼胶酶菌株的形态学观察

将菌株在2216E固体培养基上划线，于28 ℃培养24 h后，观察菌落形态特征。利用革兰氏染色法观察细菌细胞形态和染色结果。

1.2.1.5　产琼胶酶菌株的16S rDNA鉴定

采用破碎煮沸法提取DNA，利用通用引物扩增16S rDNA（上游F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）^[27]，PCR扩增体系（50 μL）包含10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq酶（5 units/μL）0.25 μL，DNA模板2 μL和无菌水36.75 μL。扩增程序步骤包括94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。使用DNAMAN 9.0软件拼接测序结果，利用BLAST工具与GenBank数据库进行序列比对，获取同源性高的菌株的16S rRNA基因序列。采用MEGA 11软件基于邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，比对建树时选择三类序列，即可能同种、同属不同种以及外群近缘属。

1.2.2　产酶菌株全基因组测序及分析

1.2.2.1　全基因组测序

使用试剂盒提取菌株基因组DNA。利用基因组DNA片段化仪将DNA样本断裂成约400 bp的片段。文库成功制备后，采用Illumina NovaSeq 6000平台进行双端测序（2×150 bp）。

1.2.2.2　基因组组装和功能注释

对Illumina平台测序所得序列经过剪切得到高质量reads（clean data）。利用组装软件SOAPdenovo2^[28]对clean data进行拼接组装。利用Glimmer^[29]对基因组中的编码序列（CDS）进行预测，利用tRNAscan-SE^[30]进行tRNA预测，利用Barrnap进行rRNA预测。利用BLASTP、Diamond、HMMER等序列比对工具对预测到的CDS进行NR、Swiss-Prot、Pfam、GO、COG、KEGG、CAZy等数据库的注释，获得基因的功能信息。

1.2.3　酶学性质

1.2.3.1　琼胶酶的最适温度及温度稳定性

粗酶液与琼脂底物溶液分别在25、30、35、40、45、50、55和60 ℃不同温度下反应30 min，测定琼胶酶活力，以最高酶活力为100%，研究琼胶酶反应的最适温度。将粗酶液预先置于30、40、50、60、70、80、90和100 ℃的水浴锅中分别孵育30、60 min，以未经处理的酶活力为100%，测定残余酶活力，研究琼胶酶的热稳定性。

1.2.3.2　琼胶酶的最适pH及酸碱稳定性

分别配制pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲溶液：柠檬酸-磷酸氢二钠（pH4.0~6.0），磷酸二氢钠-磷酸氢二钠（pH7.0~8.0），甘氨酸-氢氧化钠（pH9.0~11.0）。用不同pH的缓冲溶液配制0.5%琼脂（w/v）底物溶液，测定不同pH下的琼胶酶活力，以最高酶活力为100%，研究琼胶酶反应的最适pH。将粗酶液与pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲溶液等体积混合后，置于4 ℃保温1 h，以未经处理的琼胶酶活力为100%，测定残余酶活力，研究琼胶酶的酸碱稳定性。

1.2.3.3　不同NaCl浓度对酶活力的影响

配制不同NaCl浓度（0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 mol/L）的磷酸缓冲溶液，用上述缓冲溶液配制0.5%琼脂（w/v）底物溶液，测定不同NaCl浓度下的琼胶酶活力。将未加入NaCl的对照组的酶活力计为100%。

1.2.3.4　不同金属离子对酶活力的影响

参考梁小凤^[4]报道的方法，配制终浓度为1和10 mmol/L的不同金属离子磷酸缓冲溶液（KCl、CaCl₂、MnCl₂、MgSO₄、ZnCl₂、CuSO₄、FeCl₂、FeCl₃、CoCl₂），用上述缓冲溶液配制0.5%琼脂（w/v）底物溶液，测定琼胶酶活力，以未加入金属离子的对照组的酶活力计为100%。

1.2.3.5　EDTA和蛋白酶抑制剂对酶活力的影响

参考ZHANG等^[31]报道的方法，将粗酶液与含不同抑制剂（IAM、AEBSF、EDTA）的磷酸缓冲溶液混合，各抑制剂的终浓度分别达到1和10 mmol/L。混合均匀后置于4 ℃保温30 min，以未经处理的琼胶酶活力为100%，测定残余酶活力。

1.3　数据处理

实验测定均采用三次独立重复实验，并计算“均值±标准差”。实验数据分析使用IBM SPSS Statistics 27软件进行单因素ANOVA检验分析，P<0.05表示差异显著。图表绘制使用Origin 2024软件。

2　结果与分析

收起

2.1　产琼胶酶菌株的筛选和鉴定

2.1.1　产琼胶酶菌株的平板分离与初筛

从不同批次的鲜活鲍鱼内脏样品中涂板分菌，根据筛选培养基上琼脂凹陷圈大小，分离得到487株有琼脂降解活性的菌株。将菌株重新点板到2216E平板上培养后，经卢戈氏碘液染色后产生透明圈（图1），根据透明圈大小与菌体大小的比值（H/C）（图2）选出H/C最大（大于7.5）的菌株7株。

2.1.2　产琼胶酶菌株的酶活力测定复筛

以初筛得到的7株菌株为测试菌株，测得其琼胶酶活力（表1）。其中，菌株2DB7、2DB15、2DBB20和2DBB51的酶活力达290 U/mL以上，显著高于其他3株菌（P<0.05），用于后续实验。

2.1.3　产琼胶酶菌株的形态学观察结果

4株产琼胶酶菌株的形态学观察结果见附图1（详见本刊官网http://www.spgykj.com/文章的网络版）和附图2（详见本刊官网http://www.spgykj.com/文章的网络版）。由附图1可知，4株菌菌落形态相似，培养24 h后，菌落形状不规则，呈现半透明浅黄色，表面光滑湿润，有轻微凸起。由附图2可知，4株菌革兰氏染色呈红色，为革兰氏阴性菌，呈略微弧形弯曲的短杆状。

2.1.4　产琼胶酶菌株的16S rDNA鉴定

将扩增得到的4株菌16S rDNA序列经BLAST比对，结果表明4株菌均与地中海弧菌（V. mediterranei）同源性最高，均达到99.86%以上。从GenBank中选取和4株菌同源性较高的14株地中海弧菌（同源性达99%以上）、5株弧菌属菌株（同属不同种，同源性在90%~95%）和5株假交替单胞菌属菌株（外群校准，同源性在80%~90%）的16S rRNA基因序列构建系统发育树，结果显示，4株菌均与地中海弧菌（V. mediterranei）在同一大分支下（图3），表明4株菌均为地中海弧菌（V. mediterranei）。并且，4株菌分属于不同的小分支，也确证这4株菌为不同的菌株。

2.2　产酶菌株全基因组测序及分析

2.2.1　基因组特征

对V. mediterranei 2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51进行了基因组测序，结果表明这4株菌都不编码质粒，只有环形染色体DNA（附图3，详见本刊官网http://www.spgykj.com/文章的网络版）。它们的基因组特征如表2所示，4株菌的基因组大小分别为5688854、5922738、6120380和6129961 bp，GC含量分别为44.12%、44.03%、44.15%和43.95%，分别编码5204、5448、5730和5604个基因，编码基因总长度分别为5045709、5256072、5418285和5408262 bp，编码基因平均GC含量分别为44.94%、44.84%、44.95%和44.79%。

2.2.2　基因功能注释

在KEGG数据库中，基因根据代谢途径分为6大类，根据特定功能分为42个较小的类。2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51在KEGG数据库中分别注释到3996、4034、4213和4196个基因，分别占基因组中所有编码基因的76.79%、74.05%、73.53%和74.88%。4株菌与代谢相关的基因最丰富，分别为1219、1237、1256和1288个，其中碳水化合物代谢和氨基酸代谢占了大多数（附图4，详见本刊官网http://www.spgykj.com/文章的网络版）。

COG数据库用于蛋白质功能分类，主要基于细菌、古菌和真核生物的基因组序列，通过将同源蛋白质分组，推断蛋白质的功能和进化关系。2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51分别有4266、4371、4478和4530个基因被注释到COG数据库中的24个分类中，各占总基因数的81.98%、80.23%、78.15%和80.84%。这些基因主要在[G]（碳水化合物转运和代谢，4株菌注释基因数量分别为445、459、476和531个）、[E]（氨基酸转运和代谢，426、416、425和426个）和[K]（转录，410、440、457和447个）中富集（附图5，详见本刊官网http://www.spgykj.com/文章的网络版）。

CAZy数据库是一个专注于碳水化合物活性酶的权威数据库，系统整理和分类能够降解、修饰或合成碳水化合物的酶类及其相关模块。为了更好地解析基因组中碳水化合物利用的相关酶，使用CAZy数据库对2DB7、2DB15、2DBB20和2DBB51编码基因进行注释。分别鉴定出136、148、158和171个CAZymes，占总编码基因的2.61%、2.72%、2.76%和3.05%，包括辅助氧化还原酶（AA，12、12、12、11）、碳水化合物结合模块（CBM，1、2、1、1）、碳水化合物酯酶（CE，12、12、13、14）、糖苷水解酶（GH，64、68、81、85）、糖基转移酶（GT，47、49、47、54）和多糖裂解酶（PL，0、5、4、6）（附图6，详见本刊官网http://www.spgykj.com/文章的网络版）。GH是四株菌基因组中参与多糖降解的主要CAZyme家族，占各菌CAZyme家族基因的50%左右。

关于琼胶酶基因，在Swiss-Prot数据库中2DB7注释到1个潜在α-琼胶酶编码基因，而2DB15、2DBB20和2DBB51则分别注释到了1个潜在α-琼胶酶编码基因和4个β-琼胶酶编码基因。构建蛋白的氨基酸序列系统发育树，发现2DB15、2DBB20和2DBB51注释的4个β-琼胶酶编码基因中，都有1个β-琼胶酶属于GH16家族，其他3个属于GH50家族（图4）。2DB15、2DBB20和2DBB51的β-琼胶酶基因经CAZy数据库注释也得到相同结果。与琼胶降解相关的β-半乳糖苷酶（ABG）和α-新琼脂二糖水解酶（NABH）也在CAZy数据库中被注释到，2DB7、2DB15、2DBB20和2DBB51分别有12、14、14和15个ABG基因，且2DB15、2DBB20和2DBB51还各含有1个NABH基因。

2.3　酶学性质

2.3.1　酶的最适温度及温度稳定性

本文测定了在温度25~60 ℃范围内的酶活变化情况，结果发现2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51所产琼胶酶在温度分别为45 ℃（图5A）、40 ℃（图5B）、45 ℃（图5C）、45 ℃（图5D）条件下，发挥降解琼脂的能力最强（即最适温度）。其中2DB7所产琼胶酶在25 ℃的相对酶活为47.79%，60 ℃条件下完全失活（图5A）；2DB15所产琼胶酶在25 ℃的相对酶活为56.70%，60 ℃条件下其相对酶活下降至25.08%（图5B）；2DBB20所产琼胶酶在25 ℃的相对酶活为50.06%，60 ℃条件下其相对酶活下降至15.23%（图5C）；2DBB51所产琼胶酶在25 ℃的相对酶活为50.38%，60 ℃条件下完全失活（图5D）。在25 ℃条件下，四株菌均能保持50%左右的相对酶活，在接近室温的条件下具有一定的酶活力。在60 ℃条件下2DB7和2DBB51完全失活，热适应性较差，但是2DB15和2DBB20在60 ℃条件下，仍然具有酶活力，且2DB15酶活力可达到25.08%，因此，2DB15和2DBB20具有一定的热适应性。

本文考察了酶的温度稳定性，结果表明，2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51四株菌所产琼胶酶在40 ℃以下均可以保持良好的稳定性，孵育1 h后的相对酶活分别为95.62%（图6A）、95.99%（图6B）、90.56%（图6C）、85.85%（图6D）。超过50 ℃后四株菌所产酶的稳定性呈下降趋势。50 ℃孵育30 min后的相对酶活分别下降至46.28%、53.21%、57.24%、62.67%；孵育1 h后的相对酶活分别下降为36.35%、37.97%、46.97%、52.13%。温度升至90 ℃，2DBB51所产琼胶酶孵育30 min后活性完全丧失。温度升至100 ℃，2DB15和2DBB20所产琼胶酶孵育30 min后的相对酶活力仍然分别保持在22.73%和13.65%，直至孵育1 h后，二者的酶活力才完全丧失。而2DB7在100 ℃孵育1 h依旧保留了10.66%的相对酶活。结果表明，4株菌均具有良好的热稳定性，且2DB7所产琼胶酶热稳定性最佳。

2.3.2　酶的最适pH及酸碱稳定性

本文测定了在pH4.0~11.0范围内的酶活变化情况，结果发现2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51四株菌所产琼胶酶在pH分别为8.0（图7A）、7.0（图7B）、8.0（图7C）、7.0（图7D）条件下，酶活最高。4株菌所产琼胶酶在pH5.0~9.0之间均保持60%以上的相对酶活，表明它们pH作用范围较为广泛（图7）。2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51四株菌所产琼胶酶在pH为4.0时，相对酶活分别只有12.54%（图7A）、9.44%（图7B）、15.03%（图7C）、14.13%（图7D）。除2DBB20外，其他3株菌所产琼胶酶在pH为10.0和11.0时，仍然保留酶活力，且2DBB51所产琼胶酶在pH为11时，依旧保持29.36%的相对酶活。

本文考察了酶经过pH4.0~11.0的1 h处理后的酶活性，结果发现2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51四株菌所产琼胶酶在pH分别为7.0（图8A）、7.0（图8B）、7.0（图8C）、8.0（图8D）条件下，稳定性最好。2DB7所产琼胶酶在pH5.0~9.0放置1 h后，其相对酶活保持在76.36%以上，且在pH4.0和11.0时均有酶活力保留。2DB15所产琼胶酶在pH5.0~9.0放置1 h后，其相对酶活保持在74.62%以上，在pH4.0时酶活力完全丧失，但在pH11.0时，依旧保留28.10%的相对酶活。2DBB20所产琼胶酶在pH5.0~9.0放置1 h后，其相对酶活保持在61.52%以上。2DBB51所产琼胶酶在pH5.0~9.0放置1 h后，其相对酶活保持在50.12%以上，在pH11.0时，酶活力完全丧失，但在pH4.0时仍然有酶活力保留。

2.3.3　不同NaCl浓度对酶活力的影响

由于4株菌均是来源于鲍鱼（海洋软体动物）的肠道，故考察酶在不同盐浓度下的酶活力。2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51四株菌所产琼胶酶在NaCl浓度分别为0.25 mol/L（图9A）、1 mol/L（图9B）、0.25 mol/L（图9C）、0 mol/L（图9D）条件下，酶活最高。2DB7、2DB15、2DBB20所产琼胶酶，与不加NaCl的对照组相比，酶活力最高可达106.77%、102.96%、100.32%。当NaCl浓度增加至5 mol/L时，4株菌所产琼胶酶均保留了40%以上的相对酶活；其中2DB15的NaCl耐受能力最强，在NaCl浓度为5 mol/L时，仍然保留了54.34%的相对酶活。

2.3.4　不同金属离子对酶活力的影响

浓度为1 mmol/L的Co²⁺和Fe³⁺略微促进2DB7所产琼胶酶的酶活性，其中Fe³⁺处理时相对酶活可达101.94%；浓度为1 mmol/L的K⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺和Cu²⁺对2DB7所产琼胶酶的酶活具有显著抑制作用（P<0.05），其中Mn²⁺的抑制作用最强，将相对酶活降低至40.38%。测试的所有10 mmol/L的金属离子均对2DB7所产琼胶酶具有抑制作用，其中Cu²⁺的抑制作用最强，将相对酶活降低至13.48%（图10A）。

浓度为1 mmol/L的K⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺对2DB15所产琼胶酶的酶活具有显著促进作用（P<0.05），其中Zn²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺的促进最强，将相对酶活提高至128.98%以上；浓度为1 mmol/L的Mn²⁺和Mg²⁺对2DB15所产琼胶酶的酶活具有显著抑制作用（P<0.05），其中Mn²⁺的抑制作用最强，将相对酶活降低至69.74%。浓度为10 mmol/L的K⁺和Fe²⁺对2DB15所产琼胶酶的酶活具有显著促进作用（P<0.05），其中Fe²⁺的促进最强，将相对酶活提高至128.65%；浓度为10 mmol/L的Ca²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺对2DB15所产琼胶酶的酶活具有显著抑制作用（P<0.05），其中Cu²⁺的抑制作用最强，将相对酶活降低至16.29%（图10B）。

浓度为1 mmol/L的K⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺对2DBB20所产琼胶酶的酶活具有显著促进作用（P<0.05），其中Fe²⁺的促进最强，将相对酶活提高至130.81%；浓度为1 mmol/L的Mn²⁺对2DBB20所产琼胶酶的酶活具有显著抑制作用（P<0.05），将相对酶活降低至72.45%。除了K⁺，测试的浓度为10 mmol/L的金属离子均对2DBB20所产琼胶酶具有显著抑制作用（P<0.05），其中Cu²⁺的抑制作用最强，作用后使该酶完全失去活性（图10C）。

浓度为1 mmol/L的Co²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺对2DBB51所产琼胶酶的酶活具有显著促进作用（P<0.05），其中Cu²⁺的促进最强，将相对酶活提高至162.06%；浓度为1 mmol/L的Mn²⁺对2DBB51所产琼胶酶的酶活具有显著抑制作用（P<0.05），将相对酶活降低至64.87%。除了Fe²⁺，测试的浓度为10 mmol/L的金属离子均对2DBB51所产琼胶酶具有显著抑制作用（P<0.05），其中Cu²⁺的抑制作用最强，将相对酶活降低至13.93%（图10D）。

2.3.5　EDTA和蛋白酶抑制剂对酶活力的影响

研究IAM、AEBSF、EDTA对4株菌所产琼胶酶的酶活力的影响，1 mmol/L的IAM对2DB7、2DBB20和2DBB51所产琼胶酶起到显著促进作用（P<0.05），将相对酶活性分别提升至104.20%（图11A）、105.33%（图11C）和114.64%（图11D）；10 mmol/L的IAM处理下，4株菌所产琼胶酶活性与对照组无显著差异（P>0.05）。10 mmol/L的AEBSF对2DB7、2DB15、2DBB20和2DBB51所产琼胶酶起到抑制作用，将相对酶活性分别降至94.17%（图11A）、82.35%（图11B）、86.86%（图11C）和96.41%（图11D）。10 mmol/L的EDTA对2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51四株菌所产琼胶酶活性的抑制作用最显著（P<0.05），将相对酶活性分别降至72.47%（图11A）、56.11%（图11B）、57.39%（图11C）和74.30%（图11D）。

3　讨论与结论

收起

本研究系统考察和比较了从鲍鱼内脏中分离获得的4株产琼胶酶的地中海弧菌的基因组遗传信息及其所产琼胶酶的酶学性质。尽管已有大量研究报道了弧菌属（Vibrio sp.）中多种细菌的琼胶酶生产能力，但据搜索文献库所知，目前尚未有关于地中海弧菌产琼胶酶及其产酶相关酶学性质与遗传基础的系统研究报道。关于地中海弧菌的代谢产物的利用，CARRATURO等^[32]报道分离到一株地中海弧菌，该菌产抑制副溶血弧菌的类细菌素。因此，本文首次详细揭示了地中海弧菌作为琼胶酶生产菌株的潜力及其所产酶的酶学性质。

酶的最适温度测定结果表明，4株地中海弧菌中2DB7、2DBB20和2DBB51所产琼胶酶最适反应温度均为45 ℃，与麦氏交替假单胞菌（Alteromonas macleodii）BC7.1^[26]、交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）Q30F^[33]等来源的琼胶酶最适反应温度相似，而2DB15所产琼胶酶最适反应温度为40℃，与火色杆菌（Flammeovirga sp.）OC4^[12]、鞘脂单胞菌（Sphingomonas sp.）Q2^[25]等来源的琼胶酶最适反应温度一致。2DB7、2DB15、2DBB20、2DBB51所产琼胶酶在pH分别为8.0、7.0、8.0、7.0的条件下，酶活最高，且在pH5.0~9.0之间都保持60%以上的相对酶活，与麦氏交替假单胞菌BC7.1^[26]、交替假单胞菌Q30F^[33]和不动杆菌（Acinetobacter sp.）AG LSL-1^[34]来源的琼胶酶相比，具有较好的pH耐受性。

多糖降解是海洋碳循环的重要组成部分^[35]。海洋微生物通过分泌特异性胞外酶，如琼胶酶、纤维素酶、褐藻胶酶等，对海洋中的大分子多糖进行高效分解，从而参与深海环境的碳循环。琼胶酶作为一类重要的海洋多糖降解酶，近年来已成为研究热点，而弧菌属则是琼胶酶的主要微生物来源之一^[36–37]。许多弧菌属（Vibrio sp.）来源的琼胶酶都表现出冷适应性，在较高的温度下稳定性差。例如，来源于V. natriegens WPAGA4的琼胶酶Aga3420^[38]，其最佳反应温度在40 ℃，但仅在10~30 ℃下孵育50 min内具有良好的稳定性。来源于V. fluvialis A8的琼胶酶^[39]，在50 ℃下孵育30 min失活。为了得到较好热稳定性的弧菌来源琼胶酶，SU等^[36]将来自Vibrio sp. ZC-1的β-琼胶酶进行诱变，但诱变后的琼胶酶在46 ℃孵育10 min后也基本失活。具有一定热稳定性的Vibrio sp. S1来源的琼胶酶AgaA33和AgaA29^[40]，在50 ℃下孵育1 h，其相对活性也下降至20%以下。而本文考察的这4株弧菌所产琼胶酶在50 ℃孵育1 h后仍然具有一定的活性，其中以2DBB51热稳定性最佳，相对酶活能达到52.13%。当温度在40 ℃及以下时，4株菌所产琼胶酶均具有良好的稳定性，在40 ℃孵育1 h后，能维持85.85%以上的相对酶活。琼脂的凝胶温度通常在30~40 ℃左右，所以最适反应温度高于40 ℃以及热稳定性较高的琼胶酶在工业化应用中具有较好的应用前景^[41]。

在本研究中，10 mmol/L的EDTA和10 mmol/L的AEBSF对4株菌所产琼胶酶活性均起到抑制作用，且EDTA的抑制效果更强。EDTA作为金属螯合剂，可抑制依赖金属离子的酶的活性，AEBSF是一种广谱的丝氨酸蛋白酶抑制剂，因此，结果表明4株菌所产琼胶酶的活性中心依赖于金属离子，且与丝氨酸残基有关。进一步分析金属离子对酶活性的影响时发现，多种低浓度金属离子对测试菌所产琼胶酶活性起到促进作用，如浓度1 mmol/L的Co²⁺和Fe³⁺，而浓度1 mmol/L的Mn²⁺对4株菌所产琼胶酶均起到明显抑制作用。浓度为10 mmol/L的Cu²⁺对4株菌所产琼胶酶活性的抑制效果最强，并能使2DBB20所产琼胶酶完全失活。从结果可以看出，虽然一些低浓度的金属离子可以促进酶的活性，但过高浓度的金属离子大多可能会导致酶活力的降低，推测可能因为高浓度金属离子影响了酶分子和（或）底物分子的解离情况，或者影响了酶活性中心的电子分布与转移，或者影响了酶分子的空间构象^[42]。本研究结果与前人报道的弧菌属其他琼胶酶存在一定差异，例如，来源于Vibrio sp. S1的AgaA29和AgaA33^[40]在低浓度Co²⁺条件下同样显示出酶活促进的结果，但低浓度Mn²⁺对其酶活表现为促进作用而非抑制；V. natriegens WPAGA4的Aga3420^[38]则表现出低浓度Fe³⁺和Mn²⁺促进其酶活，而低浓度Co²⁺抑制其酶活的现象。因此，本研究中的4株地中海弧菌所产琼胶酶酶活受金属离子的影响，与其他弧菌菌株来源的琼胶酶有所不同，这种差异性拓宽了弧菌来源琼胶酶的使用场景。

本研究中测定的4株地中海弧菌（2DB7、2DB15、2DBB20和2DBB51）所产的琼胶酶均展现出较强的降解活性，酶活分别为315.17、340.99、293.88和324.37 U/mL。并且，本研究中使用的降解底物为琼脂，而大多数文献报道中测定琼胶酶活性时通常使用琼脂糖作为底物^[43−45]。琼脂是由琼脂糖（agarose）和琼脂胶（agaropectin）组成的复合物，因此，这些琼胶酶在降解与琼脂同浓度的琼脂糖时，可能会表现出更高的活性。大多数天然琼脂是硫酸化多糖，需要对其进一步加工才能生产琼脂低聚糖^[46]。因此，开发一种无需脱硫步骤即可将硫酸化琼脂糖（粗琼脂）转化为琼脂低聚糖的生物转化工艺，在工业生产中具有良好的应用潜力。

根据氨基酸序列特征，琼胶酶可分为不同的糖苷水解酶（GH）家族。已报道的β-琼胶酶主要属于GH16、GH50、GH86和GH118家族，而已报道的α-琼胶酶均属于GH96家族。GH16家族是最大的GH家族，涵盖多种内切型β-琼胶酶；且根据CAZy数据库的统计数据，迄今为止，弧菌属的GH16家族琼胶酶较常见^[47−49]，弧菌属中其他家族的β-琼胶酶特征则较少被研究。根据CAZy数据库的注释结果，2DB15、2DBB20和2DBB51分别含有3个GH50家族的琼胶酶基因，且与同为源于弧菌属GH50家族的V. fluvialis A8^[39]的琼胶酶和源于V. natriegens WPAGA4的琼胶酶Aga3420^[38]相比，本文这3株菌所产酶在热稳定性上更有优势。此外，多数琼胶酶属于内切型酶，而GH50家族的β-琼胶酶则大部分为外切型酶，能够以新琼二糖（NA2）作为唯一的降解终产物。从基因组测序结果看，本文这3株弧菌各编码有3个GH50家族琼胶酶的基因，推测它们在后续的应用上可能有更好的前景。

琼脂糖是由β-D-半乳糖（D-Gal）和3,6-脱水-α-L-半乳糖（L-AHG）通过β-1,4糖苷键和α-1,3糖苷键交替连接形成的线性中性多糖^[50]。α-琼胶酶水解琼脂糖的α-1,3糖苷键得AOS，β-琼胶酶水解琼脂糖的β-1,4糖苷键得NAOS^[51]。联合使用α-琼胶酶和β-琼胶酶，有助于实现高效降解琼脂糖。比如，联用这两种酶可降解红藻细胞壁高质量制备原生质体。串联使用β-琼胶酶Aga50D和α-琼胶酶BpGH117实现了琼脂糖组分L-AHG的一步制备^[43]。在降解的产物方面，AOS和NAOS这两类琼胶寡糖都具有良好的生物活性，但活性存在一定差异，且在开发利用时各有优缺点^[52]。此外，当前已有偶数NAOS标品，但缺乏偶数AOS标品^[15]。因此，开发和利用α-琼胶酶受到越来越多的关注。与β-琼胶酶相比，关于α-琼胶酶的研究较少。目前已报道的β-琼胶酶已超过千种，但已报道有表征的α-琼胶酶仅近10种，如来自解琼脂交替单胞菌G J1B的AgaA、来自深海单胞菌JAMB-A33的A33、来自深海单胞菌LD5的AgaD和AgaE、来自噬琼胶卵链菌的CaLJ96、来自沉积物卵链菌WS1-A的AgaWS5和来自溶藻性吉尔维菌的OUC-GAJJ96等^[15,53–54]。

已报道的α-琼胶酶的同源性相似度差别较大，从44%到90.5%；它们一般都含有碳水化合物结合模块（Carbohydrate-Binding Module，CBM）6^[55]。根据Swiss-Prot数据库的注释结果，本研究中的4株弧菌均注释到潜在的α-琼胶酶基因，注释同源性达55%左右但覆盖度较低，与已报道的GH96家族α-琼胶酶同源性较低。Swiss-Prot数据库中的蛋白质序列大都经过实验验证，其注释结果可靠性较高。进一步分析序列发现，注释到的潜在α-琼胶酶基因含有CBM6和新推定碳水化合物结合模块（novel putative carbohydrate binding module，NPCBM）。在全基因组数据中，菌株2DB7未注释到其他琼胶酶基因，仅在Swiss-Prot数据库中注释到这个潜在α-琼胶酶基因。因此，推测菌株2DB7编码新的琼胶酶基因，后续尚需通过酶蛋白纯化、分泌蛋白组质谱鉴定、基因敲除或异源表达等探究该菌株编码且表达新琼胶酶基因的可能性。

根据CAZy数据库和Swiss-Prot数据库注释结果，2DB7、2DB15、2DBB20和2DBB51四株菌均携带ABG基因，而2DB15、2DBB20和2DBB51还各含有1个NABH基因。NABH可以切割β-琼胶酶水解琼脂糖产生的偶数NAOS非还原端的第一个α-1,3糖苷键，生成相应的奇数AOS；而ABG则可以作用于α-琼胶酶水解琼脂糖产生的偶数AOS非还原端的第一个β-1,4糖苷键，生成奇数的NAOS^[56]。推测ABG与NABH的存在可能进一步提升了菌株对琼脂糖的降解效率，这可能是导致这些菌株产生的酶液拥有高琼胶酶活性的原因之一。本研究目前只在基因组层面确证了菌株编码上述的琼胶降解相关基因，后续还需结合利用RT-qPCR、转录组或蛋白质谱等进一步做蛋白表达层面的验证。

综上所述，本研究从鲍鱼内脏中分离出4株具有较高琼胶降解活性的地中海弧菌，菌株的全基因组测序注释到GH50和GH16家族琼胶酶等多种琼胶降解相关基因，菌株所产琼胶酶具有较高的酶活、较好的热稳定性和pH稳定性。研究结果丰富了琼胶酶资源库，为深入理解和利用所获得的琼胶酶提供了理论参考。下一步可考虑纯化制备琼胶酶蛋白、在蛋白表达层面验证各菌株的琼胶酶基因表达情况；优化发酵产酶条件提高酶的产量，降低产酶成本；利用深度学习模型预测定点突变或定向进化对酶分子稳定性能的影响来指导酶分子改造。

参考文献

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文献

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排序方式：

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2026年第47卷第11期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025060176

接收时间：2025-06-16
首发时间：2026-10-22
出版时间：2026-06-01

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出版历史

收稿日期：2025-06-16

基金

作者信息

¹福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002

²闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心，福建福州 350002

³福建省农副产品保鲜技术开发基地，福建福州 350002

⁴福州海洋研究院，福建福州 350108

通讯作者:

刘斌（1969−），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：liubin618@hotmail.com。

黄莹（1984−），女，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail：yinghuangyh@126.com。

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/spgykj/CN/10.13386/j.issn1002-0306.2025060176

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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