食品工业科技

水平	因素
−1	60	350	40:1
0	70	400	50:1
1	80	450	60:1

水平	因素
−1	60	350	40:1
0	70	400	50:1
1	80	450	60:1

时间（min）	A（%）	B（%）
0~1	90	10
1~13	90→0	10→100
13~17	0	100
17~17.1	0→90	100→10
17.1~20	90	10

时间（min）	A（%）	B（%）
0~1	90	10
1~13	90→0	10→100
13~17	0	100
17~17.1	0→90	100→10
17.1~20	90	10

试验号	因素	提取量（mg/g）
1	60	400	40:1	42.6079
2	70	450	60:1	43.4499
3	80	450	50:1	40.5625
4	60	450	50:1	39.6743
5	70	400	50:1	47.9638
6	80	400	60:1	43.1524
7	80	350	50:1	40.2007
8	70	400	50:1	47.9309
9	70	350	40:1	43.0816
10	80	400	40:1	42.9763
11	70	400	50:1	47.8322
12	70	400	50:1	48.0125
13	60	350	50:1	40.0362
14	70	400	50:1	47.7993
15	70	350	60:1	43.6709
16	70	450	40:1	43.1342
17	60	400	60:1	42.5992

试验号	因素	提取量（mg/g）
1	60	400	40:1	42.6079
2	70	450	60:1	43.4499
3	80	450	50:1	40.5625
4	60	450	50:1	39.6743
5	70	400	50:1	47.9638
6	80	400	60:1	43.1524
7	80	350	50:1	40.2007
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10	80	400	40:1	42.9763
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13	60	350	50:1	40.0362
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15	70	350	60:1	43.6709
16	70	450	40:1	43.1342
17	60	400	60:1	42.5992

来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	143.978	9	16	1058.28	<0.0001	**
A	0.4872	1	0.4872	32.23	0.0008	**
B	0.0035	1	0.0035	0.2348	0.6428	−
C	0.1438	1	0.1438	9.51	0.0177	*
AB	0.1309	1	0.1309	8.66	0.0216	*
AC	0.0085	1	0.0085	0.5648	0.4768	−
BC	0.0187	1	0.0187	1.24	0.3026	−
A²	72.33	1	72.33	4785.04	<0.0001	**
B²	55.93	1	55.93	3699.79	<0.0001	**
C²	3.63	1	3.63	240.41	<0.0001	**
残差	0.1058	7	0.0151
失拟	0.0737	3	0.0246	3.06	0.1541	−
纯误差	0.0321	4	0.008
合计	144.08	16

来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	143.978	9	16	1058.28	<0.0001	**
A	0.4872	1	0.4872	32.23	0.0008	**
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残差	0.1058	7	0.0151
失拟	0.0737	3	0.0246	3.06	0.1541	−
纯误差	0.0321	4	0.008
合计	144.08	16

样品	吸光度（A）	黄酮浓度（mg/mL）	纯度（%）
IPTF-C	0.822±0.041	0.434±0.022	21.69±1.08
IPTF-P	1.482±0.037	0.781±0.020	39.06±0.99

样品	吸光度（A）	黄酮浓度（mg/mL）	纯度（%）
IPTF-C	0.822±0.041	0.434±0.022	21.69±1.08
IPTF-P	1.482±0.037	0.781±0.020	39.06±0.99

检测模式	英文名	中文名	分子式	m/z	MS²碎片离子	保留时间（min）	鉴定打分（mzCloud/mzVault）
正离子	Quercetin	槲皮素	C₁₅H₁₀O₇	303.04922	303.04913，147.04362，123.04384	8.001	83.6/73.2
正离子	Quercetin-3-O-rutinoside	槲皮素-3-O-芸香苷	C₂₇H₃₀O₁₆	611.15906	303.04898，85.0282，304.05252	/	80.9/84.9
正离子	Morin	桑黄素	C₁₅H₁₀O₇	303.04922	303.04919，147.04381，229.04959	8.38	82.2/67.7
正离子	Quercetin-3-O-glucoside	槲皮素-3-O-葡萄糖苷	C₂₁H₂₀O₁₂	465.10193	303.04901，85.02826，123.04399	8.386	75.7/87.3
正离子	Epicatechin	表儿茶素	C₁₅H₁₄O₆	291.08585	147.04378，119.04891，131.04901	10.18	−/73.5
正离子	Astringin	白皮杉醇葡萄糖苷	C₂₀H₂₂O₉	407.13275	135.04378，245.0802，123.04378	5.134	70.4/84.9
正离子	Peonidin-3-O-beta-galactoside	芍药苷-3-O-β-半乳糖苷	C₂₂H₂₃O₁₁Cl	463.12228	301.06976，286.04605，147.0437	8.855	82.1/88.5
负离子	Quercetin-3-O-glucoside	槲皮素-3-O-葡萄糖苷	C₂₁H₂₀O₁₂	463.08865	300.02762，463.08682，301.03412	8.379	73.2/73.5

检测模式	英文名	中文名	分子式	m/z	MS²碎片离子	保留时间（min）	鉴定打分（mzCloud/mzVault）
正离子	Quercetin	槲皮素	C₁₅H₁₀O₇	303.04922	303.04913，147.04362，123.04384	8.001	83.6/73.2
正离子	Quercetin-3-O-rutinoside	槲皮素-3-O-芸香苷	C₂₇H₃₀O₁₆	611.15906	303.04898，85.0282，304.05252	/	80.9/84.9
正离子	Morin	桑黄素	C₁₅H₁₀O₇	303.04922	303.04919，147.04381，229.04959	8.38	82.2/67.7
正离子	Quercetin-3-O-glucoside	槲皮素-3-O-葡萄糖苷	C₂₁H₂₀O₁₂	465.10193	303.04901，85.02826，123.04399	8.386	75.7/87.3
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负离子	Quercetin-3-O-glucoside	槲皮素-3-O-葡萄糖苷	C₂₁H₂₀O₁₂	463.08865	300.02762，463.08682，301.03412	8.379	73.2/73.5

山桐子饼粕总黄酮提取纯化工艺优化、质谱结构鉴定及抗氧化活性

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杨镇宇 ¹ , 罗凯 ¹ , 豆磊 ¹ , 黄秀芳 ¹^,^* , 阚建全 ²^,^*

食品工业科技 | 工艺技术 2026,47(5): 281-291

收起

食品工业科技 |工艺技术 2026 , 47 (5) : 281 -291

山桐子饼粕总黄酮提取纯化工艺优化、质谱结构鉴定及抗氧化活性

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杨镇宇¹, 罗凯¹, 豆磊¹, 黄秀芳¹^,^*, 阚建全²^,^*

作者信息

¹湖北民族大学生物与食品工程学院，湖北恩施 445000

²西南大学食品科学学院，重庆 400715

通讯作者:

黄秀芳（1979−），女，硕士，实验师，研究方向：食品质量与安全，E-mail：2973925187@qq.com。

阚建全（1965−），男，博士，教授，研究方向：食品化学与营养学、食品质量与安全，E-mail：ganjq1965@163.com。

作者简介:

杨镇宇（2000−），男，硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏，E-mail：929182462@qq.com

Optimization of Extraction and Purification Processes, Mass Spectrometry-based Structural Characterization, and Antioxidant Activity Evaluation of Total Flavonoids from Idesia polycarpa Maxim Cake Meal

Zhenyu YANG¹, Kai LUO¹, Lei DOU¹, Xiufang HUANG¹^,^*, Jianquan KAN²^,^*

Affiliations

¹College of Biology and Food Engineering, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China

²School of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

出版时间: 2026-03-01 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030330

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摘要

收起

山桐子饼粕是油料加工副产物，本研究首次系统开发其总黄酮高效制备技术。以山桐子饼粕为原料，通过响应面法优化超声辅助提取工艺，利用AB-8大孔树脂对提取物进行纯化，并通过LC-MS/MS初步解析提取物结构，同时考察其DPPH、ABTS⁺自由基清除能力、还原能力等指标。结果表明：在超声功率400 W、超声时间70 min、液料比50:1 mL/g的条件下，总黄酮提取量达47.85±0.05 mg/g。AB-8大孔树脂纯化后总黄酮纯度提升至39.06%±0.99%，LC-MS/MS鉴定出槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等7种特征黄酮成分。体外抗氧化活性显示，纯化后总黄酮DPPH自由基清除率（IC₅₀=0.057 mg/mL）较纯化前提高33.7%，2 mg/mL时，FRAP值达13.68 mmol/L。研究表明，山桐子饼粕总黄酮的显著抗氧化活性与其特征性成分密切相关，证实了该副产物的开发潜力。

关键词

山桐子 / 总黄酮 / 液相色谱-质谱联用 / 抗氧化活性

Abstract

收起

Idesia polycarpa Maxim cake meal, a significant by-product of oil processing, was systematically investigated for the first time to develop an efficient preparation technology for total flavonoids. Using Idesia polycarpa cake meal as raw material, the ultrasound-assisted extraction process was optimized via response surface methodology, followed by purification with AB-8 macroporous resin and preliminary structural characterization of the extracts through LC-MS/MS. The antioxidant activities were comprehensively evaluated, including DPPH and ABTS⁺ radical scavenging capacities as well as reducing power (FRAP). The results showed that under optimal conditions (ultrasonic power: 400 W, extraction time: 70 min, liquid-to-material ratio: 50:1 mL/g), the total flavonoid yield reached 47.85±0.05 mg/g. Purification with AB-8 macroporous resin increased flavonoid purity to 39.06%±0.99%, while LC-MS/MS analysis identified seven characteristic flavonoid components, including quercetin and quercetin-3-O-glucoside. In vitro, antioxidant assays demonstrated that purified flavonoids exhibited enhanced DPPH radical scavenging activity (IC₅₀=0.057 mg/mL), representing a 33.7% improvement over unpurified extracts, with a FRAP value of 13.68 mmol/L at 2 mg/mL. The study confirms that the remarkable antioxidant capacity of Idesia polycarpa Maxim cake meal flavonoids is closely related to its characteristic components, highlighting the potential for valorizing this industrial by-product.

Key words

Idesia polycarpa Maxim / total flavonoids / LC-MS/MS / antioxidant activity

引用本文

杨镇宇, 罗凯, 豆磊, 黄秀芳, 阚建全. 山桐子饼粕总黄酮提取纯化工艺优化、质谱结构鉴定及抗氧化活性. 食品工业科技, 2026 , 47 (5) : 281 -291 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030330

Zhenyu YANG, Kai LUO, Lei DOU, Xiufang HUANG, Jianquan KAN. Optimization of Extraction and Purification Processes, Mass Spectrometry-based Structural Characterization, and Antioxidant Activity Evaluation of Total Flavonoids from Idesia polycarpa Maxim Cake Meal[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (5) : 281 -291 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030330

正文

收起

山桐子（Idesia polycarpa Maxim）又名油葡萄，属于大风子科山桐子属落叶乔木，是我国重要的木本油料树种^[1]。山桐子油具有较高的营养价值，成为新型植物油的优质来源^[2−3]，而“鄂选1号”山桐子作为新近认定的山桐子新品种，具有丰产稳产、适应性强等特点，备受行业关注^[4]。山桐子饼粕是山桐子果实经压榨法取油后的主要加工副产物，其干物质占比超过果实总质量的60%，目前多被用作饲料或堆肥^[5]，资源利用效率较低。近年来，学者们逐步挖掘饼粕的功能成分，发现山桐子饼粕可用于提取一系列功能因子^[6]，如抗氧化多肽^[7]、多糖^[8]及多酚^[9]，但针对其黄酮类物质的研究仍存在显著空白。尽管山桐子果实中已检出黄酮成分^[10−11]，但饼粕作为高附加值原料的潜力尚未被系统开发。

黄酮类化合物是一类重要的天然产物次生代谢产物，广泛分布于水果、蔬菜之中，因具有多种药理活性如抗氧化、护肝、抗炎、抗糖尿病^[12−16]等活性，在医药、食品、饮食等领域有着广泛的应用。现有研究表明，油料作物饼粕如蓖麻饼粕^[17]、藤椒饼粕^[18]等可通过乙醇浸提或微波辅助法提取黄酮，但其工艺普遍存在溶剂消耗大、提取率低等问题。针对山桐子饼粕，传统提取方法更面临组分复杂、目标物质富集困难等挑战，需开发高效定向的提取纯化体系。其次，现有山桐子黄酮的成分鉴定主要依赖紫外光谱或液相色谱保留时间比对^[19]，易受单宁类等物质的干扰，难以实现精准结构解析。

因此，基于“鄂选1号”山桐子粕饼原料特性，采用单因素与Box-Behnken响应面联用的方法，建立超声辅助提取（UAE）动力学模型，筛选山桐子饼粕总黄酮的关键工艺参数，解决传统方法效率低、选择性差的问题。继而采用动态吸附-解吸系统考察大孔树脂（AB-8型）纯化工艺，通过动态吸附实验、水洗脱杂质及乙醇解吸等过程确定纯化参数，减少杂质对目标成分鉴定的干扰。创新性引入液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，结合多级碎片离子匹配及数据库检索，首次明确山桐子饼粕中黄酮类化合物的组成。最后，采用DPPH·/ABTS^＋·清除体系及FRAP铁离子还原法，以梯度浓度抗坏血酸（V_C）为参照，对比纯化前后提取物的体外抗氧化活性差异，揭示黄酮结构与功能的相关性，为山桐子饼粕资源的高值化利用提供一定理论依据。

1　材料与方法

收起

1.1　材料与仪器

实验中所提到的山桐子果实为“鄂选1号”　来自于湖北省利川市；无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、三氯化铁、乙酸钠、冰醋酸、抗坏血酸（V_C）　国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠　上海易恩化学技术有限公司；硝酸铝　山东西亚化学股份有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、芦丁标品　上海源叶生物科技有限公司；硫酸亚铁　上海麦克林生化科技有限公司；2,4,6-三（2-吡啶基）-1,3,5三嗪（TPTZ）　天津希恩思生化科技有限公司；所用试剂均为分析纯。

UV-8000H紫外-可见光分光光度计　上海元析仪器有限公司；YB-150多功能粉碎机、YB-250粉碎机　永康市速锋工贸有限公司；DW-HL680超低温冷冻储存箱　中科美菱低温科技股份有限公司；SB25-12DTD超声清洗仪、真空冷冻干燥箱　宁波新芝生物科技股份有限公司；QT-100FC-LCO智能自动部分收集器　上海琪特分析仪器有限公司；L3-5T-B1型移动热泵烘干箱、循环水式真空泵　上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；M56型高配款智能榨油机　威海香威植物油有限公司；Infinite M200PRO多功能酶标仪　帝肯（上海）贸易有限公司；BS224S电子分析天平　德国赛多利斯公司；Centrifuge 5810R台式高速冷冻离心机　德国艾本德股份公司；2.5 cm×30 cm玻璃层析柱、AB-8大孔树脂　郑州和成新材料科技有限公司；YZ1515恒流泵　保定融柏恒流泵制造有限公司；HZP-T502 pH计　福建华志电子科技有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　原料的预处理

取新鲜山桐子果实，去蒂，在70 ℃条件下烘干48 h得山桐子干果。用压榨机对山桐子干果进行压榨，得山桐子饼粕。用粉碎机将饼粕粉碎，过40目筛，得山桐子饼粕粉末，密封，备用。

1.2.2　山桐子总黄酮的提取

精密称取1 g山桐子饼粕粉末于50 mL离心管中并加入适量乙醇溶液，混匀，置于超声清洗仪中，按实验设计的超声时间、超声功率、液料比进行提取。待提取完毕，置于离心机进行8000 r/min，10 min的离心处理，取上清液得山桐子总黄酮（Idesia ploycarpa Total Flavonoids，IPTF）提取液。将提取液旋转蒸发至原体积1/10后冷冻干燥处理，得山桐子饼粕粗总黄酮粉末（Coarse Idesia ploycarpa Total Flavonoids，IPTF-C）。

1.2.3　IPTF总黄酮含量的测定

1.2.3.1　标准曲线的绘制

参照张晨^[20]的方法进行黄酮的测定，称取10 mg干燥至恒重的芦丁标品，用70%乙醇溶液溶解，定容于100 mL容量瓶，得浓度为100 μg/mL的芦丁标准品原液。

将芦丁标准品原液稀释为浓度分别为0、20、40、60、80、100 μg/mL芦丁溶液，取1 mL芦丁溶液于10 mL试管中，依次加入1 mL70%乙醇、0.3 mL的5%NaNO₂，摇匀，静置6 min；加0.3 mL的10%Al（NO₃）₃，摇匀，静置6 min；再加2.0 mL的4%NaOH，摇匀，室温避光孵育15 min，采用紫外-可见分光光度法于510 nm波长下测定吸光度值，以标准品浓度（μg/mL）为X轴，标品吸光度为Y轴，经线性回归分析的特征方程Y=0.0019X−0.0021，其拟合优度R²=0.9994，证明检测体系具有优良的线性响应特性。

1.2.3.2　IPTF总黄酮提取量的测定

根据1.2.3.1所提到的方法，测定IPTF提取液的吸光度，从而计算出总黄酮提取量，计算公式如下：

$ \mathrm{w}({\mathrm{mg/g}})=\frac{\text{cv}}{1000\mathrm{m}} $

式中：w为总黄酮提取量，mg/g，c为由回归方程计算得到的IPTF的质量浓度，μg/mL，v为溶液体积，mL，m为原料的质量，g。

1.2.4　IPTF提取单因素实验设计

1.2.4.1　超声功率对IPTF提取效果的影响

固定乙醇溶液浓度为80%，液料比为40:1，提取温度为70 ℃，超声时间为70 min，分别进行超声功率为250、300、350、400、450 W的超声处理，其余处理方法同1.2.2一致。平行提取3组，按1.2.3的方法进行测定，比较不同超声功率对IPTF提取量的影响。

1.2.4.2　超声时间对IPTF提取效果的影响

固定乙醇溶液浓度为80%，液料比为40:1，提取温度为70 ℃，超声功率为400 W，分别进行超声时间为40、50、60、70、80 min的超声处理，其余处理方法同1.2.2一致。平行提取3组，按1.2.3的方法进行测定，比较不同超声时间对IPTF提取量的影响。

1.2.4.3　液料比对IPTF提取效果的影响

固定乙醇溶液浓度为80%，提取温度为70 ℃，超声功率为400 W，超声时间为70 min，分别按液料比40:1、50:1、60:1、70:1、80:1配制饼粕-乙醇溶液，其余处理方法同1.2.2一致。平行提取3组，按1.2.3的方法进行测定，比较不同液料比对IPTF提取量的影响。

1.2.5　IPTF 提取响应面优化试验设计

基于单因素预实验分析结果，筛选超声功率、超声时间及液料比作为关键工艺参数，以总黄酮提取量为响应值，采用Box-Behnken响应面法构建三因素三水平优化模型，系统探究多变量交互作用对提取效率的影响规律。通过建立二次多项式回归方程解析最优提取参数组合，具体实验参数设置详见表1。

1.2.6　IPTF纯化实验

1.2.6.1　大孔树脂的预处理

参照吕健等^[21]的方法并加以改进。称取100 g AB-8至无水乙醇中浸泡24 h，期间不断搅拌保证树脂充分溶胀，滤出无水乙醇后使用去离子水冲洗树脂至滤液清澈、无醇味。以5 BV 4%盐酸溶液浸泡树脂4 h，期间不断搅拌保证树脂与盐酸充分接触，滤出盐酸溶液后使用去离子水冲洗树脂至滤液pH为7。以5 BV 4%氢氧化钠溶液浸泡树脂4 h，滤出氢氧化钠溶液后使用去离子水冲洗树脂至滤液pH为7，备用。

1.2.6.2　树脂的动态吸附及解吸

取冷冻干燥后的山桐子饼粕粗黄酮粉末溶于20%乙醇溶液中，配制成质量浓度为2 mg/mL的上样液，过0.22 µm滤膜，置于−4 ℃条件下备用。参照王禹博^[22]的方法并加以改进，采用湿法装柱，将清洗完成的树脂以玻璃棒引流至玻璃层析柱中，将质量浓度2 mg/mL的IPTF-C溶液以1.5 mL/min的流速上样，每10 mL收集一次流出液并按1.2.3的方法测定吸光度，以上样体积（mL）为横坐标，泄露百分比为纵坐标绘制动态吸附曲线，当流出液吸光度达到上样液吸光度的1/10时，即达到泄露点，停止上样。泄露百分比计算公式如下：

$ \mathrm{泄露百分比}(\text{%})=\frac{{\mathrm{A}}_{1}}{{\mathrm{A}}_{2}}\times 100 $

式中：A₁为流出液吸光度，A₂为上样液吸光度。

以蒸馏水淋洗，流速为2 mL/min，每10 mL收集一次淋洗液并按1.2.3的方法测定吸光度，确定水洗剂用量。水洗脱杂质后，以流速2 mL/min，浓度80%的乙醇溶液对吸附饱和的树脂进行解吸，每10 mL收集一次解吸液并按1.2.3的方法测定吸光度，绘制解吸曲线。收集解吸液旋转蒸发至原体积1/10，冷冻干燥后得山桐子饼粕精黄酮粉末（Pure Idesia ploycarpa Total Flavonoids，IPTF-P），置于−4 ℃条件下备用。

1.2.6.3　纯度的检测

参考国微^[23]的方法并加以改进，称取IPTF-C与IPTF-P各0.1 g，以70%乙醇溶液定容至50 mL，过0.22 µm滤膜，按1.2.3的方法测定吸光度，按以下公式计算纯度：

$ \mathrm{纯度}(\text{%})=\frac{{\mathrm{C}}_{0}\times \mathrm{V}\times \mathrm{F}}{{\mathrm{M}}_{0}}\times 100 $

式中：C₀为山桐子饼粕总黄酮浓度，mg/mL，V为溶剂体积，mL，F为稀释倍数，M₀为样品质量，mg。

1.2.6.4　LC-MS/MS对IPTF的结构初探

对于经AB-8大孔树脂纯化后的IPTF，送至杭州研趣信息技术有限公司科学指南针，利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定IPTF中所含黄酮的种类。准确称取2.0 mg样品粉末，加入500 µL甲醇溶剂进行超声辅助溶解，经13000 r/min离心10 min后收集澄清上清液供色谱分析。色谱分离采用Thermo Hypersil Gold C₁₈反相柱（2.1 mm×100 mm，1.9 µm），流动相由0.1%甲酸/甲醇（B）-0.1%甲酸/水（A）组成。流速恒定0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样体积10 µL。按表2程序进行梯度洗脱。

质谱检测采用HESI电离源，参数设定如下：离子化温度310 ℃，毛细管加热温度320 ℃，鞘气与辅助气流速分别控制为30 arb和10 arb。正/负离子模式下喷雾电压分别设置为3.0 kV和2.8 kV。

原始质谱数据经Progenesis Qv3.0代谢组学分析平台完成基线校正、色谱峰提取与匹配、保留时间校准及数据归一化后，通过整合ChemSpider公共化学数据库（含ChEBI、ChEMBL）、天然产物数据库、黄酮类化合物专用库及mzCloud高分辨质谱库等多元数据库系统进行化合物结构解析。为进一步保证鉴定结果的准确性，提取数据矩阵表中每个成分的EIC图和二级质谱图，标注碎片信息并注释碎片结构。

1.2.7　IPTF体外抗氧化实验

1.2.7.1　DPPH自由基清除能力的测定

参考Liu等^[24]的方法并加以改进。取适量IPTF-C与IPTF-P样液，用无水乙醇稀释为梯度浓度，样品溶液与DPPH溶液（0.1 mmol/L）以体积比1:1混合，在室温下反应30 min后测定510 nm处吸光度值；相同条件下，以无水乙醇替代样液作为空白对照，以等浓度的V_C作为阳性对照，按以下公式计算DPPH自由基清除率：

$ \text{DPPH}\mathrm{自由基清除率}(\text{%})=\left(1-\frac{{\mathrm{A}}_{1}-{\mathrm{A}}_{2}}{{\mathrm{A}}_{3}}\right)\times 100 $

式中：A₁为2 mL样液与2 mL DPPH溶液的吸光度，A₂为2 mL样液与2 mL无水乙醇的吸光度，A₃为2 mL无水乙醇与2 mL DPPH溶液的吸光度。

1.2.7.2　ABTS^＋自由基清除能力的测定

参考Rumpf等^[25]的方法并加以改进。取ABTS母液，用无水乙醇稀释至734 nm处吸光度为0.700±0.02，避光，作为ABTS^＋工作液备用。取IPTF-C与IPTF-P样液，用无水乙醇配制梯度浓度样液。取1 mL样品溶液与5 mL ABTS⁺工作液混匀，避光反应10 min后测定734 nm处吸光度。相同条件下，以无水乙醇替代样液作为空白对照，以等浓度的V_C作为阳性对照。按以下公式计算ABTS⁺自由基清除率：

$ \text{ABTS}^+\mathrm{自由基清除率}(\text{%})=\left(1-\frac{{\mathrm{A}}_{1}-{\mathrm{A}}_{2}}{{\mathrm{A}}_{3}}\right)\times 100 $

式中：A₁为1 mL样液与5 mL ABTS溶液的吸光度，A₂为1 mL样液与5 mL无水乙醇的吸光度，A₃为1 mL无水乙醇与5 mL ABTS溶液的吸光度。

1.2.7.3　铁离子还原能力的测定

以FRAP法来测定IPTF-C与IPTF-P的总抗氧化能力，主要采用Zali等^[26]的方法，并加以改进。于96孔酶标板中依次加入FRAP试剂150 μL、醋酸盐缓冲液30 μL和浓度梯度的样品溶液20 μL，充分振荡混匀后，避光常温放置5 min后于593 nm波长处测得对应的吸光值。实验中，以1 mmol/L FeSO₄稀释至不同浓度做标准曲线，根据相同吸光值下样品浓度和 Fe²⁺的转换得到FRAP值^[27]。经测定，FeSO₄标准曲线为：y=0.03139+0.085215x，R²=0.99914。

1.3　数据处理

采用Excel2021软件进行基础数据整理与描述性统计，通过Design-Expert 13软件建立响应面回归模型，计算模型预测值与实验值的置信区间（95%）；使用SPSS Statistics 27进行体外抗氧化活性中自由基清除率IC₅₀值的拟合及单因素（ANOVA分析）差异性分析（P<0.05）；使用Origin2024计算均值、标准方差以及作图。实验平行测定三次，取平均值，实验结果以平均值±标准方差表示。

2　结果与分析

收起

2.1　IPTF提取单因素实验结果

2.1.1　超声功率对IPTF提取量的影响

由图1可知，随着超声功率的升高，IPTF提取量出现明显上升趋势，当超声功率为400 W时提取量可达45.77±0.05 mg/g，这是因为在相同的提取时间内，超声功率越大，细胞壁的破碎程度越大，IPTF提取量越高^[28]。继续增大超声功率至450 W，IPTF提取量呈下降趋势，这是因为超声功率的改变可引起空化效应变化，功率过低时使提取不够充分，而过高时会导致空化效应过于剧烈，破坏化学键，引起类黄酮结构的变化，导致其提取量降低^[29]，此结果与周红艳等^[30]在提取瓯柑果皮黄酮提取中的结果一致，因此，选择350、400、450 W为响应面设计中超声功率因素的三个水平。

2.1.2　超声时间对IPTF提取量的影响

由图2可知，超声时间在40~70 min范围内与IPTF提取量呈显著正相关，50~70 min范围上升速度有所减弱，在70 min时达到峰值，总体呈上升趋势，超声波产生空化气泡，能够造成组织损伤和细胞破坏，从而有利于目标化合物从基质中释放^[31]。在70~80 min范围IPTF提取量开始出现下降趋势，当超声时间过长时，各种其他成分陆续溶解，也可能导致黄酮类化合物的热不稳定和降解，总黄酮提取量减小^[32]。该变化趋势与薛婧等^[33]在黄果梨总黄酮的提取中基本一致，其研究同样表明超声时间在40~80 min范围内存在最佳值（70 min），进一步验证了超声时间对黄酮溶出与降解的双向调控作用。因此，选择60、70、80 min为响应面设计中超声时间因素的三个水平。

2.1.3　液料比对IPTF提取量的影响

由图3可知，在液料比为50:1时IPTF提取量达到峰值，为47.76±0.33 mg/g。在50:1~80:1范围内IPTF提取量逐渐下降，且下降速度逐渐缓慢，这是因为低液料比会导致粉末状原料分散不均匀，无法与溶剂相互作用^[34]，因此在一定范围内，增大液料比使得山桐子饼粕与提取溶剂的接触率增大，使IPTF更易溶出。而当液料比大于50:1时，超声波的空化作用受到一定阻碍，可能会伴随着杂质的溶出，降低IPTF提取量，造成有机溶剂的浪费^[35]。该因素的变化趋势与乔孟等^[36]在海棠叶黄酮的提取中相似，提取量在液料比50:1时达最大。因此，选择40:1、50:1、60:1为响应面设计中液料比因素的三个水平。

2.2　IPTF提取响应面优化试验

2.2.1　响应面回归模型的建立

根据上述实验结果，采用Design-Expert软件，以超声时间（A）、超声功率（B）、液料比（C）三个因素为自变量，以提取量为响应值，根据Box-BehnKen模块设计三因素三水平响应面试验，预测超声辅助溶剂提取IPTF的最佳制备工艺。响应面试验设计及结果见表3。

对表3中的试验结果进行多元拟合，得多元二次回归方程：Y=47.91+0.2468A−0.0211B+0.1314C+0.1809AB+0.0462AC−0.0684BC−4.41A²−3.64B²−0.9290C²。

2.2.2　响应面回归模型方差分析

回归模型显著性检验及方差分析见表4。

由表4、图4可知，该回归模型的P值小于0.01，表明模型差异极显著；失拟项P值大于0.05，表明该模型误差小。该模型能准确地反应出超声功率、超声时间、液料比对IPTF提取量的影响，其中，超声时间A及二次项A²、B²、C²极显著地影响IPTF提取量（P<0.01），液料比C与交互项AB显著影响IPTF提取量（P<0.05），其余因素对IPTF提取量影响不显著，说明三个因素对模型的影响依次为超声时间>液料比>超声功率，且超声时间与超声功率两因素交互作用对IPTF提取量有较大影响。

2.2.3　最优工艺参数及验证实验

根据上述分析及Design-Expert软件预测的结果，得到IPTF最优工艺参数。结果显示：超声功率400.134 W，超声时间70.302 min，液料比50.368:1 mL/g，IPTF提取量预测值为47.913 mg/g。结合理论预测和实际应用，优化结果表明：以400 W超声功率，50:1 mL/g液料比处理70 min，重复3次实验，IPTF提取量为47.85±0.05 mg/g。利用选定的最优条件检验模型方程预测最优响应值的适用性，结果吻合度较高，表明该优化工艺具有稳定性和可行性^[37]。

2.3　IPTF纯化实验结果

2.3.1　动态吸附曲线的确定

吸附曲线能反映出大孔树脂对IPTF的吸附能力。当上样体积超过AB-8树脂的动态吸附容量时，流出液中黄酮含量显著增加，表明树脂吸附位点已趋近饱和，导致未被吸附的黄酮泄漏。当流出液吸光度达到上样液吸光度1/10，即到达泄露点，认为此时大孔树脂吸附饱和。如图5所示，流出液体积为150~210 mL时，该范围内流出液泄露百分比均稳定于10%，当流出液体积大于210 mL，流出液泄露百分比均大于10%，因此，选取210 mL作为IPTF最大上样体积。

2.3.2　水洗剂用量的确定

IPTF在大孔树脂中吸附至泄露点后，柱体内仍有部分黄酮未被吸附，使用蒸馏水淋洗柱体可使该部分黄酮流出，同时可以清除柱体内水溶性杂质，减少对IPTF纯度的影响。如图6可见，随着蒸馏水体积的增加，流出液中的黄酮浓度逐渐降低，当蒸馏水体积为200 mL时，流出液中黄酮浓度几乎为0 mg/mL，这表明淋洗已基本完成。高德艳等^[38]使用AB-8大孔树脂纯化从玫瑰花渣中提取的总黄酮，在水洗体积的确定中实验结果为3 BV，与本实验结果相近，因此选择200 mL为蒸馏水淋洗体积。

2.3.3　动态解吸曲线的确定

动态解吸曲线体现了溶剂对大孔树脂吸附IPTF的解吸情况。如图7所示，在解吸液体积为0~110 mL范围内，解吸液内黄酮浓度较低，浓度增长缓慢，这表明在该范围内有较少的IPTF从大孔树脂中解吸；在解吸液体积110~300 mL范围内，解吸液黄酮浓度迅速上升，在130 mL时达到最大，这表明此时大量的IPTF从大孔树脂中解吸，后迅速下降，至300 mL处黄酮浓度逐渐趋于0 mg/mL，解吸液几乎为无色；在解吸液体积为400 mL时，黄酮浓度为0 mg/mL，继续增大解吸液体积黄酮浓度无明显波动，这表明此时大孔树脂的解吸已基本完成，后续解吸液不再具有收集价值。该变化趋势与叶佳丰等^[39]使用AB-8大孔树脂纯化油茶蒲总黄酮中解吸体积的测定实验结果基本一致，因此，选取400 mL作为解吸液体积。

2.3.4　IPTF纯度分析

收集解吸液，旋转蒸发至原体积1/10，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得IPTF-P，结果表明，经AB-8大孔树脂纯化，IPTF纯度可得到一定提升，具体结果见表5。

2.3.5　LC-MS/MS对IPTF-P的鉴定结果

质谱检测在数据依赖性采集（DDA）模式下完成，循环扫描次数设置为10次，阶梯式归一化碰撞能量（HCD）参数分别为10、28和35 eV。一级质谱的扫描质量范围覆盖100~1500 m/z，采用70000全高宽分辨率，自动增益控制目标值设定为3×10⁶，离子注入时间维持200 ms。二级质谱检测时分辨率调整为7500，自动增益控制目标值降低至1×10⁶，离子注入时间缩减为50 ms。实验分别在正、负离子模式下获取基峰色谱图（图8、图9）。

LC-MS/MS原始数据通过Compound Discoverer 3.2（Thermo Fisher Scientific）平台进行多元数据库联用分析，涵盖ChemSpider植物库、CHEBI、CHEMBL、天然产物及黄酮专用库等数据库资源。基于mzCloud与mzVault的Best Match算法对MS/MS谱图进行匹配度评分，筛选MS²碎片离子匹配阈值>80%的化合物作为有效鉴定成分，具体鉴定数据详见表6。

因此，初步确定IPTF中的黄酮类物质为槲皮素、槲皮素-3-O-芸香苷、桑黄素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、表儿茶素、白皮杉醇葡萄糖苷、芍药苷-3-O-β-半乳糖苷。

2.4　IPTF体外抗氧化活性实验结果

2.4.1　DPPH自由基清除能力结果分析

在检测DPPH自由基清除能力时，抗氧化化合物会通过氢原子供体机制与DPPH自由基反应，导致颜色从紫色变为黄色^[40]，由吸光度可计算出该样品对DPPH自由基的清除能力。由图10可知，IPTF-P的DPPH自由基清除率在各质量浓度下均大于IPTF-C，这表明在经大孔树脂纯化后，IPTF对DPPH自由基的清除能力得到提升。随着质量浓度的增大，IPTF对DPPH自由基清除率随之增大，当IPTF-P质量浓度为0.6 mg/mL时，清除率可达96.84%，与同浓度下V_C的DPPH自由基清除率99.99%相接近。经拟合线性方程计算，IPTF-C的IC₅₀值为0.086 mg/mL，IPTF-P的IC₅₀值为0.057 mg/mL，这表明IPTF在纯化后具有更加良好的DPPH自由基清除能力。

2.4.2　ABTS^＋自由基清除能力结果分析

ABTS⁺自由基是一种以氮为中心的合成自由基阳离子，通过ABTS^＋与过硫酸钾氧化产生^[41]。由图11可知，随着质量浓度的增加，IPTF-C与IPTF-P对ABTS^＋自由基的清除率随之增加。在IPTF-C质量浓度为0.6 mg/mL时，ABTS^＋自由基清除率达99.67%，与同质量浓度下的V_C的清除率无明显差异，表明IPTF-C在较高浓度时具有良好的ABTS^＋自由基清除能力。当IPTF-P质量浓度为0.2 mg/mL时，清除率可达97.96%，且在0.2~0.6 mg/mL范围内，IPTF-P与V_C的清除率差异始终小于3%，表明IPTF本身具有良好的ABTS^＋自由基清除能力，且经大孔树脂纯化后该能力得到提升。经拟合线性方程计算，IPTF-C的IC₅₀值为0.034 mg/mL，IPTF-P的IC₅₀值为0.033 mg/mL。

2.4.3　铁离子还原能力的测定结果

FRAP法是指在酸性低pH环境下，抗氧化剂会将Fe³⁺/亚铁氰化物络合物还原成Fe²⁺/亚铁氰化物，而Fe²⁺/亚铁氰化物呈深蓝色，可用于样品FRAP值的测定指标^[42]。由图12可知，在低浓度时，如0.2 mg/mL，IPTF-C与IPTF-P的FRAP值相差较小。随着质量浓度的提升，IPTF-C与IPTF-P的FARP值都随之增大，且同浓度下二者差值也随之增大，这表明经大孔树脂纯化后IPTF-P在高质量浓度下的铁离子还原能力得到有效提升。当IPTF-P浓度为2 mg/mL时，其FARP值达13.68 mmol/L，较IPTF-C提高62.9%。

3　结论

收起

山桐子饼粕作为油脂加工副产物，其高值化利用对农产品深加工产业链延伸具有重要意义。基于超声辅助提取与响应面优化，确定最佳工艺条件为超声功率400 W、液料比50:1 mL/g、超声时间70 min，IPTF提取量达47.85±0.05 mg/g；经AB-8大孔树脂纯化后，IPTF纯度由21.69%提升至39.06%；经LC-MS/MS分析，IPTF内主要的黄酮物质为：槲皮素、槲皮素-3-O-芸香苷、桑黄素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、表儿茶素、白皮杉醇葡萄糖苷、芍药苷-3-O-β-半乳糖苷。体外抗氧化试验显示，纯化后IPTF-P的DPPH自由基清除能力（IC₅₀=0.057 mg/mL）较纯化前IPTF-C（IC₅₀=0.086 mg/mL）显著增强，且在FRAP铁还原能力评估中，2 mg/mL浓度下IPTF-P的还原力达13.68 mmol/L，较IPTF-C提高62.9%，表明纯化工艺可有效富集活性成分。

尽管研究证实了山桐子粕饼黄酮的抗氧化潜力，但仍需关注以下局限性，一方面，现有LC-MS/MS仅实现主要黄酮成分的初步鉴定，缺乏单体化合物含量测定及核磁共振结构验证；另一方面，大孔树脂纯化后纯度仍较低，需开发组合纯化策略；此外，抗氧化活性的探究局限于体外，未能充分说明IPTF在体内的抗氧化及其他活性。后续将聚焦于上述不足进行深入研究，探索山桐子饼粕黄酮类物质在功能性食品或药物开发中的应用潜力。

参考文献

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文献

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2026年第47卷第5期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030330

接收时间：2025-03-25
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-03-01

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收稿日期：2025-03-25

基金

作者信息

¹湖北民族大学生物与食品工程学院，湖北恩施 445000

²西南大学食品科学学院，重庆 400715

通讯作者:

黄秀芳（1979−），女，硕士，实验师，研究方向：食品质量与安全，E-mail：2973925187@qq.com。

阚建全（1965−），男，博士，教授，研究方向：食品化学与营养学、食品质量与安全，E-mail：ganjq1965@163.com。

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/spgykj/CN/10.13386/j.issn1002-0306.2025030330

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

水平	因素
−1	60	350	40:1
0	70	400	50:1
1	80	450	60:1

水平

因素

A超声时间（min）

B超声功率（W）

C液料比（mL/g）

−1

350

40:1

400

50:1

450

60:1

时间（min）	A（%）	B（%）
0~1	90	10
1~13	90→0	10→100
13~17	0	100
17~17.1	0→90	100→10
17.1~20	90	10

时间（min）

A（%）

B（%）

0~1

1~13

90→0

10→100

13~17

100

17~17.1

0→90

100→10

17.1~20

试验号	因素	提取量（mg/g）
1	60	400	40:1	42.6079
2	70	450	60:1	43.4499
3	80	450	50:1	40.5625
4	60	450	50:1	39.6743
5	70	400	50:1	47.9638
6	80	400	60:1	43.1524
7	80	350	50:1	40.2007
8	70	400	50:1	47.9309
9	70	350	40:1	43.0816
10	80	400	40:1	42.9763
11	70	400	50:1	47.8322
12	70	400	50:1	48.0125
13	60	350	50:1	40.0362
14	70	400	50:1	47.7993
15	70	350	60:1	43.6709
16	70	450	40:1	43.1342
17	60	400	60:1	42.5992

试验号

因素

提取量（mg/g）

A（min）

B（W）

C（mL/g）

400

40:1

42.6079

450

60:1

43.4499

450

50:1

40.5625

450

50:1

39.6743

400

50:1

47.9638

400

60:1

43.1524

350

50:1

40.2007

400

50:1

47.9309

350

40:1

43.0816

400

40:1

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400

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50:1

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400

50:1

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350

60:1

43.6709

450

40:1

43.1342

400

60:1

42.5992

来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	143.978	9	16	1058.28	<0.0001	**
A	0.4872	1	0.4872	32.23	0.0008	**
B	0.0035	1	0.0035	0.2348	0.6428	−
C	0.1438	1	0.1438	9.51	0.0177	*
AB	0.1309	1	0.1309	8.66	0.0216	*
AC	0.0085	1	0.0085	0.5648	0.4768	−
BC	0.0187	1	0.0187	1.24	0.3026	−
A²	72.33	1	72.33	4785.04	<0.0001	**
B²	55.93	1	55.93	3699.79	<0.0001	**
C²	3.63	1	3.63	240.41	<0.0001	**
残差	0.1058	7	0.0151
失拟	0.0737	3	0.0246	3.06	0.1541	−
纯误差	0.0321	4	0.008
合计	144.08	16

来源

平方和

自由度

均方

F值

P值

显著性

模型

143.978

1058.28

<0.0001

0.4872

32.23

0.0008

0.0035

0.2348

0.6428

−

0.1438

9.51

0.0177

0.1309

8.66

0.0216

0.0085

0.5648

0.4768

−

0.0187

1.24

0.3026

−

A²

72.33

4785.04

<0.0001

B²

55.93

3699.79

<0.0001

C²

3.63

240.41

<0.0001

残差

0.1058

0.0151

失拟

0.0737

0.0246

3.06

0.1541

−

纯误差

0.0321

0.008

合计

144.08

样品	吸光度（A）	黄酮浓度（mg/mL）	纯度（%）
IPTF-C	0.822±0.041	0.434±0.022	21.69±1.08
IPTF-P	1.482±0.037	0.781±0.020	39.06±0.99

样品

吸光度（A）

黄酮浓度（mg/mL）

纯度（%）

IPTF-C

0.822±0.041

0.434±0.022

21.69±1.08

IPTF-P

1.482±0.037

0.781±0.020

39.06±0.99

检测模式	英文名	中文名	分子式	m/z	MS²碎片离子	保留时间（min）	鉴定打分（mzCloud/mzVault）
正离子	Quercetin	槲皮素	C₁₅H₁₀O₇	303.04922	303.04913，147.04362，123.04384	8.001	83.6/73.2
正离子	Quercetin-3-O-rutinoside	槲皮素-3-O-芸香苷	C₂₇H₃₀O₁₆	611.15906	303.04898，85.0282，304.05252	/	80.9/84.9
正离子	Morin	桑黄素	C₁₅H₁₀O₇	303.04922	303.04919，147.04381，229.04959	8.38	82.2/67.7
正离子	Quercetin-3-O-glucoside	槲皮素-3-O-葡萄糖苷	C₂₁H₂₀O₁₂	465.10193	303.04901，85.02826，123.04399	8.386	75.7/87.3
正离子	Epicatechin	表儿茶素	C₁₅H₁₄O₆	291.08585	147.04378，119.04891，131.04901	10.18	−/73.5
正离子	Astringin	白皮杉醇葡萄糖苷	C₂₀H₂₂O₉	407.13275	135.04378，245.0802，123.04378	5.134	70.4/84.9
正离子	Peonidin-3-O-beta-galactoside	芍药苷-3-O-β-半乳糖苷	C₂₂H₂₃O₁₁Cl	463.12228	301.06976，286.04605，147.0437	8.855	82.1/88.5
负离子	Quercetin-3-O-glucoside	槲皮素-3-O-葡萄糖苷	C₂₁H₂₀O₁₂	463.08865	300.02762，463.08682，301.03412	8.379	73.2/73.5

检测模式

英文名

中文名

分子式

m/z

MS²碎片离子

保留时间
（min）

鉴定打分
（mzCloud/mzVault）

正离子

Quercetin

槲皮素

C₁₅H₁₀O₇

303.04922

303.04913，147.04362，123.04384

8.001

83.6/73.2

正离子

Quercetin-3-O-rutinoside

槲皮素-3-O-芸香苷

C₂₇H₃₀O₁₆

611.15906

303.04898，85.0282，304.05252

80.9/84.9

正离子

Morin

桑黄素

C₁₅H₁₀O₇

303.04922

303.04919，147.04381，229.04959

8.38

82.2/67.7

正离子

Quercetin-3-O-glucoside

槲皮素-3-O-葡萄糖苷

C₂₁H₂₀O₁₂

465.10193

303.04901，85.02826，123.04399

8.386

75.7/87.3

正离子

Epicatechin

表儿茶素

C₁₅H₁₄O₆

291.08585

147.04378，119.04891，131.04901

10.18

−/73.5

正离子

Astringin

白皮杉醇葡萄糖苷

C₂₀H₂₂O₉

407.13275

135.04378，245.0802，123.04378

5.134

70.4/84.9

正离子

Peonidin-3-O-beta-galactoside

芍药苷-3-O-β-半乳糖苷

C₂₂H₂₃O₁₁Cl

463.12228

301.06976，286.04605，147.0437

8.855

82.1/88.5

负离子

Quercetin-3-O-glucoside

槲皮素-3-O-葡萄糖苷

C₂₁H₂₀O₁₂

463.08865

300.02762，463.08682，301.03412

8.379

73.2/73.5