食品工业科技

基因	正向引物（5’→3’）	反向引物（5’→3’）
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Occudin	CCAATGTCGAGGA GTGGG	CGCTGCTGTAACGAGGCT
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基因

正向引物（5’→3’）

反向引物（5’→3’）

GAPDH

GGGGTCGTTGATGG
CAACA

AGGTCGGTGTGAA
CGGATTTG

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CACTTGTTTTGCC
AGGTTTTA

Occudin

CCAATGTCGAGGA
GTGGG

CGCTGCTGTAACGAGGCT

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基因	正向引物（5’→3’）	反向引物（5’→3’）
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基因

正向引物（5’→3’）

反向引物（5’→3’）

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Hex2Fuc1-2	489.18814	86.8597	0.07
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寡糖

相对分子质量

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纯度（%）

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Hex2Fuc1-2

489.18814

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0.39

羊乳寡糖与两歧双歧杆菌协同改善肠屏障功能及抗炎活性的研究

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杨卓 , 伍琪 , 阮想 , 李梦琪 , 杨旭 , 李邱 , 任静 ^*

食品工业科技 | 营养与保健 2026,47(6): 397-406

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食品工业科技 |营养与保健 2026 , 47 (6) : 397 -406

羊乳寡糖与两歧双歧杆菌协同改善肠屏障功能及抗炎活性的研究

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杨卓（2000−），女，硕士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：y00008307410@163.com

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杨卓（2000−），女，硕士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：y00008307410@163.com

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杨卓, 伍琪, 阮想, 李梦琪, 杨旭, 李邱, 任静^*

作者信息

东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030

通讯作者:

任静（1979−），女，博士，副教授，研究方向：畜产品加工工程，E-mail：jingren@neau.edu.cn。

作者简介:

杨卓（2000−），女，硕士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：y00008307410@163.com

Research on the Synergistic Improvement of Intestinal Barrier Function and Anti-inflammatory Activity by Goat Milk Oligosaccharides and Bifidobacterium bifidum

Zhuo YANG, Qi WU, Xiang RUAN, Mengqi LI, Xu YANG, Qiu LI, Jing REN^*

Affiliations

Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

出版时间: 2026-03-15 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030107

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摘要

收起

本研究主要以从羊乳中分离的羊乳寡糖（Goat Milk Oligosaccharides，GMOs）与两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum ATCC15696，BB）为原材料，通过构建Caco-2:HT-29MIX细胞肠上皮屏障及炎症损伤模型，探究了单独的GMOs与BB以及二者协同作用对肠屏障完整性与通透性以及对炎症因子表达量的影响。结果表明，单独的GMOs以剂量依赖的方式显著提高跨膜电阻（Transepithelial Electrical Resistance，TEER），抑制炎症因子的分泌与促进紧密连接蛋白的表达，且作用效果优于单独的BB。而GMOs与BB协同作用时其效果更为显著（P<0.01），当作用浓度为10.0 mg/mL时，TEER值的变化率较GMOs组提升1.62%~3.27%（P<0.01），IL-6、IL-8与TNF-α表达量分别显著降低（2.11~14.93 ng/L）、（7.42~16.27 ng/L）与（7.03~12.29 ng/L）（P<0.05），而Claudin-1、ZO-1和Occludin三种紧密连接蛋白的表达量提升1.0~2.0倍（P<0.001）。总体而言，单独的GMOs与BB能够改善肠道屏障功能与抑制炎症因子的分泌，但GMOs与BB协同作用效果更显著，且当作用浓度为10.0 mg/mL时对屏障功能的恢复效果最佳，并显著抑制了炎症因子的表达。

关键词

羊乳寡糖 / 唾液乳糖 / 两歧双歧杆菌 / 肠屏障功能 / 抗炎作用

Abstract

收起

This study used goat milk oligosaccharides (GMOs) isolated from goat milk and Bifidobacterium bifidum ATCC15696 (BB) as raw materials. By constructing a Caco-2:HT-29MIX cell intestinal epithelial barrier and an inflammation injury model, the effects of GMOs alone, BB alone, and their synergistic interaction on intestinal barrier integrity, permeability, and the expression levels of inflammatory cytokines were investigated. The results showed that GMOs alone markedly increased transepithelial electrical resistance (TEER) in a dose-dependent manner, inhibited the secretion of inflammatory factors and promoted the expression of tight junction proteins, and the effect was superior to that of BB. However, GMOs and BB acted in synergy, the effect was more significant (P<0.01). When the action concentration was 10.0 mg/mL, the change rate of the TEER increased by 1.62%~3.27% compared with the GMOs group (P<0.01). The expression levels of IL-6, IL-8, and TNF-α decreased (2.11~14.93 ng/L), (7.42~16.27 ng/L) and (7.03~12.29 ng/L) (P<0.05), respectively. The expression levels of the three tight junction proteins, claudin-1, ZO-1 and occludin, increased by 1.0~2.0 times (P<0.001). Overall, individual GMOs and BB could improve the intestinal barrier function and inhibit the secretion of inflammatory factors. However, the synergistic effect of GMOs and BB was more significant, with the best recovery effect on barrier function and a significant inhibition of inflammatory factor expression at a concentration of 10.0 mg/mL.

Key words

goat milk oligosaccharides / sialyllactose / Bifidobacterium bifidum / intestinal barrier function / anti-inflammatory effect

引用本文

杨卓, 伍琪, 阮想, 李梦琪, 杨旭, 李邱, 任静. 羊乳寡糖与两歧双歧杆菌协同改善肠屏障功能及抗炎活性的研究. 食品工业科技, 2026 , 47 (6) : 397 -406 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030107

Zhuo YANG, Qi WU, Xiang RUAN, Mengqi LI, Xu YANG, Qiu LI, Jing REN. Research on the Synergistic Improvement of Intestinal Barrier Function and Anti-inflammatory Activity by Goat Milk Oligosaccharides and Bifidobacterium bifidum[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026 , 47 (6) : 397 -406 . DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030107

正文

收起

近年来，随着对疾病发病机制的深入研究，肠道屏障功能在维持机体健康中的关键作用逐渐受到广泛关注^[1]。作为维持肠道稳态的关键防御系统，肠道屏障结构的完整性在抵御病原体入侵、调节免疫应答和维持肠道微环境平衡中发挥着决定性作用。研究表明，受到外界因子刺激可引发屏障功能损伤，会导致黏液层厚度出现异常和屏障通透性增加，使致病性病原体能够突破防线与肠上皮细胞直接接触，从而引发一系列的免疫反应^[2−3]。例如，肠道屏障受损后，细菌和毒素可渗透至肠黏膜固有层，激活固有层免疫细胞，释放大量炎症因子（如IL-1β、TNF-α等）和蛋白酶，可直接破坏肠屏障的紧密连接蛋白（如claudin、occludin），进一步加剧炎症反应。肠屏障受损是早产儿需要特别关注的问题，因为它会增加坏死性小肠结肠炎的风险^[4]。与配方乳粉喂养的婴儿相比，母乳喂养的婴儿肠道渗透性下降更快，这表明母乳含有有助于肠屏障功能成熟的组分^[5]。

母乳寡糖（Human Milk Oligosaccharides，HMOs）是母乳中第三大生物活性成分，对婴儿肠道健康发展起着至关重要的作用^[6−7]。然而，当前市场上婴儿配方乳粉中所添加的HMOs主要是人工合成的，其由于合成工艺复杂、生产成本高昂以及种类单一等问题，难以充分模拟母乳中HMOs的多样性和功能特性。因此，开发更经济、天然且与HMOs功能更接近的寡糖来源，已成为婴儿配方奶粉强化剂研究的重要方向。羊乳寡糖（Goat Milk Oligosaccharides，GMOs）在结构、功能和应用潜力上与HMOs高度相似。目前研究中，已在羊乳中鉴定出超过50种GMOs，其核心寡糖组分包含HMOs的主要结构类型，且在分子组成和结构特征上与HMOs高度相似，可能是HMOs的理想替代来源^[8]。体外研究表明，单独的GMOs能够促进双歧杆菌（Bifidobacterium）在肠上皮的黏附，而将Bifidobacterium与GMOs协同培养后，发现Bifidobacterium对肠细胞的黏附能力提升了8.3倍，对致病菌的定植起到了抑制作用^[9]。此外在一项针对断奶小鼠的研究中进一步证实，GMOs的摄入能够显著增加肠道内Bifidobacterium的数量，有效促进肠道健康^[10]。这些研究结果共同表明，GMOs与Bifidobacterium之间具有显著的协同效应，不仅能够抑制病原菌的定植，还能调节肠道菌群分布，为开发基于GMOs的婴儿配方奶粉提供了重要的科学依据。

目前，关于益生元-益生菌协同作用的研究主要集中在肠道菌群调节效应方面，而针对肠屏障功能调控的机制研究仍明显不足。然而，由于伦理的限制和技术瓶颈，直接评估人体肠道屏障结构和功能仍面临诸多挑战^[11]。因此，建立可靠的体外模型已成为研究肠道屏障功能的重要手段，相较于传统的人直肠癌细胞Caco-2单层细胞模型，人结肠癌细胞HT-29与Caco-2共同培养模型克服了Caco-2单层细胞模型通透性过高与缺乏黏液分泌的问题，形成的单层上皮结构形态与功能特征和人体肠道上皮结构高度相似^[12]。因此，本研究主要以从山羊乳中分离的GMOs与两歧双歧杆菌标准菌株（Bifidobacterium bifidum ATCC-15696，简称BB）为原材料，使用LPS 刺激Caco-2：HT-29MIX细胞形成炎症损伤模型，研究单独的GMOs与BB以及二者协同发酵产物对肠屏障的完整性与通透性以及相关炎症因子表达量的影响，该研究重点揭示了GMOs与BB协同增效效应对肠道屏障保护作用机制，也为其在肠道健康领域的应用提供了重要的理论依据。

1　材料与方法

收起

1.1　材料与仪器

山羊乳汁　黑龙江省哈尔滨市幸福人家牧场提供；Bifidobacterium bifidum ATCC-15696 上海微生物菌种保藏中心，保存在−80 ℃超低温环境；人直肠癌Caco-2细胞与人结肠癌HT-29细胞　东北农业大学乳品工程重点实验室提供；TPY液体培养基　青岛海博生物科技有限公司；高糖培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM）　 Gibco公司；PBS　武汉赛维尔生物科技有限公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、青链霉素混合液、0.5%胰蛋白酶-EDTA消化液　北京索莱宝科技有限公司；IL-6、IL-8、TNF-α、NO试剂盒　南京建成生物工程研究所；CCK-8 试剂盒　上海碧云天生物技术有限公司；12孔Transwell 悬挂式细胞培养皿　美国 Corning 公司。

HF90型CO₂细胞培养箱　上海力申科学仪器有限公司；Concept厌氧工作站　英国Ruskinn公司；SpectraMax i3x多功能酶仪　美谷分子仪器（上海）有限公司；Opticlean-1300 洁净工作台　力康精密科技（上海）有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　GMOs的分离

在Bondue等^[13]的方法基础上进一步改进，将山羊乳汁经过脱脂与脱蛋白处理后，采用G-10葡聚糖凝胶过滤层析法富集寡糖成分并结合高分辨质谱技术进行寡糖成分鉴定与分析，获得主要以唾液乳糖为原料的寡糖组分。

1.2.2　细胞复苏与培养

从液氮中取出细胞，置于37 ℃水浴锅中快速融化，并转移至新的离心管内，加入等体积的DMEM培养基充分混匀。在1000 r/min条件下离心5 min，弃掉上清液，将细胞重悬后接种至T25培养瓶中隔夜培养。待细胞贴壁长满单层后，使用PBS缓冲液清洗两次，加入1.0 mL 0.5%胰酶消化培养，并转至新的T25瓶中传代培养。

1.2.3　细胞毒性检测

为确定不同处理组的干预浓度，参考欧洲安全局规定的唾液乳糖的添加浓度^[14−15]，用基础的DMEM培养基稀释四个不同处理组，即：GMOs、BB、GMOs与BB、GMOs与BB协同培养的上清液（Cell-free Probiotic Supernatant with GMOs，CFSM），得到了不同浓度（0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL）的干预液。

在96孔板中，每孔接种100 μL Caco-2:HT-29（接种体积比例为7:3）MIX细胞悬液，培养24 h形成单层后，弃去孔中的上清液，用PBS溶液清洗2次。每孔加入100 μL的干预液，将细胞板放于CO₂细胞培养箱中孵育24 h后重复操作，再向孔中加入10 μL CCK-8试剂和100 μL无血清培养基，培养30 min。用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度（Optical Density，OD）。公式为：

$ \text{细胞存活率}(\text{%})=\left(\frac{{\text{OD}}_{\mathrm{s}}-{\text{OD}}_{\mathrm{b}}}{{\text{OD}}_{\mathrm{c}}-{\text{OD}}_{\mathrm{b}}}\right)\times 100 $

式中：OD_s：实验孔吸光度；OD_b：空白组吸光度；OD_c：阴性对照组吸光度。

1.2.4　细胞共培养与Transwell模型的建立

将培养好的 Caco-2 和 HT-29细胞重悬于培养基内，预以5×10⁴个/孔的密度接种至细胞小室的上室中，并加入10% FBS的DMEM培养基0.5 mL，同时在下室内加入1.5 mL培养基。细胞培养期间，每次更换细胞培养液时用细胞电阻仪测定电阻值并记录，由下面公式计算单层细胞的跨膜电阻值（Transepithelial Electrical Resistance，TEER）。

$ \mathrm{TEER}=(\mathrm{A}-{\mathrm{A}}_{0})\times \mathrm{S} $

式中：A：测定电阻值；A₀：空白值；S：小室膜面积。

1.2.5　细胞受损模型的建立与评估

用DMEM基础培养基稀释一系列浓度（各浓度为0.0、0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025、0.005和0.050 mg/mL）的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），将不同浓度的LPS溶液作用于根据1.2.4方法建立的细胞模型的AP侧，置于CO₂培养箱内培养56 h，每个实验组设置3个平行。随后利用1.2.3的公式，计算细胞的存活率。

1.2.6　GMOs与BB对Caco-2:HT-29MIX细胞的干预

当混合细胞模型构建完成后，用基础的DMEM培养基稀释一定浓度的LPS与单独的GMOs、BB、GMOs-BB、CFSM干预液。同时，使用PBS清洗2次共培养细胞，并在无FBS的DMEM基础培养基中进行24 h的血清饥饿处理。使混合细胞的AP侧暴露在0.0025 mg/mL的LPS同时，用不同浓度的干预液处理56 h，并设置不含炎症因子的Caco-2:HT-29MIX细胞为空白对照组（Control，CON），只含有LPS的细胞实验组为阴性对照组。为避免细胞自身TEER值在Transwell小室的不同孔中存在的差异及其随时间的自然变化对实验结果的影响，通过测量每孔自身的TEER值对比计算TEER电阻值的变化率。公式为：

$ \mathrm{M}(\text{%})=\frac{{\text{TEER}}_{\text{处理}}}{{\text{TEER}}_{\text{空白}}}\times 100 $

式中：M为TEER值变化率； TEER_处理为LPS刺激56 h后的TEER值；TEER_空白为LPS刺激0 h的TEER值。

1.2.7　碱性磷酸酶的活性

按照 1.2.4的方法建立好细胞模型后，分别从顶端侧（Apical Side，AP）和基底侧（Basolateral Side，BL）收集培养基，在1000 r/min/的条件下离心5 min后取上清液，使用碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）试剂盒测定其酶活性。公式为：

$\begin{split} &\text{培养基中AKP活性}=\frac{{\text{OD}}_{\text{实测}}-{\text{OD}}_{\text{空白}}}{{\text{OD}}_{\text{标准}}-{\text{OD}}_{\text{空白}}}\times \\&\text{标准品浓度}\times 100\;\mathrm{mL}\times \text{稀释倍数} \end{split}$

式中：OD_实测为样品孔吸光度；OD_标准为标准孔吸光度；OD_空白为空白组吸光度；标准品为酚标准溶液（浓度为0.1 mg/mL）。

1.2.8　GMOs与BB对细胞膜通透性的影响

模型经LPS与单独的GMOs、BB、GMOs-BB、CFSM干预处理后，分别用预热的Hank’s平衡盐缓冲液（Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS）清洗AP侧和BL侧。随后，在AP侧加入0.5 mL浓度为20 μg/mL的荧光黄素溶液，BL侧加入1.0 mL HBSS缓冲液，并将细胞置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中孵育。在0.5 h和1 h时，分别从BL侧吸取100 μL样品，并补充相同体积的空白HBSS。培养完成后，在激发波长427 nm和发射波长526 nm下测定荧光强度，并计算荧光强度和荧光黄素的表观渗透系数（Apparent Permeability Coefficient，Papp）。

$ \mathrm{Papp}=\frac{\text{dQ}/\text{dt}}{\mathrm{A}{\mathrm{C}}_{0}} $

式中，dQ/dt为单位时间荧光黄素转运量（μg/mL·s⁻¹）；A为有效膜面积（1.12 cm²）；C₀为荧光黄素的初始浓度（20 μg/mL）。

1.2.9　Caco-2:HT-29MIX细胞中紧密连接蛋白mRNA的表达

收集Transwell小室中的细胞培养液，按照EZ-10总RNA提取试剂盒说明书进行总RNA提取。使用超微紫外分光光度计测定RNA浓度，随后通过逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用罗氏Light Cycler 480 Ⅱ PCR仪进行荧光定量分析，建立20 μL反应体系。qPCR引物序列详见表1，以GAPDH作为内参基因，每个样本设置3个平行对照。

1.2.10　IL-6、IL-8与TNF-α分泌量测定

将AP与BL侧的培养液在2500 r/min条件下离心20 min，收集上清液用于检测。使用 ELISA试剂盒分别对炎症损伤模型的AP和BL侧培养液中的IL-6、IL-8与TNF-α分泌量进行检测，根据试剂盒提供的说明书建立标准曲线，并以ng/L为单位对三种因子进行定量。

1.2.11　NO分泌量的测定

将NO检测试剂盒置于室温平衡30 min，将细胞悬液以2500 r/min离心20 min，留细胞沉淀，并用PBS缓冲液冲洗2次，超声破碎细胞后在2500 r/min条件下离心10 min取上清液，根据试剂盒提供的说明书利用比色法测定NO浓度，从而评估细胞中NO的分泌量。

1.3　数据处理

每组实验均重复3次，数据用平均值±标准偏差表示，Origin 2024软件绘图，数据之间的差异采用IBM SPSS Statistics 27 软件进行单因素方差分析，P<0.05，差异显著。

2　结果与分析

收起

2.1　GMOs的分离

根据1.2.1的方法对GMOs 进行分离纯化与鉴定，获得以唾液乳糖为主要成分的寡糖混合物，各寡糖的相对分子质量、相对丰度与纯度如表2所示。

2.2　GMOs协同BB对Caco-2:HT-29MIX的细胞毒性的影响

为了确定GMOs与BB协同作用的最佳干预浓度，本研究依据国家食品安全标准中Bifidobacterium的推荐添加浓度^[16]（7 lg CFU/mL），设置了单独的GMOs与BB以及二者协同培养的处理组。随后，通过CCK-8试验评估不同浓度的GMOs、BB、GMOs-BB与CFSM 对已分化细胞的毒性作用，实验结果如图1所示。与空白对照组相比，在各浓度（0.5~10.0 mg/mL）下GMOs提升了Caco-2:HT-29MIX细胞的存活率，表明GMOs对肠道细胞具有一定的积极作用，并未表现出细胞毒性；经BB处理的细胞在0.5~4.0 mg/mL浓度范围内对细胞存活起到了促进作用，然而当处理浓度进一步升高时则表现细胞存活率下降出现凋亡，这可能是由于Bifidobacterium在有限空间内占据了细胞生长所需的空间，从而限制了细胞的正常生长^[17−18]；而经过GMOs-BB与CFSM组处理的细胞在0.5~6.0 mg/mL浓度范围内促进了细胞生长，但随着浓度继续增加，细胞存活率略有下降，这可能是因为BB代谢GMOs产生的短链脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFAs）在低浓度时促进细胞增殖，而在高浓度时抑制细胞生长或诱导细胞凋亡^[19−20]。在0.5~10.0 mg/mL浓度范围内，上述处理方法在特定条件下对细胞生长表现出轻微的毒性作用，但作用效果并不显著，细胞的存活率仍>95%，适合用于后续实验研究。

2.3　肠上皮细胞受损模型的建立

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种特有成分，因其能够模拟细菌感染诱导的炎症反应，且具有高度的重现性和测量的方便性，被广泛应用于建立肠道屏障损伤模型^[19]。为了确定LPS诱导的Caco-2:HT-29MIX细胞导致肠屏障受损的最佳浓度，分别使用不同浓度的LPS处理细胞56 h，通过CCK-8试验评估对细胞存活率的影响，结果如图2所示。当LPS浓度在0.0005~0.0015 mg/mL时，细胞的存活率随LPS的浓度增加而出现降低，但存活率仍>90%；当LPS浓度达到0.0025 mg/mL时，细胞增殖受到明显抑制，此时细胞存活率<70%，表明该浓度能够有效诱导肠上皮损伤，同时未造成过度细胞死亡。但随着LPS浓度继续增加，会导致细胞大量死亡，表明高浓度LPS对细胞具有强烈的毒性作用。基于上述结果，本研究选择0.0025 mg/mL LPS刺激56 h作为建立肠屏障损伤模型的最佳条件。这一浓度既能有效模拟炎症诱导的肠屏障损伤，又可避免因细胞过度死亡而影响后续实验的稳定性和可重复性。

2.4　GMOs协同BB对肠上皮细胞跨膜电阻值的影响

在建立细胞模型时，TEER值逐渐增加，当增加至200~500 Ω·cm²之间时，表明Caco-2:HT-29MIX细胞已成功分化为具有极性的单层上皮结构，可用于后续实验研究^[21]。图3A可知，在0~12 d时Caco-2:HT-29MIX细胞的TEER值逐渐增加，在13 d时TEER值达到了200 Ω·cm²，并增长至第18 d后趋于稳定，表明肠上皮屏障模型建立成功，可用于后续实验研究。由图3B可知，与GMOs和BB处理组相比，经GMOs-BB和CFSM干预培养56 h后，低、中、高浓度均能显著提高细胞屏障的TEER值，使TEER值的变化率增加，增强肠屏障的完整性（P<0.05）。相比之下，单独使用的GMOs仅在较高浓度下对细胞屏障的TEER值产生显著影响，当处理浓度为10.0 mg/mL时，使LPS诱导的损伤模型TEER值的变化率恢复至对照组的73.83%±2.95%，表明GMOs对细胞TEER值的影响具有剂量依赖效应（P<0.05）；当单独使用BB时，未能有效抑制LPS引起的TEER值下降；当GMOs与BB协同作用时，随着处理浓度的增加细胞屏障的TEER值的变化率呈现出先增加后降低的动态变化趋势。这可能是因为GMOs与BB在0.5~4.0 mg/mL浓度范围内通过协同调控紧密连接蛋白表达和细胞间信号通路，增强了肠道屏障功能；然而，当浓度升高至10.0 mg/mL时，可能因代谢副产物的过度累积最终对肠道屏障功能产生抑制作用^[22]，然而其TEER值的变化率较GMOs组仍提升1.62%~3.27%（P<0.01）。TEER值是肠上皮屏障功能完整性和紧密性的非特异性标志物，反映了细胞渗透性和紧密连接蛋白的状态^[23]。与LPS处理组相比，经GMOs、GMOs-BB与CFSM处理的样品TEER值的显著增加（P<0.01），表明这些处理对细胞的紧密性有显著的增强作用。

2.5　GMOs协同BB对肠屏障碱性磷酸酶的影响

AKP的活力水平能够反映细胞的分化和成熟程度，是肠道黏膜通透性的主要调节因子。在成功构建Caco-2：HT-29MIX细胞模型后，该模型可分化为类似小肠粘膜上皮结构，而AKP通常存在于肠上皮细胞的刷状缘（即AP侧），当AP与BL的AKP比值（即AP/BL）处于4.0~7.0范围内，说明细胞在培养过程中成功地实现了极化，形成了类似于体内组织的结构和功能特征。因此，通过检测Transwell小室AP与BL侧AKP含量可以评估模型的建立情况^[12,24]，结果如图4A。

在模型建立初期，AP/BL的值为2.4；当细胞模型培养至7 d时，此时AP/BL的值约为3.5，随着培养时间的延长，模型进一步分化；在第14 d时，AP/BL值约为4.2，第21 d时，AP/BL值为4.6，细胞模型达到相对稳定状态，AKP逐渐向刷状缘集中，细胞分化具有明显的极性。使用LPS、GMOs及BB以及协同作用产物干预屏障模型，结果如图4B所示。在LPS诱导的肠屏障损伤模型中，AKP含量显著降低，模型组AKP活性为（20.59±1.071）U/100 mL，较正常对照组下降了44.4%（P<0.001）。而经过单独GMOs处理的模型AKP的含量有所恢复，且作用效果优于单独的BB。当GMOs与BB协同作用时，AKP活性显著增加，并且随着浓度增加，其恢复效果呈现剂量依赖增强趋势，当作用浓度为10.0 mg/mL时AKP的含量较单独处理组提升6.67%~23.3%（P<0.01），促进了肠屏障功能的恢复。

2.6　GMOs协同BB对细胞膜通透性的影响

荧光黄素是评估细胞通透性的关键指标，通过测量荧光黄素的渗透量评估细胞模型的通透性。当Papp值低于5×10⁻⁷ cm²/s时，表明肠屏障的通透性和紧密性良好^[22]。图5A展示了细胞在21 d分化过程AP与BL侧荧光黄素表达量的变化。在细胞模型建立初期，荧光黄素的表达量变化不明显，始终高于5×10⁻⁷ cm²/s，这表明细胞间的紧密连接尚未完全形成，通透性较高，屏障功能尚未成熟^[25]。而在培养中期，当细胞密度达到60%时，荧光黄素的表达量下降并低于5×10⁻⁷ cm²/s，表明此时细胞间紧密连接逐渐形成，通透性降低，屏障功能趋于完善，适合用于后续的实验研究。由图5B可知，与对照组相比，使用LPS、GMOs、BB、GMOs-BB以及CFSM处理后的模型中，单独使用LPS处理的模型Papp值显著增加，对肠道屏障功能造成了显著损伤，导致细胞间紧密连接被破坏，通透性显著升高（P<0.001）；而经过单独的GMOs和BB干预的模型，Papp值低于LPS对照组（P<0.05）。然而，当GMOs和BB协同作用时，Papp值进一步显著降低至（3.888±0.150）×10⁻⁷ cm²/s（P<0.01），表明GMOs和BB在协同作用下能够更有效地改善肠屏障的通透性，减轻LPS引起的损伤；此外，与LPS处理组相比，随着干预浓度的增加，Papp值也呈现下降趋势，当作用浓度为10.0 mg/mL时，作用效果最显著（P<0.01）。

2.7　紧密连接蛋白的表达

紧密连接蛋白（Tight Junction Proteins，TJPs）作为肠上皮屏障通透性的重要组成成分，主要是由Claudins、Occludin等跨膜蛋白与ZO-1等胞质附着蛋白通过特异性相互作用形成的功能复合体，并与细胞骨架网络建立动态连接^[26]。在肠上皮细胞中，TJPs的分子组成和功能状态直接决定了肠道屏障的完整性，其表达水平和功能异常与多种胃肠道疾病的发展显著相关^[27]。为进一步评价GMOs、BB、GMOs-BB和CFSM对肠上皮屏障功能的影响以及减轻炎症反应可能的机制，通过qPCR技术对对照组以及各处理组细胞中多种紧密连接蛋白mRNA的相对表达量进行检测，结果如图6所示。

与对照组相比，当模型使用LPS刺激56 h后，显著降低了Claudin-1、ZO-1与Occludin三种紧密连接蛋白mRNA的表达，其中Occludin降低的较为显著（P<0.01），这可能是因为LPS通过激活NF-κB等炎症信号通路抑制TJPs的转录活性，使TJPs表达水平降低导致肠上皮屏障结构完整性受到损伤，诱发或加剧局部及全身性炎症反应^[28]。经GMOs、BB、GMOs-BB与CFSM干预后，Claudin-1、Occludin及ZO-1等紧密连接蛋白的基因表达水平显著上调，约为阴性对照组的3.0~4.0倍（P<0.001），结果表明GMOs与BB及其代谢产物可能通过调控TJPs的转录活性，从而修复受损的肠上皮屏障功能。与TEER值检测结果一致的是，单独使用GMOs处理的样本中TPJs的表达量优于BB组；而GMOs与BB共同作用的样本中TJPs的表达量更高，约为GMOs组的1.0~2.0倍。这种协同效应可能源于Bifidobacterium bifidum所具有的独特糖苷水解酶系统，其能够有效分解寡糖组分生成单糖分子或通过转糖基化作用生成其他益生元低聚糖，进而通过相应的酵解途径生成SCFAs^[29−30]。然而，在本研究中协同处理组的样本TJPs的表达量与TEER值并未呈现严格的正比例关系。当作用浓度为4.0 mg/mL时，TEER值达到峰值，表明此时肠上皮的物理屏障功能恢复最为显著；而当浓度升至10.0 mg/mL时TJPs的mRNA表达量达到最高水平，这可能是由于TJPs mRNA表达上调且未完全转化为功能性蛋白或低浓度时MUC2、F-actin等成分协同作用已恢复屏障功能^[31]，然而具体的原因仍需通过蛋白质组学及时间动力学实验进一步验证。

2.8　GMOs协同BB对IL-6、IL-8及TNF-α分泌的影响

通过测定细胞炎症因子（IL-8、IL-6和TNF-α）的表达量，探讨了GMOs和BB以及二者协同作用时对受损肠上皮细胞炎症反应的影响，结果如图7所示。总体而言，在Caco-2:HT-29MIX细胞培养液中，IL-8分泌量高于IL-6和TNF-α，且AP侧的IL-6、IL-8及TNF-α浓度高于BL侧。虽然不同处理组对炎症因子的抑制效果存在差异，但在一定程度上均减轻了LPS引起的肠上皮损伤，且在高浓度条件下显著抑制了炎症因子的表达（P<0.05）。与对照组相比，当处理浓度为0.5 mg/mL时，GMOs与BB组对IL-6、IL-8和TNF-α的表达量无显著影响，这可能与其作用浓度较低或作用机制尚未充分激活有关；而GMOs-BB组和CFSM作用时，对炎症因子的抑制作用高于单独的GMOs与BB，尤其是CFSM组对IL-8的抑制作用更为突出，IL-8作为炎症反应中的关键趋化因子，通过CXCR1/2受体介导中性粒细胞趋化迁移，同时促进吞噬体形成及活性氧释放，从而放大炎症信号传导^[32]。当CFSM作用后可能通过多靶点调控机制抑制IL-8的表达，其活性成分能够特异性阻断IκBα蛋白的Ser32/36位点磷酸化及NF-κB蛋白核转位过程；同时通过干预相关的信号通路降低AP-1复合体的DNA结合活性，实现对IL-8基因转录的双通路协同抑制^[33]。当处理浓度为4.0 mg/mL时GMOs组对IL-6的抑制效果优于IL-8，这可能与IL-6和IL-8在炎症反应中的调控机制有关。IL-6通常被认为是急性反应的核心因子，可通过JAK/STAT3通路促进炎症反应，进一步促进NF-κB的核转位，从而调控炎症因子如IL-6、IL-1β和TNF-α的表达^[34]。当GMOs作用后与肠上皮细胞表面凝集素（如DC-SIGN）结合，激活相关的信号通路促进细胞增殖与分化，或是通过调节代谢性炎症信号通路，从而减少促炎因子的分泌。此外有研究表明在炎症性肠病中，寡糖通过调节Th1/Th2平衡，增强抗炎细胞因子IL-10的产生，同时抑制了促炎细胞因子的分泌^[35]。而GMOs-BB组对IL-6和TNF-α的抑制作用进一步表明，二者的协同效应可能通过多靶点调控炎症因子的表达。Bifidobacterium代谢GMOs产生的SCFAs（如丁酸、丙酸）通过抑制IKK激酶活性阻断IκBα蛋白降解，同时下调MEK1/2-ERK1/2信号通路磷酸化水平，形成双重抗炎效应；此外，Bifidobacterium代谢寡糖产生的胞外多糖及其内源性糖苷水解酶降解寡糖生成的功能性寡糖片段诱导IL-10分泌，同时激活相应的信号通路促进Foxp3+调节性T细胞（Treg）分化与抑制Th17细胞活性，最终实现Th1/Th2免疫平衡的精准调控，从而在转录水平和细胞免疫层面协同下调IL-6和TNF-α等促炎因子的表达^[36-37]。CFSM组对IL-6和IL-8的抑制效果也再次表明了其在抗炎方面的优势，而经CFSM处理的样品对TNF-α的作用不明显，可能与其作用机制的选择性有关；当处理浓度为10.0 mg/mL时，相较于单独的GMOs与BB，二者协同作用对IL-6、IL-8与TNF-α抑制效果更显著，表达量分别降低（2.11~14.93 ng/L）、（7.42~16.27 ng/L）与（7.03~12.29 ng/L）（P<0.05），这可能是由于高浓度下协同作用进一步增强，提升了在抗炎方面的潜力。

2.9　GMOs协同BB对NO分泌的影响

有研究表明促炎的一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）可以催化L-精氨酸的氧化脱氨作用生成NO^[38]。而NO是一种常见且关键的肠道炎症介质，过度生产的NO可导致炎症状况，增加粘膜的通透性，从而引发炎症性肠病。因此，本研究使用Griess 法探究了单独GMOs与BB以及协同代谢作用对受损肠上皮细胞NO产量情况，如图8所示。与LPS处理组相比，除高浓度的CFSM组外，其他处理组间均以剂量依赖的方式抑制了NO的表达（P<0.01），然而高浓度的CFSM抑制NO能力下降，这可能是因为代谢产物（如SCFAs）降低了模型的pH，肠上皮细胞的能量代谢转向糖酵解，导致活性氧积累和iNOS激活导致NO的水平略微增加^[39]。

3　结论

收起

本研究通过构建LPS诱导的体外肠上皮细胞屏障损伤模型，探究了单独的GMOs与BB以及二者协同作用对肠道屏障功能的影响。研究结果表明，GMOs与BB主要以剂量依赖的方式保护肠屏障完整性，当二者协同作用时对肠屏障完整性的恢复效果显著提升（P<0.01），对炎症因子的抑制作用也更为显著（P<0.05），同时紧密连接蛋白的表达量也提高了1.0~2.0倍（P<0.05）。然而，本研究仍存在一定局限性：研究仅初步探讨了单独GMOs、BB以及协同作用对肠屏障功能的部分指标影响，相关机制尚未完全阐明。例如，研究虽证实了GMOs对炎症因子表达水平的调控作用，但未深入探讨相关基因表达变化及参与的信号通路（如NF-κB、MAPK等）的分子机制。为了更全面理解GMOs与BB的益生特性及其对肠道健康的影响，未来应该开展多维度的研究最大程度揭示GMOs与BB的协同作用机制，为开发新型肠道健康干预方案提供理论依据。

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2026年第47卷第6期

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doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025030107

接收时间：2025-03-10
首发时间：2026-10-24
出版时间：2026-03-15

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收稿日期：2025-03-10

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东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030

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任静（1979−），女，博士，副教授，研究方向：畜产品加工工程，E-mail：jingren@neau.edu.cn。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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