食品安全质量检测学报

蛋白酶种类	最适pH	最适温度/℃
碱性蛋白酶	8.0~9.0	50~60
中性蛋白酶	6.5~7.5	45~55
胃蛋白酶	1.5~2.5	35~45
胰蛋白酶	7.5~8.5	45~55
木瓜蛋白酶	6.0~7.0	55~65

蛋白酶种类	最适pH	最适温度/℃
碱性蛋白酶	8.0~9.0	50~60
中性蛋白酶	6.5~7.5	45~55
胃蛋白酶	1.5~2.5	35~45
胰蛋白酶	7.5~8.5	45~55
木瓜蛋白酶	6.0~7.0	55~65

编码水平	A-温度 /℃	B-时间 /h	C-pH	D-酶添加量 /%	E-底物浓度 /%
低(-1)	50	2	7	3.5	3
高(+1)	60	4	8	4.5	5

编码水平	A-温度 /℃	B-时间 /h	C-pH	D-酶添加量 /%	E-底物浓度 /%
低(-1)	50	2	7	3.5	3
高(+1)	60	4	8	4.5	5

因素	编码水平
A-温度/℃	55.0	55.5	56.0
C-pH	7.5	7.9	8.3
D-酶添加量/%	4.0	4.5	5.0

因素	编码水平
A-温度/℃	55.0	55.5	56.0
C-pH	7.5	7.9	8.3
D-酶添加量/%	4.0	4.5	5.0

试验号	A/℃	B/h	C	D/%	E/%	DPPH自由基清除率/%
1	60	4	7	4.5	5	67.16
2	50	4	8	3.5	5	55.63
3	60	2	8	4.5	3	63.21
4	50	4	7	4.5	5	62.51
5	50	2	8	3.5	5	54.06
6	50	2	7	4.5	3	64.96
7	60	2	7	3.5	5	62.50
8	60	4	7	3.5	3	64.10
9	60	4	8	3.5	3	59.34
10	50	4	8	4.5	3	61.31
11	60	2	8	4.5	5	63.73

试验号	A/℃	B/h	C	D/%	E/%	DPPH自由基清除率/%
1	60	4	7	4.5	5	67.16
2	50	4	8	3.5	5	55.63
3	60	2	8	4.5	3	63.21
4	50	4	7	4.5	5	62.51
5	50	2	8	3.5	5	54.06
6	50	2	7	4.5	3	64.96
7	60	2	7	3.5	5	62.50
8	60	4	7	3.5	3	64.10
9	60	4	8	3.5	3	59.34
10	50	4	8	4.5	3	61.31
11	60	2	8	4.5	5	63.73

来源	自由度	平方和	均方	F	P	显著性
模型	5	161.92	32.38	30.49	0.0003	显著
A/℃	1	46.89	46.89	44.14	0.0006	显著
B/h	1	1.17	1.17	1.10	0.3352
C	1	39.60	39.60	37.28	0.0009	显著
D/%	1	72.03	72.03	67.81	0.0002	显著
E/%	1	2.24	2.24	2.11	0.1970
残差	6	6.37	1.06	30.49	0.0003
综合	11	168.29	32.38	44.14	0.0006
R²=0.9621	R_Pred²=0.8485	CV/%=1.68
R²_adj=0.9306	精密度=17.9891

来源	自由度	平方和	均方	F	P	显著性
模型	5	161.92	32.38	30.49	0.0003	显著
A/℃	1	46.89	46.89	44.14	0.0006	显著
B/h	1	1.17	1.17	1.10	0.3352
C	1	39.60	39.60	37.28	0.0009	显著
D/%	1	72.03	72.03	67.81	0.0002	显著
E/%	1	2.24	2.24	2.11	0.1970
残差	6	6.37	1.06	30.49	0.0003
综合	11	168.29	32.38	44.14	0.0006
R²=0.9621	R_Pred²=0.8485	CV/%=1.68
R²_adj=0.9306	精密度=17.9891

处理	步长	D/%	A/℃	C	DPPH自由基清除率/%
1	0	4.0	55.0	7.5	59.91
2	0+1Δ	4.5	55.5	7.9	65.25
3	0+2Δ	5.0	56.0	8.3	64.53
4	0+3Δ	5.5	56.5	8.7	60.72
5	0+4Δ	6.0	57.0	9.1	55.28
6	0+5Δ	6.5	57.5	9.5	53.74

处理	步长	D/%	A/℃	C	DPPH自由基清除率/%
1	0	4.0	55.0	7.5	59.91
2	0+1Δ	4.5	55.5	7.9	65.25
3	0+2Δ	5.0	56.0	8.3	64.53
4	0+3Δ	5.5	56.5	8.7	60.72
5	0+4Δ	6.0	57.0	9.1	55.28
6	0+5Δ	6.5	57.5	9.5	53.74

试验号	D/%	A/℃	C	DPPH自由基清除率/%
1	4.0	55.0	7.9	65.61
2	5.0	55.0	7.9	65.77
3	4.0	56.0	7.9	65.44
4	5.0	56.0	7.9	66.12
5	4.0	55.5	7.5	65.56
6	5.0	55.5	7.5	65.89
7	4.0	55.5	8.3	65.83
8	5.0	55.5	8.3	65.98
9	4.5	55.0	7.5	65.87
10	4.5	56.0	7.5	66.07
11	4.5	55.0	8.3	66.21
12	4.5	56.0	8.3	66.08
13	4.5	55.5	7.9	66.71
14	4.5	55.5	7.9	66.79
15	4.5	55.5	7.9	66.75
16	4.5	55.5	7.9	66.78
17	4.5	55.5	7.9	66.76

试验号	D/%	A/℃	C	DPPH自由基清除率/%
1	4.0	55.0	7.9	65.61
2	5.0	55.0	7.9	65.77
3	4.0	56.0	7.9	65.44
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5	4.0	55.5	7.5	65.56
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8	5.0	55.5	8.3	65.98
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10	4.5	56.0	7.5	66.07
11	4.5	55.0	8.3	66.21
12	4.5	56.0	8.3	66.08
13	4.5	55.5	7.9	66.71
14	4.5	55.5	7.9	66.79
15	4.5	55.5	7.9	66.75
16	4.5	55.5	7.9	66.78
17	4.5	55.5	7.9	66.76

来源	平方和	自由度	均方	F	P	显著性
模型	3.4100	9	0.3784	122.60	<0.0001	显著
D	0.2178	1	0.2178	70.57	<0.0001	显著
A	0.0078	1	0.0078	2.53	0.1556
C	0.0630	1	0.0630	20.42	0.0027	显著
DA	0.0676	1	0.0676	21.90	0.0023	显著
DC	0.0081	1	0.0081	2.62	0.1493
AC	0.0272	1	0.0272	8.82	0.0208	显著
D²	1.6900	1	1.6900	546.19	<0.0001	显著
A²	0.6412	1	0.6412	207.76	<0.0001	显著
C²	0.4053	1	0.4053	131.31	<0.0001	显著
残差	0.0216	7	0.0031
失拟	0.0177	3	0.0059	6.09	0.0567	不显著
R²=0.9937	R_Pred²=0.9155	CV/%=0.0840
R²_adj=0.9856	精密度=30.1989

来源	平方和	自由度	均方	F	P	显著性
模型	3.4100	9	0.3784	122.60	<0.0001	显著
D	0.2178	1	0.2178	70.57	<0.0001	显著
A	0.0078	1	0.0078	2.53	0.1556
C	0.0630	1	0.0630	20.42	0.0027	显著
DA	0.0676	1	0.0676	21.90	0.0023	显著
DC	0.0081	1	0.0081	2.62	0.1493
AC	0.0272	1	0.0272	8.82	0.0208	显著
D²	1.6900	1	1.6900	546.19	<0.0001	显著
A²	0.6412	1	0.6412	207.76	<0.0001	显著
C²	0.4053	1	0.4053	131.31	<0.0001	显著
残差	0.0216	7	0.0031
失拟	0.0177	3	0.0059	6.09	0.0567	不显著
R²=0.9937	R_Pred²=0.9155	CV/%=0.0840
R²_adj=0.9856	精密度=30.1989

处理方法	α-螺旋相对含量/%	β-折叠相对含量/%	β-转角相对含量/%	无规则卷曲相对含量/%
CN	28.93±0.33^a	26.91±0.21^b	17.55±0.37^a	26.49±0.64^a
U-CN	28.79±0.43^a	26.60±0.37^b	16.49±0.64^ab	27.91±1.16^a
AEH-CN	28.78±0.33^a	27.17±0.22^b	16.86±0.38^ab	28.12±0.51^a
UAEH-CN	26.70±0.47^b	28.53±0.54^a	16.32±0.36^b	28.35±0.71^a

处理方法	α-螺旋相对含量/%	β-折叠相对含量/%	β-转角相对含量/%	无规则卷曲相对含量/%
CN	28.93±0.33^a	26.91±0.21^b	17.55±0.37^a	26.49±0.64^a
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UAEH-CN	26.70±0.47^b	28.53±0.54^a	16.32±0.36^b	28.35±0.71^a

超声预处理对驴乳酪蛋白酶解物抗氧化性及结构的影响

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杨惠仪 ¹ , 刘秋美 ¹ , 张雨萌 ¹ , 谢远方 ¹ , 岳喜庆 ¹ , 李墨翰 ¹^,²^,³^,^*

食品安全质量检测学报 | 专题：动物性食品加工与质量安全 2025,16(15): 16-27

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食品安全质量检测学报 | 专题：动物性食品加工与质量安全 2025, 16(15): 16-27

超声预处理对驴乳酪蛋白酶解物抗氧化性及结构的影响

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杨惠仪¹, 刘秋美¹, 张雨萌¹, 谢远方¹, 岳喜庆¹, 李墨翰¹^,²^,³^,^*

作者信息

¹ 沈阳农业大学食品学院, 沈阳 110866

² 乳业生物技术国家重点实验室, 上海乳业生物工程技术研究中心, 光明乳业股份有限公司乳业研究院, 上海 200436

³ 上海交通大学生命科学技术学院, 上海 200240

杨惠仪(2004—), 女, 主要研究方向为动物源食品加工与利用。E-mail: YangHuiYi805@163.com

通讯作者:

*李墨翰(1994—), 男, 副教授, 主要研究方向为动物源食品加工与利用。E-mail: fslimohan@126.com

Effects of ultrasonic pretreatment on antioxidant activity and structure of donkey milk casein hydrolysate

Hui-Yi YANG¹, Qiu-Mei LIU¹, Yu-Meng ZHANG¹, Yuan-Fang XIE¹, Xi-Qing YUE¹, Mo-Han LI¹^,²^,³^,^*

Affiliations

¹ College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

² State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology, Dairy Research Institute, Bright Dairy & Food Co., Ltd., Shanghai 200436, China

³ School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

出版时间: 2025-08-15 doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250610002

文章导航

摘要

收起

目的探究超声协同酶解对驴乳酪蛋白抗氧化性及结构的影响, 优化复合处理工艺参数, 解析超声预处理对酶解过程的促进机制。方法以驴乳酪蛋白为原料, 单因素试验优化超声参数(200 W、20 min、6 s/6 s间歇比), 筛选中性蛋白酶与胰蛋白酶(质量比2:1)复配, 结合响应面法优化酶解条件(酶添加量4.86%、55.28 ℃、pH 7.76)。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)、红外光谱法等分析蛋白分子质量、二级结构及官能团变化, 测定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除率等抗氧化指标。结果超声协同酶解使抗氧化能力达69.77%, Fe³⁺还原能力提升65.3%, 显著优于单一处理。结构显示α-螺旋减少至26.70%, 无规卷曲增至28.35%, 芳香族氨基酸暴露, 巯基氧化为二硫键, 分子质量降低。响应面模型预测值与实测值吻合度高(R²=0.9937)。结论超声预处理通过破坏蛋白胶束结构, 协同酶解释放抗氧化短肽, 显著提升抗氧化性, 研究结果为高附加值驴乳抗氧化产品的生产提供可参考的工艺参数, 有助于推动驴乳产业的发展, 提高驴乳的经济价值。

关键词

超声 / 酶解 / 酪蛋白 / 抗氧化性 / 结构

Abstract

收起

Objective To explore the effects of ultrasonic synergistic enzymatic hydrolysis on the antioxidant activity and structure of donkey milk casein, optimize the process parameters of composite treatment, and analyze the promotion mechanism of ultrasonic pretreatment on the enzymatic hydrolysis process. Methods Using donkey milk casein as raw material, the ultrasonic parameters (200 W, 20 min, 6 s/6 s intermittency ratio) were optimized by single factor experiment, the neutral protease and trypsin (the mass ratio was 2:1) were screened, and the enzymatic hydrolysis conditions were optimized by response surface method (enzyme addition amount 4.86%, 55.28 °C, pH 7.76). The changes of protein molecular weight, secondary structure and functional groups were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and infrared spectroscopy. The antioxidant indexes such as 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) scavenging rate were determined. Results Ultrasonic synergistic enzymatic hydrolysis resulted in antioxidant ability of 69.77% and a 65.3% increase in Fe³⁺ reducing capacity, which was significantly better than that of the single treatment. The structure showed that the α-helix decreased to 26.70%, the random coil increased to 28.35%, the aromatic amino acids were exposed, the sulfhydryl groups were oxidized to disulfide bonds, and the molecular weight was reduced. The predicted value of the response surface model was in good agreement with the measured value (R²=0.9937). Conclusion The results of ultrasonic pretreatment significantly improves the antioxidant activity by destroying the structure of protein micelles and releasing antioxidant short peptides in synergy with enzymes, which provides a reference process parameter for the production of high value-added donkey milk antioxidant products, which is helpful to promote the development of donkey milk industry and improve the economic value of donkey milk.

Key words

ultrasonic / hydrolysis / casein / antioxidant activity / structure

引用本文

杨惠仪, 刘秋美, 张雨萌, 谢远方, 岳喜庆, 李墨翰. 超声预处理对驴乳酪蛋白酶解物抗氧化性及结构的影响. 食品安全质量检测学报, 2025 , 16 (15) : 16 -27 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250610002

Hui-Yi YANG, Qiu-Mei LIU, Yu-Meng ZHANG, Yuan-Fang XIE, Xi-Qing YUE, Mo-Han LI. Effects of ultrasonic pretreatment on antioxidant activity and structure of donkey milk casein hydrolysate[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2025 , 16 (15) : 16 -27 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250610002

正文

收起

0 引言

收起

驴乳富含酪蛋白^[1-2], 其氨基酸组成均衡且具有抗氧化^[3]、抗菌^[4]等生物活性, 在功能食品与营养领域具有广阔应用前景^[5-7]。当下, 氧化损伤相关健康问题频发, 食品中抗氧化成分需求迫切, 而酪蛋白作为驴乳关键成分, 提升其抗氧化性对开发功能性食品、增强产品健康价值意义重大, 可更好发挥抗氧化、延缓氧化劣变等作用, 满足消费者对健康食品的需求^[8-10]。目前, 单一物理或酶解技术对酪蛋白抗氧化性的提升效果有限^[11-12], 现有研究表明超声辅助酶解可用于对过敏原进行过敏性降低处理^[13], 超声预处理与酶解的协同作用因能突破天然蛋白结构限制^[14]、增强活性肽释放潜力, 成为改善蛋白功能特性的研究热点。国内外研究表明, 超声空化效应可破坏酪蛋白胶束的疏水相互作用^[15-18], 暴露内部活性位点, 而酶解能定向切割肽链生成抗氧化肽段^[19]。然而, 现有研究对超声与酶解协同处理驴乳酪蛋白的抗氧化机制研究较少。

本研究以驴乳酪蛋白为对象, 旨在通过超声预处理结合酶解技术, 探究其对抗氧化活性的提升效果及作用机制。首先通过单因素试验优化超声参数, 解析超声对蛋白二级结构(傅里叶红外光谱)、三级结构(紫外/荧光光谱)的影响; 进而筛选复合酶配比并优化酶解工艺(响应面法), 明确超声与酶解协同作用下蛋白分子降解规律[十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)]; 研究结果将为驴乳功能性产品开发提供理论依据, 同时为蛋白复合改性技术在食品工业中的应用拓展新思路。

1 材料与方法

收起

1.1 材料与试剂

驴乳酪蛋白粉(实验室自制)。

木瓜蛋白酶(酶活力32767 U/g)、碱性蛋白酶(酶活力105466 U/g)、胰蛋白酶(酶活力1250000 U/g)、胃蛋白酶(酶活力348204 U/g)、中性蛋白酶(酶活力88070 U/g)(诺维信生物有限公司); 四硼酸钠(分析纯, 无锡市展望化工试剂有限公司); SDS、邻苯二甲醛、氢氧化钠、苯氨基-萘磺酸铵盐、乙二胺四乙酸二钠、尿素、8-苯氨基-萘磺酸铵盐(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司); L-丝氨酸、硫代巴比妥酸、考马斯亮蓝R250(分析纯, 北京索莱宝有限公司); 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl, DPPH)(分析纯, 美国Sigma公司); 铁氰化钾(分析纯, 天津博迪化工股份有限公司); 无水硫酸铜(CuSO₄)(分析纯, 天津市华盛化学试剂有限公司); 氯化铁(分析纯, 无锡市展望化工试剂有限公司); 菲洛嗪(分析纯, 合肥博美生物科技有限责任公司); 邻苯二酚紫(分析纯, 天津市鲁鑫化工科技有限公司); 三氯乙酸、β-巯基乙醇(分析纯, 天津市巴斯夫化工有限公司); 三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)(分析纯, 上海麦克林生化科技有限公司); 5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(分析纯, 合肥千盛生物科技有限公司); 甲醇、冰乙酸(分析纯, 成都市科隆化学品有限公司)。

1.2 仪器与设备

Sonics VCX750超声波细胞破碎仪(美国Sonics公司); 雷磁PHS-25 pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司); UV2700紫外可见分光光度计(日本岛津公司); Eon酶标仪、PowerPac Basic电泳仪(美国BioTek仪器有限公司); SQP天平(精度0.01 mg, 赛多利斯科学仪器有限公司); Hitachi F-4600荧光光谱仪(日本日立公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白酶选择及配比确定

将冻干的酪蛋白粉用0.01 mol/L, pH 7.4的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)配成质量浓度为10 mg/mL母液, 取25 mL于高筒烧杯中, 放入超声细胞破碎仪中, 探头浸入液面下1 cm, 进行超声波处理, 超声处理条件设置为: 超声功率200 W, 超声处理20 min, 超声间歇比6 s/6 s。

通过预试验固定酶解条件: 底物浓度4%、酶添加量4%、时间3 h, 将超声处理后的溶液, 按预试验固定酶解条件, 在各蛋白酶最适pH和温度条件下酶解3 h(表1), 反应进程中用0.1 mol/L NaOH标准溶液稳定酶解液pH, 根据水解度(degree of hydrolysis, DH)、DPPH自由基清除率的大小, 筛选出酶解效果最好的2种酶。将效果最优的两种酶以1:1、1:2、1:3、2:1、3:1的质量比进行复配, 以DH、DPPH自由基清除率的大小为指标筛选最佳的酶配比。

1.3.2 超声辅助酶解法单因素试验

以DH和抗氧化性为指标, 各单因素的基础条件为温度45 ℃、时间3 h、pH 6.5、酶添加量4%、底物浓度4%。各单因素的水平为温度45、50、55、60、65 ℃; 时间1、2、3、4、5 h; pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5; 酶添加量1%、2%、3%、4%、5%; 底物浓度2%、3%、4%、5%、6%。根据加入NaOH的量, 计算DH。水解结束后时间组煮沸10 min; 温度、底物浓度组煮沸15 min; pH、酶添加量组煮沸即可, 终止酶解, 测定抗氧化率。

1.3.3 酪蛋白DH测定

准备待测的酪蛋白水解溶液, 在水解反应开始前, 使用0.1 mol/L NaOH溶液将样品的初始pH调整至目标pH, 使用pH计实时测定, 确保在设定的pH范围内。当pH下降时, 通过滴定管滴加0.1 mol/L的NaOH溶液, 至pH恢复至设定的数值。DH可通过公式(1)计算:

(1)DH/%=$\frac{V\times C\times f}{样品质量}$×100%

式中: V为NaOH的体积, L; C为NaOH的浓度, mol/L; f为氨基酸中氮的摩尔化当量, 通常为14分子量。

1.3.4 酪蛋白抗氧化性测定

(1) DPPH自由基清除能力分析

参照文献[20]方法稍作修改。将驴乳酪蛋白溶液配制为4 mg/mL, 移取2.5 mL至反应试管中, 定量加入等体积0.2 mmol/L DPPH溶液。混合体系于避光环境孵育30 min后, 设定离心力5000 r/min进行10 min离心。取上清液在517 nm波长下测定吸光值。超纯水替代样品的空白参照组, 乙醇为对照组。按公式(2)计算DPPH自由基清除率:

(2)DPPH自由基清除率/%=(1-$\frac{{A}_{s}-{A}_{b}}{{A}_{c}}$)×100%

式中: A_s、A_b和A_c分别为样品组、空白组和对照组的吸光度。

(2) Fe³⁺还原能力分析

参考文献[21]方法稍作修改。将待测样品经超纯水稀释至目标质量浓度(2.0 mg/mL), 准确移取0.5 mL并与等体积浓度为1%铁氰化钾溶液及0.02 mol/L缓冲液混合。反应后置于55 ℃恒温孵育20 min后立即冰浴降温, 加入0.5 mL浓度为10%的三氯乙酸溶液进行混合。取混匀后液体1 mL与显色剂体系(1 mL超纯水+0.2 mL 0.1% FeCl₃溶液)经涡旋振荡混匀, 静置显色10 min后, 于700 nm处测定吸光值。用超纯水替代样品作为空白对照组。按公式(3)计算Fe³⁺还原能力:

(3)Fe³⁺还原能力=A_n-A_m

式中: A_n和A_m分别为样品组、对照组的吸光度。

(3)金属离子螯合能力分析

Fe²⁺螯合能力, 参考文献[22]试验方法, 将1 mL驴乳酪蛋白样品, 3.7 mL 去离子水, 0.1 mL FeCl₂溶液和0.2 mL菲啰嗪溶液分别加入到试管中, 混合均匀, 混合溶液在常温静置20 min, 取上清液于562 nm处测定吸光度, 用去离子水作为对照组并进行调零。按公式(4)计算Fe²⁺螯合能力:

(4)Fe²⁺螯合能力/%=(1-$\frac{{A}_{1}}{{A}_{0}}$)×100%

式中: A₀为空白对照的吸光度; A₁为样品溶液的吸光度。

Cu²⁺螯合能力测定, 参考文献[22]试验方法, 采用邻苯二酚紫测定, 将1 mL 浓度为2 mmol/L的CuSO₄溶液、1 mL浓度为10%的吡啶与20 μL浓度为0.1%的邻苯二酚紫进行混合, 混合均匀后加入1 mL样品溶液, 继续混合均匀, 室温下静置5 min。取上清液在波长632 nm处测定吸光度, 以1 mL的去离子水作为对照组。按公式(5)计算Cu²⁺螯合能力:

(5)Cu²⁺螯合能力/%=(1-$\frac{{A}_{2}}{{A}_{3}}$)×100%

式中: A₂为空白对照的吸光度; A₃为样品溶液的吸光度。

1.3.5 响应面优化设计

(1) Plackett-Burman试验

Plackett-Burman试验次数为12次, 利用Design-expert 13进行试验的组合设计, 对A-温度、B-时间、C-pH、D-酶添加量和E-底物浓度5个因素进行考察(表2), 以DPPH自由基清除率为响应值, 测定各因素组合对抗氧化性的影响。

(2)最陡爬坡试验

最陡爬坡试验是通过在参数空间中进行局部线性回归, 识别响应函数在特定条件下的变化率。试验过程主要是围绕当前设计点对各影响因素进行微小变化, 观察响应变量的变化, 选择温度、pH、酶添加量3个最显著因素进行最陡爬坡试验。

(3)响应面试验

Box-Behnken设计是一种常用的响应面设计方法^[23]。在Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验的基础上, 以温度、pH、酶添加量为变量, 以驴乳酪蛋白水解产物的DPPH自由基清除率为响应值Y₁, 进行3因素3水平的试验, 试验水平的选取及编码如表3所示。

1.3.6 超声处理结合酶解驴乳酪蛋白的样品制备

将冻干处理的驴乳酪蛋白粉用0.01 mol/L, pH 7.4的PBS配成质量浓度为10mg/mL的溶液, 在25 ℃条件下磁力搅拌2 h, 取25 mL于烧杯中, 放入超声波细胞破碎仪中(探头直径为6 mm, 超声探头浸入液面下1 cm)进行超声波处理, 超声处理条件设置为: 超声功率200 W, 超声间歇比6 s/6 s, 超声处理20 min。45 ℃水浴加热3 h, 未超声和超声处理后的驴乳酪蛋白分别加入酶与底物的质量比为4%的复合酶, 调节pH至6.5, 45 ℃水浴加热3 h。

1.3.7 SDS-PAGE电泳

基于文献[24]方法略作调整, 40 μL样品中加入10 μL非还原上样缓冲液混合, 在100 ℃温度下加热5 min, 冷却后进行50 s离心, 取上清液进行上样, 每孔上样20 μL, Marker每孔上样8 μL。电压120 V, 当样品条带跑至玻璃板边缘大约0.5 cm时停止电泳。固定时间20 min, 染色3 h后, 用甲醇-冰乙酸脱色液进行脱色, 直至出现清晰的蛋白条带。

1.3.8 傅里叶红外光谱分析

基于文献[25]方法略作调整。将2 mg样品与KBr粉末均匀混合后精细研磨, 经液压成型工艺制备透明薄片。采用傅里叶变换红外光谱仪在恒温条件(25 ℃)下进行全波长扫描, 参数设定为: 波数范围4000~400 cm^-1, 光谱分辨率4 cm^-1, 扫描64次。试验设置纯KBr薄片作为空白对照组, 获取的原始光谱数据通过OMNIC进行多峰拟合处理。通过Peak Fit v4.12软件进行处理并计算蛋白二级结构的相对含量。

1.3.9 紫外吸收光谱分析

基于文献[22]方法略加调整, 样品使用PBS稀释至1 mg/mL, 取3 mL 样品打入两面透光的比色皿中, 用PBS作为空白对照, 检测前使用两种不同pH的PBS对仪器进行基线校正, 在温度为25 ℃、波长为190~450 nm的条件下对样品进行扫描, 参数设置为: 分辨率0.5 nm, 扫描步长1 nm, 速率50 nm/min, 得到紫外吸收光谱后, 选择波长为200~450 nm的蛋白样品紫外吸收光谱进行分析。

1.3.10 内源荧光光谱分析

基于文献[25]方法, 样品使用PBS稀释至0.5 mg/mL。取3 mL样品加入比色皿中, 用PBS作为空白对照测定参数设置为: 扫描范围290~450 nm, 激发狭缝5 nm, 发射狭缝5 nm, 扫描速度1200 nm/min, 激发波长280 nm, 电压500 V, 测定样液的内源荧光发射光谱, 并分析其内源荧光强度的变化。

1.4 数据处理

通过Design-Expert 13软件进行响应面试验设计和分析, 所有试验均平行测定3次, 结果用平均值±标准偏差表示, 使用软件IBM SPSS Statistix 26进行显著性分析, P<0.05为差异显著, P>0.05为差异不显著。采用Origin 2022软件作图。

2 结果与分析

收起

2.1 复合酶对抗氧化性的影响

2.1.1 单酶酶解效果的比较

酶解特性研究表明, DH可作为肽键断裂比例的量化指标^[26-27], 能反映蛋白酶解进程, 而DPPH自由基清除率反映样品降低羟自由基、烷自由基和过氧化自由基等的能力, 被广泛证实为评价物质抗氧化效能的可靠参数^[28]。

如图1数据所示, 中性蛋白酶与胰蛋白酶的DH分别达22.83%和22.25%, DPPH自由基清除率则达到55.33%与51.83%。木瓜蛋白酶组在两项指标中均呈现显著劣势(DH<10%, DPPH自由基清除率<40%)。基于酶解效率与抗氧化功能的测定, 最终选定中性蛋白酶与胰蛋白酶进行后续试验。

2.1.2 复合酶酶解效果的比较

由于酶具有特异性, 当下越来越多的的研究都选择使用多种酶复配进行酶解, 不仅可以提高DH, 在一定程度上还可以提高抗氧化性^[29]。选择中性蛋白酶与胰蛋白酶按比例复配后水解酪蛋白, DH、DPPH自由基清除率如图2所示。从图2中可以看出, 中性蛋白酶与胰蛋白酶以2:1复配时DH可达27.73%, DPPH自由基清除率最高达57.3%, 显著高于其他复配组合(P<0.05), 因此, 选择中性蛋白酶与胰蛋白酶配比为2:1进行驴乳酪蛋白的酶解。

2.2 单因素试验

图3为各因素下蛋白酶酶解的DH及抗氧化性。

由图3(a)可以发现, DH和DPPH自由基清除率随温度变化均呈先升后降的趋势并出现一个峰值(55 ℃), 适度的热效应也可增加酶的构象柔韧性, 从而提高胰蛋白酶和中性蛋白酶两种酶的活性协同性, 获得最佳的水解率和抗氧化性^[29]。以DPPH自由基清除率为主要标准, 55 ℃为最佳酶解温度。

由图3(b)可知, DH和DPPH自由基清除率随着时间的增长, 呈现先升高后降低的趋势, 在3 h时均达到峰值。在反应前3 h时, 复配酶之间表现出较强的协同作用, 使酪蛋白快速降解释放出富含抗氧化基团的短肽片段, 并且新生成的肽段其活性位点未被破坏, 共同推动DH与DPPH自由基清除率升高。因此, 以DPPH自由基清除率为主要判断标准时, 选择3 h为酶解驴乳酪蛋白的最佳时间。

如图3(c)所示, DH和DPPH自由基清除率随pH升高, 二者先上升后降低, 且在pH 7.5处同时达到峰值。pH 6.5~7.5时, 中性蛋白酶与胰蛋白酶的协同增效作用较突出。因此, 以DPPH自由基清除率为主要参考指标, 将pH 7.5确定为酶解驴乳酪蛋白的最佳pH。

图3(d)表明, 随着酶添加量的升高, DH表现出先升后降的趋势, 在3%时达最大值; 而DPPH自由基清除率变化幅度不大, 同样在3%时达最大值。这表明酶量对DH和抗氧化性具有有非线性影响。以DPPH自由基清除率为判断指标, 选择3%为酶解驴乳酪蛋白的最佳酶添加量。

由图3(e)可以看出, 随着底物浓度的升高, DH和DPPH自由基清除率均在4%达最大值。低浓度底物情况下(2%~4%)底物与酶的摩尔比逐渐优化, 得到具有抗氧化活性的短肽片段, 同时保证反应体系的传质效率, 使水解产物的生成速度和自由基清除效果处于最优化状态, 通过评价指标DPPH自由基清除率, 确定4%为酶水解驴乳酪蛋白的最适浓度。

2.3 酶解优化设计及结果分析

2.3.1 Plackett-Burman试验设计筛选结果

对表4 Plackett-Burman试验设计与结果进行方差分析, 使用Lenth方法识别Plackett-Burman试验中的显著效应^[30], 得到因素标准化效应的半正态概率图(图4)和帕累托图(图5)。

在图4中, 因素D、A和C的标准化效应点远离拟合线, 表明它们是显著因素(P<0.05), 即酶添加量、温度和时间是影响抗氧化性的主要因素, 而其他因素的标准化效应值较小。

通过图5的标准化效应帕累托图, 可以看出因素D、A和C超过t值, 表明它们是显著因子^[31]。

由Plackett-Burman试验的显著性分析见表5, 该模型的P<0.01, 表明这一模型极显著, 整个回归区域的拟合性能良好。相关系数R²=0.9621, 说明此模型能解释96.21%的试验数据变异量, 有3.79%的变异不能用此模型解释(校正系数R²_adj=0.9306), CV越小, 试验的可信度和精确度越高, CV=1.68%, 说明Plackett-Burman试验的可靠性较高。精密度>4.0为合理^[32], 此试验精密度为17.9891。通过对数据进行多元回归拟合, 得到回归方程如公式(6)所示:

(6)Y=48.062+0.395A+0.312B-3.633C+4.9D-0.432E

2.3.2 最陡爬坡试验结果

最陡爬坡试验由回归方程(6)可知, 因素D偏回归系数为4.9, 表明因素D对DPPH自由基清除率的影响为7下正效应, 即随着D因素的增加, DPPH自由基清除率呈上升趋势; C因素为负效应, A因素为正效应。因此选取D、C、A 3个因素做响应面试验, 响应面试验中3个因素的试验次数为20。最显著的为因素D, 因此选择D为爬坡单位。A、C、D步长计算如公式(7)~(9)所示:

(7)A步长=$\frac{0.395}{4.9}$×$\frac{60-50}{2}$=0.403

(8)C步长=$\frac{3.633}{4.9}$×$\frac{8-7}{2}$=0.37

(9)D步长=$\frac{4.9}{4.9}$×$\frac{4.5-3.5}{2}$=0.5

式中: A根据试验实际取为0.5 ℃; C根据试验实际取为pH=0.4; 后续试验D步长取0.5%。

根据步长计算结果(7)~(9)设计最陡爬坡试验表格, 如表6所示。

由表6可知, 处理2的DPPH自由基清除率达到最大值, 因此以处理2为响应面试验的中心点。

2.3.3 Box-Behnken响应面法试验结果

根据最陡爬坡试验, 以处理2为中心点实行Box-Behnken试验^[23], 选择酶添加量、pH和温度3个因素作为自变量, 根据Box-Behnken设计建立3因素3水平试验, 以DPPH自由基清除率为响应值。试验设计及结果见表7。

通过对数据进行二次多元回归拟合, 得到二次多项式方程如公式(10)所示:

(10)Y=66.76+0.1650D+0.0313A+0.0887C+0.1300DA-0.0450DC-0.0825AC-0.6328D²-0.3903A²-0.3102C²

模型的显著性小于0.01, 失拟项大于0.05, 表明该模型极显著, 说明模型与实际数据拟合较好, 相关系数R²=0.9937, 校正系数R²_adj=0.9856说明预测值与实测值之间具有高度相关性, 该模型可以解释98.56%的变化, 可用于分析和预测酶解处理后蛋白的抗氧化性的变化情况。从表8中可以看出, 因素D和C、交互项DA、AC对抗氧化性有显著性影响, DC没有显著性影响; 二次项D²、A²、C²对抗氧化性有显著性影响。由F可以看出, 各因素影响程度顺序为: D>C>A。

利用回归模型预测不同酶解条件下的抗氧化性。为更加直观地反映模型预测效果, 分别绘制模型预测值与试验值相关图, 如图6所示。可以看出, 各个样本点都近乎分布在45°对角线上, 说明该模型对于预测各个酶解条件下的抗氧化性与试验结果具有较高的拟合度, 二者较为接近。

理想的模型通常要求大部分样本预测误差在模型的±2标准差(standard deviation, SD)范围以内, 由图7可以看出, 该模型中的样本点都在模型的±2SD的范围内, 并未发现离群点, 说明该模型预测能力较强, 可以用来分析蛋白酶解后的抗氧化能力^[33]。

依据回归方程, 利用Design-expert绘出响应面分析图, 结果见图8。通过响应面3D图可以明显看到所做试验的范围包括最大值所在区域。利用Design-expert对模型进行分析预测, 得到酶添加量为4.86%, 温度为55.28 ℃, pH为7.76, 此时的响应值最大值为66.79%。

2.4 不同处理对驴乳酪蛋白抗氧化性的影响

图9为不同处理对驴乳酪蛋白抗氧化性的影响。

如图9(a)所示, 采用单一处理方式, 超声与酶解均能提升Fe³⁺的还原能力, 但酶解效果更显著, 可能酶解过程中DH较高, 水解物中的小肽比例增加, 从而氢离子可用性增强, 增加与铁离子的反应表面积, 促进还原反应的进行。通过超声协同酶解的处理方式, 显著提升Fe³⁺的还原能力至65.3%。

如图9(b)所示, 驴乳酪蛋白经超声与酶解联合处理后DPPH自由基清除能力的显著提升, 且酶解效果优于超声处理。与未超声处理组相比, 超声预处理结合酶解后DPPH自由基清除能力有显著性升高(P<0.05), 可能是因为超声预处理使蛋白致密结构舒展开来, 促使酶能更好的切割肽链, 所以超声后的反应体系的DPPH自由基的清除能力增强^[34]。

如图9(c)所示, 以超声、酶解、超声结合酶解处理驴乳酪蛋白后, 其金属离子螯合能力均得到提高。超声处理是以物理方法来改变蛋白质的空间构象, 从而暴露出更多的活性位点, 进而能够更容易与金属离子螯合; 酶解处理则是通过酶的催化降解, 又进一步降解出更多小肽段, 这些小肽段的金属离子结合能力比蛋白好^[35-36]。

如图9(d)所示, 未经处理的驴乳酪蛋白脂质抗氧化能力为18.4%, 而经过超声处理后, 抗氧化能力显著提升至57.8%, 可能是超声引起的蛋白质结构重组和活性位点的暴露, 进而增强了其与自由基的结合能力; 酶解处理后抗氧化能力达到60.3%, 超声结合酶解处理后的抗氧化能力进一步提高至69.77%, 可能是超声波引起液体中的微小气泡产生爆炸效应, 这种空化现象可以有效地破坏细胞壁和生物膜, 提高脂质纤维的暴露, 增加酶与脂质的接触面, 促进酶的水解反应, 提高脂质抗氧化能力^[37-38]。

2.5 不同处理对酪蛋白分子量分布的影响

如图10所示, 超声处理条带与未经处理的酪蛋白相比, 条带变浅, 可能是超声的机械作用, 引起蛋白质的断裂或者降解, 导致其空间构象发生改变, 降低了蛋白质的聚合程度和稳定性, 在凝胶电泳中蛋白条带的强度降低, 颜色变浅^[39]。经过酶解处理后, 酪蛋白的条带出现上移的现象, 可能是由于分子被酶切割为较小的肽段和氨基酸, 导致在电泳过程中, 胶体中的小肽移动速度加快, 会相对较高的位置出现, 因此会向上移动, 电泳图谱表现为条带上移。经过超声结合酶解处理后, 电泳条带出现变深的现象, 可能是超声后的酪蛋白经过酶解处理, 生成比原始蛋白更有效的聚合体或肽段, 聚合体在电泳中表现为更深的条带^[40]。

2.6 不同处理对驴乳酪蛋白二级结构的影响

不同处理对驴乳酪蛋白傅里叶红外光谱如图11所示。与未超声处理组对比, 其他处理组在3600~3000 cm^-1的光谱范围内, 出现谱带变宽的现象, 可能是超声处理通过空化效应破坏酪蛋白胶束的疏水聚集结构, 导致分子间氢键相互作用断裂或重组, 而酶解作用进一步切割肽链, 暴露更多极性基-NH₂, 促使游离羟基和氨基与水分子形成动态氢键网络, 导致O-H的伸缩振动和N-H的弯曲振动, 引起光谱图的变化, 表现为吸收峰展宽^[41]。

表9结构分析数据显示, 超声结合酶解处理能显著改变驴乳酪蛋白二级结构组成: 相较于对照组, α-螺旋相对含量下降(26.70%), 无规卷曲增加(28.53%), β-折叠相对含量提升, β-转角相对含量下降。α-螺旋的减少可归因于超声空化效应产生的剪切力场及瞬态高温, 导致螺旋区氢键断裂并重排为β-折叠。也可能是由于超声产生的机械作用使蛋白结构松散, 削弱了维系蛋白结构稳定的氢键作用力, 增加了底物与酶的结合位点, 使有序的蛋白结构在水解后向无序形式转变^[42]。

2.7 不同处理驴对乳酪蛋白紫外吸收光谱的影响

如图12所示, 通过紫外吸收光谱分析不同处理方式对驴乳酪蛋白结构的影响。超声组、酶解组及超声结合酶解处理组的吸光度与未处理组相比均有所增强。其中, 超声结合酶解处理组的吸光度最高, 可能是超声预处理使包埋于蛋白内部的芳香族氨基酸残基爆露, 且促进酶解产物的发色基团释放, 通过破坏酪蛋白胶束的致密结构, 蛋白结构更加疏松, 暴露出更多酶切位点, 促使酶解反应更彻底^[22]。酶解处理组的吸光度低于超声处理组, 可能因蛋白酶特异性切割导致部分发色基团随小分子肽段流失。

2.8 不同处理驴对乳酪蛋白内源荧光光谱的影响

如图13所示, 经过超声处理后酪蛋白的内源荧光强度明显高于未处理的酪蛋白, 而经过酶解处理和超声结合酶解的处理下, 荧光强度低于未处理组。在超声作用下, 二硫键诱导聚合反应形成聚合物, 导致具有荧光特性的氨基酸被隐藏起来, 从而荧光强度增强^[43]。酶解处理后的蛋白荧光光谱最大吸收峰从342 nm蓝移到340 nm, 荧光强度降低, 可能是酪蛋白在酶解条件下结构容易展开, 残留在疏水区域的色氨酸暴露于溶剂中, 从而导致荧光强度下降。在超声结合酶解处理后, 蛋白质分子之间结构稳定性下降, 改变它们的微环境, 进一步导致荧光猝灭现象。

3 结论

收起

本研究通过超声预处理结合酶解技术对驴乳酪蛋白进行改性, 系统探究了不同处理方式对蛋白抗氧化性及结构的影响。结果表明, 超声处理(200 W, 20 min, 6 s/6 s间歇比)可通过破坏蛋白胶束结构、暴露疏水基团, 使DPPH自由基清除率提升至57.3%; 中性蛋白酶与胰蛋白酶(2:1)复配酶解可将DH和DPPH清除率提高至27.73%和57.3%。超声结合酶解协同处理进一步使抗氧化能力达69.77%, Fe³⁺还原能力提升65.3%, 显著优于单一处理, 归因于超声破除空间位阻促进酶解效率, 释放更多小分子抗氧化肽。结构分析显示, 协同处理导致α-螺旋减少、无规卷曲增加(28.35%), 紫外吸光度增强表明芳香族氨基酸暴露, 内源荧光强度降低及巯基氧化反映微环境改变。响应面优化确定最优酶解条件为酶添加量4.86%、55.28 ℃、pH 7.76, 此时抗氧化性达峰值。本研究证实超声-酶解协同可通过结构重构提升酪蛋白抗氧化性, 可为驴乳功能性产品开发提供理论依据。

基金

收起

辽宁省自然科学基金联合基金项目(2023-BSBA-281)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

COSENZA

, MAURIELLO

, GARRO

, et al. Casein composition and differential translational efficiency of casein transcripts in donkey's milk[J]. Journal of Dairy Research, 2019, 86(2): 201-207.

[2]

MOHAN

, HAIKUN

, JIALI

, et al. Novel insights into whey protein differences between donkey and bovine milk[J]. Food Chemistry, 2021, 365: 130397.

[3]

SIMOS

, METSIOS

, VERGINADIS

, et al. Antioxidant and anti-platelet properties of milk from goat, donkey and cow: An in vitro, ex vivo and in vivo study[J]. International Dairy Journal, 2011, 21(11): 901-906.

[4]

ŠARIĆ

LJUBIŠA

, PREMOVIĆ

TAMARA

, ŠARIĆ

BOJANA

, et al. Microbiological quality of raw donkey milk from serbia and its antibacterial properties at pre-cooling temperature[J]. Animals, 2023, 13(3): 327.

[5]

李墨翰, 张秀敏, 宋婉莹, 等. 驴初乳与常乳乳脂球膜蛋白质组的对比分析(英文)[J]. 食品科学, 2022, 43(8): 104-112.

, ZHANG

, SONG

, et al. Comparative proteomic analysis of milk fat globule membrane proteins between donkey colostrum and mature milk[J]. Food Science, 2022, 43(8): 104-112.

[6]

VINCENZETTI

, SANTINI

, POLZONETTI

, et al. Vitamins in human and donkey milk: Functional and nutritional role[J]. Nutrients, 2021, 13(5): 1509.

[7]

李墨翰, 刘爱成, 赵闪闪, 等. 驴乳营养成分研究进展[J]. 乳业科学与技术, 2022, 45(6): 42-49.

, LIU

AIC

, ZHAO

, et al. Progress in research on the nutritional components of donkey milk[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2022, 45(6): 42-49.

[8]

吴登宇, 韦体, 马忠仁, 等. 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对HEK293细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 食品科学, 2023, 44(23): 142-150.

, WEI

, MA

, et al. Protective effect of antioxidant peptides derived from yak milk casein on oxidative stress injury in HEK293 cells[J]. Food Science, 2023, 44(23): 142-150.

[9]

李委红. 酪蛋白糖巨肽酶解物的制备及抗氧化活性研究[D]. 天津: 天津科技大学, 2019.

. Studies on the preparation and antioxidant activity of casein glycomacropeptide hydrolysates[D]. Tianjin: Tianjin University of Science and Technology, 2019.

[10]

成雪. 酪蛋白糖肽抑制巨噬细胞炎症反应的分子机制研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2015.

CHENG

. Molecular mechanisms underlying the anti-inflammatory effects of casein glycopeptide in macrophages[D]. Beijing: China Agricultural University, 2015.

[11]

SHU

, WANG

, CHEN

, et al. Enzymolysis technology optimization for production of antioxidant peptides from goat milk casein[J]. Acta Universitatis Cibiniensis. Series E: Food Technology, 2017, 21(1): 51-60.

[12]

, LIU

, ZHANG

, et al. Enzymolysis technology optimization for production of antioxidant peptides from chickpea protein[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2008, 24(1): 268-273.

[13]

孙佳益. 南美白对虾主要过敏原原肌球蛋白的过敏原性消减方法探讨[C]. 上海: 上海海洋大学第十四届研究生论文报告会论文集, 2012.

SUN

. Reduction of allergenicity of Penaeus vannamei major allergen tropomyosin[C]. Shanghai:Proceedings of the 14th Graduate Thesis Report of Shanghai Ocean University, 2012.

[14]

, HE

, SHAO

, et al. Extracellular proteins, polysaccharides and enzymes impact on sludge aerobic digestion after ultrasonic pretreatment[J]. Water Research, 2008, 42(8-9): 1925-1934.

[15]

GHASEMI

, ABBASI

. Formation of natural casein micelle nanocapsule by means of pH changes and ultrasound[J]. Food Hydrocolloids, 2014, 42: 42-47.

[16]

VARGAS

, RUIZ-LOPEZ

, AMADOR-ESPEJO

GRE

, et al. Use of high-intensity ultrasound and micellar casein concentrate addition for improving whey Ricotta cheese production[J]. International Journal of Dairy Technology, 2024, 77(2): 518-531.

[17]

张雨萌. 农产品加工利用. 超声改性酪蛋白胶束及其与多糖互作的酶诱导凝胶特性研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2022.

ZHANG

. Study on the rennet-induced gel properties of caseinmicellar modified by ultrasound and interacted with polysaccharides[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences Thesis, 2022.

[18]

梁振华, 张静, 张千喜, 等. 超声预处理改性羊乳酪蛋白对酶解物ACE抑制活性的影响[J]. 中国乳品工业, 2025, 53(1): 37-43.

LIANG

, ZHANG

, et al. Effect of ultrasonic pretreatment-modified goat milk casein on the ACE inhibitoryactivity of enzymatic digest[J]. China Dairy Industry, 2025, 53(1): 37-43.

[19]

钟烜钰, 刘宇佳, 朱杰, 等. 超声辅助酶解法提取火龙果皮结合酚及其抗氧化和酶抑制活性研究[J]. 食品安全质量检测学报, 2023, 14(13): 25-32.

ZHONG

, LIU

, ZHU

, et al. Study on ultrasonic assisted enzymatic hydrolysis for extraction of bound phenol of pitahaya peel and its antioxidant and enzyme inhibitory activities[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2023, 14(13): 25-32.

[20]

熊治渝, 孙兰静, 张倩倩, 等. 虾肉蛋白在乳酸菌发酵过程中的降解及其体外抗氧化活性的动态变化[J]. 食品科学, 2024, 45(22): 65-72.

XIONG

, SUN

, ZHANG

, et al. Degradation of shrimp proteins during fermentation with lactic acid bacteria and dynamic changes in their in vitro antioxidant activity[J]. Food Science, 2024, 45(22): 65-72.

[21]

张涵, 黄意情, 王海东, 等. 五味子蛋白酶解前后抗氧化活性和功能特性[J]. 食品研究与开发, 2024, 45(15): 42-52.

ZHANG

, HUANG

, WANG

, et al. Antioxidant activity of Schisandra chinensis protein before and after enzymolysis and functional characteristics[J]. Food Research and Development, 2024, 45(15): 42-52.

[22]

夏琪娜. 超声预处理结合美拉德对酪蛋白及其酶解物抗氧化性影响[D]. 哈尔滨: 东北农林大学, 2019.

XIA

. Effects of ultrasonic pretreatment combined with Maillard reaction on antioxidant activity of casein and its enzymatic hydrolysates[D]. Harbin: Northeast Agricultural University, 2019.

[23]

FERREIRA

, BRUNS

, FERREIRA

, et al. Box-Behnken design: An alternative for the optimization of analytical methods[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 597(2): 179-186.

[24]

PATRICK

, HANS

, ANGELIKA

. Determination of the bovine food allergen casein in white wines by quantitative indirect ELISA, SDS-PAGE, western blot and immunostaining[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(18): 8399-8405.

[25]

刘爱成, 杨惠仪, 王奕雯, 等. 超声处理对乳清蛋白致敏性及结构的影响[J]. 中国乳品工业, 2024, 52(6): 17-22.

LIU

AIC

, YANG

, WANG

, et al. Effect of ultrasonic treatment on sensitization and structure of whey protein[J]. China Dairy Industry, 2024, 52(6): 17-22.

[26]

MAHMOUD

, MALONE

, CORDLE

. Enzymatic hydrolysis of casein: Effect of degree of hydrolysis on antigenicity and physical properties[J]. Journal of Food Science, 1992, 57(5): 1223-1229.

[27]

SMITH

, HANSEN

. The pH-rate profile for the hydrolysis of a peptide bond[J]. Journal of the American Chemical Society, 1998, 120(35): 8910-8913.

[28]

董晓斌, 付丽丽, 朴姗善, 等. 发酵乳清蛋白制取抗氧化肽的研究[J]. 食品科学, 2011, 32(S1): 172-175.

DONG

, FU

, PIAO

, et al. Study on the anti-oxidative capability of the fermentation product of the whey protein by probiotics[J]. Food Science, 2011, 32(S1): 172-175.

[29]

马宇骥, 李键, 王洪志, 等. 复合酶解牦牛乳酪蛋白工艺优化及抗氧化性的研究[J]. 食品科技, 2018, 43(2): 109-114.

, LI

, WANG

, et al. Optimization on enzyme process and antioxidant activity of yak's milkcasein polypeptide[J]. Food Science and Technology, 2018, 43(2): 109-114.

[30]

张辉, 张娜娜, 马丽, 等. 响应面法优化大麦苗叶绿素提取工艺[J]. 食品科学, 2014, 35(2): 75-80.

ZHANG

, ZHANG

, MA

, et al. Optimization of extraction process for chlorophyll from young barley grasses based on response surface methodology[J]. Food Science, 2014, 35(2): 75-80.

[31]

田泱源, 李瑞芳. 响应面法在生物过程优化中的应用[J]. 食品工程, 2010(2): 8-11, 53.

TIAN

, LI

. Application of response surface methodology in the optimization of bioprocesses[J]. Food Engineering, 2010(2): 8-11, 53.

[32]

褚冲, 姚尚杰, 黄钧, 等. 中心组合设计优化野葛糖化工艺[J]. 中国酿造, 2016, 35(9): 145-149.

CHU

, YAO

, HUANG

, et al. Optimization of saccharification conditions of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi with central composite design[J]. China Brewing, 2016, 35(9): 145-149.

[33]

彭传友, 廖立敏. 中心组合设计优化超声波提取枇杷叶多糖研究[J]. 中国食品添加剂, 2021, 32(12): 9-15.

PENG

, LIAO

. Study on optimization of ultrasonic extraction of polysaccharidesfrom loquat leaf by center combination design[J]. China Food Additives, 2021, 32(12): 9-15.

[34]

, SUN

, LIU

, et al. Ultrasonic-assisted enzymolysis to improve the antioxidant activities of peanut (Arachin conarachin L.) antioxidant hydrolysate[J]. International Journal of Mechanical Sciences, 2012, 13(7): 9051-9068.

[35]

ELAHE

, SHIMA

, SEYED

HBM

. Structure-based modification of a-amylase by conventional and emerging technologies: Comparative study on the secondary structure, activity, thermal stability and amylolysis efficiency[J]. Food Chemistry, 2023, 437(P1): 137903.

[36]

CAI

, LIU

, XU

, et al. Mineral-element-chelating activity of food-derived peptides: Influencing factors and enhancement strategies[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2025, 65(16): 3241-3255.

[37]

李墨翰, 宋婉莹, 张秀敏, 等. 乳极性脂质组成及其功能性研究进展[J]. 乳业科学与技术, 2022, 45(2): 24-29.

, SONG

, ZHANG

, et al. Progress in understanding the composition and function of milk polar lipids[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2022, 45(2): 24-29.

[38]

李墨翰, 宋婉莹, 于海坤, 等. 乳脂分离与检测分析技术研究进展[J]. 沈阳农业大学学报, 2021, 52(2): 246-256.

, SONG

, ZHANG

, et al. Research progress in separation and analytical methods of milk lipids[J]. Journal of Shenyang Agricultural University, 2021, 52(2): 246-256.

[39]

WANLU

, RU

, LI

, et al. Study on processing stability and fermentation characteristics of donkey milk[J]. LWT-Food Science and Technology, 2020, 124: 109151.

[40]

李墨翰, 张秀敏, 王亦宁, 等. 牛初乳与牛常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的表征与分析[J]. 食品科学, 2022, 43(12): 163-170.

, ZHANG

, WANG

, et al. Characterization and analysis of differentially abundant proteins in milk fat globule membranes between bovine colostrum and mature milk[J]. Food Science, 2022, 43(12): 163-170.

[41]

CHANDRAPALA

, MARTIN

GJO

, ZISU

, et al. The effect of ultrasound on casein micelle integrity[J]. Journal of Dairy Science, 2012, 95(12): 6882-6890.

[42]

胡锦瑞, 曹荣安, 陈洪生, 等. 超声辅助酶解对绿豆蛋白水解物结构和抗氧化活性的影响[J/OL]. 中国食品学报, 1-14. [2024-12-30]. DOI: 10.16429/j.1009-7848.2025.01.023

, CAO

RAN

, CHEN

, et al. Effect of ultrasound-assisted enzymatic digestion on the structure and antioxidantactivity of mung bean protein hydrolysate[J/OL]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 1-14. [2024-12-30]. DOI: 10.16429/j.1009-7848.2025.01.023

[43]

杜童申, 刘悦, 马骏骅, 等. 超声预处理对亚麻籽胶-大豆分离蛋白复合凝胶凝胶特性及结构的影响[J]. 食品工业科技, 2024, 45(13): 83-90.

, LIU

, MA

, et al. Effect of ultrasonic pretreatment on the gel properties and structure of flaxseed gum-soybean protein isolate composite gels[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(13): 83-90.

2025年第16卷第15期

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文章信息

doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250610002

接收时间：2025-06-10
首发时间：2026-01-09
出版时间：2025-08-15

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作者

出版历史

收稿日期：2025-06-10

基金

辽宁省自然科学基金联合基金项目(2023-BSBA-281)

作者信息

¹ 沈阳农业大学食品学院, 沈阳 110866

² 乳业生物技术国家重点实验室, 上海乳业生物工程技术研究中心, 光明乳业股份有限公司乳业研究院, 上海 200436

³ 上海交通大学生命科学技术学院, 上海 200240

通讯作者:

*李墨翰(1994—), 男, 副教授, 主要研究方向为动物源食品加工与利用。E-mail: fslimohan@126.com

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/spaq/CN/10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250610002

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

蛋白酶种类	最适pH	最适温度/℃
碱性蛋白酶	8.0~9.0	50~60
中性蛋白酶	6.5~7.5	45~55
胃蛋白酶	1.5~2.5	35~45
胰蛋白酶	7.5~8.5	45~55
木瓜蛋白酶	6.0~7.0	55~65

蛋白酶种类

最适pH

最适温度/℃

碱性蛋白酶

8.0~9.0

50~60

中性蛋白酶

6.5~7.5

45~55

胃蛋白酶

1.5~2.5

35~45

胰蛋白酶

7.5~8.5

45~55

木瓜蛋白酶

6.0~7.0

55~65

编码水平	A-温度 /℃	B-时间 /h	C-pH	D-酶添加量 /%	E-底物浓度 /%
低(-1)	50	2	7	3.5	3
高(+1)	60	4	8	4.5	5

编码
水平

A-温度
/℃

B-时间
/h

C-pH

D-酶添加量
/%

E-底物浓度
/%

低(-1)

3.5

高(+1)

4.5

因素	编码水平
A-温度/℃	55.0	55.5	56.0
C-pH	7.5	7.9	8.3
D-酶添加量/%	4.0	4.5	5.0

因素

编码水平

-1

A-温度/℃

55.0

55.5

56.0

C-pH

7.5

7.9

8.3

D-酶添加量/%

4.0

4.5

5.0

试验号	A/℃	B/h	C	D/%	E/%	DPPH自由基清除率/%
1	60	4	7	4.5	5	67.16
2	50	4	8	3.5	5	55.63
3	60	2	8	4.5	3	63.21
4	50	4	7	4.5	5	62.51
5	50	2	8	3.5	5	54.06
6	50	2	7	4.5	3	64.96
7	60	2	7	3.5	5	62.50
8	60	4	7	3.5	3	64.10
9	60	4	8	3.5	3	59.34
10	50	4	8	4.5	3	61.31
11	60	2	8	4.5	5	63.73

试验号

A/℃

B/h

D/%

E/%

DPPH自由基
清除率/%

4.5

67.16

3.5

55.63

4.5

63.21

4.5

62.51

3.5

54.06

4.5

64.96

3.5

62.50

3.5

64.10

3.5

59.34

4.5

61.31

4.5

63.73

来源	自由度	平方和	均方	F	P	显著性
模型	5	161.92	32.38	30.49	0.0003	显著
A/℃	1	46.89	46.89	44.14	0.0006	显著
B/h	1	1.17	1.17	1.10	0.3352
C	1	39.60	39.60	37.28	0.0009	显著
D/%	1	72.03	72.03	67.81	0.0002	显著
E/%	1	2.24	2.24	2.11	0.1970
残差	6	6.37	1.06	30.49	0.0003
综合	11	168.29	32.38	44.14	0.0006
R²=0.9621	R_Pred²=0.8485	CV/%=1.68
R²_adj=0.9306	精密度=17.9891

来源

自由度

平方和

均方

显著性

模型

161.92

32.38

30.49

0.0003

显著

A/℃

46.89

44.14

0.0006

显著

B/h

1.17

1.10

0.3352

39.60

37.28

0.0009

显著

D/%

72.03

67.81

0.0002

显著

E/%

2.24

2.11

0.1970

残差

6.37

1.06

30.49

0.0003

综合

168.29

32.38

44.14

0.0006

R²=0.9621

R_Pred²=0.8485

CV/%=1.68

R²_adj=0.9306

精密度=17.9891

处理	步长	D/%	A/℃	C	DPPH自由基清除率/%
1	0	4.0	55.0	7.5	59.91
2	0+1Δ	4.5	55.5	7.9	65.25
3	0+2Δ	5.0	56.0	8.3	64.53
4	0+3Δ	5.5	56.5	8.7	60.72
5	0+4Δ	6.0	57.0	9.1	55.28
6	0+5Δ	6.5	57.5	9.5	53.74

处理

步长

D/%

A/℃

DPPH自由基
清除率/%

4.0

55.0

7.5

59.91

0+1Δ

4.5

55.5

7.9

65.25

0+2Δ

5.0

56.0

8.3

64.53

0+3Δ

5.5

56.5

8.7

60.72

0+4Δ

6.0

57.0

9.1

55.28

0+5Δ

6.5

57.5

9.5

53.74

试验号	D/%	A/℃	C	DPPH自由基清除率/%
1	4.0	55.0	7.9	65.61
2	5.0	55.0	7.9	65.77
3	4.0	56.0	7.9	65.44
4	5.0	56.0	7.9	66.12
5	4.0	55.5	7.5	65.56
6	5.0	55.5	7.5	65.89
7	4.0	55.5	8.3	65.83
8	5.0	55.5	8.3	65.98
9	4.5	55.0	7.5	65.87
10	4.5	56.0	7.5	66.07
11	4.5	55.0	8.3	66.21
12	4.5	56.0	8.3	66.08
13	4.5	55.5	7.9	66.71
14	4.5	55.5	7.9	66.79
15	4.5	55.5	7.9	66.75
16	4.5	55.5	7.9	66.78
17	4.5	55.5	7.9	66.76

试验号

D/%

A/℃

DPPH自由基清除率/%

4.0

55.0

7.9

65.61

5.0

55.0

7.9

65.77

4.0

56.0

7.9

65.44

5.0

56.0

7.9

66.12

4.0

55.5

7.5

65.56

5.0

55.5

7.5

65.89

4.0

55.5

8.3

65.83

5.0

55.5

8.3

65.98

4.5

55.0

7.5

65.87

4.5

56.0

7.5

66.07

4.5

55.0

8.3

66.21

4.5

56.0

8.3

66.08

4.5

55.5

7.9

66.71

4.5

55.5

7.9

66.79

4.5

55.5

7.9

66.75

4.5

55.5

7.9

66.78

4.5

55.5

7.9

66.76

来源	平方和	自由度	均方	F	P	显著性
模型	3.4100	9	0.3784	122.60	<0.0001	显著
D	0.2178	1	0.2178	70.57	<0.0001	显著
A	0.0078	1	0.0078	2.53	0.1556
C	0.0630	1	0.0630	20.42	0.0027	显著
DA	0.0676	1	0.0676	21.90	0.0023	显著
DC	0.0081	1	0.0081	2.62	0.1493
AC	0.0272	1	0.0272	8.82	0.0208	显著
D²	1.6900	1	1.6900	546.19	<0.0001	显著
A²	0.6412	1	0.6412	207.76	<0.0001	显著
C²	0.4053	1	0.4053	131.31	<0.0001	显著
残差	0.0216	7	0.0031
失拟	0.0177	3	0.0059	6.09	0.0567	不显著
R²=0.9937	R_Pred²=0.9155	CV/%=0.0840
R²_adj=0.9856	精密度=30.1989

来源

平方和

自由度

均方

显著性

模型

3.4100

0.3784

122.60

<0.0001

显著

0.2178

70.57

<0.0001

显著

0.0078

2.53

0.1556

0.0630

20.42

0.0027

显著

0.0676

21.90

0.0023

显著

0.0081

2.62

0.1493

0.0272

8.82

0.0208

显著

D²

1.6900

546.19

<0.0001

显著

A²

0.6412

207.76

<0.0001

显著

C²

0.4053

131.31

<0.0001

显著

残差

0.0216

0.0031

失拟

0.0177

0.0059

6.09

0.0567

不显著

R²=0.9937

R_Pred²=0.9155

CV/%=0.0840

R²_adj=0.9856

精密度=30.1989

处理方法	α-螺旋相对含量/%	β-折叠相对含量/%	β-转角相对含量/%	无规则卷曲相对含量/%
CN	28.93±0.33^a	26.91±0.21^b	17.55±0.37^a	26.49±0.64^a
U-CN	28.79±0.43^a	26.60±0.37^b	16.49±0.64^ab	27.91±1.16^a
AEH-CN	28.78±0.33^a	27.17±0.22^b	16.86±0.38^ab	28.12±0.51^a
UAEH-CN	26.70±0.47^b	28.53±0.54^a	16.32±0.36^b	28.35±0.71^a

处理方法

α-螺旋相对含量/%

β-折叠相对含量/%

β-转角相对
含量/%

无规则卷曲相对含量/%

28.93±0.33^a

26.91±0.21^b

17.55±0.37^a

26.49±0.64^a

U-CN

28.79±0.43^a

26.60±0.37^b

16.49±0.64^ab

27.91±1.16^a

AEH-CN

28.78±0.33^a

27.17±0.22^b

16.86±0.38^ab

28.12±0.51^a

UAEH-CN

26.70±0.47^b

28.53±0.54^a

16.32±0.36^b

28.35±0.71^a