实验室检测

药动学参数(单位)	最小二乘几何均值及比值	结果
受试制剂(NT)	参比制剂(NR)	T/R 比值(%)	T/R 比值(%)的 90% CI
${\mathrm{C}}_{\max }\left({\mu \mathrm{g}/\mathrm{{mL}}}\right)$	31.242(44)	30.993(44)	101.06	98.46 ~103.31	等效
${\mathrm{{AUC}}}_{0 -\mathrm{t}}\left({\mathrm{h}\cdot \mathrm{{\mu g}}/\mathrm{{mL}}}\right)$	988.5(44)	970.6(44)	101.71	99.18~104.41	等效
${\mathrm{{AUC}}}_{0 -\infty }\left({\mathrm{h}\bullet \mathrm{{\mu g}}/\mathrm{{mL}}}\right)$	1012.1(43)	990.2(42)	101.94	99.30~104.87	等效

药动学参数(单位)	最小二乘几何均值及比值	结果
受试制剂(NT)	参比制剂(NR)	T/R 比值(%)	T/R 比值(%)的 90% CI
${\mathrm{C}}_{\max }\left({\mu \mathrm{g}/\mathrm{{mL}}}\right)$	31.242(44)	30.993(44)	101.06	98.46 ~103.31	等效
${\mathrm{{AUC}}}_{0 -\mathrm{t}}\left({\mathrm{h}\cdot \mathrm{{\mu g}}/\mathrm{{mL}}}\right)$	988.5(44)	970.6(44)	101.71	99.18~104.41	等效
${\mathrm{{AUC}}}_{0 -\infty }\left({\mathrm{h}\bullet \mathrm{{\mu g}}/\mathrm{{mL}}}\right)$	1012.1(43)	990.2(42)	101.94	99.30~104.87	等效

药动学参数(单位)	最小二乘几何均值及比值	结果
受试制剂(NT)	参比制剂(NR)	T/R 比值(%)	T/R 比值(%)的 90% CI
${\mathrm{C}}_{\max }\left({\mu \mathrm{g}/\mathrm{{mL}}}\right)$	30.562(34)	30.628(35)	99.82	97.70~101.87	等效
${\mathrm{{AUC}}}_{0 -\mathrm{t}}\left({\mathrm{h}\cdot \mathrm{{\mu g}}/\mathrm{{mL}}}\right)$	1049.1(34)	1051.3(35)	99.66	97.74 ~101.88	等效
${\mathrm{{AUC}}}_{0 -\infty }\left({\mathrm{h}\bullet \mathrm{{\mu g}}/\mathrm{{mL}}}\right)$	1093.1(34)	1091.5(35)	100.03	98.00~102.34	等效

药动学参数(单位)	最小二乘几何均值及比值	结果
受试制剂(NT)	参比制剂(NR)	T/R 比值(%)	T/R 比值(%)的 90% CI
${\mathrm{C}}_{\max }\left({\mu \mathrm{g}/\mathrm{{mL}}}\right)$	30.562(34)	30.628(35)	99.82	97.70~101.87	等效
${\mathrm{{AUC}}}_{0 -\mathrm{t}}\left({\mathrm{h}\cdot \mathrm{{\mu g}}/\mathrm{{mL}}}\right)$	1049.1(34)	1051.3(35)	99.66	97.74 ~101.88	等效
${\mathrm{{AUC}}}_{0 -\infty }\left({\mathrm{h}\bullet \mathrm{{\mu g}}/\mathrm{{mL}}}\right)$	1093.1(34)	1091.5(35)	100.03	98.00~102.34	等效

超高效液相色谱-串联质谱联用技术在丙戊酸钠缓释片生物等效性研究中的应用

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梁彦 ¹^,^* , 陈建宁 ²

实验室检测 | 创新应用 2024,2(12): 32-34

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实验室检测 | 创新应用 2024, 2(12): 32-34

超高效液相色谱-串联质谱联用技术在丙戊酸钠缓释片生物等效性研究中的应用

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梁彦¹^,^*, 陈建宁²

作者信息

¹ 桂林医学院附属医院药学部桂林 541001

² 桂林市人民医院药学部桂林 541002

梁彦,主管药师,研究方向为药物代谢研究。

陈建宁,硕士,初级药师,研究方向为临床药学及应用。

通讯作者:

^*梁彦，主管药师，研究方向为药物代谢研究。E-mail: 23696724@qq.com

Application of ultra performance lc-mass spectrometry/mass spectrometry method in the bioequivalence study of Sodium Valproate Sustained-Release Tablets

Yan LIANG¹^,^*, Jian-Ning CHEN²

Affiliations

¹ Department of Pharmacy Affiliated Hospital of Guilin Medical University Guilin 541001 China

² Department of Pharmacy Guilin People's Hospital Guilin 541002 China

出版时间: 2024-12-08

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摘要

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目的建立一个能够快速、简便、大批量分析检测丙戊酸血药浓度,并可应用于评价丙戊酸钠缓释片在健康志愿者中的生物等效性的检测方法学。方法组织受试者服用规格为${0.5}\mathrm{\;g}$的丙戊酸钠缓释片受试制剂与参比制剂, 采集血样并制备血浆样本。用所建立的超高效液相色谱 - 串联质谱联用技术 (ultra performance lc-mass spectrometry/ mass spectrometry, UPLC-MS/MS)测定血浆中丙戊酸的浓度。结果在空腹和餐后条件下,两制剂在吸收速度、吸收程度上均生物等效。结论本实验建立了一种准确、快速地检测人血浆样本中丙戊酸含量的 UPLC-MS/MS 法。两种制剂具有生物等效性。

关键词

方法学 / 丙戊酸钠缓释片 / 药物代谢动力学 / 生物等效性 / 超高效液相色谱-串联质谱

Abstract

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Objective Establish a detection methodology that can quickly, easily, and in large quantities analyze and detect the blood concentration of valproic acid, and can be applied to evaluate the bioequivalence of Sodium Valproate Sustained-Release Tablets in healthy volunteers. Methods Organize subjects to take the test and reference formulations of 0.5 g sodium valproate sustained-release tablets, collect blood samples, and prepare plasma samples. Determine the concentration of valproic acid in plasma using the established ultra performance lc-mass spectrometry/mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Results Under fasting and postprandial conditions, both formulations were bioequivalence in terms of absorption rate and degree. Conclusion This experiment established an accurate and rapid UPLC-MS/MS method for detecting the content of valproic acid in human plasma samples. Two formulations have bioequivalence.

Key words

methodology / Sodium Valproate Sustained-Release Tablets / pharmacokinetics / bioequivalence / ultra performance lc-mass spectrometry/mass spectrometry

引用本文

梁彦, 陈建宁. 超高效液相色谱-串联质谱联用技术在丙戊酸钠缓释片生物等效性研究中的应用. 实验室检测, 2024 , 2 (12) : 32 -34 .

Yan LIANG, Jian-Ning CHEN. Application of ultra performance lc-mass spectrometry/mass spectrometry method in the bioequivalence study of Sodium Valproate Sustained-Release Tablets[J]. Laboratory Testing, 2024 , 2 (12) : 32 -34 .

正文

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0 引言

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丙戊酸钠(valproic acid, VPA)能够促进$\gamma$-氨基丁酸 ($\gamma$-aminobutyric acid, GABA) 受体的激活,增加 GABA 的释放, 或直接与 GABA 受体结合,增强其抑制效应^[1]。这种机制可以抑制神经元的异常放电,从而抑制癫痫的发作。其是一种临床上常用的一线抗癫痫药物, 并广泛应用于治疗双相情感障碍、急性躁狂和偏头痛等疾病,也具有抗肿瘤、抗戒断症状、抑菌等疗效。需要注意的是 VPA 属于窄治疗窗药物, 应根据患者的具体情况进行个体化的治疗方案。当血药浓度过高时可能会引起一些不良反应, 如头晕、恶心、皮疹等, 患者在使用期间应注意不良反应的监测和管理。丙戊酸钠缓释片的良好疗效,使其在临床得到了广泛的应用^[2]。一直以来,国内生物等效性研究多采用 HPLC 或 LC-MS 法为主要检测手段^[3]。由于 VPA 属于窄治疗窗药物且有研究表明其变异较大^[4],因此本品种生物等效性试验等效难度极大, 开展体内 BE 研究前需充分评估制剂差异, 临床试验过程中应注重个体内变异控制, 提高临床试验质量, 降低试验不等效的风险,根据《窄治疗指数药物生物等效性研究技术指导原则》^[5], 本文通过建立 UPLC-MS/MS 法, 测定人血浆中 VPA 的浓度, 根据参比制剂的个体内变异 (within subject variability, WSV) 标度的平均生物等效性标准来评价国内某厂家生产的丙戊酸钠缓释片与参比制剂 (德巴金) 是否具有生物等效性, 为国内做相关药物实验的工作人员提供参考和依据。

1 材料与方法

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1.1 实验材料

1.1.1 试验药物信息

受试制剂为国内某药企生产的丙戊酸钠缓释片, 参比制剂根据化学仿制药参比制剂目录(第六十四批),选择由 SANOFI WINTHROP INDUSTRIE 公司生产的丙戊酸钠缓释片 (Depakine® Chrono, 德巴金)。待测物对照品选用自中国食品药品检定研究院购买的丙戊酸钠 (批号 100963-202004), 内标选用从加拿大 TLC 购买的丙戊酸 -D14 钠盐 (批号 4376-018A3)。

1.2 主要仪器

液相色谱仪和质谱系统皆是来自美国 Waters 公司, 移液器等材料主要选择 Gilson 和 Rainin 公司的产品。

1.3 方法学的开发与验证

1.3.1 分析条件

通过查阅丙戊酸的理化性质与化学结构, 采用以纯乙腈为基础的蛋白质沉淀法对样本进行预处理, 以丙戊酸-D14 作为内标。本方法操作快捷且提取效果较好,乙腈和 5 mmol 碳酸氢铵配置的流动相,具有较好的分离度和响应。

1.3.2 测定条件

色谱条件: 色谱柱 Waters ACQUITY UPLC BEH${\mathrm{C}}_{18}$ $\left({{2.1}\mathrm{\;{mm}}\times {50}\mathrm{\;{mm}},{1.7\mu }\mathrm{m}}\right)$; 柱温${40}^{\circ }\mathrm{C}$; 流动相$\mathrm{A}: 5\mathrm{\;{mmol}}/\mathrm{L}$碳酸氢铵水溶液,流动相 B: 乙腈；流速:0.3 mL/min。质谱条件:离子源 ESI；检测模式为多反应监测扫描 (MRM)；喷雾器电压${1500}\mathrm{\;V}$;温度${150}^{\circ }\mathrm{C}$。电离方式为负离子电离,用于检测的离子对为丙戊酸(m/z:143.08/143.08),内标丙戊酸-D14 (157.18/157.18), 二者皆以原型母离子保留, 故检测母离子。

1.3.3 溶液配置

工作液的配制:称取丙戊酸加入适量甲醇配制成${1.000}\mathrm{{mg}}/\mathrm{{mL}}$丙戊酸储备液, 取适量储备液用 50% 甲醇水逐级稀释, 配制成丙戊酸的终浓度为 6.000、12.000、36.000、72.000、216.000、 480.000、960.000、1200.000μg/mL的标准曲线溶液。

1.3.4 样品的预处理方法

取血浆${100\mu }\mathrm{L}$至96孔聚丙烯板,加入${200\mu }\mathrm{L}$乙腈,将板密封后在振荡器上振荡 2 min,后在${4000}\mathrm{r}/\mathrm{{min}}$,下离心${15}\mathrm{\;{min}}$。取上清${100\mu }\mathrm{L}$转移到另一个 96 孔聚丙烯板,加入${300\mu }\mathrm{L}$稀释剂混匀,后在${4000}\mathrm{r}/\mathrm{{min}}$,下离心${15}\mathrm{\;{min}}$,将样品转移至进样器中等待进样。

1.3.5 回收率及精密度实验

分别配制 0.900、20.000、45.000 μg/mL 丙戊酸血浆样本,按 “1.3.4” 项下操作,得出丙戊酸低、中、高浓度回收率: 76.04%、 72.48%、75.15%,回收率的变异系数分别为 4.07%、2.39%、2.68%, 提取后样品待测物响应变异系数分别为 2.76%、1.98%、2.90%, 未提取样品待测物响应变异系数分别为 4.26%、1.08%、1.19%；不同浓度水平待测物回收率的总体变异系数为 2.48%。符合《中华人民共和国药典》规定中变异系数<15% 的要求^[6]。

本法满足各项验证要求,能够在${0.300}\sim {60.000\mu }\mathrm{g}/\mathrm{{mL}}$范围内准确测定丙戊酸血浆样本的含量,因此展开生物等效性研究。

1.4 临床试验

1.4.1 受试者的选择

选取男女健康受试者$\left({n ={80}}\right)$,通过临床评估(体格检查、心电图)和血、尿常规,肝肾功能和传染病筛查等实验室检查对其健康状况进行评估。临床研究方案经伦理委员会审核同意。受试者在充分了解试验的目的、方法与受试药品的药理作用、不良反应及临床基本应用后,自愿签署 “志愿受试者知情同意书” 成为本试验志愿受试者。

1.4.2 给药方案

采用随机、开放、单中心、四周期、两序列完全重复交叉设计, 单剂量给药试验, 将筛选合格的 80 名受试者随机分配到空腹组及餐后组, 空腹 44 人, 餐后 36 人, 给药剂量为 1 片, 空腹和餐后试验的受试者均随机分 2 组,空腹组于给药前空腹${10}\mathrm{\;h}$, 空腹状态下服用受试制剂(T)1 片或参比制剂(R)1 片,餐后组在试验当日晨取空白血后进食高脂高热量早餐,并在 30 min 内用餐完毕,进餐后${30}\mathrm{\;{min}}$时$\left({\pm 1\mathrm{\;{min}}}\right)$,准时服用$\mathrm{T}$药或$\mathrm{R}$药 1 片。空腹组和餐后组均在给药后 1 小时内禁止饮水,给药 4、 10 小时后进食清淡饮食。

1.4.3 血样采集

分别于给药前(0h)及给药后$1\text{、}2\text{、}3\text{、}4\text{、}5\text{、}6\text{、}7\text{、}8\text{、}9$、 10、11、12、13、14、15、16、24、36、48、72、96h 采集静脉血约$3\mathrm{\;{mL}}$。并在采血后$1\mathrm{\;h}$内置于低温离心机在${4}^{\circ }\mathrm{C},{1200}\mathrm{\;g}$条件下离心${10}\mathrm{\;{min}}$。离心完成之后,将血浆样本分成两份,一份检测(分装约${0.75}\mathrm{\;{mL}}$),一份备份 (剩余的血浆)。当血浆量不足时,优先保证检测管用量^[6]。血样离心后于$2\mathrm{\;h}$内转入$-{80}^{\circ }\mathrm{C}$超低温冰箱保存至将血浆样品转运到实验室。后续按上述方法进行检测。

1.4.4 药代动力学参数的计算

采用 1.3 项下的方法学对受试者的血浆样本进行血药浓度分析, 对各受试者的给药剂量和血药浓度 - 实际采血结束时点数据, 采用 Phoenix WinNonlin 8.2 软件, 以非房室模型法 (NCA 模块) 计算${\mathrm{T}}_{\max }$、${\mathrm{C}}_{\max }$、${\mathrm{{AUC}}}_{0\text{-}t}$、${\mathrm{{AUC}}}_{0\text{-}\infty }$、${t}_{1/2}$等药动学参数。

2 结果与分析

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2.1 药代动力学参数

采用 UPLC-MS/MS 法对样本进行丙戊酸含量的分析。待测样本的检测共 44 个分析批次,其中空腹组 24 个分析批次,餐后组 20 个分析批次。本次待测样本分析中无质控样品准确度偏差范围超过$\pm {15.0}\%$ 的情况,标曲中所有浓度点的准确度均在 85%~115% 范围内,标准曲线${r}^{2}$ 均值为 0.997645$\geq {0.99}$ 。所有分析批次都符合接受标准。在检测过程中血药浓度数据无缺失, 空腹组和餐后组丙戊酸的平均血药浓度 - 时间关系如图 1~2。

2.2 生物等效性评价

空腹组: 最小二乘均数估计法计算,受试制剂$\mathrm{T}$ 与参比制剂$\mathrm{R}$ 的${\mathrm{C}}_{\max }$ 、${\mathrm{{AUC}}}_{0 - t}$ 、${\mathrm{{AUC}}}_{0 -\infty }$ 的几何均数比值 (GMR) 及其 90% 置信区间分别为 101.06%(98.46%103.31%)、101.71%(99.18% 104.41%)、100.94%(99.30%~104.87%),均在《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》中生物等效性的等效范围要求内 (80.00%~125.00%),可认为两制剂具有生物等效性, 具体见下表 1。

餐后组最小二乘均数估计法计算,受试制剂 (T) 与参比制剂(R)的${\mathrm{C}}_{\max }$ 、${\mathrm{{AUC}}}_{0 - t}$ 、${\mathrm{{AUC}}}_{0 -\infty }$ 的几何均数比值(GMR)及其 90% 置信区间分别为 99.82%(97.70%~101.87%)、 99.66%(97.74% 101.88%)、100.03%(98.00% 102.34%),均在《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》中生物等效性的等效范围要求内 (80.00%~125.00%),可认为受试制剂 (T) 与参比制剂 (R) 具有生物等效性。丙戊酸的主要药动学参数等效性统计分析结果见下表 2。

在空腹及餐后条件下的吸收速度、吸收程度上均生物等效。

3 讨论与结论

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根据《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》的规定一般推荐仅测定原形药物, 因为相比代谢产物, 其药时曲线一般能更大程度的突出两种制剂的差异性^[8]。且根据要求如同时满足以下两点,才需要同时予以测定:(1)代谢产物主要产生于进入体循环以前,如源自首过效应或肠道内代谢等；(2)代谢产物显著影响药物的安全性和有效性^[9]。建议以原形药物评价生物等效性,代谢产物的相关数据用于进一步支持临床疗效的可比性^[10]。VPA 口服后在血浆中基本以原形存在, 其代谢产物未同时满足上述两点条件, 故仅检测丙戊酸的血药浓度。本文采用液质联用的方法不仅样本处理简单、耗时短,也更灵敏。

免疫测定法是治疗药物监测实验室最常用的方法, 因为它易于使用, 但缺乏高选择性并且不能大批量检测。通过 HPLC 和 GC 制备丙戊酸分析样品的传统方法很复杂。而采用液质联用的方法不仅样本处理简单、耗时短,也更灵敏。结合方法学的建立与验证部分的数据来看, 从系统适应性, 特异性, 基质效应, 回收率与稳定性等方面均表明此分析方法各项指标均符合《中华人民共和国药典》9012 指导原则的要求,且准确性和用时都优于以往的 LC-MS 法和《中华人民共和国药典》中记载的 HPLC 法, 可以用于实际临床应用中丙戊酸的检测, 也可以为其他药物的检测提供参考价值。

丙戊酸钠缓释片属于高变异指数、窄治疗指数药物, 而以往的等效性研究中, 均采用两周期或三周期实验设计, 而我们采用完全重复(两制剂、四周期、两序列)交叉设计, 这样做不仅可以通过较少的受试者获得更多的样本量, 节省大量人力及财力成本, 减少不必要的人群暴露, 可以同时获得确切的受试制剂个体内变异系数。对于口服缓释制剂, 建议同时进行空腹和餐后生物等效性研究。这又是本实验对比以往研究的一大创新点。

本研究成功建立了具有高度特异性, 适用于检测血浆样本中丙戊酸含量的 UPLC-MS/MS 方法, 其快速、简便且经济, 适用于样本的大批量处理。并且验证了以丙戊酸计,两制剂

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第2卷第12期

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首发时间：2025-07-28
出版时间：2024-12-08

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¹ 桂林医学院附属医院药学部桂林 541001

² 桂林市人民医院药学部桂林 541002

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^*梁彦，主管药师，研究方向为药物代谢研究。E-mail: 23696724@qq.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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