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目的 建立壮腰健肾丸的高效液相色谱(HPLC)特征图谱及金丝桃苷的含量测定方法。方法 HPLC特征图谱采用月旭 Ultimate AQC18 (4.6mm×250 mm, 5µm)色谱柱,流动相为0.1%磷酸溶液乙腈,梯度洗脱,检测波长215 nm;金丝桃苷的含量测定色谱柱为 SharpsilT C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 µm),流动相0.1%磷酸溶液乙腈(85:15),检测波长360nm。结果 新建的壮腰健肾丸的HPLC特征图谱,确认了12个特征峰,分别为没食子酸(1号峰)、原儿茶酸(2号峰)、原儿茶醛(3号峰)、红景天苷(4号峰)、刺桐碱(5号峰)、金丝桃苷(6号峰)、染料木苷(7号峰)、特女贞苷(8号峰)、槲皮素(9号峰)、齐墩果酸(10号峰)、12β-乙酰氧基黑老虎酸(11号峰)、开环新南五味子酸A(12号峰);含量测定中金丝桃苷进样量在0.001934~1.9341 µg范围内线性关系良好(r=0.9999),平均回收率为93.4%,19批样品中金丝桃苷质量分数在20.76~102.97 µg/g。结论 建立的HPLC特征图谱及含量测定方法适用于壮腰健肾丸的全面质量评价。

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*廖宝源,副主任中药师,研究方向为中药质量标准控制。E-mail:
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副主任中药师,研究方向为中药质量标准控制

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12β-乙酰氧基黑老虎酸 231219 98.0% 上海融禾医药科技发展有限公司
开环新南五味子酸 A 240107 98.0% 上海融禾医药科技发展有限公司
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名称 批号 含量 来源
没食子酸 110831-202407 90.8% 中国食品药品检定研究院
原儿茶酸 110809-202207 97.5% 中国食品药品检定研究院
原儿茶醛 110810-201909 99.6% 中国食品药品检定研究院
红景天苷 110818-202009 98.6% 中国食品药品检定研究院
刺桐碱 112058-202001 / 中国食品药品检定研究院
金丝桃苷 111521-201809 94.9% 中国食品药品检定研究院
染料木苷 111709-202303 / 中国食品药品检定研究院
特女贞苷 111926-201906 95.0% 中国食品药品检定研究院
槲皮素 100081-201610 99.1% 中国食品药品检定研究院
齐墩果酸 110709-202109 95.8% 中国食品药品检定研究院
12β-乙酰氧基黑老虎酸 231219 98.0% 上海融禾医药科技发展有限公司
开环新南五味子酸 A 240107 98.0% 上海融禾医药科技发展有限公司
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名称 批号 来源
狗脊 121071-201706 中国食品药品检定研究院
黑老虎 121438-201503 中国食品药品检定研究院
鸡血藤 121173-201805 中国食品药品检定研究院
金樱子 121047-201204 中国食品药品检定研究院
千斤拔 121502-201803 中国食品药品检定研究院
菟丝子 121232-202104 中国食品药品检定研究院
女贞子 121041-201905 中国食品药品检定研究院
桑寄生 121075-201604 中国食品药品检定研究院
牛大力 121209-202004 中国食品药品检定研究院
), ArticleFig(id=1154353360925876313, tenantId=1146029695717560320, journalId=1146119944283992078, articleId=1149789896161845911, language=CN, label=表 2, caption=对照药材名称、批号和来源, figureFileSmall=null, figureFileBig=null, tableContent=
名称 批号 来源
狗脊 121071-201706 中国食品药品检定研究院
黑老虎 121438-201503 中国食品药品检定研究院
鸡血藤 121173-201805 中国食品药品检定研究院
金樱子 121047-201204 中国食品药品检定研究院
千斤拔 121502-201803 中国食品药品检定研究院
菟丝子 121232-202104 中国食品药品检定研究院
女贞子 121041-201905 中国食品药品检定研究院
桑寄生 121075-201604 中国食品药品检定研究院
牛大力 121209-202004 中国食品药品检定研究院
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峰号 成分 药材归属
1 没食子酸 鸡血藤、桑寄生、金樱子、千斤拔
2 原儿茶酸 鸡血藤、桑寄生、金樱子、千斤拔、狗脊
3 原儿茶醛 狗脊
4 红景天苷 女贞子
5 刺桐碱 牛大力
6 金丝桃苷 菟丝子
7 染料木苷 千斤拔
8 特女贞苷 女贞子
9 槲皮素 桑寄生
10 齐墩果酸 女贞子
11 12β-乙酰氧基黑老虎酸 黑老虎
12 开环新南五味子酸 A 黑老虎
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峰号 成分 药材归属
1 没食子酸 鸡血藤、桑寄生、金樱子、千斤拔
2 原儿茶酸 鸡血藤、桑寄生、金樱子、千斤拔、狗脊
3 原儿茶醛 狗脊
4 红景天苷 女贞子
5 刺桐碱 牛大力
6 金丝桃苷 菟丝子
7 染料木苷 千斤拔
8 特女贞苷 女贞子
9 槲皮素 桑寄生
10 齐墩果酸 女贞子
11 12β-乙酰氧基黑老虎酸 黑老虎
12 开环新南五味子酸 A 黑老虎
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批号 金丝桃苷/
S1 48.14
S2 20.76
S3 29.2
S4 36.45
S5 23.64
S6 102.97
S7 77.1
S8 41.44
S9 37.31
S10 77.62
S11 36.67
S12 20.79
S13 61.98
S14 27.1
S15 29.99
S16 83.86
S17 41.47
S18 48.8
S19 35.18
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批号 金丝桃苷/
S1 48.14
S2 20.76
S3 29.2
S4 36.45
S5 23.64
S6 102.97
S7 77.1
S8 41.44
S9 37.31
S10 77.62
S11 36.67
S12 20.79
S13 61.98
S14 27.1
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S16 83.86
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基于高效液相色谱特征图谱及含量测定的壮腰健肾丸质量评价
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廖宝源 * , 方慧琼 , 肖芳红 , 吴应帅 , 李玲 , 王翠 , 袁芳 , 罗静
实验室检测 | 创新应用 2025,3(6): 1-5
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实验室检测 | 创新应用 2025, 3(6): 1-5
基于高效液相色谱特征图谱及含量测定的壮腰健肾丸质量评价
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廖宝源* , 方慧琼, 肖芳红, 吴应帅, 李玲, 王翠, 袁芳, 罗静
作者信息
  • 赣州市综合检验检测院 赣州

通讯作者:

*廖宝源,副主任中药师,研究方向为中药质量标准控制。E-mail:
Affiliations
出版时间: 2025-03-23
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目的 建立壮腰健肾丸的高效液相色谱(HPLC)特征图谱及金丝桃苷的含量测定方法。方法 HPLC特征图谱采用月旭 Ultimate AQC18 (4.6mm×250 mm, 5µm)色谱柱,流动相为0.1%磷酸溶液乙腈,梯度洗脱,检测波长215 nm;金丝桃苷的含量测定色谱柱为 SharpsilT C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 µm),流动相0.1%磷酸溶液乙腈(85:15),检测波长360nm。结果 新建的壮腰健肾丸的HPLC特征图谱,确认了12个特征峰,分别为没食子酸(1号峰)、原儿茶酸(2号峰)、原儿茶醛(3号峰)、红景天苷(4号峰)、刺桐碱(5号峰)、金丝桃苷(6号峰)、染料木苷(7号峰)、特女贞苷(8号峰)、槲皮素(9号峰)、齐墩果酸(10号峰)、12β-乙酰氧基黑老虎酸(11号峰)、开环新南五味子酸A(12号峰);含量测定中金丝桃苷进样量在0.001934~1.9341 µg范围内线性关系良好(r=0.9999),平均回收率为93.4%,19批样品中金丝桃苷质量分数在20.76~102.97 µg/g。结论 建立的HPLC特征图谱及含量测定方法适用于壮腰健肾丸的全面质量评价。

壮腰健肾丸  /  HPLC  /  含量测定  /  特征图谱  /  质量评价  /  金丝桃苷  /  12β-乙酰氧基黑老虎酸  /  开环新南五味子酸 A
廖宝源, 方慧琼, 肖芳红, 吴应帅, 李玲, 王翠, 袁芳, 罗静. 基于高效液相色谱特征图谱及含量测定的壮腰健肾丸质量评价. 实验室检测, 2025 , 3 (6) : 1 -5 .
壮腰健肾丸为内科类补肾壮骨类中成药, 处方由狗脊、黑老虎、牛大力、菟丝子(盐水制)等九味药组成。方中重用狗脊补肝肾、强筋骨、祛风湿,为君药。黑老虎行气止痛、散瘀通络,鸡血藤补血活血、舒筋活络,桑寄生补益肝肾、养血祛风、舒筋活络,女贞子和菟丝子(盐制) 补益肝肾,金樱子固精缩尿,以上六味药与君药相配,从而加强补肝肾、祛风湿、活络之力,为方中的臣药。千斤拔祛风湿、强腰膝、舒筋络,牛大力润肺,强筋活络,协助君臣药以加强补益扶正之功,为方中佐使药。以上诸药互相配伍,既能补肝肾、益气血,又能祛风湿、舒筋络、 强腰膝,扶正祛邪并用,故尤适用于肝肾不足,神经衰弱, 腰膝酸痛, 膝软无力, 小便频数, 遗精梦遗, 气血失调,风湿痹阻之症的治疗[1],同时可以提高机体的免疫功能[2]。药理研究${}^{\left\lbrack 3\text{-}6\right\rbrack }$发现,壮腰健肾丸具有固精补肾的作用, 有增强体质、提高适应能力和抗病能力; 对衰老过程中脑神经氧化损伤的发生有保护的作用;增强成骨细胞活性,增加骨密度; 提高小鼠血清免疫球蛋白$\mathrm{G}$的含量,调整机体免疫功能。
壮腰健肾丸有多个现行标准,其中药典业发 (2001) 第 578 号所附标准, 多个标准检验项目设置过于简单, 只有显微鉴别和化学反应鉴别项,个别标准增加了狗脊中原儿茶酸的含量测定项,但通过查找资料[7-10]和前期实验摸索, 原儿茶酸为鸡血藤、桑寄生、金樱子、千斤拔等药材的共有成分, 而非狗脊的专属性成分。狗脊、桑寄生的有效成分分别为原儿茶酸、咖啡酸、槲皮素等,具有抗感染、抗氧化之功效[11-13]。黑老虎的主要生理活性成分为木脂素和三萜酸[14],其中木脂素结构类型较多,立体化学复杂,而且具有抗肝炎、抗艾滋病毒和抗肿瘤等活性[15-16]。 中药指纹/特征图谱能够较为全面地体现中药复杂的物质基础,目前广泛被应用于中药的质量评价[17-19]。为全面控制与评价壮腰健肾丸质量, 本研究建立了高效液相色谱 (HPLC)特征图谱和含量测定方法。
Waters Arc 高效液相色谱仪,沃特世公司; XSE205DU 型电子天平, 梅特勒公司; Linomat5 型半自动点样仪, 卡玛公司; Good Lock-1000 型薄层数码成像系统,上海科哲。
对照品批号、含量、来源见表 1, 对照药材批号、来源见表 2
样品均为浓缩水蜜丸: A 公司 (批号: 240101)、B 公司(批号: 202310001)、C 公司(批号: 220503)、D 公司(批号:20240106)、E 公司(批号:20230602)、F 公司(批号: 2307053、2311088)、G 公司(批号:230530)、H 公司(批号:C08008、B08221)、I 公司(批号:A24A001)、J 公司 (批号:10723001)、K 公司(批号:24011123)、L 公司(批号:231204)、M 公司(批号:231103、240304)、N 公司 (批号: 202305001)、O 公司(批号: 3035004)、P 公司(批号:20230608),分别编号 S1~S19。
乙腈为色谱纯, Sigma-Aldrich; 其它试剂均为分析纯;硅胶$\mathrm{G}$预制薄层板、硅胶$\mathrm{H}$预制薄层板,青岛海洋化工;聚酰胺薄膜,台州市路桥四甲生化塑料厂。
取按本品工艺制备的缺菟丝子阴性对照样品, 同供试品溶液制备方法制成阴性对照样品溶液。
取 S5 号样品, 照 1.6.3 项下方法和 1.6.1 项下色谱条件, 制成供试品溶液并重复进样 6 次, 结果刺桐碱峰 (5 号峰)峰面积较大且分离度较好,以该峰为参照峰,得到 12 个主要色谱峰, 计算相对保留时间的相对标准偏差 (RSD) 为 0%~0.07%,相对峰面积 RSD 为 0%~2.60%,显示仪器精密度良好。
取 S5 号样品, 照 1.6.3 项下方法制成供试品溶液, 照 1.6.1 项下色谱条件于 0、3.5、9、14.5、24 h 分别进样,在得到的色谱图中, 以刺桐碱峰 ( 5 号峰) 为参照峰, 计算 12 个主要色谱峰的相对保留时间 RSD 为 0%~0.12%,相对峰面积 RSD 为 0%~2.70%,表明供试品溶液 24 h 内稳定。
照 1.6.3 项下方法和 1.6.1 项下色谱条件, 将 S5 号样品制成平行供试品溶液共 6 份并进样测定, 以刺桐碱峰 (5 号峰)为参照峰, 计算 12 个主要色谱峰的相对保留时间 RSD 为 0%~0.13%,相对峰面积 RSD 为 0%~2.95%,显示该方法具有良好的重复性。
照 1.6.3 项下方法和 1.6.1 项下色谱条件,将样品制成供试品溶液并进样, 记录色谱图, 用 Empower 软件导出特征图谱 CDF 格式, 并导入 2012 年版中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行处理, 以刺桐碱峰 ( 5 号峰) 为参照峰, 时间窗为 0.10, Mark 峰匹配方式, 对照图谱生成以平均数计算, 生成对照特征图谱。 19 批样品的叠加特征图谱和对照特征图谱见图 1
取方中九味药相应的对照药材, 照 1.6.3 项下方法和 1.6.1 项下色谱条件, 分别制成对照药材溶液并进样测定, 记录色谱图,确定了 12 个共有峰的药味归属。结果见表 3
取 1.6.2 ~ 1.6.4 项下的三种溶液,分别照 1.6.1 项色谱条件进样测定, 结果表明阴性对照样品无干扰, 见图 2
取 1.6.2 项下的对照品溶液, 重复进样测定 6 次, 计算所得峰面积的 RSD 为 0.56%,显示仪器具有良好的精密度。
取 S9 号样品, 照 1.7.3 项下方法制得供试品溶液, 并照 1.6.1 项下色谱条件分别于 0、2、4、6、8、10、12 h 进样测定, 测得峰面积的 RSD 为 0.78%, 显示供试品溶液在 12 h 内稳定。
照 1.6.3 项下方法和 1.6.1 项下色谱条件,取 S1~S19 号样品制成供试品溶液并进样测定。测定结果见表 4
特征图谱研究中, 通过前期试验研究和相关文献, 对甲醇-磷酸溶液和乙腈-磷酸溶液等流动相系统进行了考察,并筛选了多种梯度洗脱组合,结果发现乙腈 -0.1% 磷酸溶液流动相洗脱出的色谱峰更多,响应值更高,且各色谱峰分离度符合药典要求。测定供试品溶液时设定在采集时间内扫描${190} \sim {400}\mathrm{\;{nm}}$的光谱,得到$3\mathrm{D}$图,结果显示大部分峰在末端吸收更大, 同时考虑到乙腈 - 磷酸流动相体系的末端吸收,故采集波长定为${215}\mathrm{\;{nm}}$。供试品制备方法使用${70}\%$甲醇${50}\mathrm{\;{mL}}$作为溶剂,采取超声处理和加热回流两种提取方式, 结果显示两种提取方式所提供试品色谱峰效果一致,区别不大,为节能增效,采用超声提取。
含量测定以金丝桃苷的质量分数为考察指标, 对样品提取方法进行了优化。试验分别考察了超声提取 30、45、${60}\mathrm{\;{min}}$和回流提取${30}\text{、}{60}\mathrm{\;{min}}$等提取方法,根据考察结果,超声提取${30}\mathrm{\;{min}}$与回流提取${30}\text{、}{60}\mathrm{\;{min}}$结果相近, 为节能增效,最终采用超声处理 30 min 提取样品。本文还进一步考察比较了多个流动相系统 (乙腈 - 磷酸溶液、 乙腈-冰醋酸溶液、甲醇-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸溶液) 得到的色谱图, 结果显示乙腈 - 磷酸溶液系统所得色谱峰形态更好, 且分离度满足试验要求, 故确定为金丝桃苷含量测定流动相系统。
本研究建立了 HPLC 特征图谱和金丝桃苷含量测定方法, 特征图谱方法同时标定和指认了 19 批样品中的 12 个共有峰,并明确了其药味归属。结果显示,不同批次壮腰健肾丸样品间特征图谱化学成分基本一致, 但色谱峰高或峰面积存在一定差异。本研究以 HPLC 特征图谱和含量测定相结合, 通过对多批次壮腰健肾丸的定性鉴别和含量测定, 表明本法可较好控制其整体质量, 也为壮腰健肾丸的质量标准研究提供了新思路。
  • 江西省药品监督管理局科研项目(2023JS19)
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2025年第3卷第6期
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  • 首发时间:2025-07-09
  • 出版时间:2025-03-23
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    赣州市综合检验检测院 赣州

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*廖宝源,副主任中药师,研究方向为中药质量标准控制。E-mail:
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种数
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占总种数比例
Percentage of
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Genus
种数
Number of
species
占总种数比例
Percentage of total
species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae 2 11 5.26 鹅膏菌属 Amanita 10 4.78
小菇科 Mycenaceae 2 12 5.74 丝盖伞属 Inocybe 5 2.39
多孔菌科 Polyporaceae 8 14 6.70 蜡蘑属 Laccaria 5 2.39
红菇科 Russulaceae 3 23 11.00 小皮伞属 Marasmius 6 2.87
小菇属 Mycena 11 5.26
光柄菇属 Pluteus 5 2.39
红菇属 Russula 17 8.13
栓菌属 Trametes 5 2.39
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