实验室检测

相当于标示量 100%	制霉菌素加入量/ mg	制霉菌素测得量/ mg	回收率 /%
80	12.21	7.96	65.2
80	11.98	7.43	62.0
80	11.87	8.49	71.5
100	15.05	8.49	56.4
100	15.01	8.91	59.4
100	14.79	9.75	65.9
120	18.05	12.47	69.1
120	18.23	12.23	67.1
120	17.98	12.46	69.3

相当于标示量 100%

制霉菌素加入量/ mg

制霉菌素测得量/ mg

回收率 /%

12.21

7.96

65.2

11.98

7.43

62.0

11.87

8.49

71.5

100

15.05

8.49

56.4

100

15.01

8.91

59.4

100

14.79

9.75

65.9

120

18.05

12.47

69.1

120

18.23

12.23

67.1

120

17.98

12.46

69.3

相当于标示量 100%	制霉菌素加入量/ mg	制霉菌素测得量/ mg	回收率 /%
80	12.21	7.96	65.2
80	11.98	7.43	62.0
80	11.87	8.49	71.5
100	15.05	8.49	56.4
100	15.01	8.91	59.4
100	14.79	9.75	65.9
120	18.05	12.47	69.1
120	18.23	12.23	67.1
120	17.98	12.46	69.3

相当于标示量 100%

制霉菌素加入量/ mg

制霉菌素测得量/ mg

回收率 /%

12.21

7.96

65.2

11.98

7.43

62.0

11.87

8.49

71.5

100

15.05

8.49

56.4

100

15.01

8.91

59.4

100

14.79

9.75

65.9

120

18.05

12.47

69.1

120

18.23

12.23

67.1

120

17.98

12.46

69.3

相当于标示量 /100%	制霉菌素加入量/ mg	制霉菌素测得量 / mg	回收率 /%	回收率平均值 / %	RSD/ %
80	12.11	12.05	99.5
80	12.03	12.03	100.0
80	11.56	12.01	103.9
100	15.02	15.01	99.9
100	15.12	15.03	99.4	100.3	1.4
100	14.86	14.98	100.8
120	18.26	18.15	99.4
120	18.01	18	99.9
120	17.95	17.92	99.8

相当于标示量 /100%

制霉菌素加入量/ mg

制霉菌素测得量 / mg

回收率 /%

回收率平均值 / %

RSD/ %

12.11

12.05

99.5

12.03

100.0

11.56

12.01

103.9

100

15.02

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14.86

14.98

100.8

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18.26

18.15

99.4

120

18.01

99.9

120

17.95

17.92

99.8

相当于标示量 /100%	制霉菌素加入量/ mg	制霉菌素测得量 / mg	回收率 /%	回收率平均值 / %	RSD/ %
80	12.11	12.05	99.5
80	12.03	12.03	100.0
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100	14.86	14.98	100.8
120	18.26	18.15	99.4
120	18.01	18	99.9
120	17.95	17.92	99.8

相当于标示量 /100%

制霉菌素加入量/ mg

制霉菌素测得量 / mg

回收率 /%

回收率平均值 / %

RSD/ %

12.11

12.05

99.5

12.03

100.0

11.56

12.01

103.9

100

15.02

15.01

99.9

100

15.12

15.03

99.4

100.3

1.4

100

14.86

14.98

100.8

120

18.26

18.15

99.4

120

18.01

99.9

120

17.95

17.92

99.8

含量 /%	可信限率	含量平均值 /%	RSD/%
100.6	3.2
99.1	4.9
102.6	4.0
99.6	3.7
100.5	4.2	100.7	1.3
101.1	3.5
98.9	4.1
101.7	4.3
102.0	4.1

含量 /%

可信限率

含量平均值 /%

RSD/%

100.6

3.2

99.1

4.9

102.6

4.0

99.6

3.7

100.5

4.2

100.7

1.3

101.1

3.5

98.9

4.1

101.7

4.3

102.0

4.1

含量 /%	可信限率	含量平均值 /%	RSD/%
100.6	3.2
99.1	4.9
102.6	4.0
99.6	3.7
100.5	4.2	100.7	1.3
101.1	3.5
98.9	4.1
101.7	4.3
102.0	4.1

含量 /%

可信限率

含量平均值 /%

RSD/%

100.6

3.2

99.1

4.9

102.6

4.0

99.6

3.7

100.5

4.2

100.7

1.3

101.1

3.5

98.9

4.1

101.7

4.3

102.0

4.1

批号	含量 /%	可信限率
2304121	100.1	4.2
2304131	97.8	3.7
2304141	95.6	4.9
2307141	96.9	4.6
2307161	101.1	4.7

批号

含量 /%

可信限率

2304121

100.1

4.2

2304131

97.8

3.7

2304141

95.6

4.9

2307141

96.9

4.6

2307161

101.1

4.7

批号	含量 /%	可信限率
2304121	100.1	4.2
2304131	97.8	3.7
2304141	95.6	4.9
2307141	96.9	4.6
2307161	101.1	4.7

批号

含量 /%

可信限率

2304121

100.1

4.2

2304131

97.8

3.7

2304141

95.6

4.9

2307141

96.9

4.6

2307161

101.1

4.7

硝呋太尔制霉菌素阴道栓中制霉菌素的效价测定方法的改进研究

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苏健 , 何薛纯 , 王恺 ^*

实验室检测 | 创新应用 2025,3(7): 25-27

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实验室检测 | 创新应用 2025, 3(7): 25-27

硝呋太尔制霉菌素阴道栓中制霉菌素的效价测定方法的改进研究

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苏健, 何薛纯, 王恺^*

作者信息

江苏省南通市食品药品监督检验中心南通 226006

苏健，副主任药师，研究方向为药品质量检定及质量标准。

通讯作者:

^*王恺，工程师，研究方向为食品药品质量检定及质量标准。E-mail: 18106299300@163.com

Affiliations

出版时间: 2025-04-08

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摘要

收起

目的优化硝呋太尔制霉菌素阴道栓中制霉菌素效价测定方法,使其检验方法准确可靠。方法以啤酒酵母菌(ATCC9763)作为实验菌株,对抗生物微生物二剂量法测定制霉菌素效价进行试验设计,抗生素高低剂量浓度为14~28 U·mL¯¹对硝呋太尔制霉菌素阴道栓中制霉菌素含量进行测定。结果方法准确可靠,精密度RSD(相对标准偏差)和准确性均符合要求,定量线性范围内平均回收率为100.3%,可信限率符合规定。结论该法适用于硝呋太尔制霉菌素阴道栓中制霉菌素的含量测定。

关键词

制霉菌素 / 含量测定 / 效价测定

引用本文

苏健, 何薛纯, 王恺. 硝呋太尔制霉菌素阴道栓中制霉菌素的效价测定方法的改进研究. 实验室检测, 2025 , 3 (7) : 25 -27 .

正文

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0 引言

收起

硝呋太尔制霉菌素阴道栓为江苏万高药业有限公司产品, 主要用于细菌性阴道病、念珠菌性外阴阴道病和阴道混合感染。该产品质量标准规定需测定制霉菌素含量, 因厂家的检测方法不稳定, 本文建立了新的方法, 按《中华人民共和国药典(2020 年版)》抗生素效价测定法^[1]、《药品微生物学检验手册》抗生素效价测定法^[2]、《微生物学实验》抗生素效价的测定^[3]、《生物制品质量控制分析方法验证技术评审一般原则》^[4]对设计的方案予以考证^[5-6]。

1 材料与方法

收起

1.1 仪器

抑菌圈测定仪, CAM-III B 型, 波浦电脑系统上海工程有限公司；电子分析天平, ME2002E,奥豪斯仪器(常州)有限公司；微生物培养箱, GNP-9270BS,海门市恒昌仪器厂；立式压力蒸汽灭菌器, YXQ-LS-50S II,上海东亚压力容器制造有限公司；恒温水浴锅, TW20,优莱博技术北京有限公司；电热恒温鼓风干燥箱,101AB-1,海门市恒昌仪器有限公司。

1.2 试药与菌种

制霉菌素国家标准品 (批号为 130375-201802,使用前不需要干燥处理,含量以制霉菌素单位计,5900 单位$/\mathrm{{mg}}$ ,中国食品药品检定研究院)；硝呋太尔制霉菌素阴道栓(批号为 2304121, 2304131, 2304141, 2307141, 2307161,江苏万高药业有限公司)；制霉菌素检定培养基,批号为 20210217,青岛高科技生物技术有限公司(海博)；抗生素检定培养基 5 号,批号为 20230115,青岛高科技生物技术有限公司(海博)；抗生素检定培养基Ⅳ 号, 批号为 20221013, 青岛高科技生物技术有限公司(海博)；灭菌的磷酸盐缓冲液 (pH 6.0) 均按《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则配制；沙氏葡萄糖液体培养基(SDB),批号为 1236551,美国 BD 公司；啤酒酵母菌 (ATCC-9763), 中国食品药品检定研究院。

1.3 方法

厂家采用 2020 年版中国药典四部通则 1201 抗生素效价测定法二剂量常规法, 本文拟通过改变菌层、培养温度和时间来优化厂家方法, 提高结果的准确性。

(1)培养基配制:取沙氏葡萄糖液体培养基30g加水${1000}\mathrm{\;{mL}}$ ,加热搅拌使其完全溶解,搅匀分装,以${121}^{ \circ }\mathrm{C}$ 灭菌${15}\mathrm{\;{min}}$ ；取抗生素检定培养基$\mathrm{{IV}}$ 号${27}\mathrm{\;g}$ 加水${1000}\mathrm{\;{mL}}$ ,加热搅拌使其完全溶解,搅匀分装,以${115}^{ \circ }\mathrm{C}$ 灭菌${30}\mathrm{\;{min}}$ ；取抗生素检定培养基 5 号${70}\mathrm{\;g}$ 加水${1000}\mathrm{\;{mL}}$ ,加热搅拌使其完全溶解,搅匀分装,以${115}{}^{ \circ }\mathrm{C}$ 灭菌${30}\mathrm{\;{min}}$ ；取制霉菌素检定培养基${54.5}\mathrm{\;g}$ 加水${1000}\mathrm{\;{mL}}$ ,加热搅拌使其完全溶解,搅匀分装,以${121}^{ \circ }\mathrm{C}$ 灭菌 15 min。

(2)器具灭菌:试验前将玻璃刻度吸管、牛津杯、抗生素效价检定培养皿、陶瓦盖等,均放入干热灭菌箱中 250°C 30 min 灭菌。

(3)菌悬液制备:取啤酒酵母菌(ATCC-9763)菌粉接种至${20}\mathrm{\;{mL}}$ 沙氏葡萄糖液体培养基中在${30}^{ \circ }\mathrm{C}$ 培养${24}\mathrm{\;h}$ ,转接至抗生素检定培养基 5 号琼脂斜面在${30}^{ \circ }\mathrm{C}$ 培养${24}\mathrm{\;h}$ , 把啤酒酵母菌(ATCC-9763)的 V 号培养基培养物,接种于 IV号琼脂培养基的培养瓶中,培养温度在$\left( {{30} \pm 1}\right) {}^{ \circ }\mathrm{C}$ ,培养时间(20~24)h,用灭菌水将表面菌苔洗出至含有无菌瓶中, 摇均, 待用。

(4)线性范围:称取制霉菌素标准品适量,加二甲基甲酰胺使溶解稀释成含制霉菌素${700}\mathrm{\;U} \cdot {\mathrm{{mL}}}^{-1}$ 的储备液。以${21}\mathrm{U} \cdot {\mathrm{{mL}}}^{-1}$ 为对照浓度,剂距为$1 : {0.8}$ ,用$\mathrm{{pH}}{6.0}$ 磷酸盐缓冲液稀释成含制霉菌素 10.3、12.8、16.1、20.1、25.1、${31.4}\text{、}{39.2}\text{、}{49.0}\mathrm{U} \cdot {\mathrm{{mL}}}^{-1}$ 的体系溶液,按抗生素检定法一剂量法, 各浓度设一组, 每组 3 个双碟, 各双碟菌面上, 等角摆放 6 个牛津杯, 在各组牛津杯内间隔滴加对照浓度和体系浓度,培养${20}\mathrm{\;h}$ 后,测量体系浓度的抑菌圈直径, 对照浓度抑菌圈直径符合范围要求 (16.2~17.9 mm),以浓度对数$\left( {\lg C}\right)$ 为$X$ 轴,对照浓度与体系浓度的抑菌圈直径平均差值$\left( {f}_{k}\right)$ 为$Y$ 轴(mm)进行线性回归。

(5)溶液配制:标准品溶液的制备。精密称取制霉菌素标准品 (相当于 14 万单位),至${200}\mathrm{\;{mL}}$ 量瓶中,用二甲基甲酰胺使溶解, 并稀释加至刻线, 摇匀。精密吸取上述溶液${2.0}\mathrm{\;{mL}}$ 两份,分别至${50}\mathrm{\;{mL}}$ 和${100}\mathrm{\;{mL}}$ 容量瓶中,分别加入二甲基甲酰胺${0.5}\mathrm{\;{mL}}$ 和${3.0}\mathrm{\;{mL}}$ ,使得测定溶液中二甲基甲酰胺的浓度为$5\% \left( {V/V}\right)$ 再各加入灭菌磷酸盐缓冲液(pH6.0)稀释至刻度,摇匀,即得每$1\mathrm{\;{mL}}$ 含${28}\mathrm{U} \cdot {\mathrm{{mL}}}^{-1}$ 和${14}\mathrm{U} \cdot {\mathrm{{mL}}}^{-1}$ 的高低浓度的标准品溶液。供试品溶液的制备。称取 20 粒的内容物 (相当于 14 万单位), 制备方法同标准品溶液。

(6)双碟制备:厂家。取直径约${90}\mathrm{\;{mm}}$ ,高${16} \sim {17}\mathrm{\;{mm}}$ 的无菌双碟, 取预制备灭菌的制霉菌素检定培养基适量加热至完全融化,放冷至${48} \sim {50}^{ \circ }\mathrm{C}$ ,加入啤酒酵母菌菌悬液适量,混匀,在每一个培养皿中各加入${15}\mathrm{\;{mL}}$ ,均匀摊布平皿内, 水平放置在台面上冷却凝固后, 在每一个培养皿中以同样距离摆放牛津杯小管 4 只,用陶土盖遮盖备用。改进法。取上述与厂家相同的双碟, 另外取制霉菌素检定培养基适量加热融化后,放冷至${48} \sim {50}{}^{ \circ }\mathrm{C}$ ,摇匀,在每一个双碟中分别加入${18}\mathrm{\;{mL}}$ ,使碟底内均匀摊布,放置在水平台面上冷却凝固后 (作为底层),再在上面加入$5\mathrm{\;{mL}}$ 含啤酒酵母菌菌悬液适量的${48} \sim {50}{}^{ \circ }\mathrm{C}$ 制霉菌素检定培养基, 使碟底内均匀摊布,${30}\mathrm{\;{min}}$ 后在每一个双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管 4 个,用陶瓦盖覆盖备用。

(7)测定方法:取上述四个浓度的各溶液,分别滴装至每一个双碟的 4 个牛津杯小管中, 对角的 2 个牛津杯小管中分别滴装两个浓度的标准品溶液, 其余 2 个牛津杯小管中分别滴装两个浓度的供试品溶液,厂家置${32}^{ \circ }\mathrm{C}$ 下培养${24}\mathrm{\;h}$ ,改进法置${30}^{ \circ }\mathrm{C}$ 下培养${20}\mathrm{\;h}$ 后,测定抑菌圈直径。照生物检定统计法 (《中华人民共和国药典 (2020 年版四部)》通则 1431 中 2.2 法)进行可靠性测验及效价计算。

2 结果与分析

收起

2.1 线性范围

回归方程为:$Y = {1.0253} + {0.1567X}, r = {0.9996}$ ,在${10.3} \sim {49.0}\mathrm{U} \cdot {\mathrm{{mL}}}^{-1}$ 的制霉菌素浓度范围内,相关系数$r$ 符合规定,${f}_{k}\left( \mathrm{{mm}}\right)$ 与浓度对数$\lg C$ 线性关系良好。

图 1

厂家方法见图 1(左), 标准品和供试品的抑菌圈均出现边缘模糊不清、试验菌蔓延的现象, 对试验存在干扰, 该法不可靠。改进法见图 1(右), 结果表明: S1、S2、 T1、T2 的抑菌圈边缘分明；该改进法专属性符合要求。

2.3 准确性

按产品各成分比例制备不含制霉菌素样品的栓剂 9 组, 投放一定量的制霉菌素标准品, 按 1.3(5)方法制备, 制备标准品和供试品高低浓度的系列溶液, 用两种方法来测定比较其回收率。厂家方法结果见表 1。实验结果表明:平均回收率 65.1%,偏离投入量。改进法结果见表 2, 试验表明: 平均回收率为 100.3%, RSD 为 1.4%, 符合规定。

2.4 精密度

取 9 份样品 (同一批号), 按改进法进行效价测定。结果见表 3, RSD 为 1.3%,与药品质量标准分析方法一般原则的操作要求相符合。

2.5 样品测定

取 5 个批号的硝呋太尔制霉菌素阴道栓,按改进方法对测定其含量, 结果见表 4。可信限率均符合《中华人民共和国药典》2020 年版四部抗生素微生物检定法规定的范围 (应不得大于 5%)。

3 讨论与结论

收起

在检验过程中, 抑菌圈模糊导致制霉菌素含量测定无法进行, 影响硝呋太尔制霉菌素阴道栓的生产销售环节, 本文通过查阅文献^[7-10],结合长期的经验积累,建立了新的实验方法。本研究根据硝呋太尔制霉菌素阴道栓的自身特点, 并结合检定菌的生长特性, 从培养基的加菌量、培养温度及时间、菌层由单层菌层变为底层加菌层等方面对现有方法进行改进, 建立了新的硝呋太尔制霉菌素阴道栓效价测定方法。因啤酒酵母菌的培养温度低, 培养时间长, 抑菌圈容易模糊, 通过增加底层和改变菌层厚度, 从培养基选择、菌悬液、培养时间等方面入手对现有测定方法优化, 严格控制培养时间, 由于制霉菌素的抑菌圈边缘的菌群只是被抑制,超过最佳培养时间后,制霉菌素的抑菌力降低,抑菌圈边缘的菌群继续繁殖,导致抑菌圈边缘模糊, 改进法中形成的抑菌圈边缘清晰, 提高了结果的准确性, 可供厂家在检验该产品含量测定时的技术参考。

参考文献

收起

文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

国家食品药品监督管理总局. 中华人民共和国药典2020年版四部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020.

[2]

马绪荣, 苏德模. 药品微生物学检验手册[M]. 北京: 科学出版社, 2000.

[3]

蔡信之, 黄君红. 微生物学实验[M]. 北京: 科学出版社, 2019.

[4]

生物制品质量控制分析方法验证技术评审一般原则[EB/OL]. 2022 -12-26）[2025-02-12]. https://www.cde.org.cn/zdyz/domesticinfopage?zdyzIdCODE=55d24be91d7699353dc65fe76639d21f.

[5]

沈振, 丁勃, 孟晓丽, 等. 管碟法测定制霉菌素效价的方法建立及应用[J]. 中国抗生素杂志, 2023, 48(5): 532-537.

[6]

李朋朋, 张聪, 杨绒娟, 等. 复方制霉菌素软膏中新霉素微生物检定法研究[J]. 中国兽药杂志, 2024, 58(8): 21-27.

[7]

梅芊, 郜继东, 刘英. 影响管碟法测定磷霉素效价中抑菌圈质量的因素分析[J]. 中国抗生素杂志, 2021, 46(9): 868-872.

[8]

任仲丽, 张秀花, 王静, 等. 管碟法测定抗生素效价影响因素与控制方法的研究进展[J]. 中国当代医药, 2020, 27(25): 27-33.

[9]

田胜利. 管碟法测定抗生素效价中的注意事项[J]. 黑龙江医药, 2008, 21(3): 64-64.

[10]

沈佳特. 制霉素及其片剂含量测定方法的改进[J]. 药物分析杂志, 2013, 33(1): 26-29.

2025年第3卷第7期

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江苏省南通市食品药品监督检验中心南通 226006

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^*王恺，工程师，研究方向为食品药品质量检定及质量标准。E-mail: 18106299300@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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相当于标示量 100%	制霉菌素加入量/ mg	制霉菌素测得量/ mg	回收率 /%
80	12.21	7.96	65.2
80	11.98	7.43	62.0
80	11.87	8.49	71.5
100	15.05	8.49	56.4
100	15.01	8.91	59.4
100	14.79	9.75	65.9
120	18.05	12.47	69.1
120	18.23	12.23	67.1
120	17.98	12.46	69.3

相当于标示量 100%

制霉菌素加入量/ mg

制霉菌素测得量/ mg

回收率 /%

12.21

7.96

65.2

11.98

7.43

62.0

11.87

8.49

71.5

100

15.05

8.49

56.4

100

15.01

8.91

59.4

100

14.79

9.75

65.9

120

18.05

12.47

69.1

120

18.23

12.23

67.1

120

17.98

12.46

69.3

相当于标示量 /100%	制霉菌素加入量/ mg	制霉菌素测得量 / mg	回收率 /%	回收率平均值 / %	RSD/ %
80	12.11	12.05	99.5
80	12.03	12.03	100.0
80	11.56	12.01	103.9
100	15.02	15.01	99.9
100	15.12	15.03	99.4	100.3	1.4
100	14.86	14.98	100.8
120	18.26	18.15	99.4
120	18.01	18	99.9
120	17.95	17.92	99.8

相当于标示量 /100%

制霉菌素加入量/ mg

制霉菌素测得量 / mg

回收率 /%

回收率平均值 / %

RSD/ %

12.11

12.05

99.5

12.03

100.0

11.56

12.01

103.9

100

15.02

15.01

99.9

100

15.12

15.03

99.4

100.3

1.4

100

14.86

14.98

100.8

120

18.26

18.15

99.4

120

18.01

99.9

120

17.95

17.92

99.8

含量 /%	可信限率	含量平均值 /%	RSD/%
100.6	3.2
99.1	4.9
102.6	4.0
99.6	3.7
100.5	4.2	100.7	1.3
101.1	3.5
98.9	4.1
101.7	4.3
102.0	4.1

含量 /%

可信限率

含量平均值 /%

RSD/%

100.6

3.2

99.1

4.9

102.6

4.0

99.6

3.7

100.5

4.2

100.7

1.3

101.1

3.5

98.9

4.1

101.7

4.3

102.0

4.1

批号	含量 /%	可信限率
2304121	100.1	4.2
2304131	97.8	3.7
2304141	95.6	4.9
2307141	96.9	4.6
2307161	101.1	4.7

批号

含量 /%

可信限率

2304121

100.1

4.2

2304131

97.8

3.7

2304141

95.6

4.9

2307141

96.9

4.6

2307161

101.1

4.7