食品安全质量检测学报

样品	加样质量浓度 /(ng/mL)	检测质量浓度 /(ng/mL)	回收率 /%	相对标准偏差 /%
苹果汁	200	182.90±3.29	91.45	1.80
500	451.89±20.47	90.38	4.53
1000	939.56±14.80	93.96	1.58
啤酒	200	211.41±8.11	105.71	3.83
500	484.49±6.58	96.90	1.36
1000	968.52±9.89	96.85	1.02

样品	加样质量浓度 /(ng/mL)	检测质量浓度 /(ng/mL)	回收率 /%	相对标准偏差 /%
苹果汁	200	182.90±3.29	91.45	1.80
500	451.89±20.47	90.38	4.53
1000	939.56±14.80	93.96	1.58
啤酒	200	211.41±8.11	105.71	3.83
500	484.49±6.58	96.90	1.36
1000	968.52±9.89	96.85	1.02

基于金属有机框架负载铂纳米粒子标记免疫方法检测脂多糖

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范佳怡 , 韦琳 , 朱明雪 , 曹立民 , 王凯强 , 王秀丹 , 隋建新 ^*

食品安全质量检测学报 | 本期重点：食品中有毒有害物质分析与监测 2025,16(12): 106-115

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食品安全质量检测学报 | 本期重点：食品中有毒有害物质分析与监测 2025, 16(12): 106-115

基于金属有机框架负载铂纳米粒子标记免疫方法检测脂多糖

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范佳怡, 韦琳, 朱明雪, 曹立民, 王凯强, 王秀丹, 隋建新^*

作者信息

中国海洋大学食品科学与工程学院, 青岛 266003

范佳怡(2001—), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为水产品安全与质量控制。E-mail: fanfanjiayi@163.com

通讯作者:

*隋建新(1981—), 男, 博士, 教授, 主要研究方向为水产品安全与质量控制。E-mail: suijianxin@ouc.edu.cn

Detection of lipopolysaccharide using metal-organic framework-supported platinum nanoparticle-labeled immunoassay

Jia-Yi FAN, Lin WEI, Ming-Xue ZHU, Li-Min CAO, Kai-Qiang WANG, Xiu-Dan WANG, Jian-Xin SUI^*

Affiliations

College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China

出版时间: 2025-06-25 doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250312006

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摘要

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目的基于金属有机框架负载铂纳米粒子标记免疫方法检测脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。方法通过外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)免疫小鼠获得LPS的多克隆抗体, 并制备由金属有机框架负载铂纳米粒子(platinum nanoparticles, Pt NPs)的复合纳米酶作为抗体的信号标记物结合酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 进一步建立针对LPS的新型免疫传感器。结果免疫获得效价为1:256000的LPS抗体。在构建的基于复合纳米酶的比色免疫分析方法中, 检测LPS的结果显示: 检出限为5 ng/mL, 较使用天然酶标记抗体的ELISA方法灵敏度提高了4倍, 线性检测范围为20~2000 ng/mL, 且具有良好的稳定性和特异性, 在苹果汁和啤酒中回收率为90.38%~105.71%。结论本研究研制了特异性强、效价高的LPS抗体, 建立的Pt@MIL101-NH₂-ELISA方法具有良好的灵敏度和稳定性, 为LPS的免疫检测提供了新思路。

关键词

脂多糖 / 外膜囊泡 / 金属有机框架 / 纳米酶 / 酶联免疫吸附法

Abstract

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Objective To detection of lipopolysaccharide (LPS) by platinum nanoparticle labeling immunoassay based on metal-organic framework. Methods LPS polyclonal antibodies were obtained through immunization of mice with outer membrane vesicles (OMVs). A composite nanozyme consisting of platinum nanoparticles (Pt NPs) loaded on metal-organic framework (MIL101-NH₂) was prepared as a signal label. This nanozyme was integrated with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to establish a novel immunosensing platform for LPS detection. Results The prepared LPS antibodies demonstrated a titer of 1:256000. The constructed nanozyme-based colorimetric immunoassay showed the limit of detection was 5 ng/mL (4-fold improvement in sensitivity compared with conventional enzyme-labeled ELISA), linear detection range of 20-2000 ng/mL, and satisfactory stability and specificity. Recoveries in apple juice and beer samples ranged from 90.38% to 105.71%. Conclusion This study develop LPS antibodies exhibited high specificity and strong titer. The establish Pt@MIL101-NH₂-ELISA method demonstrated enhanced sensitivity and reliability, providing a new approach for immunological detection of LPS.

Key words

lipopolysaccharide / outer membrane vesicles / metal-organic framework / nanozyme / enzyme-linked immunosorbent assay

引用本文

范佳怡, 韦琳, 朱明雪, 曹立民, 王凯强, 王秀丹, 隋建新. 基于金属有机框架负载铂纳米粒子标记免疫方法检测脂多糖. 食品安全质量检测学报, 2025 , 16 (12) : 106 -115 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250312006

Jia-Yi FAN, Lin WEI, Ming-Xue ZHU, Li-Min CAO, Kai-Qiang WANG, Xiu-Dan WANG, Jian-Xin SUI. Detection of lipopolysaccharide using metal-organic framework-supported platinum nanoparticle-labeled immunoassay[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2025 , 16 (12) : 106 -115 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250312006

正文

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0 引言

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脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)又称内毒素, 是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上特有的结构^[1], 由脂质A、核心多糖以及O-抗原组成。其中, O-抗原由多个重复的寡糖单位构成, 其结构多样性决定了细菌的血清分型特征, 这对于菌株分类及致病机制分析具有重要意义^[2]。LPS的脂质A组分是引发免疫反应的核心要素^[3], 具有显著的危害。LPS能够引发发热、白细胞减少、低血压等一系列症状, 甚至可能诱发败血症休克^[4-5], 会在细菌细胞死亡、裂解、生长和增殖过程中伴随外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)被释放到环境中。LPS结构稳定, 难以去除, 极易在药物、水源、食品、医疗器械及生物制品生产环节中形成内毒素残留污染^[6]。因此, 快速且准确地测定LPS含量对保障人类健康具有重要意义。

LPS的常用检测方法主要有传统兔热原试验(rabbit pyrogen test, RPT)法、鲎试剂检测(limulus amebocyte lysate test, LAL)法等^[7]。RPT作为经典方法具有检测多种热原的优势。然而, 该方法无法实现LPS定量检测, 且实验结果易受实验动物个体差异影响, 导致重复性欠佳^[8-9]。LAL法基于鲎血细胞裂解物与LPS的特异性凝血反应, 是目前检测内毒素的金标准^[10], 该方法具有快速、简便、灵敏度高和重复性好等特点^[11]。但其检测结果易受样本基质颜色影响, 且过度依赖鲎血生物资源, 对保护动物鲎的种群生存构成威胁^[9,11]。

酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)因兼具抗体高特异性与酶的放大效应^[12], 能排除样品颜色干扰, 具备特异性强、准确性高等优势, 故而被用于内毒素检测。然而, 天然酶稳定性欠佳且负载能力有限等问题^[13-14], 导致其检测灵敏度相较于LAL法存在较大差距。此外, LPS属于胸腺非依赖(thymus-independent, TI)抗原, 仅能引发体液免疫, 无法诱导抗体亲和成熟及免疫记忆^[15-16]。因此, 依照常规免疫手段, 难以获取高亲和力的LPS抗体(antibody, Ab)。而直接采用灭活菌体进行免疫时, 灭活过程可能改变病毒抗原结构, 致使部分抗原表位被破坏或修饰^[17-18], 显著降低其免疫原性。鉴于上述原因, ELISA方法在LPS实际检测中的应用受到一定限制。

OMVs是革兰氏阴性菌外膜在一定的机制下发生出芽并在细菌表面形成的一种囊泡状的结构, 这种结构包括了外膜以及周质成分^[19]。近年许多研究发现OMVs具有良好的免疫原性^[20-21]。OMVs呈球形结构, 拥有较高的比表面积, 这使得其中LPS呈现显著富集状态^[22-23], OMVs表面LPS的密度可达游离LPS单体的10~100倍。OMVs不仅能诱导机体产生适应性免疫记忆, 还可作为自身佐剂增强免疫应答^[24-25]。与细胞外的Toll样受体4 (toll-like receptor 4, TLR4)识别LPS的方式不同, OMVs能够通过内吞作用进入细胞, 进而形成吞噬泡。即便处于吞噬泡中, OMVs的LPS依然可以与TLR4受体相互作用, 调节机体免疫^[26]。因此OMVs中少量的LPS即可发挥有效的免疫调节功能。

金属有机框架(metal-organic framework, MOFs)是一类由金属离子或离子簇与有机配体连接而成的孔配位聚合物^[27-29], 迄今为止, 已经开发出大量具有类酶催化活性的MOFs^[30-32]。MOFs纳米酶有着性质稳定、成本低, 且制备过程简单、容易大规模制备的优点^[33]。同时金、铂纳米粒子(platinum nanoparticles, Pt NPs)等贵金属纳米颗粒具有优异的过氧化物模拟酶活性但其易团聚的特性常导致颗粒尺寸增大、活性位点减少, 进而降低催化效率。由于MOFs具有较好的生物相容性、高比表面积和丰富的孔隙结构, 为纳米颗粒提供了大量的附着位点, 不仅可以有效抑制其团聚现象, 还能与纳米颗粒产生协同作用^[34-35], 提升整体催化性能^[36], 在多种催化反应中呈现出优异效果。

本研究采用大肠杆菌OMVs免疫小鼠获得LPS多克隆抗体, 并进一步设计合成Pt@MIL101-NH₂复合纳米酶。为了能在Pt@MIL101-NH₂表面结合更多抗体, 在Pt@MIL101-NH₂表面包覆稳定性好、生物相容性良好的聚多巴胺(polydopamine, PDA)^[37], 通过其表面大量的醌类官能团与抗体发生迈克尔加成反应, 将二抗(secondary antibodies, Ab₂)共价偶联到聚多巴胺表面^[38-39], 合成信号标记物Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂, 结合多粘菌素B (polymyxin B, PMB)对LPS的强烈的特异性吸附作用^[40], 构建PMB与抗体联用的夹心ELISA。构建基于Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂的ELISA方法检测LPS, 为食品中LPS的现场检测技术的研究提供参考。

1 材料与方法

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1.1 材料与试剂

大肠杆菌外膜囊泡ΔNLPI@LptDE (南方科技大学李颜颜课题组馈赠); BALB/c小鼠(雌性, 6~8周龄)购自济南朋悦实验动物繁育有限公司, 饲养在中国海洋大学食品科学与工程学院动物中心, 实验过程严格按照动物福利要求进行操作。苹果汁、啤酒购自青岛当地超市。

2-氨基对苯二甲酸(2-aminoterephthalic acid, NH₂-BDC)、盐酸多巴胺(dopamine hydrochloride, DA-HCl)(分析纯, 上海麦克林生化科技有限公司); N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide, DMF)、乙醇、甲醇(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司); 三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl) aminoethane, Tris, 分析纯]、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS, 分析纯)、碳酸盐缓冲液(carbonate buffer solution, CBS, 分析纯)、3,3’,5’-N,N’四甲基联苯胺(3,3’,5,5’ -tetramethylbenzidine, TMB, 纯度>99%)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝胶试剂盒、吐温20(纯度>98%)、牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA, 纯度≥98%)、卵清蛋白(ovalbumin, OVA, 纯度≥80%)、G8061明胶、SL038山羊血清、SE131辣根过氧化物酶(horse radishperoxidase, HRP)标记羊抗鼠IgG(北京索莱宝科技有限公司); 脱脂奶粉(纯度>90%, 德国Einhausen Biofroxx有限公司)、超滤离心管(截留分子量10 kD)(美国Millipore公司); F5881弗氏完全佐剂、F5506弗氏不完全佐剂、L2880大肠杆菌脂多糖O55:B5、L2755大肠杆菌脂多糖O128:B12、L3129大肠杆菌脂多糖O127:B8、L2630大肠杆菌脂多糖O111:B4、L3755大肠杆菌脂多糖O26:B6(德国sigma公司); 三氯化铁六水合物(FeCl₃·6H₂O)、氯铂酸(H₂PtCl₆·6H₂O)(分析纯)、L755655肠沙门氏菌脂多糖、L611586绿脓假单胞菌脂多糖、P105490 PMB[阿拉丁试剂(上海)有限公司]。

1.2 仪器与设备

BCE224-1CCN分析天平[精度为0.0001 g, 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]; TG16-WS台式高速离心机(湖南湘鑫仪器仪表有限公司); KQ-400-DM超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); Wellwash洗板机、K-AlphaX射线光电子能谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司); DZG-6020真空干燥箱(上海培因实验仪器有限公司); ChemiDocXRS+凝胶成像系统(上海伯乐生命医学产品有限公司); CMax Plus微孔板酶标仪(上海美谷分子仪器); 3K15高速冷冻离心机(德国Sigma公司); Smartlab9kwX射线粉末衍射仪(日本理学Rigaku公司); Jem-2100F透射电子显微镜(日本电子株式会社); SU8100扫描电子显微镜(日本日立高科株式会社)。

1.3 实验方法

1.3.1 抗体的制备

以大肠杆菌OMVs为抗原(质量浓度为0.5 mg/mL), 采用皮下多点注射方式免疫小鼠, 每次免疫剂量为200 µL/只, 共免6次。首次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化免疫原, 间隔2周, 用等量弗氏不完全佐剂乳化免疫原同样方式加强免疫, 每隔2周免疫1次, 每次免疫后隔1周尾尖取血测定效价。加强免疫4次后用生理盐水将抗原稀释成1 mg/mL冲击免疫1次, 3 d后眼球取血。

1.3.2 抗血清效价测定及纯化

对免疫后的血清分别进行倍比稀释, 然后用30 µg/mL的LPS包被, 采用间接ELISA方法检测抗LPS多克隆抗体效价, 测定450 nm处吸光值。间接ELISA效价检测的结果判定以抗血清的阳性孔吸光值(P)/不加抗血清的阴性孔吸光值(N)之比≥2.1 (P/N≥2.1), 小鼠的抗血清最大稀释倍数定义为抗血清的效价^[41]。选取效价高的抗血清进一步用蛋白A重力柱进行纯化, 用蛋白浓度测定 (bicinchoninic acid, BCA)法测定纯化后抗体的质量浓度, 并用SDS-PAGE鉴定纯化效果。

1.3.3 MIL101-NH₂、Pt NPs和Pt@MIL101-NH₂的制备

MIL101-NH₂的合成: 参考文献[42-43]的方法, 稍作修改。将0.374 g FeCl₃∙6H₂O和0.313 g NH₂-BDC加到30 mL DMF溶液中, 超声处理1 h后剧烈搅拌1 h使之充分溶解。接着将上述溶液置于聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中, 在120 ℃下反应12 h, 自然冷却后离心(9000 r/min, 15 min)收集沉淀物并分别用DMF和无水乙醇交替离心洗涤3次以去除多余的反应试剂, 最后将沉淀产物置于60 ℃真空干燥过夜, 获得棕褐色粉末样品。

Pt NPs的合成参考文献[44]。Pt@MIL101-NH₂的合成: 称取100 mg MIL101-NH₂超声分散在50 mL DMF中, 然后加入12 mL上述处理好的Pt NPs溶液室温搅拌16 h。随后, 离心(9000 r/min, 15 min)收集后乙醇洗3次。最后将获得的Pt@MIL101-NH₂在60 ℃下真空干燥过夜, 收集备用。

1.3.4 PDA@Pt@MIL101-NH₂的制备及PDA@Pt@MIL101- NH₂标记羊抗鼠IgG

通过多巴胺在Pt@MIL101-NH₂表面上的氧化自聚合合成PDA@Pt@MIL101-NH₂^[45-46]: 将90 mg Pt@MIL101-NH₂超声分散于90 mL的超纯水中, 接着将20 mg DA-HCl溶解于90 mL的Tris-HCl (pH=8.5)中。然后, 将DA-HCl溶液倒入Pt@MIL101-NH₂溶液中, 室温搅拌12 h后, 在Pt@MIL101-NH₂表面形成稳定的PDA, 离心收集产物PDA@Pt@MIL101-NH₂, 乙醇和超纯水交替洗3次, 在60 ℃下真空干燥过夜后, 研磨成粉末置于干燥罐中保存备用。

Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂的制备过程如图1(a)所示。具体步骤为: 将1 mg的PDA@Pt@MIL101-NH₂超声分散于PBS, 加入40 µL羊抗鼠IgG二抗 (6 mg/mL), 室温(10000 r/min, 5 min)下搅拌2 h, 离心弃上清, PBST溶液(含0.05%吐温20的PBS溶液)洗1次, 重新分散于1 mL含5% BSA的PBS溶液中, 室温下搅拌1 h, 以达到封闭探针效果。离心弃上清, PBST溶液洗2次, 重新分散于1 mL含0.5% BSA的PBS溶液中, 最后将制备的Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.5 基于Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂的夹心ELISA方法的建立

将PMB包被酶标板, LPS多克隆抗体作为检测抗体, 建立夹心ELISA检测方法, 采用棋盘法确定包被浓度、检测抗体的工作浓度和最佳封闭剂。按照以下步骤进行检测(图1b): 首先将PMB用CBS (0.05 mol/L, pH=9.60)稀释至适宜浓度加入到96孔板中, 每孔中加入100 µL, 置于4 ℃冰箱孵育12 h。甩掉孔内液体后用300 µL/孔的PBST(含0.05%吐温20的PBS)洗3次, 拍干待用。往孔中加入300 µL的封闭剂后, 置于37 ℃烘箱孵育2 h, PBST洗涤3次, 然后加入特定浓度的LPS, 于37 ℃烘箱中孵育1.5 h, PBST洗涤3次后拍干, 再用PBST将纯化后的抗体稀释至适宜倍数, 每孔100 µL, 置于37 ℃烘箱中孵育1.5 h, PBST洗涤3次。接着将制备的Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂稀释至0.1 mg/mL, 每孔加入100 µL, 于37 ℃烘箱中孵育1 h, PBST洗涤5次后拍干。最后每孔加入TMB显色液100 µL, 并置于37 ℃烘箱中避光孵育15 min。显色结果后每孔加入50 µL硫酸终止液终止反应。将96孔板置于酶标仪450 nm处测定吸光值。

1.3.6 基于Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂的夹心ELISA方法灵敏度及特异性的测定

用1.3.5中的优化好的方法检测从大肠杆菌O55:B5、大肠杆菌糖O128:B12、大肠杆菌O127:B8、大肠杆菌O111:B4、大肠杆菌脂多糖O26:B6、肠沙门氏菌、绿脓假单胞菌中提取纯化的LPS, 作为阳性对照的大肠杆菌O55:B5 LPS质量浓度设置为5 µg/mL, 其余所有LPS样本均稀释至10 µg/mL。同时将大肠杆菌O55:B5来源的脂多糖系列稀释后进行检测, 确定该检测方法的灵敏度。

1.3.7 加标回收率检测

为验证检测方法在食品基质中的适用性, 选择苹果汁与啤酒两种典型饮品作为代表性样品进行了LPS的检测。将苹果汁离心(10000 r/min, 5 min)以除去其中的颗粒物, 然后将上清液用PBS稀释10倍; 将啤酒用PBS直接稀释10倍进行分析, 加标样品的LPS浓度保持在检测的线性范围内。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2024、PowerPoint 2024和Origin 2018分析实验数据并绘制图表, 统计学分析采用IBM SPSS Statistics 22软件进行。单因素方差分析后组间显著性差异以不同小写字母标注(P<0.05)。各实验处理均设置3次独立重复实验以确保结果可靠性。

2 结果与分析

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2.1 抗血清的效果评价

间接ELISA测定抗血清的结果(图2)表明随着免疫次数的增加, 针对LPS的特异性抗体数量也逐渐增加, 经过6次免疫后, 小鼠抗血清的效价可以达到1:256000, 对照设立的阴性组(仅注射免疫佐剂)效价在整个免疫过程中基本为零且保持不变。该结果证实诱导产生的抗体与细菌脂多糖抗原表位具有特异性结合能力, 排除非特异性免疫应答的干扰。该免疫策略所制备的脂多糖抗血清效价显著高于文献报道的直接使用大肠杆菌脂多糖免疫制备的抗血清(1:12800~1:16000)^[47-48]。

本研究选取了对LPS有较好识别效果的小鼠抗血清进行蛋白A柱纯化。从SDS-PAGE结果(图3)可以看到泳道4中有两条明显的条带, 分子量分别约为50 kDa和25 kDa, 其与IgG抗体的重链、轻链分子量大小相吻合。而在泳道2、3中看不到与IgG抗体的重链、轻链大小相符的条带, 且其他杂质蛋白条带较为明显, 此结果表明蛋白A柱层析可特异性捕获血清中IgG组分, 同时有效去除杂蛋白。

2.2 Pt@MIL101-NH₂复合纳米酶的表征及其类酶活性鉴定

由MIL101-NH₂的扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)[图4(a)]结果可知, 利用溶剂热法合成的MIL101-NH₂具有规则的八面体形态, 分散性良好且粒径大小均匀, 平均粒径在145 nm左右适用于ELISA检测。通过简单的搅拌作用成功制备Pt@MIL101-NH₂复合纳米酶, 其透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)图像(图4b)和高分辨率透射电子显微镜(high resolution transmission microscopy, HRTEM)图像[图4(c)]显示Pt NPs均匀且密集地分布在MIL101-NH₂表面, MIL101-NH₂形貌结构和尺寸没有发生明显变化且未观察到颗粒聚集或过度生长的现象。从图4(d)可以看到固定在MIL101-NH₂上的Pt NPs的晶格间距为0.23 nm, 与Pt的(111)面一致, 证实Pt以结晶态形式存在。

此外, 进行了MIL101-NH₂和Pt@MIL101-NH₂的X射线衍射(X-ray diffraction, XRD)测定, 如图4(e)所示, MIL101-NH₂的XRD图谱中的特征衍射峰位置与MIL-101标准卡片及文献[49]报道的MIL101-NH₂数据高度一致, 证实其高结晶度。负载Pt纳米颗粒后, 主衍射峰位置仅发生微小偏移, 表明Pt负载未显著改变MOF骨架的晶体结构。XRD图谱中未检测到Pt的特征峰, 推测因Pt纳米颗粒尺寸较小且高度分散。

综合这些表征结果可以表明成功构建了形貌良好、结构稳定且均匀负载Pt纳米粒子的Pt@MIL101-NH₂复合材料。

以TMB为反应底物分别测定Pt NPs、MIL101-NH₂和负载Pt NPs后的复合纳米酶催化H₂O₂氧化TMB活性的能力。如图5(a)所示结果, Pt@MIL101-NH₂较MIL101-NH₂的催化活性提升约1倍, 其类过氧化物酶活性得到了明显的改善。这些结果表明了在Pt NPs和MIL101-NH₂的两种组分之间存在良好的协同催化作用。在催化过程中Pt纳米粒子作为电子供体, 部分电子通过界面转移至Fe³⁺, 加速了催化反应的速率控制步骤—Fe³⁺→Fe²⁺还原^[50], 进而与Fe协同增强了材料的类过氧化物酶活性。

基于米氏方程对Pt@MIL101-NH₂催化H₂O₂氧化TMB动力学参数进行测定。分别固定TMB和H₂O₂浓度, 测定催化H₂O₂氧化TMB的动力学曲线。通过分析图5(b)和图5(c)计算出纳米酶的米氏常数Km和最大反应速率Vmax, Km值越小, 表明酶对底物的亲和力越好。以米氏常数Km和最大反应速率Vmax分析, Pt@MIL101-NH₂对底物TMB的Km值为0.29 mmol/L, Vmax值为4.28×10^-7 mol/(L·s), 对底物H₂O₂的Km值为0.67 mmol/L, Vmax值为2.50×10^-7 mol/(L·s)。与天然酶对比可知^[51], Pt@MIL101-NH₂对两种反应底物的Km值均低于天然酶, Vmax值高于天然酶。上述数据表明Pt@MIL101-NH₂相对于HRP表现出更为优异的催化活性。这证明了Pt@MIL101-NH₂作为纳米酶的潜力。

基于抗体羧基与PDA表面丰富的醌式结构共价偶联的特性, 本研究借助PDA在Pt@MIL-101-NH₂表面的包覆构建了Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂免疫探针。为优化探针性能, 系统考察了盐酸多巴胺添加量(1~40 mg)对材料催化活性的影响。如图6(a)所示, 随着DA-HCl添加量从1 mg增至20 mg, 材料催化活性缓慢降低, 然而当DA-HCl量超过20 mg时, 催化活性急剧下降, 推测过厚的PDA层会阻塞MOF介孔通道, 限制H₂O₂和TMB分子向活性位点的扩散, 并削弱Pt纳米颗粒与Fe节点的电子协同效应。综合考虑催化活性与抗体标记位点数量的平衡, 最终选择20 mg DA-HCl作为最佳修饰用量, 在保持材料高催化活性的同时, 为抗体固定提供充足反应位点。

对Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂进行酶的稳态动力学分析结果如图6(b)和图6(c)所示, 反应底物浓度与反应速率呈现典型酶促反应特征。TMB体系显示其Vmax高达4.62×10⁻⁷ mol/(L·s), Km为0.42 mmol/L, 而H₂O₂体系的Vmax为2.1×10⁻⁷mol/(L·s), Km为0.51 mmol/L。对比分析发现, 与Pt@MIL101-NH₂原始体系相比, 其Vmax与Km数值无显著差异, 进一步表明PDA介导的抗体固定化过程未显著屏蔽活性位点, 材料实现了催化活性与抗体固定功能的兼容。

2.3 Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂的稳定性

免疫传感器的分析性能与酶的稳定性和抗体的生物活性密切相关。因此本研究探究了不同条件下Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂的生物活性, 并与HRP-Ab₂进一步进行了相应的对比。图7(a)显示随着储存天数的增加, 直至到达室温储存10 d时, HRP-Ab₂的活性损失了80%以上而Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂的相对生物活性还保持在50%左右。图7(b)显示随着温度从20 ℃逐步升高至80 ℃, HRP-RIgG的生物活性仅可以保持在15%左右, 但是相同条件下Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂的生物活性仍可以保持超过50%。这些结果表明PDA@Pt@MIL101-NH₂作为载体提高了免疫探针的耐长期储存和耐高温稳定性, Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂与传统的酶标抗体相比耐高温和耐长期储存的性能得到改善。这对ELISA在检测痕量目标物中的应用有益^[52]。

2.4 夹心ELISA检测方法的特异性检测

将5 µg/mL的大肠杆菌O55:B5 LPS作为阳性样品, 其他类似物浓度设置为10 µg/mL进行检测。如图8所示, 抗体仅与大肠杆菌O55:B5来源的LPS产生特异性结合, 对其他相似物基本没有交叉反应。这表明通过囊泡免疫策略制备的多克隆抗体对大肠杆菌O55:B5血清型LPS具有高度特异性识别能力。大肠杆菌O55:B5作为肠致病性大肠杆菌的重要血清型, 其污染广泛存在于饮用水处理、肉类加工及乳制品生产等食品链关键环节。值得注意的是, 该菌株被美国食品药品监督管理局列为LPS检测的标准菌株^[53], 针对该血清型的特异性检测方法能为污染溯源、风险评估提供依据。

2.5 基于Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂的ELISA检测LPS的灵敏度测定

对Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂的ELISA体系进行条件优化。棋盘法实验结果表明PMB最佳包被质量浓度为25 µg/mL, LPS多克隆抗体的最佳稀释倍数为1:1000, 选择5% BSA为最适封闭剂。

在优化反应条件下, 通过建立LPS质量浓度与氧化TMB在450 nm处吸光度的标准曲线(图9), 验证该方法的分析性能。结果表明, Pt@MIL101-NH₂-ELISA体系在20~2000 ng/mL质量浓度范围内呈现良好的线性响应(r²=0.9776), LPS的检出限估计为5 ng/mL (P:N=2.1:1)。与只含酶标二抗HRP-IgG的传统ELISA方法相比, 该方法检出限降低了4倍, 这一差异表明Ab₂-PDA@Pt@MIL101-NH₂比HRP-IgG具有更好的传感性能, 体现出其在痕量LPS检测中更卓越的分析性能。

2.6 实际样本的检测

通过加标回收实验评估Pt@MIL101-NH₂-ELISA方法在食品基质中的适用性。由于饮用水污染是大肠杆菌O55:B5的重要传播途径, 本研究选取两种具有代表性的饮品作为食品基质进行验证。结果显示(表1), 苹果汁中LPS的回收率为90.38%~93.96%, 啤酒中为96.85%~105.71%, 所有样本的回收率均接近理论值(100%±10%), 表明检测体系受基质干扰较小。进一步分析重复性参数, 苹果汁与啤酒样本的相对标准偏差分别为1.58%~4.53%和1.02%~3.83%, 证明该方法具有良好的批内精密度, 表明本研究建立的Pt@MIL101- NH₂-ELISA方法对饮品样本中LPS的分析检测可靠。该方法准确度高、重复性好, 可用于实际样品的检测。

3 讨论与结论

收起

本研究通过OMVs免疫策略, 避免了LPS作为免疫原不能诱导免疫记忆的缺陷, 成功制备了效价达1:256000的LPS多克隆抗体, 并结合PMB对LPS的特异性强吸附, 进一步引入Pt@MIL101-NH₂复合纳米酶作为信号标记物构建了新型比色免疫传感器, 实现对LPS的特异性检测。同时Pt@MIL101-NH₂复合纳米酶的标记提升了检测性能, 构建的方法针对LPS的检出限为5 ng/mL, 灵敏度较HRP标记的传统ELISA方法提高4倍, 且在苹果汁和啤酒样本中回收率达90.38%~105.71%, 验证了方法的实际适用性。相较于传统ELISA依赖天然酶的局限性, 本研究提出的纳米酶标记策略为免疫分析提供了更稳定、灵敏的替代方案。与现有LAL法相比, 该方法避免了珍稀生物资源依赖和基质干扰, 具有更高的普适性和可操作性, 在食品、药品和环境样本的现场快速检测中具有广阔的实际应用前景。本研究中制备的LPS抗体存在着仅适用于目标菌株(大肠杆菌O55:B5) LPS的精准检测, 对其他血清型大肠杆菌或革兰氏阴性菌的LPS无交叉反应的局限。未来可进一步开发基因工程改造的OMVs载体, 使OMVs定向展示高免疫原性LPS保守表位, 诱导针对脂质A/核心多糖的广谱抗体, 提升检测普适性。

基金

收起

山东省重点研发计划项目(2023CXGC010709)

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2025年第16卷第12期

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doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250312006

接收时间：2025-03-12
首发时间：2026-01-13
出版时间：2025-06-25

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作者

出版历史

收稿日期：2025-03-12

基金

山东省重点研发计划项目(2023CXGC010709)

作者信息

中国海洋大学食品科学与工程学院, 青岛 266003

通讯作者:

*隋建新(1981—), 男, 博士, 教授, 主要研究方向为水产品安全与质量控制。E-mail: suijianxin@ouc.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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