食品安全质量检测学报

试剂	对照孔	对照空白孔	测定孔	测定空白孔
待测样本	-	-	20	20
蒸馏水	20	20	-	-
酶工作液	20		20	-
酶稀释液	-	20	-	20
底物应用液	200	200	200	200
混匀, 37 ℃孵育20 min, 波长 450 nm, 酶标仪读数

试剂	对照孔	对照空白孔	测定孔	测定空白孔
待测样本	-	-	20	20
蒸馏水	20	20	-	-
酶工作液	20		20	-
酶稀释液	-	20	-	20
底物应用液	200	200	200	200
混匀, 37 ℃孵育20 min, 波长 450 nm, 酶标仪读数

试剂	空白管	标准管	测定管	对照管
10 nmol/mL标准品	-	0.1	-	-
无水乙醇	0.1	-	-	-
测试样品	-	-	0.1	0.1
试剂一	0.1	0.1	0.1	-
混匀(摇动几下离心管架)
试剂二应用液	1.5	1.5	1.5	1.5
试剂三应用液	1.5	1.5	1.5	-
50%冰醋酸	-	-	-	1.5

试剂	空白管	标准管	测定管	对照管
10 nmol/mL标准品	-	0.1	-	-
无水乙醇	0.1	-	-	-
测试样品	-	-	0.1	0.1
试剂一	0.1	0.1	0.1	-
混匀(摇动几下离心管架)
试剂二应用液	1.5	1.5	1.5	1.5
试剂三应用液	1.5	1.5	1.5	-
50%冰醋酸	-	-	-	1.5

试剂	非酶管	酶管
1 mmol/L GSH	100	100
待测样本	-	100
	37 ℃水浴预温5 min, 试剂一应用液提前37 ℃预温
试剂1应用液	50	50
	37 ℃水浴反应 5 min
试剂2应用液	1000	1000

试剂	非酶管	酶管
1 mmol/L GSH	100	100
待测样本	-	100
	37 ℃水浴预温5 min, 试剂一应用液提前37 ℃预温
试剂1应用液	50	50
	37 ℃水浴反应 5 min
试剂2应用液	1000	1000

试剂	空白管	标准管	非酶管	酶管
GSH标准品溶剂应用液	1 000	-	-	-
20 mol/L GSH 标准液	-	1 000	-	-
上清液	-	-	1 000	-
试剂3应用液	1 000	1 000	1 000	1 000
试剂4应用液	250	250	250	250
试剂5应用液	50	50	50	50

试剂	空白管	标准管	非酶管	酶管
GSH标准品溶剂应用液	1 000	-	-	-
20 mol/L GSH 标准液	-	1 000	-	-
上清液	-	-	1 000	-
试剂3应用液	1 000	1 000	1 000	1 000
试剂4应用液	250	250	250	250
试剂5应用液	50	50	50	50

金枪鱼胶原低聚肽抑制皮肤细胞黑色素生成及抗氧化损伤作用研究

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吴松霞 ¹ , 郑硕磊 ² , 安颖 ¹ , 李嘉鑫 ¹ , 王玉梅 ²^,^* , 王斌 ²^,^*

食品安全质量检测学报 | 专题：水产品加工与质量安全 2025,16(1): 91-101

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食品安全质量检测学报 | 专题：水产品加工与质量安全 2025, 16(1): 91-101

金枪鱼胶原低聚肽抑制皮肤细胞黑色素生成及抗氧化损伤作用研究

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吴松霞¹, 郑硕磊², 安颖¹, 李嘉鑫¹, 王玉梅²^,^*, 王斌²^,^*

作者信息

1.生命科学大健康研究院, 浙江平太荣生物科技有限公司, 舟山 316104

2.浙江海洋大学食品与药学学院, 舟山 316022

吴松霞(1993—), 女, 硕士, 工程师, 主要研究方向为海洋资源综合利用。E-mail: 603427375@qq.com

通讯作者:

^*王玉梅(1989—), 女, 硕士, 实验师, 主要研究方向为海洋药物。E-mail: Wangyumei731@163.com;

王斌(1977—), 男, 教授, 主要研究方向为海洋药学、海洋生物资源综合利用。E-mail: wangbin@zjou.edu.cn

Study on the inhibition of melanogenesis and antioxidant damage of tuna skin collagen oligo-peptide

Song-Xia WU¹, Shuo-Lei ZHENG², Ying AN¹, Jia-Xin LI¹, Yu-Mei WANG²^,^*, Bin WANG²^,^*

Affiliations

1. Great Health Research Institute of Life Sciences, Zhejiang Pingtairong Biotechnology Co., Ltd., Zhoushan 316104, China

2. School of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China

出版时间: 2025-01-15 doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20241030008

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摘要

收起

目的研究金枪鱼胶原低聚肽(tuna skin collagen oligo-peptide, TSCP)对黑色素生成的抑制作用及其对Hacat细胞氧化损伤的保护效果。方法通过研究TSCP对B16-f10 细胞黑色素和酪氨酸酶生成的影响, 对B16-f10细胞抗氧化活性分析, 及对双氧水(hydrogen peroxide, H₂O₂)诱导Hacat细胞氧化损伤的保护作用, 揭示TSCP对黑色素生成的抑制作用及对Hacat细胞氧化损伤的保护机制。结果 TSCP在0.01~1.00 mg/mL质量浓度范围内对B16-f10细胞无明显毒性, 并能显著抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成。在1.00 mg/mL质量浓度下, TSCP将黑色素含量降低至83.79%±4.31% (P<0.01), 酪氨酸酶活力降低至78.14%±6.95% (P<0.001)。同时, TSCP显著降低了B16-f10细胞内的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)水平, 1.00 mg/mL质量浓度下ROS含量下降至53.5%±4.4% (P<0.001), 呈现出良好的抗氧化效果。此外, TSCP能够提升细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活力[(16.62±0.62) U/mg prot, P<0.001], 降低氧化应激标志物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的水平[(0.352±0.051) U/mg prot, P<0.001], 并增强谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的含量[(284.55±4.99) ng/mL, P<0.01]。在Hacat细胞模型中, TSCP同样无显著毒性, 且在H₂O₂诱导的氧化损伤模型中, TSCP可显著提高细胞存活率, 并抑制细胞凋亡, 1.00 mg/mL TSCP处理后细胞存活率提高至73.66%±5.48% (P<0.01)。结论 TSCP具有显著的抑制黑色素生成和抗氧化活性, 展现出在皮肤美白和抗氧化治疗中的潜在应用价值。

关键词

金枪鱼胶原低聚肽 / 黑色素生成 / 抗氧化 / Hacat细胞 / 氧化损伤

Abstract

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Objective To investigate the inhibitory effects of tuna skin collagen oligo-peptide (TSCP) on melanin production and oxidative damage protection in Hacat cells. Methods Through investigated the effects of TSCP on melanin and tyrosinase production in B16-f10 cells, analyzed the antioxidant activity in B16-f10 cells, and assessed its protective effect against hydrogen peroxide (H₂O₂) induced oxidative damage in Hacat cells, the inhibitory mechanism of TSCP on melanin production and its protective mechanism against oxidative damage in Hacat cells were revealed. Results The experimental results showed that TSCP exhibits no significant cytotoxicity to B16-f10 cells at concentrations ranging from 0.01 to 1.00 mg/mL, and significantly inhibited tyrosinase activity and melanin production. At a concentration of 1.00 mg/mL, TSCP significantly reduced melanin content to 83.79%±4.31% (P<0.01) and tyrosinase activity to 78.14%±6.95% (P<0.001). TSCP also significantly reduced the levels of reactive oxygen species (ROS) in B16-f10 cells. At 1.00 mg/mL, the ROS levels decreased to 53.5%±4.4% of the control group (P<0.001), indicating potent antioxidant potential. Additionally, TSCP increased the activity of superoxide dismutase (SOD) to (16.62±0.62) U/mg prot (P<0.001) and reduced malondialdehyde (MDA) content to (0.352±0.051) U/mg prot (P<0.001). Glutathione peroxidase (GSH-Px) levels were also elevated, reaching (284.55±4.99) ng/mL at 1.0 mg/mL (P<0.01). In the Hacat cell model, TSCP similarly exhibited no significant toxicity and, in the H₂O₂-induced oxidative damage model, significantly improved cell viability and suppressed apoptosis. At 1.00 mg/mL, TSCP improved cell survival to 73.66%±5.48% (P<0.01), compared to the model group. Conclusion TSCP can inhibit melanin production, reduce oxidative stress, providing a foundation for its potential applications in skin whitening and antioxidant therapies.

Key words

tuna skin collagen oligo-peptide / melanin production / antioxidant / Hacat cells / oxidative damage

引用本文

吴松霞, 郑硕磊, 安颖, 李嘉鑫, 王玉梅, 王斌. 金枪鱼胶原低聚肽抑制皮肤细胞黑色素生成及抗氧化损伤作用研究. 食品安全质量检测学报, 2025 , 16 (1) : 91 -101 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20241030008

Song-Xia WU, Shuo-Lei ZHENG, Ying AN, Jia-Xin LI, Yu-Mei WANG, Bin WANG. Study on the inhibition of melanogenesis and antioxidant damage of tuna skin collagen oligo-peptide[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2025 , 16 (1) : 91 -101 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20241030008

正文

收起

0 引言

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黑色素生成是由一系列复杂的生物化学过程驱动的, 其中酪氨酸酶是关键的限速酶。酪氨酸酶的活性直接影响黑色素的产生和沉积, 过度的黑色素沉积不仅会引起皮肤色素沉着等美观问题, 还与多种皮肤病症有关, 如黄褐斑、老年斑等^[1]。近年来, 研究表明天然多肽在抑制酪氨酸酶活性和减少黑色素生成方面具有显著的潜力, 尤其是在美肤产品中的应用逐渐受到重视^[2]。

胶原蛋白肽作为一种来源于海洋的功能性肽, 逐渐成为研究的热点。胶原蛋白肽不仅在抗氧化方面表现出色, 还能够通过抑制酪氨酸酶活性, 调节黑色素生成途径^[3]。近年来的研究发现, 胶原蛋白肽能显著降低黑色素的合成, 并在小鼠模型中显示出减缓色素沉着的效果, 如: TU团队的研究表明, 草鱼鱼鳞胶原蛋白肽能够显著抑制B16-F10黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的活性, 降低黑色素生成, 同时上调抗氧化酶的表达水平^[1]。此外, KYUNGHEE团队通过构建小鼠模型发现, 外用发酵的鱼胶原蛋白能够显著减轻紫外线引起的皮肤色素沉着, 改善皮肤光老化现象^[4]。这使得胶原蛋白肽在皮肤护理和美容领域的应用前景更为广阔^[5]。此外, 胶原蛋白肽对氧化应激的调控作用也引起了广泛关注。氧化应激不仅是多种皮肤老化和色素沉着的主要原因, 还会引发一系列细胞损伤^[6]。Hacat细胞作为人角质形成细胞的经典模型, 广泛用于研究皮肤细胞的抗氧化机制和防护功能^[7-8]。研究表明, 海洋鱼类副产品蛋白肽(DP, KGYSSYICDK)能够清除体内的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS), 增强细胞内抗氧化酶[如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)]的活性, 并减少脂质过氧化产物[如丙二醛(malondialdehyde, MDA)]的生成, DP以剂量依赖的方式抑制了α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH)诱导的B16F10黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶活性并减少了黑色素生成。此外, DP还能够通过抑制氧化应激诱导的炎症因子表达, 从而减轻细胞损伤和衰老过程^[9]。

海洋生物来源的胶原肽, 尤其是金枪鱼胶原低聚肽(tuna skin collagen oligo-peptide, TSCP), 展现出极大的应用潜力, 现有研究多集中于TSCP对氧化应激的保护作用及其在美容领域的应用潜力, 然而, TSCP通过调控黑色素生成和抗氧化应激的具体机制仍需深入探讨。因此, 本研究旨在利用B16-F10细胞模型和双氧水(hydrogen peroxide, H₂O₂)诱导的Hacat细胞氧化损伤模型, 进一步探讨TSCP抑制酪氨酸酶活性、减少黑色素生成及增强抗氧化酶水平的机制。这将为开发基于TSCP的皮肤美白和抗衰老产品提供理论依据, 同时也为拓展其在功能性护肤品中的应用潜力提供新的视角^[10-11]。未来的研究应聚焦于其在皮肤健康中的具体作用及机制, 以推动其在现代皮肤护理产品中的应用^[12-13]。

1 材料与方法

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1.1 仪器与设备

DGG-9070AD恒温烘箱(上海森信实验仪器有限公司); RB29NFSBIS低温冰箱[三星电冰箱(中国)有限公司]; Heracell 150i细胞孵育箱、Revco ULT Freezer-86 °C U410冰箱、Multisjan F酶标仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]; HH-W420恒温水箱(金坛市白塔新宝仪器厂); TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂); TI-S倒置式荧光生物显微镜(日本尼康株式会社)。

1.2 材料与试剂

Hacat细胞系(中国武汉尚恩生物技术有限公司); TSCP黄白色粉末(平均分子量556 Da, 低聚肽含量96.8%, 浙江平太荣生物科技有限公司); NaOH、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、30% H₂O₂(中国医药集团有限公司); α-熊果苷[阿拉丁试剂(上海)有限公司]; 细胞计数试剂盒-8 (cell counting kit-8, CCK8)试剂盒(亚科因生物科技公司); N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)、β-半乳糖苷酶染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司); 曲拉通X-100 (TritonX-100)、L-酪氨酸(L-tyrosine, L-Tyr)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)、25% 乙二胺四乙酸-胰蛋白酶、高效RIPA组织/细胞快速裂解液(附带PMSF: 蛋白酶抑制剂)、Hoechst 33258 (北京索莱宝科技有限公司); BCA蛋白定量试剂盒[爱必信(上海)生物科技有限公司]; SOD、MDA、ROS试剂盒(南京建成生物工程研究所); GSH-Px、醌氧化还原酶1 (quinone oxidoreductase 1, NQO1)、血红素加氧酶1 (heme oxygenase 1, HO-1)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司); B16-F10细胞专用培养基、Hacat细胞专用培养基、B16-F10细胞系(武汉普诺赛生命科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 供试品和对照品

将TSCP溶解于PBS中, 按0.01、0.10、0.50和1.00 mg/mL的浓度梯度稀释后, 临用前配制, 分别用于B16-f10和Hacat细胞。B16-f10细胞实验中, α-熊果苷作为对照品, 质量浓度为0.01 mg/mL; Hacat细胞实验中, NAC对照品质量浓度为0.3260 mg/mL。给药体积根据培养容器的大小调整, 分别为96孔板的20 μL、6孔板的200 μL以及90 mm培养皿的600 μL。细胞种板后24 h给药, B16-f10细胞经过48 h检测, Hacat细胞则在暴露于30% H₂O₂ 4 h后再进行24 h给药, 并进行后续检测。

1.3.2 细胞毒性实验

(1) TSCP对B16-f10细胞存活率的影响

通过B16-f10(小鼠皮肤黑色素瘤细胞)进行细胞的毒性实验。TSCP的质量浓度设置为: 0.01、0.10、0.50、1.00 mg/mL, 把细胞种于96孔板中, 24 h后进行给药, 给药48 h后利用CCK8的实验方法, 进行细胞毒性实验。

(2) α-熊果苷对B16-f10细胞存活率的影响

实验步骤同上1.3.2(1)。

1.3.3 TSCP对B16-f10细胞黑色素和酪氨酸酶生成的影响

(1) TSCP对抑制黑色素生成的影响

取B16-f10细胞接种于含有专用培养基的96孔板中, 置于37 ℃、5% CO₂的恒温箱中孵育, 培养过夜后弃掉上清液。分为实验组和空白组, 实验组加入20 μL不同质量浓度的TSCP (0.01、0.10、0.50和1.00 mg/mL)或(0.01 mg/mL) α-熊果苷, 空白组加入20 μL PBS缓冲液。继续培养48 h后, 把细胞收集到无菌的EP管中2500 r/min转速离心5 min, 弃上清, 使用PBS缓冲液清洗3次后, 向每个EP管内加入NaOH(含有10% DMSO), 再加纯水, 将混合液吹打均匀后转至96孔板内, 在酶标仪490 nm处测定吸光度值, 将每组均设定3个复孔。

(2) TSCP对抑制酪氨酸酶生成的影响

本研究通过B16-f10(小鼠皮肤黑色素瘤细胞)进行抑制酪氨酸酶的实验。TSCP的质量浓度以及α-熊果苷的浓度由上述的毒性实验筛选出来, 分别为1.00 mg/mL, 0.01 mg/mL, 接着通过给药与未给药的测得的酪氨酸酶的含量, 验证TSCP抑制酪氨酸酶的能力。取B16-F10细胞接种在96孔板中, 将其置于37 ℃、5% CO₂的恒温箱中孵育, 培养过夜。分为实验组和空白组, 实验组加入20 μL不同质量浓度的TSCP (0.01、0.10、0.50和1.00 mg/mL)或α-熊果苷(0.01 mg/mL), 空白组加入20 μL PBS缓冲液, 每组设置3个复孔。继续培养48 h 后弃上清, 用PBS缓冲液进行3次冲洗, 再在每个孔内加入含1%体积分数的TritonX-100的溶液, 将96孔板用封口膜封好, 置于-80 ℃的冰箱内60 min后, 将培养板室温放置使细胞融化裂解后, 向每个孔内加入L-Tyr。将培养板放入已预热的37 ℃空气浴内反应1 h, 在酶标仪上490 nm处测定其吸光度值。

1.3.4 TSCP对B16-f10细胞抗氧化活性分析

(1) TSCP对B16-f10细胞ROS含量的影响

取B16-f10细胞接种于96孔培养板中, 置于细胞孵育恒温箱中孵育24 h。细胞分组及给药同1.3.2, 后弃去培养液用PBS洗涤2次, 加入10 μmol/L DCFH-DA荧光探针溶液, 孵育1 h后, 用PBS洗涤2次, 放置于暗室中, 通过荧光倒置显微镜观察、拍摄细胞荧光情况。使用酶标仪测定其光强(激发波长为485 nm/发射波长为535 nm)。

(2) TSCP对B16-f10细胞SOD活力的影响

细胞分组及给药同1.3.2, 实验步骤见表1。计算公式见(1)~(2)。

(1) $\begin{aligned} &\text { SOD 抑制率/％=}\\ &\begin{gathered}\frac{\left(A_{\text {对照 }}-A_{\text {对照空白 }}\right)-\left(A_{\text {测定 }}-A_{\text {测定空白 }}\right)}{A_{\text {对照 }}-A_{\text {对照空白 }}} \times 100 \% \end{gathered} \end{aligned}$

(2) $\mathrm{SOD} \text { 活力 }=\frac{\mathrm{SOD} \text { 抑制率 }}{50 \%} \times \frac{0.24}{0.02 \times C_{\text {待测样本 }}} $

注: SOD活力, U/mg prot; 0.24为反应体系, mL; 0.02为稀释倍数, mL; C_待测样本, mg/mL prot。

(3) TSCP对B16-f10细胞MDA含量的影响

细胞分组及给药同1.3.2, 实验步骤见表2。

离心管盖上后, 刺出小孔, 振荡混匀, 95 ℃水浴40 min, 取出后流水冷却, 离心取上清, 在532 nm处测其吸光度值, 计算公式见(3)。

(3) $\mathrm{MDA} \text { 含量 }=\frac{\mathrm{OD}_{\text {标准 }}-\mathrm{OD}_{\text {测定 }}}{\mathrm{OD}_{\text {对照 }}-\mathrm{OD}_{\text {空白 }}} \times \frac{C_{\text {标准品 }}}{C_{\text {待测样本 }}} $

注: MDA含量, mmol/grot; C_标准品为10 nmol/mL, C_待测样本, mg/mL prot。

(4) TSCP对B16-f10细胞GSH-Px活力的影响

细胞分组及给药同1.3.2, 实验步骤见表3、4。

混匀后, 静置15 min, 在紫外波长412 nm处测吸光度值。计算公式如(4):

(4) $\begin{aligned} &\begin{gathered} \mathrm{GSH}-\mathrm{Px} \text { 酶活力 }=\frac{\mathrm{OD}_{\text {非酶管 }}-\mathrm{OD}_{\text {酶管 }}}{\mathrm{OD}_{\text {标准管 }}-\mathrm{OD}_{\text {空白管 }}} \times \\ \frac{C_{\text {标准品 }} \times 5 \times \text { 取样量 } \times \text { 样本蛋白含量 }}{\text { 反应时间 }} \end{gathered} \end{aligned}$

注: C_标准品为20 μmol/L; 5为稀释倍数。

1.3.5 TSCP对H₂O₂诱导Hacat细胞氧化损伤的保护作用

(1)对Hacat细胞的毒性实验

为评估TSCP、NAC及H₂O₂对Hacat细胞的毒性, 实验通过不同药物浓度进行细胞存活率测试。首先, 将Hacat细胞接种于96孔板中, 24 h后分别给予0.01、0.10和1.00 mg/mL质量浓度的TSCP, 24 h后通过CCK8试剂盒检测细胞存活率, 筛选出合适浓度。其次, NAC毒性实验采用相同方法, 质量浓度设置为0.0815、0.1630、0.2510和0.3260 mg/mL。最后, 30% H₂O₂的浓度分别为100、125、150和200 μmol/L, 检测其对Hacat细胞的毒性作用, 方法同上。

(2) H₂O₂诱导Hacat细胞氧化损伤模型的建立

本研究利用上述实验筛选出150 μmol/L浓度的H₂O₂为细胞的半数致死量, 因此选用150 μmol/L浓度的H₂O₂进行诱导Hacat细胞氧化损伤模型的建立。首先将细胞种于96孔板中, 孵育24 h后给予150 μmol/L浓度30%的 H₂O₂, 继续培养4 h后, 吸去H₂O₂, 建立Hacat细胞氧化损伤模型。

(3) TSCP对Hacat细胞氧化损伤的保护效应

将Hacat细胞接种到 96 孔板后, 将细胞标记为实验组、模型组和空白组, 孵育24 h后更换培养基。向空白组和模型组加入20 μL完全培养基, 实验组分别添加0.01、0.10和1.00 mg/mL的20 μL TSCP, 继续孵育24 h。再次更换培养基, 加入完全培养基(空白组)或150 μmol/L H₂O₂(模型组和实验组), 继续培养24 h后, 采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测细胞存活率。

(4) TSCP对Hacat细胞氧化损伤模型的抗凋亡、抗衰老及抗氧化酶分析

Hoechst 33258实验: 将细胞接种于6孔板中, 孵育24 h后给予150 μmol/L (0.005 mg/mL) 30% H₂O₂, 继续孵育4 h后, 吸去H₂O₂后加入200 μL TSCP, 再孵育24 h后, 吸去培养基, 用PBS润洗3遍, 加入1 mL染色液。继续培养20~30 min。弃染色液, 用PBS或培养液洗涤2~3次后进行荧光检测。

β-半乳糖苷酶: 将细胞接种于6孔板中, 孵育24 h后给予150 μmol/L (0.005 mg/mL) 30% H₂O₂, 继续孵育4 h后, 吸去H₂O₂后加入200 μL TSCP, 继续孵育24 h后, 吸除细胞培养液, 用PBS洗涤1次, 加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液, 室温固定15 min。吸除细胞固定液, 用PBS洗涤细胞3次, 每次3 min。吸除PBS, 每孔加入1 mL染色工作液, 37 ºC孵育过夜, 而后在普通光学显微镜下观察。

抗氧化酶检测: 将细胞接种于6孔板中, 孵育24 h后给予150 μmol/L (0.005 mg/mL) 30% H₂O₂, 继续孵育4 h后, 吸去H₂O₂, 加入200 μL TSCP, 再孵育24 h后, 吸取上清液, 进行ELISA试剂盒的检测。

1.4 数据处理

每组实验均进行3次重复(n=3), 结果以平均值±标准偏差表示。使用Origin 19进行数据可视化, 并通过SPSS 22.0软件中的单因素方差分析进行统计检验, 差异分析采用Duncan多重比较法。显著性水平设定为P<0.05为显著差异, P<0.01为极显著差异, P<0.001为强极显著差异。

2 结果与分析

收起

2.1 TSCP对小鼠体重和摄食量的影响

从图1A可知, TSCP在0.01~1.00 mg/mL质量浓度下, 各组B16-f10细胞的存活率均在100%左右, 与空白组相较无显著差异。因此, TSCP在检测浓度下, 对B16-f10细胞无显著毒性, 故采用最高质量浓度1.00 mg/mL进行后续实验。图1B可知, α-熊果苷在0.01 mg/mL的质量浓度下, 细胞的存活率为99.69%±7.25%, 与空白组相较无显著差异, 对细胞无毒性, 但质量浓度增加到0.10、0.50和1.00 mg/mL的时候, 细胞的存活率显著下降到65.33%±4.14%、43.29%±6.34%和37.89%±7.54%, P<0.05。因此以0.01 mg/mL α-熊果苷进行后续实验。

2.2 TSCP对B16-f10细胞内黑色素生成、酪氨酸酶活力的影响

由图2A可知, 给药1.0 mg/mL的TSCP后, B16-f10细胞内黑色素的含量下降到83.79%±4.31%, 与正常组有显著的差异(P<0.01), 说明TSCP对黑色素的生成有比较强的抑制能力。由图2B可知, 给药1.0 mg/mL的TSCP后, B16-f10细胞内酪氨酸酶的活力与空白组相比下降到78.14%±6.95%, 抑制率为21.86%±6.95%, 与正常组有强极显著的差异(P<0.001)。说明TSCP对酪氨酸酶的活力有较高的抑制能力。TSCP的抗黑色素生成和抑制酪氨酸酶活性的机制可能是通过其抗氧化特性和对关键酶活性的调控作用实现, 这为其在护肤和美白领域的潜在应用提供了理论基础。

2.3 TSCP对B16-f10细胞内ROS含量的影响

如图3A所示, 经过ROS荧光探针染色处理后, 空白组显示出明显的绿色荧光信号, 表明细胞内ROS水平较高。相较于空白组, 处理后的α-熊果苷组显著减少了绿色荧光的强度, 指示细胞内ROS的产生显著降低。此外, 随着TSCP浓度的增加, TSCP组的荧光面积和强度逐步减弱, 进一步反映了细胞内ROS含量的减少。根据图3B, 在给予α-熊果苷后, ROS水平降至空白组的29.4%±2.2% (P<0.001), 显示出α-熊果苷在降低ROS活性方面具有显著效果。图3B的进一步的定量分析显示, 当TSCP质量浓度为0.10 mg/mL时, ROS含量极显著下降至空白组的74.0%±4.8% (P<0.01); 而在1.00 mg/mL质量浓度下, ROS含量进一步降低至空白组的53.50%±4.4% (P<0.001)。综上所述结果表明, TSCP在中高浓度下对B16-f10细胞内ROS活性具有显著抑制作用, 并呈现量效依赖性, 提示其在抗氧化治疗中的潜在应用价值。

2.4 TSCP对B16-f10细胞内SOD、MDA、GSH-Px活力或含量的影响

从图4A可知, 当给予阳性药α-熊果苷后, B16-f10细胞内SOD的活力为(19.37±0.99) U/mg prot, 较空白组(14.84±0.11) U/mg prot有强极显著的上升(P<0.001), 因此, α-熊果苷提高了SOD的活力。给药0.1 mg/mL TSCP时, 细胞内SOD的活力为(15.81±0.51) U/mg prot, 与空白组相比有极显著的上升(P<0.01), 当给药质量浓度达到1.0 mg/mL时, SOD的活力为(16.62±0.62) U/mg prot, 与空白组相比有强极显著上升(P<0.001)。

从图4B可见, 当给予α-熊果苷后MDA的含量为(0.438±0.045) nmol/mg prot, 较空白组(0.626±0.018) nmol/mg prot有显著的下降(P<0.05), 因此, α-熊果苷有一定的降低B16-f10细胞内MDA含量的效果。而TSCP在质量浓度为0.01 mg/mL与0.10 mg/mL时MDA的含量分别为(0.462±0.043) nmol/mg prot和(0.45±0.062) nmol/mg prot, 与空白组相比有显著的下降(P<0.05), 当给药质量浓度达到1.00 mg/mL时, MDA的含量为(0.352±0.051) nmol/mg prot, 与空白组相比有强极显著下降(P<0.001)。

从图4C可知, 当给予阳性药α-熊果苷后, 细胞内GSH-Px的含量为(288.43±2.90) ng/mL, 较空白组(256.93± 1.40) ng/mL有极显著的上升(P<0.01), 说明阳性药α-熊果苷有提高细胞内GSH-Px含量的作用; 在给予0.10 mg/mL的TSCP后, 细胞内GSH-Px的含量为(278.05±3.84) ng/mL, 与空白组相比有显著上升(P<0.05); 当给药的TSCP质量浓度达到1.00 mg/mL时, GSH-Px的含量为(284.55±4.99) ng/mL, 与空白组相比有极显著的上升(P<0.01)。因此, TSCP在0.10~1.00 mg/mL质量浓度时具有较为显著提高B16-f10细胞内GSH-Px含量的效果。

综上, TSCP在抗氧化方面展现了显著效果, 能够显著提高B16-F10细胞内SOD和GSH-Px的活性, 同时降低MDA含量, 表明其在增强抗氧化酶活性和减少脂质过氧化方面具有重要作用^[14]。此外, TSCP还有效抑制了酪氨酸酶的活性, 抑制黑色素的生成, 从而可能通过调节抗氧化和黑色素合成路径, 发挥护肤和抗衰老作用^[15-16]。这些效果可能与TSCP中丰富的氨基酸成分和其生物活性密切相关, 具有作为功能性护肤成分的潜力^[17]。

2.5 TSCP、NAC对Hacat细胞存活率的影响

利用CCK8的实验检测TSCP在0.01、0.10和1.00 mg/mL质量浓度下对Hacat细胞的毒性, 结果如图5A所示, 在检测的TSCP浓度范围内, 细胞存活率均大于95%, 与正常组相比无显著性差异(P>0.05)。因此, 以0.01、0.10和1.00 mg/mL的TSCP质量浓度进行后续实验。类似的, NAC在0.0815~0.3260 mg/mL质量浓度范围内对Hacat细胞的毒性, 结果如图5B所示: NAC处理Hacat细胞的存活率都在100%上下浮动, 且与正常组相比无显著差异(P>0.05)。因此, 为使结果更为显著, 选择0.3260 mg/mL的NAC药物质量浓度进行后续实验。

2.6 H₂O₂对Hacat细胞存活率的影响

建模时, 利用CCK8的法检测H₂O₂在100~200 μmol/L浓度范围内对Hacat细胞的毒性, 结果如图6所示: 随着H₂O₂浓度的增加, Hacat细胞的存活率逐渐降低, 当H₂O₂浓度为150 μmol/L时, 细胞存活率为51.13%±1.32%。因此, 选择H₂O₂浓度150 μmol/L建立Hacat细胞氧化损伤模型。

2.7 TSCP对H₂O₂-Hacat细胞凋亡的影响和对氧化损伤Hacat细胞的保护作用

从图7A可知, 当给予150 μmol/L浓度的H₂O₂后, 模型组细胞的细胞核出现大量的固缩, 变形, 说明有大量的细胞凋亡; 而TSCP在0.01、0.10和1.00 mg/mL质量浓度下给药时, 细胞核固缩变形大量减少。表明TSCP可以一定程度减少细胞的凋亡, 具有一定的抑制氧化损伤Hacat细胞凋亡的能力。从图7B可知, 当给予150 μmol/L浓度的H₂O₂后, 模型组的存活率为52.30%±8.83%, 给予0.3260 mg/mL的NAC后, 细胞存活率提高到74.15%±2.18%, TSCP在0.01、0.10和1.00 mg/mL质量浓度下, 氧化损伤Hacat细胞的存活率剂量依赖性地分别提高到68.50%±1.62%、70.96%±4.516%和73.66%±5.48%, 且与模型组具有显著差异(P<0.05)。因此, 可以发现TSCP具有一定的抗氧化保护作用, 可剂量依赖性地修复H₂O₂氧化损伤对Hacat细胞造成的伤害, 有助于减轻氧化应激所导致的细胞损伤与凋亡。

2.8 TSCP对H₂O₂氧化损伤Hacat细胞衰老的影响

图8A结果显示, 150 μmol/L H₂O₂处理后, 模型组细胞中观察到大量蓝绿色荧光, 表明细胞发生显著的衰老现象。而在添加阳性对照NAC (0.3260 mg/mL)后, 细胞中蓝绿色荧光明显减少, 提示NAC能够有效减轻H₂O₂诱导的细胞衰老。类似地, 随着TSCP浓度的增加, 细胞内蓝绿色荧光逐渐减少, 与空白组相比差异显著, 说明TSCP能够与NAC相似, 显著减缓H₂O₂引起的细胞衰老。进一步从图8B的定量分析可以看出, 150 μmol/L H₂O₂处理导致模型组β-半乳糖苷酶含量显著增加, 达到68.36%±1.26%, 相较于正常组的23.4%±0.9%呈强极显著升高(P<0.001), 这表明大量细胞进入衰老状态。而经0.3260 mg/mL NAC处理后, β-半乳糖苷酶含量强极显著降低至33.08%±1.18% (P<0.001)。在给予不同质量浓度的TSCP处理后, β-半乳糖苷酶含量分别为44.43%±1.62%、42.58%±1.35%和36.66%±1.48%, 与模型组相比均强极显著降低(P<0.001),并呈现剂量依赖性递减趋势。这表明TSCP能够有效抑制H₂O₂诱导的Hacat细胞衰老, 展现出显著的抗衰老活性。综上所述, TSCP在减缓氧化应激引起的细胞衰老方面具有显著的作用, 并且其抗衰老效果在一定范围内呈现剂量依赖性。

这一现象与已有文献的研究结果一致。例如, GEAHCHAN等^[18]发现胶原肽能够减缓H₂O₂诱导的细胞衰老, 类似地, CHI等^[19]也指出, 海洋多肽通过减轻氧化应激, 表现出抗衰老效果。与这些研究相比, TSCP在减缓细胞衰老方面展现出了剂量依赖性, 这表明其抗衰老活性不仅与其化学成分有关, 还与其在细胞中的活性物质浓度密切相关。此外, TSCP的抗衰老作用可能通过抑制氧化应激引发的损伤和调节衰老相关信号通路来实现。

2.9 TSCP对氧化损伤Hacat细胞内抗氧化酶HO-1和NQO1含量的影响

HO-1是一种在氧化应激状态下上调的抗氧化酶, 能够通过分解血红素生成具有抗氧化和抗炎作用的代谢产物, 保护细胞免受氧化损伤。NQO1是一种关键的抗氧化酶, 通过催化氧化还原反应减少细胞内氧化应激, 从而保护细胞免受氧化损伤。从图9A可以看出, 150 μmol/L H₂O₂处理后, 模型组细胞内抗氧化酶HO-1的含量显著下降至(17.81±0.13) ng/mL, 而空白组的HO-1含量为(26.95±1.15) ng/mL, 两者之间存在强极显著差异(P<0.001), 这表明H₂O₂诱导了严重的氧化损伤, 导致细胞内抗氧化防御能力降低。经0.3260 mg/mL的NAC处理后, HO-1的含量强极显著上升至(24.79±1.16) ng/mL (P<0.001), 证明NAC具有较强的抗氧化作用。给予0.01、0.10和1.00 mg/mL的TSCP后, HO-1的含量分别为(22.51±1.32)、(24.45±1.20)和(25.59±1.33) ng/mL, 均与模型组相比极显著增加(P<0.01), 表明TSCP具有明显的抗氧化活性, 能够提升细胞的抗氧化防御能力。同时, 从图9B还可以看出, H₂O₂处理后模型组NQO1的含量也显著下降至(8.89±0.23) ng/mL, 较空白组(13.31±0.10) ng/mL有强极显著差异(P<0.001), 提示氧化应激导致了NQO1活性降低。经0.3260 mg/mL NAC处理后, NQO1含量恢复至(12.78±0.44) ng/mL (P<0.001)。在TSCP处理组中, 随着质量浓度增加, NQO1的含量逐渐上升, 0.01、0.10和1.00 mg/mL TSCP处理组的NQO1含量分别为(11.15±0.68)、(11.76±0.56)和(12.35±0.09) ng/mL, 强极显著高于模型组(P<0.001)。这一结果表明, TSCP具有促进NQO1表达的能力, 从而增强细胞的抗氧化能力。

这些结果表明, TSCP可能通过上调HO-1和NQO1的表达, 增强细胞的抗氧化防御机制, 从而减轻氧化损伤和炎症的产生, 具有较强的抗氧化作用和细胞保护效果。这与已有研究结果相类似, FUNES等^[20]研究表明, HO-1对氧化应激引起的细胞损伤具有保护作用, 并在多种病理条件下表现出抗炎特性。特别是在一些慢性炎症性疾病中, HO-1的上调被认为能够减轻细胞的氧化损伤, 从而缓解疾病的进展。YUAN等^[21]讨论了Nrf2/HO-1途径在氧化应激和慢性肠炎中的作用。Nrf2激活能够增强HO-1的表达, 促进抗氧化反应, 减轻肠道的炎症反应。这一机制为治疗炎症性肠病提供了新的思路, 并表明Nrf2/HO-1通路在防止氧化应激损伤方面具有广泛的应用潜力。这些发现支持了TSCP在抗氧化应激和衰老防护中的潜力, 并为其在皮肤护理和抗衰老领域的应用提供了实验依据。

3 讨论

收起

3.1 TSCP对B16-f10细胞内抗氧化指标的影响

本研究发现, TSCP能调节抗氧化酶SOD、氧化应激标志物MDA以及抗氧化酶GSH-Px, 显示出其具有良好的抗氧化性能, 这为TSCP在抗氧化领域的应用提供了有力的支持。

WANG等^[22]的研究指出, 红唇鱼鳞胶原肽在相似浓度下显著提高了细胞内SOD活性, 达到(16.50±0.47) U/mg prot, 同时具有显著的细胞保护作用。此外, GONZÁLEZ-SERRANO等^[23]的研究表明, 普通鲤鱼副产物胶原肽在0.10 mg/mL时可提升SOD活性至(15.70±0.60) U/mg prot。这些对比表明, TSCP对SOD活力的提升与其他研究一致, 中高浓度的TSCP具有良好的提高SOD活力的能力并呈量效依赖性, 展现出良好的抗氧化潜力。类似地, SUN等^[24]的研究指出, 海洋红藻来源的蛋白水解产物中的抗氧化肽在相同浓度下显著降低了MDA含量至0.36±0.04 U/mg prot, 这进一步验证了TSCP在降低B16-f10细胞内MDA水平方面的显著效果, 且在高浓度下效果更为显著, 表明TSCP在抑制氧化应激标志物MDA方面具有显著作用。SIVARAMAN等^[25]研究表明, 鱼胶原肽水解产物在相同浓度下可将GSH-Px活性提升至(283.12±3.54) ng/mL, 这与WANG等^[26]的结果一致, 进一步支持了TSCP在0.10~1.00 mg/mL质量浓度范围内显著提升GSH-Px水平的能力。

3.2 TSCP对H₂O₂-Hacat细胞凋亡的保护作用

本研究发现, TSCP可以显著提高H₂O₂诱导的细胞内HO-1和NQO1的表达水平, 表明其在抗氧化应激中具有重要作用。WANG等^[26]研究表明, 南极磷虾蛋白水解产物中的抗氧化肽在H₂O₂诱导的细胞模型中能够显著恢复HO-1的含量, 表明其对氧化应激损伤具有显著的保护作用。本研究中1.0 mg/mL TSCP组的HO-1含量达到(25.59±1.33) ng/mL, 说明TSCP具有优于其他抗氧化肽的潜在应用价值。张佳怡等^[27]的研究同样发现, 鹿茸肽在体外具有抗氧化活性, 在H₂O₂诱导的Hacat细胞模型中显著提高了HO-1的表达水平, 进一步验证了抗氧化肽通过调控HO-1的表达来减轻氧化应激损伤的机制。此外, 鱼源抗氧化肽的结构与功能关系研究表明, 其在氧化应激条件下通过激活Nrf2/HO-1信号通路实现了细胞的抗氧化保护作用^[28]。这一机制与本研究的结果一致, 本研究中1.00 mg/mL TSCP处理后, HO-1的含量显著升高, 显示出良好的抗氧化能力。NQO1的表达与氧化应激的减轻密切相关, LAMMINPÄÄ等^[29]的研究指出, 海洋来源的生物活性成分能够显著提高Nrf2信号通路相关基因（包括NQO1）的表达, 从而改善细胞抗氧化能力。此外, CAI等^[30]的研究表明, 河豚皮胶原水解产物中的ACE抑制肽能够显著提升NQO1的水平, 有助于减轻氧化应激损伤。本研究中, 1.00 mg/mL TSCP组的NQO1水平为(12.35±0.09) ng/mL, 与上述文献结果基本一致, 进一步证明了TSCP的抗氧化活性及其通过调控Nrf2/HO-1信号通路减轻氧化应激损伤的机制。。

综上所述, 本研究结果与文献报道的抗氧化肽作用机制一致, TSCP能够显著提升H₂O₂诱导的细胞内HO-1和NQO1的表达, 说明其通过激活细胞的内源性抗氧化系统, 在减轻氧化应激和保护细胞方面表现出良好的作用, 其效力在多项文献对比中均表现突出, 表明其作为天然抗氧化剂的潜在应用价值。

4 结论

收起

本研究证实了TSCP在抑制黑色素生成方面的显著效果。TSCP通过增强Hacat细胞内抗氧化酶活性以及降低氧化应激标志物的水平, 有效缓解了氧化损伤。这些发现表明, TSCP具有作为一种天然美白成分的潜力, 为相关皮肤护理产品的研发提供了理论基础。考虑到TSCP的天然来源, 未来的研究还应关注其在综合皮肤治疗方案中的应用潜力, 或与其他天然成分的协同效应, 为促进皮肤健康和美丽提供更为安全有效的解决方案。

基金

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国家自然科学基金项目(82073764)

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文献

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2025年第16卷第1期

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doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20241030008

接收时间：2024-10-30
首发时间：2025-07-21
出版时间：2025-01-15

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收稿日期：2024-10-30

基金

国家自然科学基金项目(82073764)

作者信息

1.生命科学大健康研究院, 浙江平太荣生物科技有限公司, 舟山 316104

2.浙江海洋大学食品与药学学院, 舟山 316022

通讯作者:

^*王玉梅(1989—), 女, 硕士, 实验师, 主要研究方向为海洋药物。E-mail: Wangyumei731@163.com;

王斌(1977—), 男, 教授, 主要研究方向为海洋药学、海洋生物资源综合利用。E-mail: wangbin@zjou.edu.cn

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鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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待测样本	-	-	20	20
蒸馏水	20	20	-	-
酶工作液	20		20	-
酶稀释液	-	20	-	20
底物应用液	200	200	200	200
混匀, 37 ℃孵育20 min, 波长 450 nm, 酶标仪读数

试剂

对照孔

对照空白孔

测定孔

测定空白孔

待测样本

蒸馏水

酶工作液

酶稀释液

底物应用液

200

混匀, 37 ℃孵育20 min, 波长 450 nm, 酶标仪读数

试剂	空白管	标准管	测定管	对照管
10 nmol/mL标准品	-	0.1	-	-
无水乙醇	0.1	-	-	-
测试样品	-	-	0.1	0.1
试剂一	0.1	0.1	0.1	-
混匀(摇动几下离心管架)
试剂二应用液	1.5	1.5	1.5	1.5
试剂三应用液	1.5	1.5	1.5	-
50%冰醋酸	-	-	-	1.5

试剂

空白管

标准管

测定管

对照管

10 nmol/mL标准品

0.1

无水乙醇

0.1

测试样品

0.1

试剂一

0.1

混匀(摇动几下离心管架)

试剂二应用液

1.5

试剂三应用液

1.5

50%冰醋酸

1.5

试剂	非酶管	酶管
1 mmol/L GSH	100	100
待测样本	-	100
	37 ℃水浴预温5 min, 试剂一应用液提前37 ℃预温
试剂1应用液	50	50
	37 ℃水浴反应 5 min
试剂2应用液	1000	1000

试剂

非酶管

酶管

1 mmol/L GSH

100

待测样本

100

37 ℃水浴预温5 min, 试剂一应用液提前37 ℃预温

试剂1应用液

37 ℃水浴反应 5 min

试剂2应用液

1000

试剂	空白管	标准管	非酶管	酶管
GSH标准品溶剂应用液	1 000	-	-	-
20 mol/L GSH 标准液	-	1 000	-	-
上清液	-	-	1 000	-
试剂3应用液	1 000	1 000	1 000	1 000
试剂4应用液	250	250	250	250
试剂5应用液	50	50	50	50

试剂

空白管

标准管

非酶管

酶管

GSH标准品溶剂应用液

1 000

20 mol/L GSH 标准液

1 000

上清液

1 000

试剂3应用液

1 000

试剂4应用液

250

试剂5应用液