食品安全质量检测学报

编号	取样组织	处理方式	处理时间/h
GHA	鳃组织	高温处理	6
GHB	12
GHC	24
GHD	48
GLA	低温处理	6
GLB	12
GLC	24
GLD	48
HHA	消化腺组织	高温处理	6
HHB	12
HHC	24
HHD	48
HLA	低温处理	6
HLB	12
HLC	24
HLD	48
GC	鳃组织	对照	0
HC	消化腺组织	0

编号	取样组织	处理方式	处理时间/h
GHA	鳃组织	高温处理	6
GHB	12
GHC	24
GHD	48
GLA	低温处理	6
GLB	12
GLC	24
GLD	48
HHA	消化腺组织	高温处理	6
HHB	12
HHC	24
HHD	48
HLA	低温处理	6
HLB	12
HLC	24
HLD	48
GC	鳃组织	对照	0
HC	消化腺组织	0

基因ID	引物名称	序列(5'-3')
LOC105319208	q-F1	CTGGTCGTCTGCTGGCTCTTG
q-R1	CGCAAGGTGATCGTATGAATATGGC
LOC105325358	q-F2	GTATGTGTTCTTCTTGGCGAGACAG
q-R2	GCTGCGACTTTCCTTGGTTGTG
LOC105321656	q-F3	GTCAATCTAAGTGGTGGGCAGAAAC
q-R3	ACGAGAGTCAACAGCAGATAGTGG
LOC105325575	q-F4	CCATAGACAGAGAACAGCCAGTGAG
q-R4	GCGAAACCTCTCCAAAGCAACAG
LOC105318009	q-F5	TCGGTAACAGTGGACGGTGAC
q-R5	GCAGGTGCGTATCCGAAGAATAG
LOC105318166	q-F6	GGTTCCATTGTACGACTTCCAGAC
q-R6	ACCTATGCTATGTGCCTCATCCAG
LOC117689189	q-F7	GGACAACAACAACCACCGTGAC
q-R7	GAAGCACCACCTTGAACCTGATG
LOC105326276	q-F8	TCAATCACAGAGACTTGGAGCAGAC
q-R8	GCAGGCGTAGTGGAGGATAGAAC
LOC117683256	B3GALT1-F	GTTAGTATTCTTGCTCAACTCTGGACTG
LOC117683256	B3GALT1-R	GAAGAATTGACCCATCACCTACCT
LOC117683256	B3GALT1-q-F	TTACCCTCTCGCCACTCAGTTCC
LOC117683256	B3GALT1-q-R	CCAGTACCGCACTGTGTTCAC
AF026063	F-actin	CTGTGCTACGTTGCCCTGGACTT
R-actin	TGGGCACCTGAATCGCTCGTT

基因ID	引物名称	序列(5'-3')
LOC105319208	q-F1	CTGGTCGTCTGCTGGCTCTTG
q-R1	CGCAAGGTGATCGTATGAATATGGC
LOC105325358	q-F2	GTATGTGTTCTTCTTGGCGAGACAG
q-R2	GCTGCGACTTTCCTTGGTTGTG
LOC105321656	q-F3	GTCAATCTAAGTGGTGGGCAGAAAC
q-R3	ACGAGAGTCAACAGCAGATAGTGG
LOC105325575	q-F4	CCATAGACAGAGAACAGCCAGTGAG
q-R4	GCGAAACCTCTCCAAAGCAACAG
LOC105318009	q-F5	TCGGTAACAGTGGACGGTGAC
q-R5	GCAGGTGCGTATCCGAAGAATAG
LOC105318166	q-F6	GGTTCCATTGTACGACTTCCAGAC
q-R6	ACCTATGCTATGTGCCTCATCCAG
LOC117689189	q-F7	GGACAACAACAACCACCGTGAC
q-R7	GAAGCACCACCTTGAACCTGATG
LOC105326276	q-F8	TCAATCACAGAGACTTGGAGCAGAC
q-R8	GCAGGCGTAGTGGAGGATAGAAC
LOC117683256	B3GALT1-F	GTTAGTATTCTTGCTCAACTCTGGACTG
LOC117683256	B3GALT1-R	GAAGAATTGACCCATCACCTACCT
LOC117683256	B3GALT1-q-F	TTACCCTCTCGCCACTCAGTTCC
LOC117683256	B3GALT1-q-R	CCAGTACCGCACTGTGTTCAC
AF026063	F-actin	CTGTGCTACGTTGCCCTGGACTT
R-actin	TGGGCACCTGAATCGCTCGTT

基因ID	差异倍数对数值log₂FC	上调或下调	差异分组
LOC105327316	2.86	上调	GHA vs GC
2.68	上调	GHB vs GC
2.50	上调	GHC vs GC
LOC105327909	-1.72	下调	GHC vs GC
LOC117691395	2.63	上调	GHD vs GC
LOC105335091	-1.63	下调	GLA vs GC
LOC117683256	1.04	上调	GLB vs GC
1.11	上调	GLC vs GC
1.23	上调	GLD vs GC
LOC105324924	-1.50	下调	HHB vs HC
LOC105325959	-1.15	下调	HHB vs HC
LOC105326727	-23.22	下调	HHB vs HC
-23.26	下调	HHD vs HC
LOC105336015	1.14	上调	HHB vs HC
LOC105342967	-7.45	下调	HHB vs HC

基因ID	差异倍数对数值log₂FC	上调或下调	差异分组
LOC105327316	2.86	上调	GHA vs GC
2.68	上调	GHB vs GC
2.50	上调	GHC vs GC
LOC105327909	-1.72	下调	GHC vs GC
LOC117691395	2.63	上调	GHD vs GC
LOC105335091	-1.63	下调	GLA vs GC
LOC117683256	1.04	上调	GLB vs GC
1.11	上调	GLC vs GC
1.23	上调	GLD vs GC
LOC105324924	-1.50	下调	HHB vs HC
LOC105325959	-1.15	下调	HHB vs HC
LOC105326727	-23.22	下调	HHB vs HC
-23.26	下调	HHD vs HC
LOC105336015	1.14	上调	HHB vs HC
LOC105342967	-7.45	下调	HHB vs HC

太平洋牡蛎不同温度处理下转录组分析与类B3GALT1基因的克隆及表达

PDF下载

张蔚然 ¹^,² , 曲梦 ¹ , 胡君霞 ¹^,³ , 江艳华 ¹ , 郭莹莹 ¹ , 朱文嘉 ¹ , 李娜 ¹ , 李风铃 ¹ , 姚琳 ¹^,^*

食品安全质量检测学报 | 专题：水产品加工与质量安全 2025,16(1): 81-90

收起

食品安全质量检测学报 | 专题：水产品加工与质量安全 2025, 16(1): 81-90

太平洋牡蛎不同温度处理下转录组分析与类B3GALT1基因的克隆及表达

全屏

张蔚然¹^,², 曲梦¹, 胡君霞¹^,³, 江艳华¹, 郭莹莹¹, 朱文嘉¹, 李娜¹, 李风铃¹, 姚琳¹^,^*

作者信息

1.中国水产科学研究院黄海水产研究所/农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室, 青岛 266071

2.上海海洋大学食品学院, 上海 201306

3.中国海洋大学食品科学与工程学院, 青岛 266003

张蔚然(1999—), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为水产品质量安全。E-mail: zwr9909@163.com

通讯作者:

^*姚琳(1980—), 男, 博士, 研究员, 主要研究方向为水产品质量安全与标准化。E-mail: yaolin@ysfri.ac.cn

Transcriptome analysis of different temperature stress in Crassostrea gigas and cloning and expression of B3GALT1-like

Wei-Ran ZHANG¹^,², Meng QU¹, Jun-Xia HU¹^,³, Yan-Hua JIANG¹, Ying-Ying GUO¹, Wen-Jia ZHU¹, Na LI¹, Feng-Ling LI¹, Lin YAO¹^,^*

Affiliations

1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071, China

2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China

3. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China

出版时间: 2025-01-15 doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20240812007

文章导航

摘要

收起

目的探究不同温度处理下太平洋牡蛎中诺如病毒结合受体合成通路上响应的基因, 筛选后进行克隆和表达规律的研究。-方法对牡蛎分别进行高温(25 ℃)及低温(5 ℃)处理, 取其鳃和消化腺两种组织, 提取RNA后进行转录组测序与分析。选取诺如病毒结合受体合成通路上规律性响应温度处理的基因作为目标, 对目标基因进行克隆、原核表达与免疫印迹鉴定。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析该基因的组织表达和季节表达规律。结果类β1,3半乳糖转移酶1 (B3GALT1)基因(GenBank LOC117683256)在鳃组织低温组的多个取样点均出现显著上调。扩增得到该基因1089 bp的编码区(coding sequence, CDS)。在25 ℃、异丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl beta-D-1- thiogalactopyranoside, IPTG)诱导8 h后, 出现大小约为84.9 kDa的蛋白条带, 该条带与抗MBP标签抗体、抗人B3GALT1抗体均能发生特异性结合。类B3GALT1基因在鳃组织中大量表达, 且低温时的表达量显著高于高温(P<0.01)。结论太平洋牡蛎类B3GALT1基因的表达量受温度影响, 表达的蛋白与人类β1,3半乳糖基转移酶具有相似的免疫原性; 类B3GALT1基因的组织表达和季节表达规律在一定程度上与诺如病毒爆发的季节性相符合。本研究为深入探索牡蛎季节性富集诺如病毒分子机制提供基础。

关键词

太平洋牡蛎 / 转录组 / 诺如病毒 / 类B3GALT1基因 / 组织表达

Abstract

收起

Objective To explore the genes that respond to the synthesis pathway of norovirus binding receptors in Crassostrea gigas under different temperature stress, screen them, and study their cloning and expression patterns. Methods Crassostrea gigas were treated at high temperature (25 ℃) and low temperature (5 ℃), and two tissues of gills and digestive glands were extracted for RNA extracted for transcriptome sequencing and analysis. Selected genes on the synthesis pathway of norovirus binding receptors that responded to temperature treatment as targets, clone, express in prokaryotic cells, and identified by Western blotting. The tissue expression and seasonal expression pattern of the gene were analyzed by quantitative real time-polymerase chain reaction (qRT-PCR). Results The β1,3 galactosyltransferase-like 1 (B3GALT1-like) gene (GenBank LOC117683256) was significantly upregulated in multiple sampling sites in the gill group. The 1089 bp coding sequence (CDS) region of the gene was amplified. After 8 h of induction of 25 ℃, isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), a protein band of about 84.9 kDa appeared, which was specifically bound to both anti-MBP tag antibody and anti-human B3GALT1 antibody. B3GALT1-like genes was abundantly expressed in gill tissue and was significantly higher at low temperature than at high temperature (P<0.01). Conclusion The expression level of B3GALT1 gene in Crassostrea gigas is affected by temperature, and the expressed protein has similar immunogenicity to human β1,3 galactosyltransferase. The tissue expression and seasonal expression patterns of the B3GALT1 gene are somewhat consistent with the seasonality of norovirus outbreaks. This study provides a foundation for further exploration of the molecular mechanism of seasonal enrichment of norovirus in Crassostrea gigas.

Key words

Crassostrea gigas / transcriptome / norovirus / B3GALT1-like gene / tissue expression

引用本文

张蔚然, 曲梦, 胡君霞, 江艳华, 郭莹莹, 朱文嘉, 李娜, 李风铃, 姚琳. 太平洋牡蛎不同温度处理下转录组分析与类B3GALT1基因的克隆及表达. 食品安全质量检测学报, 2025 , 16 (1) : 81 -90 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20240812007

Wei-Ran ZHANG, Meng QU, Jun-Xia HU, Yan-Hua JIANG, Ying-Ying GUO, Wen-Jia ZHU, Na LI, Feng-Ling LI, Lin YAO. Transcriptome analysis of different temperature stress in Crassostrea gigas and cloning and expression of B3GALT1-like[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2025 , 16 (1) : 81 -90 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20240812007

正文

收起

0 引言

收起

诺如病毒是全球食源性疾病中主要涉及的病原体, 具有极低的感染剂量和极强的传播能力^[1]。感染后会出现恶心、呕吐、腹泻和低烧等症状, 常会引起急性胃肠炎散发病例和暴发疫情, 是食品安全、公共卫生领域重点关注的病原^[2-3]。诺如病毒主要通过“粪-口”途径传播, 除了被污染的水、果蔬外, 牡蛎也被认为是诺如病毒食源性传播的重要载体之一^[4-6]。牡蛎属于滤食性动物, 可以特异性富集水中的诺如病毒, 在体内积累的病毒通常很难在净化过程中排出^[7-9]。

研究表明, 诺如病毒识别组织血型抗原(histo-blood group antigens, HBGAs)并将其作为侵入人类肠道细胞的受体^[10-11]。在牡蛎的消化腺、鳃等组织中也发现有多种类HBGAs的表达, 作为一种特定受体选择性地富集诺如病毒, 这可能是诺如病毒生物积累的主要机制^[7,12]。

组织血型抗原是具有高度多态性的糖类抗原, 主要包含A/B、Lewis和H抗原3大类决定簇, 决定簇的形成通常是以二糖前体为核心, 受控于不同的基因通过糖基转移酶有序地加成单糖而形成具有特定序列的多糖, 通常以糖蛋白或者鞘糖脂(glycosphingolipids, GSLs)的形式存在^[13-14]。

研究人员对诺如病毒在牡蛎体内积累过程的影响因素展开过多方面的研究, 包括温度、水污染等环境因素^[15], 以及牡蛎在诺如病毒生物积累过程中类HBGAs分子表达和基因调控特征等^[16]。诺如病毒的爆发存在一定的季节性, 常在冬春季出现感染高峰, 而牡蛎中诺如病毒的检出率在冬季等气温较低的季节也明显高于其他季节^[17-18], 且来自冷水水域(5 ℃)的牡蛎的病毒载量明显高于来自温暖水域(大于10 ℃)的牡蛎^[19]。有研究指出冬末春初诺如病毒与牡蛎鳃、外套膜和消化腺组织的结合能力及富集效率显著加强, 而牡蛎中类HBGAs的含量存在一定的季节变化, 在冬季的表达量将增加, 提示研究人员温度对牡蛎中类HBGAs的表达可能有一定的影响^[20-21]。

目前对于温度影响牡蛎类HBGAs表达的分子机制鲜少见报道。本研究对太平洋牡蛎进行高温及低温处理并进行转录组测序分析, 选择鞘糖脂生物合成-乳糖和新乳糖系列通路上规律性响应温度胁迫的差异表达基因作为目的基因进行原核表达, 并进行免疫印迹鉴定; 通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)对该基因进行组织表达与季节性表达分析。本研究旨在深入探索牡蛎季节性富集诺如病毒的分子机制, 以期为预防和控制诺如病毒在牡蛎中的传播提供新的策略与方法。

1 材料与方法

收起

1.1 材料与试剂

本研究所用太平洋牡蛎采自青岛某养殖场。

动物组织总RNA提取试剂盒、大肠杆菌Escherichia coli TOP10和BL21 (DE3)感受态细胞、增强型辣根过氧化物酶-二氨基联苯胺(horseradish peroxidase- diaminobenzidine, HRP-DAB)底物显色试剂盒(北京天根生化科技有限公司); qRT-PCR反转录试剂盒PrimeScript ^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (perfect realtime)、qRT-PCR试剂盒TB Green ^®Premix Ex Taq TM II(北京宝日医生物技术有限公司); pMAL-c5x载体(武汉淼灵生物科技有限公司); PCR 2×Accurate Taq Master Mix(预混液)、Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司); 12 cm亲和层析柱空柱、Ni-NTA 6FF琼脂糖纯化树脂、糊精树脂6FF、引物(上海生工生物工程股份有限公司); 硝酸纤维素膜(北京兰杰柯科技有限公司); 异丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactoside, IPTG)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(北京索莱宝科技有限公司); 烟草蚀纹病毒蛋白酶(组氨酸标签)(上海碧云天生物技术有限公司); 兔抗β1,3-半乳糖基转移酶1多克隆抗体(苏州博奥龙科技有限公司); HRP标记的羊抗兔免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)(重链和轻链)(美国Proteintech集团有限公司); Rabbit pAb兔抗MBP-tag多克隆抗体[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]。

1.2 仪器与设备

T1型PCR仪(德国Whatman Biomerra公司); LightCycler 480II实时荧光PCR仪(瑞士Hoffmann-La Roche有限公司); Nano Photometer Pearl微量核酸蛋白测定仪(德国Implen公司); Y-ZY3半干式转膜仪(北京君意东方电泳设备有限公司); ALQD59A300实验室养殖水体温度控制系统(深圳市奥凌恒业有限公司); JY92-IIN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物及样品处理

选取规格相近且双壳完整健康无损伤的活牡蛎120只, 平均壳长(11.0±1.0) cm, 壳高(4.0±0.5) cm, 湿重(120.0±5.0) g。实验用牡蛎4~8 ℃运输至实验室后, 清洗表面附着物, 用过滤后的海水冲洗干净, 在塑料养殖箱(1.0 m× 0.7 m×0.4 m)中暂养3 d, 期间水温保持在15 ℃, 每天换1/2海水, 持续充氧, 不投喂食物。

准备3个养殖箱, 对照组养殖箱加入15 ℃的海水, 低温实验组、高温实验组养殖箱内加入海水后用温控系统使水温分别维持在5 ℃和25 ℃, 温度选取参考水温年际变化^[22]。将结束暂养的120只牡蛎随机分配于3个养殖箱中, 每组40只。实验期间持续充氧, 每天换海水1次, 换水前将新水预热或预冷至各组所需温度, 每天投喂小球藻1次。

以实验开始时0 h取样作为对照, 鳃和消化腺组织样品的对照组编号分别为GC和HC。参照刘慧等^[23]探究温度对长牡蛎类HBGAs表达的影响时选取的取样时间, 分别在高温及低温组处理6、12、24、48 h时取样, 一共18组编号, 54个样品, 具体分组方式见表1。

每组在取样时随机选取2只牡蛎, 用无菌镊子和手术刀解剖将鳃及消化腺组织取出。取1~2 g组织置于无菌无酶冻存管并迅速置于液氮中, 随后转移到-80 ℃冰箱保存。将两只个体的同种组织取出后混匀合并为1个样品, 每个组均设置3个生物学重复, 即每组共选取6只牡蛎。

1.3.2 转录组文库的构建与测序

采用TRIzol试剂依照说明书提取样品总RNA后构建转录组, 文库质检合格后, 使用Illumina测序仪进行测序。采用fastp软件预处理原始数据后获取质量较高的待分析数据, 用于后续数据分析^[24]。

1.3.3 转录组分析

本研究共设计消化腺组织和鳃组织的2个实验组在4个取样时间和对照组相比的HLA vs HC、GLA vs GC等16个比较分组, 使用HISAT2软件将高质量序列数据(clean reads)与参考基因组(GCF_902806645.1_cgigas_ uk_roslin_v1)进行比对^[25], 并进行基因表达量计算^[26]。利用DESeq2软件进行差异表达基因分析, 其中符合q值<0.05且表达差异倍数(foldchange, FC)>2或FC<0.5阈值的基因被定义为差异表达基因^[27]。随后, 基于超几何分布算法对差异表达基因进行基因本体论(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析, 用于筛选显著性富集功能条目。委托上海欧易生物技术有限公司进行文库构建、转录组测序和分析。

1.3.4 转录组数据qRT-PCR验证

为了确保转录组实验的准确性及可重复性, 分别在鳃组织和消化腺组织的高温及低温处理组中各随机挑选两个差异表达基因, 包括DDX39B、ATP-dependent RNA helicase DEAH12等共8个基因, 进行qRT-PCR验证, 与对照GC组和HC组分别对比。将qRT-PCR与转录组测序数据中基因的相对表达量做比较分析。使用与转录组测序同批次的RNA, 参照反转录试剂盒说明书进行反转录, 获得相应的cDNA作为模板, 以太平洋牡蛎β-actin (Genbank编号: AF026063)为参考基因, 合成引物F-actin和R-actin^[28]。按照TB Green^®Premix Ex Taq TM II试剂盒进行qRT-PCR, 反应体系如下: 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, TB Green Premix Ex Taq II 10 μL, cDNA 模板 2 μL, DNase Free Water 6.4 μL。反应程序为: 预变性95 ℃ 30 s, 变性95 ℃ 5 s, 退火60 ℃ 30 s, 循环40次, 融解95 ℃ 5 s、60 ℃ 60 s, 降温50 ℃ 30 s。每个样本进行3次技术重复。相对表达量的数据结果使用2^−ΔΔCt方法计算^[29], 引物序列见表2。

1.3.5 重点基因筛选及编码区序列克隆

对差异表达基因进行KEGG富集分析, 重点筛选鞘糖脂生物合成-乳糖和新乳糖系列通路(KEGG编号crg00601)上的基因, 对各个实验组与对照组相比, 选择在此通路上呈现差异性表达并规律性响应温度处理的基因作为目的基因。

根据美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库中太平洋牡蛎基因组(ID 29159)中目的基因的序列信息, 做进一步的克隆验证, 选取其中的编码区(coding sequence, CDS), 利用Primer 5.0软件设计核心片段扩增引物B3GALT1-F/B3GALT1-R。所用引物序列见表2。

取活太平洋牡蛎的鳃组织约50 mg, 放入研钵加液氮充分研磨后提取总RNA。使用以Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒合成的第一链cDNA为模板, PCR扩增相关片段。反应条件: 预变性95 ℃ 5 min; 变性95 ℃ 30 s, 退火50 ℃ 30 s, 延伸72 ℃ 1 min, 35个循环; 最终延伸72 ℃ 5 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后, 使用凝胶成像仪观察, 选择合适条带切胶并送上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.3.6 生物信息学分析

使用Snapgene软件预测目的基因的开放阅读框、氨基酸序列, 并计算出分子量和等电点。用TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在线分析蛋白质跨膜结构域, 用SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在线分析蛋白质二级结构, 用SMART (http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)和phyre (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/help.cgi?id= help/faq)在线分析蛋白质三级结构。

1.3.7 质粒构建与原核表达

使用在线密码子优化工具(https://www.genscript.com.cn/gensmart-free-gene-codon-optimization.html), 对克隆得到的基因序列依据大肠杆菌密码子偏好性进行稀有密码子优化。优化后的基因序列在氨基酸序列5’添加6×His标签序列及TEV酶切割位点, 基因合成后通过同源重组克隆至载体pMAL-c5x上, 基因合成及重组质粒构建委托金斯瑞生物科技有限公司完成。

将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞, 氨苄青霉素筛选后挑取单菌落接种于含50 μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基, 经36 ℃摇床过夜培养后按1:50体积比转移至含有氨苄青霉素的LB培养基中扩大培养。至菌液OD 600为0.6时, 加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L, 再次放入摇床诱导8 h。取2 mL诱导后的菌液离心并收集菌体。用80 μL ddH₂O重悬菌体后加入20 μL的5×蛋白上样缓冲液混匀, 水浴煮沸10 min, 12000 r/min离心2 min, 取上清, 即为总蛋白溶液。取10 μL加入丙烯酰胺浓度为12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中, 经120 V恒压电泳分离, 取胶块经考马斯亮蓝染液染色1 h, 后使用脱色液充分脱色, 查看蛋白表达情况, 经鉴定选取阳性样品溶液, 置于-20 ℃保存。

1.3.8 表达蛋白的免疫印迹分析

取阳性重组菌进行凝胶电泳(步骤同1.3.7), 电泳完成后经转膜仪25 V恒压30 min后转移蛋白至硝酸纤维素薄膜, 而后转移至含有1% BSA的含吐温-20三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris buffered saline with Tween-20, TBST)中封闭, 于4 ℃冰箱孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤薄膜3次, 加入目的基因对应的抗体(使用TBST缓冲液稀释1000倍), 同时在另一组加入兔抗麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)标签多克隆抗体(使用TBST缓冲液稀释2000倍)室温孵育2 h, 用TBST缓冲液洗涤薄膜3次, 加入对应的二抗(使用含1% BSA的TBST缓冲液稀释3000倍)室温孵育1 h, 用TBST缓冲液洗涤薄膜3次。按照HRP-DAB底物显色试剂盒说明书配制显色液进行显色并观察。

1.3.9 蛋白纯化

选取成功诱导表达后的菌液600 mL离心收集菌体, 使用裂解液[EDTA),pH 7.4]重悬菌体并于冰上超声破碎菌体, 8000 r/min离心10 min后, 分别收集上清与沉淀。将表达于上清的可溶性蛋白经0.45 μm的滤膜过滤, 载入预先用裂解液平衡好的MBP标签亲和层析柱, 孵育10 min后使流穿液缓慢排出树脂, 取第一次流穿液再次加入纯化柱中流出, 增加蛋白与填料的结合率。依次向纯化柱中加入5倍柱体积的低盐缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.2)与10倍柱体积的高盐缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.2)洗脱杂蛋白。用10倍填料体积的麦芽糖洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L麦芽糖, pH 7.4)洗脱后获得纯化后的重组蛋白, 用凝胶电泳检测纯化效果。

1.3.10 目的基因季节性表达与组织表达分析

(1)季节表达规律分析

在2023年每个季节(3月、6月、9月、12月的上旬), 采集太平洋牡蛎样品, 取3只牡蛎的鳃组织, 在液氮中充分研磨, 并用试剂盒提取RNA, 按照1.3.4的方法进行反转录与qRT-PCR检测, 以分析不同季节牡蛎鳃组织目的基因的表达规律, 所用引物序列见表2。

(2)组织表达规律分析

取3只牡蛎的外套膜、鳃、闭壳肌、唇瓣和消化腺组织, 在液氮中充分研磨并用试剂盒提取RNA, 采取同1.3.4的方法进行反转录与qRT-PCR检测以分析5种组织中目的基因的相对表达水平。所用引物序列见表2。

1.4 数据处理

所有的实验重复3次或以上, 结果以平均值±标准偏差表示, 使用GraphPad Prism 8.0进行显著性分析和绘图。

2 结果与分析

收起

2.1 转录组测序

共完成54个样本的有参转录组测序, 获得368.79 G的待分析数据, 各样本的有效数据量分布在6.06~7.08 G, Q30碱基分布在92.09%~93.88%, 平均GC含量为42.29%。能定位到参考基因组上的Clean reads占比在68.34%~75.57%。基于比对结果, 进行蛋白编码基因表达量分析。根据蛋白编码基因在不同样本中的表达量, 进行差异表达基因筛选。

2.2 qRT-PCR验证

从图1可知, 随机选定的8个基因在qRT-PCR分析中的表达情况与转录组测序分析结果呈现出一致的上调或下调的表达趋势, 表明本次转录组数据和分析结果具有很高的准确性和可靠性。

2.3 目的基因筛选

经过对转录组数据比较分析, 初步筛选得到大量富集在KEGG中鞘糖脂生物合成-乳糖和新乳糖系列通路上的差异表达基因, 见表3, 其中类β1,3-半乳糖转移酶 (B3GALT1)基因(GenBank: LOC117683256)的基因在鳃组织低温组的12、24、48 h 3个取样点均出现显著上调, 满足q值<0.05且差异倍数大于2, 仅在6 h取样点时的差异倍数为1.83, 但满足q值<0.05, 故将其列为目的基因, 命名为类B3GALT1。

2.4 目的基因CDS克隆

克隆得到类B3GALT1共1743 bp长度的基因片段, 见图2, 其中含1089 bp的完整CDS区, 包含一个起始密码子(ATG)和一个终止密码子(TAA), 编码362个氨基酸序列的开放阅读框。测序结果表明, 该扩增片段序列与GenBank ID为LOC117683256基因序列CDS区一致。

2.5 生物信息学分析

ExPASy-Compute pI-Mwtool在线预测结果表明, 类B3GALT1蛋白相对分子质量为42.8 kDa, 理论等电点为8.89。用TMHMM推算其跨膜结构域, 结果如图3, 表明类B3GALT1具有一个跨膜结构域, 由位于20~42的23个氨基酸组成。

利用SOPMA蛋白二级结构预测分析软件在线分析类B3GALT1二级结构, 结果如图4, 表明类B3GALT1含有131个α螺旋, 14个β折叠, 145个无规则卷曲。

通过phyre网站在线预测蛋白质三级结构, B3GALT1蛋白的三级结构模型来源依据为c7jhkC, 包括253个氨基酸残基, 该模型置信度达100% (图5A)。具有β1,3-半乳糖基转移酶活性的人B3 (Ⅰ型前体合成酶)的蛋白三级结构模型同为c7jhkC, 包括264个氨基酸残基, 置信度达100%。结果表明, 二者具有相同的三级结构(图5B)。

2.6 原核表达

将成功构建的重组质粒命名为P-B3, 转化大肠杆菌(BL21)并诱导后, 使用凝胶电泳分析, 结果如图6所示, 在25 ℃, 0.2 mmol/L IPTG终浓度诱导表达8 h的诱导条件下, 含P-B3质粒的重组大肠杆菌总蛋白在84.9 kDa大小处出现了明显的目的条带, 大小与预测结果相符合, 空白对照组未出现相似条带, 表明类B3GALT1蛋白在大肠杆菌表达系统中成功表达。

2.7 免疫印迹分析

使用兔抗MBP标签抗体(图7A)和兔抗人B3GALT1蛋白抗体(图7B)的免疫印迹分析结果显示, 在泳道2中(目的蛋白组)在约84.9 kDa处有明显的显色条带, 且空白对照无显色。这一结果证实重组质粒P-B3成功表达蛋白并被转移至硝酸纤维素薄膜上, 不仅能与通用型的MBP标签抗体结合, 且能被抗人B3GALT1抗体特异性识别, 表明表达蛋白具有与人β1,3-半乳糖基转移酶蛋白高度相似的免疫原性。

2.8 蛋白纯化

重组大肠杆菌菌体样本及超声破碎后上清液样本经纯化后, 通过凝胶电泳分析, 都出现了与目的蛋白分子量大小相似的条带, 约为84.9 kDa, 结果如图8所示。在低盐洗脱液组分中, 杂蛋白已经较少, 说明与填料结合的杂蛋白不多, 而高盐洗脱液中已几乎无杂蛋白。在麦芽糖洗脱液组分中, 存在与目的蛋白大小相似的条带, 说明目的蛋白被成功洗脱。

2.9 基因组织表达与季节性表达规律

类B3GALT1基因的季节性表达检测结果如图9A所示, 表明该基因在9月份的表达量最低, 与6月和9月这种高温季节相比, 类B3GALT1在3月和12月这种低温季节相对表达量较高, 上述结果呈现出转录组数据基本一致的趋势。

通过qRT-PCR分析了牡蛎5种组织中的类B3GALT1基因的表达量, 结果如图9B所示, 该基因在各组织中的表达量差异较大, 在消化腺中的表达量最低, 以消化腺中的表达量为基准, 在外套膜、鳃、闭壳肌和唇瓣中的表达量分别为5.4、84.6、2.4和55.7倍, 在鳃组织的表达量最高。

3 讨论与结论

收起

诺如病毒导致的急性胃肠炎具有明显的冬春季爆发的季节性特征, 被一度称为“冬季呕吐病”^[30], 引起冬春季诺如病毒爆发的原因可能有很多, 低温利于病毒的存活和传播是其中的外部因素之一^[31]。相关研究显示在双壳贝类受到高温或低温影响时, 多种基因的表达都会出现上调或下调的变化^[32-34], 类似的变化是否会影响牡蛎富集诺如病毒的某个环节, 值得研究人员深入探索。

鞘糖脂生物合成-乳糖和新乳糖系列通路是诺如病毒特异性结合受体合成相关的重点通路, MA等^[35]在对诺如病毒污染与太平洋牡蛎鞘糖脂生物合成途径的转录组学研究中也曾对此通路展开分析, 本研究将研究重点也放在该通路上。本研究的转录组测序结果显示, 该通路上有12个糖基转移酶相关基因出现了不同程度的差异表达, 且上、下调情况也有很大差异。有研究发现太平洋牡蛎不同组织中的类HBGAs存在多态性和差异性^[23,36], 从本研究转录组测序结果推测, 该现象可能与不同组织在温度变化时发生显著差异表达的基因不同有关, 从而引发类HBGAs的表达量和类别的不同。

β1,3-半乳糖转移酶1 (B3GALT1)在鞘糖脂生物合成途径中占据上游的关键位置, 可将UDP-半乳糖转化为半乳糖, 而后与N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以1,3糖苷键连接, 催化I型前体的合成, 参与糖脂和糖蛋白的碳水化合物部分的生物合成。本研究通过对其跨膜结构域的预测, 得出该基因包含跨膜结构域, 这与之前人类β1,3-半乳糖转移酶基因编码一种 Ⅱ 型跨膜蛋白质结构域的研究相符合^[37]。类B3GALT1基因(Genebank ID为LOC117683256), 在牡蛎鳃组织中的表达呈现上调趋势, 这一发现与牡蛎组织血型抗原的量、牡蛎与诺如病毒的富集效率以及牡蛎中诺如病毒的检出率均存在明显的季节性高峰的现象相符合。推测类B3GALT1基因的上调会引起下游相关血型组织抗原表达量的增加, 这也能从分子水平上解释了其他研究人员发现的低温诱使牡蛎内脏团中类A型HBGAs的表达量显著增加的现象^[23]。组织血型抗原的表达量的增加会使得牡蛎对诺如病毒的富集量增加, 这可能是诺如病毒爆发呈现一定季节性的重要内在原因之一。

在前期的研究中本研究团队已克隆了多个太平洋牡蛎类HBGAs合成相关的糖基转移酶基因如类FUT2基因^[28]、Lewis抗原合成酶类FUT10基因^[38]、类FUT1基因^[39]、CgFUT5基因^[40], 且进行了相关的功能验证, 逐步证明了牡蛎体内可能存在与人血型抗原相似合成路径。本研究对类B3GALT1基因进行克隆及相关生信分析, 发现该基因的表达蛋白与人B3GALT1蛋白具有非常相似的三级结构, 免疫印迹结果显示抗人β1,3-半乳糖基转移酶1的抗体与该重组蛋白确实能实现特异性结合, 不仅说明牡蛎中类B3GALT1与人β1,3-半乳糖基转移酶1之间存在相似的免疫原性, 也从一个角度证实了两者之间的高级结构具有相似性。

有研究表明, 融合MBP标签可增加蛋白的可溶性, pMAL-c5x载体含有MBP融合标签、tac启动子, 都可在一定程度上促进蛋白的可溶性表达^[41], 因此本研究选择了带有MBP标签的pMAL-c5x载体。在类B3GALT1原核表达的实验中, 起初其表达量并不高, 考虑到跨膜结构域对糖基转移酶蛋白在原核表达系统中的可溶性及表达量有直接影响^[42-43], 且本团队在前期研究中发现缺失跨膜域的cgFUT5在大肠杆菌中实现了更高的表达量^[40], 在本研究中也缺失了跨膜域并获得了预期的实验结果。

在季度表达分析中, 类B3GALT1基因在3月和12月这两个低温时间的相对表达量较高, 而在6月和9月这两个高温时间的相对表达量较低。这一发现与转录组数据所呈现的趋势基本一致, 进一步支持类B3GALT1基因表达受温度影响的假设。结合秋冬季节诺如病毒在牡蛎中的检出率呈现高峰的现象^[18,44], 以及HBGAs在低温季节表达量增高的趋势^[23], 可推测类B3GALT1基因的表达与诺如病毒的富集之间很可能存在某种联系。由于类B3GALT1是催化HBGAs合成的关键酶之一, 其在低温季节的高表达很可能导致牡蛎类HBGAs表达量的增加, 进而促进了牡蛎对诺如病毒的富集, 加快了诺如病毒的食源性传播。

本研究结果显示, 类B3GALT1基因在所检测的5种组织中均有表达, 且表达量在不同组织间存在显著差异。有研究发现牡蛎消化腺和鳃组织中的类HBGAs同样呈现一定的多态性和差异性^[36], 且不同基因型的诺如病毒在牡蛎不同组织中的富集率也不同^[7], 这可能与本研究发现的类B3GALT1在不同组织的基因表达量的差异有关。

本研究以温度作为牡蛎中诺如病毒特异性结合受体合成通路上关键基因的关键影响因素, 为研究牡蛎类HBGAs合成酶功能及探索合成路径提供了基础, 也为解析牡蛎结合诺如病毒分子机制与控制诺如病毒的食源性传播提供了新的研究思路和理论依据。

基金

收起

国家自然科学基金项目(31101883)
国家自然科学基金项目(32172292)
中国水产科学研究院基本科研业务费项目(2023TD76)
现代农业产业技术体系专项(CARS-49)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

CAUL

. Viral gastroenteritis: Small round structured viruses, caliciviruses and astroviruses. Part II. The epidemiological perspective[J]. Journal of Clinical Pathology, 1996, 49(12): 959-964.

[2]

ATMAR

, RAMANI

, ESTES

. Human noroviruses: Recent advances in a 50-year history[J]. Current Opinion in Infectious Diseases, 2018, 31(5): 422-432.

[3]

European Food Safety Authority (EFSA), European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). The European Union one health 2022 zoonoses report[J]. EFSA Journal, 2023, 21(12): e8442.

[4]

崔健, 杨莉莉, 邓婷婷, 等. 果蔬食品中诺如病毒污染状况及检测研究进展[J]. 食品安全质量检测学报, 2022, 13(12): 3884-3892.

CUI

, YANG

, DENG

, et al. Research progress on norovirus contamination status and detection technology in fruit and vegetable foods from a non-traditional perspective[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2022, 13(12): 3884-3892.

[5]

FERLAND

, COLLARD

ÈM

, BEAULIEU

, et al. Evaluation of a new automated viral RNA extraction platform for hepatitis A virus and human norovirus in testing of berries, lettuce, and oysters[J]. International Journal of Food Microbiology, 2024, 416: 110664.

[6]

PANDISCIA

, FALCÓ

, TERIO

, et al. Survival modelling of infectious human norovirus and surrogates for high-pressure inactivation in strawberry puree[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2024, 94: 103702

[7]

MAO

, ZHANG

, ZHAO

, et al. Spatial distribution and enrichment dynamics of foodborne norovirus in oyster tissues[J]. Foods, 2023, 13(1): 128.

[8]

TIAN

, ENGELBREKTSON

, XI

, et al. Norovirus recognizes histo-blood group antigens on gastrointestinal cells of clams, mussels, and oysters: A possible mechanism of bioaccumulation[J]. Journal of Food Protection, 2007, 70(9): 2140-2147.

[9]

RAZAFIMAHEFA

, LUDWIG-BEGALL

, THIRY

. Cockles and mussels, alive, alive, oh-The role of bivalve molluscs as transmission vehicles for human norovirus infections[J]. Transboundary and Emerging Diseases, 2020, 67(S2): 9-25.

[10]

SINGH

, LEUTHOLD

, HANSMAN

. Structural constraints on human norovirus binding to histo-blood group antigens[J]. Msphere, 2016, 1(2): e00049-16

[11]

SAIKIA

, SAHARIA

, SINGH

, et al. Association of histo-blood group antigens and predisposition to gastrointestinal diseases[J]. Journal of Medical Virology, 2022, 94(11): 5149-5162.

[12]

TIAN

, ENGELBREKTSON

, MANDRELL

. Seasonal tracking of histo-blood group antigen expression and norovirus binding in oyster gastrointestinal cells[J]. Journal of Food Protection, 2008, 71(8): 1696-1700.

[13]

MARIONNEAU

, CAILLEAU-THOMAS

, ROCHER

, et al. ABH and Lewis histo-blood group antigens, a model for the meaning of oligosaccharide diversity in the face of a changing world[J]. Biochimie, 2001, 83(7): 565-573.

[14]

RIMKUTE

, THORSTEINSSON

, HENRICSSON

, et al. Histo-blood group antigens of glycosphingolipids predict susceptibility of human intestinal enteroids to norovirus infection[J]. Journal of Biological Chemistry, 2020, 295(47): 15974-15987.

[15]

SUN

, LIANG

, ZHAO

, et al. Research progress on biological accumulation, detection and inactivation technologies of norovirus in oysters[J]. Foods, 2023, 12(21): 3891

[16]

YANG

, TONG

, WANG

, et al. Gut microbiota and transcriptomics reveal the effect of human norovirus bioaccumulation on oysters (Crassostrea gigas)[J]. Microbiology Spectrum, 2022, 10(4): e0016122.

[17]

周德庆, 苏来金, 赵峰, 等. 诺如病毒在贝类中的富集特性与机制研究进展[J]. 病毒学报, 2015, 31(3): 313-317.

ZHOU

, SU

, ZHAO

, et al. Research progress in norovirus bioaccumulation in shellfish[J]. Chinese Journal of Virology, 2015, 31(3): 313-317.

[18]

SMITH

, MAQSOOD

, SULLINS

, et al. Seasonality of respiratory, enteric, and urinary viruses revealed by wastewater genomic surveillance[J]. Msphere, 2024, 9(5): e0010524.

[19]

CAMPOS

CJA

, KERSHAW

, MORGAN

, et al. Risk factors for norovirus contamination of shellfish water catchments in England and Wales[J]. International Journal of Food Microbiology, 2017, 241(16): 318-324.

[20]

LE-GUYADER

, LOISY

, ATMAR

, et al. Norwalk virus-specific binding to oyster digestive tissues[J]. Emerging Infectious Diseases, 2006, 12(6): 931-936.

[21]

MAALOUF

, ZAKHOUR

, LE

PENDU J

, et al. Distribution in tissue and seasonal variation of norovirus genogroup I and II ligands in oysters[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(16): 5621-5630.

[22]

苑克磊, 侯查伟, 丁一, 等. 我国黄海浒苔绿潮暴发海域环境因子季节性变化及年际变化分析[J]. 广西科学院学报, 2018, 34(3): 204-209.

FAN

, HOU

, DING

, et al. Analysis of the seasonal and inter-annual changes of environmental factors in Enteromorpha prolifera green tide outbreak in the Yellow Sea[J]. Journal of Guangxi Academy of Sciences, 2018, 34(3): 204-209.

[23]

刘慧, 马丽萍, 赵峰, 等. 长牡蛎类HBGAs的提取与组织分布以及温度和盐度对其表达的影响[J]. 中国食品学报, 2019, 19(2): 236-243.

LIU

, MA

, ZHAO

, et al. Extraction, tissue distribution and influence of temperature and salinity on HBGAs-like molecules in oyster[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2019, 19(2): 236-243.

[24]

CHEN

, ZHOU

, CHEN

, et al. FASTP: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor[J]. Bioinformatics, 2018, 34(17): 884-890.

[25]

KIM

, LANDMEAD

, SALZBERG

. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 357-U121.

[26]

ROBERTS

, TRAPNELL

, DONAGHEY

, et al. Improving RNA-Seq expression estimates by correcting for fragment bias[J]. Genome Biology, 2011, 12(3): R22.

[27]

LOVE

, HUBER

, ANDERS

. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2[J]. Genome Biology, 2014, 15(12): 550

[28]

姜薇, 姚琳, 江艳华, 等. 太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)类FUT2基因的克隆与组织表达[J]. 渔业科学进展, 2014, 35(5): 70-75.

JIANG

, YAO

, JIANG

, et al. Molecular cloning and expression of FUT2-like gene in the oyster (Crassostrea gigas)[J]. Progress in Fishery Sciences, 2014, 35(5): 70-75.

[29]

LIVAK

, SCHMITTGEN

. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[30]

THONGPRACHUM

, KHAMRIN

, MANEEKARN

, et al. Epidemiology of gastroenteritis viruses in Japan: Prevalence, seasonality, and outbreak[J]. Journal of Medical Virology, 2016, 88(4): 551-570.

[31]

翟梦滢, 汤巧雨, 李永红, 等. 气候要素对我国诺如病毒急性胃肠炎感染暴发的影响分析[J]. 环境卫生学杂志, 2023, 13(3): 154-161.

ZHAI

, TANG

, LI

, et al. Influence of climatic factors on the outbreaks of acute gastroenteritis caused by norovirus in China[J]. Journal of Environmental Hygiene, 2023, 13(3): 154-161.

[32]

FAN

, MAO

, WANG

, et al. Transcriptomic WGCNA analyses reveal endoplasmic reticulum response of Patinopecten yessoensis under acute heat stress[J]. Aquaculture, 2024, 589: 740938.

[33]

ZHANG

, ZHU

, YUAN

, et al. Diversity of heat shock proteins in response to various stressors in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei[J]. Aquaculture, 2024, 584: 740647.

[34]

ACQUAFREDDA

, GUO

, MUNROE

. Transcriptomic response of the atlantic surfclam (Spisula solidissima) to acute heat stress[J]. Marine Biotechnology, 2024, 26(1): 149-168.

[35]

, SU

, LIU

, et al. Norovirus contamination and the glycosphingolipid biosynthesis pathway in Pacific oyster: A transcriptomics study[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2017, 66: 26-34.

[36]

苏来金. 诺如病毒在贝类中的分布及与牡蛎类组织血型抗原结合机制研究[D]. 上海: 上海海洋大学, 2019.

. Distribution of norovirus in shellfish and the binding mechanism to HBGA-like molecules in oysters[D]. Shanghai: Shanghai Ocean University, 2019.

[37]

杨丽娟, 陈艳华. β1,3-半乳糖基转移酶家族研究进展[J]. 中国现代医药杂志, 2016, 18(8): 101-105.

YANG

, CHEN

. Research progress on the β1,3-galactosyltransferase family[J]. Modern Medicine Journal of China, 2016, 18(8): 101-105.

[38]

教杨, 姚琳, 曲梦, 等. 牡蛎诺如病毒受体合成基因类FUT10的克隆与组织表达[J]. 食品安全质量检测学报, 2022, 13(1): 120-127.

JIAO

, YAO

, QU

, et al. Molecular cloning and expression of FUT10-like gene for norovirus receptor synthesis in Crassostrea gigas [J]. Journal of Food Safety & Quality, 2022, 13(1): 120-127.

[39]

GUI

, YAO

, QU

, et al. Cloning, expression, and functional characterization of FUT1, a key gene for histo-blood group antigens synthesis in Crassostrea gigas[J]. CURR Issues Mol Biol, 2023, 45(5): 4200-4213.

[40]

桂彬彬, 曲梦, 张蔚然, 等. 牡蛎诺如病毒受体类Lewis抗原合成相关基因CgFUT5的克隆与表达鉴定[J]. 南方水产科学, 2023, 19(6): 150-157.

GUI

, QU

, ZHANG

, et al. Cloning, expression and identification of CgFUT5 gene associated with Lewis antigen synthesis of oyster norovirus receptors[J]. South China Fisheries Science, 2023, 19(6): 150-157.

[41]

史成颖, 李正国, 徐乾, 等. 茶树谷氨酰胺合成酶同源基因的克隆及表达分析[J]. 西北植物学报, 2017, 37(1): 40-47.

SHI

, LI

, XU

, et al. Clone and expression of gs homologue of tea plant (Camellia sinensis)[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2017, 37(1): 40-47.

[42]

DE-VRIES

, STORM

, ROTTEVEEL

, et al. Production of soluble human α3-fucosyltransferase (FucT VII) by membrane targeting and in vivo proteolysis[J]. Glycobiology, 2001, 11(9): 711-717.

[43]

EL-BATTARI

, PROROK

, ANGATA

, et al. Different glycosyltransferases are differentially processed for secretion, dimerization, and autoglycosylation[J]. Glycobiology, 2003, 13(12): 941-953.

[44]

寇晓霞, 吴爱武, 范宏英. 广东省市售牡蛎中诺如病毒污染调查[J]. 现代预防医学, 2018(24): 4439-4442.

KOU

, WU

AIW

, FAN

. Survey on Norovirus contamination in commercial oysters in Guangdong Province[J]. Modern Preventive Medicine, 2018(24): 4439-4442.

2025年第16卷第1期

PDF下载

337

154

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20240812007

接收时间：2024-08-12
首发时间：2025-07-21
出版时间：2025-01-15

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2024-08-12

基金

国家自然科学基金项目(31101883)

国家自然科学基金项目(32172292)

中国水产科学研究院基本科研业务费项目(2023TD76)

现代农业产业技术体系专项(CARS-49)

作者信息

1.中国水产科学研究院黄海水产研究所/农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室, 青岛 266071

2.上海海洋大学食品学院, 上海 201306

3.中国海洋大学食品科学与工程学院, 青岛 266003

通讯作者:

^*姚琳(1980—), 男, 博士, 研究员, 主要研究方向为水产品质量安全与标准化。E-mail: yaolin@ysfri.ac.cn

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/spaq/CN/10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20240812007

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT

编号	取样组织	处理方式	处理时间/h
GHA	鳃组织	高温处理	6
GHB	12
GHC	24
GHD	48
GLA	低温处理	6
GLB	12
GLC	24
GLD	48
HHA	消化腺组织	高温处理	6
HHB	12
HHC	24
HHD	48
HLA	低温处理	6
HLB	12
HLC	24
HLD	48
GC	鳃组织	对照	0
HC	消化腺组织	0

编号

取样组织

处理方式

处理时间/h

GHA

鳃组织

高温处理

GHB

GHC

GHD

GLA

低温处理

GLB

GLC

GLD

HHA

消化腺组织

高温处理

HHB

HHC

HHD

HLA

低温处理

HLB

HLC

HLD

鳃组织

对照

消化腺组织

基因ID	引物名称	序列(5'-3')
LOC105319208	q-F1	CTGGTCGTCTGCTGGCTCTTG
q-R1	CGCAAGGTGATCGTATGAATATGGC
LOC105325358	q-F2	GTATGTGTTCTTCTTGGCGAGACAG
q-R2	GCTGCGACTTTCCTTGGTTGTG
LOC105321656	q-F3	GTCAATCTAAGTGGTGGGCAGAAAC
q-R3	ACGAGAGTCAACAGCAGATAGTGG
LOC105325575	q-F4	CCATAGACAGAGAACAGCCAGTGAG
q-R4	GCGAAACCTCTCCAAAGCAACAG
LOC105318009	q-F5	TCGGTAACAGTGGACGGTGAC
q-R5	GCAGGTGCGTATCCGAAGAATAG
LOC105318166	q-F6	GGTTCCATTGTACGACTTCCAGAC
q-R6	ACCTATGCTATGTGCCTCATCCAG
LOC117689189	q-F7	GGACAACAACAACCACCGTGAC
q-R7	GAAGCACCACCTTGAACCTGATG
LOC105326276	q-F8	TCAATCACAGAGACTTGGAGCAGAC
q-R8	GCAGGCGTAGTGGAGGATAGAAC
LOC117683256	B3GALT1-F	GTTAGTATTCTTGCTCAACTCTGGACTG
LOC117683256	B3GALT1-R	GAAGAATTGACCCATCACCTACCT
LOC117683256	B3GALT1-q-F	TTACCCTCTCGCCACTCAGTTCC
LOC117683256	B3GALT1-q-R	CCAGTACCGCACTGTGTTCAC
AF026063	F-actin	CTGTGCTACGTTGCCCTGGACTT
R-actin	TGGGCACCTGAATCGCTCGTT

基因ID

引物名称

序列(5'-3')

LOC105319208

q-F1

CTGGTCGTCTGCTGGCTCTTG

q-R1

CGCAAGGTGATCGTATGAATATGGC

LOC105325358

q-F2

GTATGTGTTCTTCTTGGCGAGACAG

q-R2

GCTGCGACTTTCCTTGGTTGTG

LOC105321656

q-F3

GTCAATCTAAGTGGTGGGCAGAAAC

q-R3

ACGAGAGTCAACAGCAGATAGTGG

LOC105325575

q-F4

CCATAGACAGAGAACAGCCAGTGAG

q-R4

GCGAAACCTCTCCAAAGCAACAG

LOC105318009

q-F5

TCGGTAACAGTGGACGGTGAC

q-R5

GCAGGTGCGTATCCGAAGAATAG

LOC105318166

q-F6

GGTTCCATTGTACGACTTCCAGAC

q-R6

ACCTATGCTATGTGCCTCATCCAG

LOC117689189

q-F7

GGACAACAACAACCACCGTGAC

q-R7

GAAGCACCACCTTGAACCTGATG

LOC105326276

q-F8

TCAATCACAGAGACTTGGAGCAGAC

q-R8

GCAGGCGTAGTGGAGGATAGAAC

LOC117683256

B3GALT1-F

GTTAGTATTCTTGCTCAACTCTGGACTG

LOC117683256

B3GALT1-R

GAAGAATTGACCCATCACCTACCT

LOC117683256

B3GALT1-q-F

TTACCCTCTCGCCACTCAGTTCC

LOC117683256

B3GALT1-q-R

CCAGTACCGCACTGTGTTCAC

AF026063

F-actin

CTGTGCTACGTTGCCCTGGACTT

R-actin

TGGGCACCTGAATCGCTCGTT

基因ID	差异倍数对数值log₂FC	上调或下调	差异分组
LOC105327316	2.86	上调	GHA vs GC
2.68	上调	GHB vs GC
2.50	上调	GHC vs GC
LOC105327909	-1.72	下调	GHC vs GC
LOC117691395	2.63	上调	GHD vs GC
LOC105335091	-1.63	下调	GLA vs GC
LOC117683256	1.04	上调	GLB vs GC
1.11	上调	GLC vs GC
1.23	上调	GLD vs GC
LOC105324924	-1.50	下调	HHB vs HC
LOC105325959	-1.15	下调	HHB vs HC
LOC105326727	-23.22	下调	HHB vs HC
-23.26	下调	HHD vs HC
LOC105336015	1.14	上调	HHB vs HC
LOC105342967	-7.45	下调	HHB vs HC

基因ID

差异倍数对
数值log₂FC

上调或
下调

差异分组

LOC105327316

2.86

上调

GHA vs GC

2.68

上调

GHB vs GC

2.50

上调

GHC vs GC

LOC105327909

-1.72

下调

GHC vs GC

LOC117691395

2.63

上调

GHD vs GC

LOC105335091

-1.63

下调

GLA vs GC

LOC117683256

1.04

上调

GLB vs GC

1.11

上调

GLC vs GC

1.23

上调

GLD vs GC

LOC105324924

-1.50

下调

HHB vs HC

LOC105325959

-1.15

下调

HHB vs HC

LOC105326727

-23.22

下调

HHB vs HC

-23.26

下调

HHD vs HC

LOC105336015

1.14

上调

HHB vs HC

LOC105342967

-7.45

下调

HHB vs HC