食品安全质量检测学报

方法	优势	局限性
EC	响应快、成本低、灵敏度高, 适用于快速筛选和现场检测	稳定性和重现性相对较差
比色法	低成本、简单、可用于现场分析	肉眼难以识别颜色的微弱变化, 灵敏度偏低
荧光/磷光法	高灵敏度和高选择性	易受干扰, 荧光团可能发生光漂白
拉曼光谱	快速、灵敏、无损、可原位分析	拉曼散射强度较弱, 稳定性和可重复性较差
侧流层析	灵敏度高、成本低、操作简便、可用于现场快速检测	灵敏度和定量能力有限, 有一定概率出现假阳/阴性, 在复杂基质中易受干扰

方法	优势	局限性
EC	响应快、成本低、灵敏度高, 适用于快速筛选和现场检测	稳定性和重现性相对较差
比色法	低成本、简单、可用于现场分析	肉眼难以识别颜色的微弱变化, 灵敏度偏低
荧光/磷光法	高灵敏度和高选择性	易受干扰, 荧光团可能发生光漂白
拉曼光谱	快速、灵敏、无损、可原位分析	拉曼散射强度较弱, 稳定性和可重复性较差
侧流层析	灵敏度高、成本低、操作简便、可用于现场快速检测	灵敏度和定量能力有限, 有一定概率出现假阳/阴性, 在复杂基质中易受干扰

方法	样品	目标分子	检出限	线性范围	回收率/%	分析时间	参考文献
EC	牛奶	BPA	5 nmol/L	0.01~10 pmol/L	105	30 min	[101]
牛奶、肉类	E2	9.9×10^-19mol/L	10^-18~10^-6 mol/L	95.1~104.8	20 min	[31]
比色法	牛奶	E2	13.1 pmol/L	0.05~0.8 nmol/L	100.1~113.0	1.5 h	[55]
BPA	7.60 pmol/L	10~100 pmol/L	96.10~106.5	55 min	[102]
肉类	E2	0.15 μmol/L	0~10 μmol/L	95.70~113.8	40 min	[57]
荧光/磷光法	牛奶	孕酮	0.065 ng/mL	0.25~25 ng/mL	90~105	15 min	[103]
E2	3.48×10^-12 mol/L	10^-11~10^-6 mol/L	82~107	1.5 h	[104]
0.29 ng/mL	0.5~1.2 μg/mL	93.6~102.4	40 min	[67]
拉曼光谱	鸡肉、牛奶	E2	9.58×10^-14 mol/L	10^-12~10^-4mol/L	95.00~98.72	1 h	[87]
牛奶	1.95×10^-16mol/L	10^-14~10^-6mol/L	90.56~109.40	35 min	[89]
侧流层析	水产、牛奶	E2	65 ng/g	75 ng/g	-	7~10 min	[93]
鸡/猪肉	丙酸睾酮	0.32 μg/kg	0.05~0.94 ng/mL	90~110	40 min	[105]
牛奶	地塞米松	0.0013 μg/kg	0.05~0.08 μg/kg	81.1~113.7	20 min	[100]
牛肉	0.08 μg/kg	0.35~1.50 μg/kg	89.2~115.4
猪肉	0.07 μg/kg	0.25~1.00 μg/kg

方法	样品	目标分子	检出限	线性范围	回收率/%	分析时间	参考文献
EC	牛奶	BPA	5 nmol/L	0.01~10 pmol/L	105	30 min	[101]
牛奶、肉类	E2	9.9×10^-19mol/L	10^-18~10^-6 mol/L	95.1~104.8	20 min	[31]
比色法	牛奶	E2	13.1 pmol/L	0.05~0.8 nmol/L	100.1~113.0	1.5 h	[55]
BPA	7.60 pmol/L	10~100 pmol/L	96.10~106.5	55 min	[102]
肉类	E2	0.15 μmol/L	0~10 μmol/L	95.70~113.8	40 min	[57]
荧光/磷光法	牛奶	孕酮	0.065 ng/mL	0.25~25 ng/mL	90~105	15 min	[103]
E2	3.48×10^-12 mol/L	10^-11~10^-6 mol/L	82~107	1.5 h	[104]
0.29 ng/mL	0.5~1.2 μg/mL	93.6~102.4	40 min	[67]
拉曼光谱	鸡肉、牛奶	E2	9.58×10^-14 mol/L	10^-12~10^-4mol/L	95.00~98.72	1 h	[87]
牛奶	1.95×10^-16mol/L	10^-14~10^-6mol/L	90.56~109.40	35 min	[89]
侧流层析	水产、牛奶	E2	65 ng/g	75 ng/g	-	7~10 min	[93]
鸡/猪肉	丙酸睾酮	0.32 μg/kg	0.05~0.94 ng/mL	90~110	40 min	[105]
牛奶	地塞米松	0.0013 μg/kg	0.05~0.08 μg/kg	81.1~113.7	20 min	[100]
牛肉	0.08 μg/kg	0.35~1.50 μg/kg	89.2~115.4
猪肉	0.07 μg/kg	0.25~1.00 μg/kg

动物源性食品中类固醇激素的快速检测方法研究进展

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薛耀辉 ¹^,²^,³^,^# , 李锦花 ²^,^# , 马明 ² , 钱四化 ³ , 韩超 ¹^,^* , 王宇辉 ³^,^*

食品安全质量检测学报 | 本期专题：食品中有毒有害物质分析与监测 2025,16(9): 159-171

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食品安全质量检测学报 | 本期专题：食品中有毒有害物质分析与监测 2025, 16(9): 159-171

动物源性食品中类固醇激素的快速检测方法研究进展

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薛耀辉¹^,²^,³^,^#, 李锦花²^,^#, 马明², 钱四化³, 韩超¹^,^*, 王宇辉³^,^*

作者信息

1.华北理工大学化学工程学院, 唐山 063210

2.宁波海关技术中心, 宁波 315048

3.中国科学院宁波材料技术与工程研究所, 宁波 315201

薛耀辉(1999—), 男, 硕士研究生, 主要研究方向为食品安全检测。E-mail: xueyaohui@nimte.ac.cn

李锦花(1982—), 女, 硕士, 高级工程师, 主要研究方向为食品分析。E-mail: 82944338@qq.com

通讯作者:

^* 韩超(1984—), 男, 副教授, 主要研究方向为有机探针与分析。E-mail: hanchao@ncst.edu.cn

王宇辉(1985—), 男, 副研究员, 主要研究方向为食品安全检测。E-mail: wangyuhui@nimte.ac.cn

Research progress on rapid detection methods for steroid hormones in animal derived foods

Yao-Hui XUE¹^,²^,³, Jin-Hua LI², Ming MA², Si-Hua QIAN³, Chao HAN¹^,^*, Yu-Hui WANG³^,^*

Affiliations

1. School of Chemical Engineering, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China

2. Ningbo Customs Technology Center, Ningbo 315048, China

3. Ningbo Institute of Materials Technology & Engineering, Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315201, China

出版时间: 2025-05-15 doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250109002

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摘要

收起

动物源性食品是人类重要的营养素来源之一。在养殖过程中, 类固醇激素的合理使用可达到促生长、增重、消炎等目的, 但过渡滥用会严重威胁食品安全和消费者身体健康。目前, 类固醇激素的检测方法主要为液相色谱法、气相色谱法及其与质谱的联用技术, 这严重依赖大型精密仪器、预处理复杂, 并且需要专业实验室和技术人员。近些年来, 随着分析科学技术与仪器的飞速发展, 各种类固醇激素残留的快速检测技术已不断涌现, 为食品安全提供了坚实的技术保障。本文对目前类固醇激素的快速检测方法, 包括电化学法、比色法、荧光/磷光法、拉曼光谱法和侧流免疫层析法进行了详细综述, 分析了这些方法的优点及不足, 探讨了其面临的挑战及未来的发展方向。该综述将为食品中类固醇激素残留的快速检测方法的设计提供参考借鉴, 并对相关研究者提供思路启发。

关键词

类固醇激素 / 快速检测 / 电化学法 / 比色法 / 免疫层析法 / 表面增强拉曼光谱法 / 荧光检测法

Abstract

收起

Animal derived foods are one of the important sources of nutrients for humans. During the breeding process, the rational use of steroid hormones can achieve the goals of promoting growth, weight gain and anti-inflammatory effects, but excessive abuse can lead to serious threats to food safety and consumer health. At present, the detection methods for steroid hormones mainly rely on liquid chromatography, gas chromatography and their combined techniques with mass spectrometry. They also heavily rely on large precision instruments and complex preprocessing, requiring professional laboratories and technical personnel. In recent years, with the rapid development of analytical science and technology, rapid detection technologies for various steroid hormone residues have emerged, providing solid technical support for food safety. This paper presented a comprehensive review of current rapid detection methods for steroid hormones, including electrochemistry, colorimetric methods, fluorescence/phosphorescence methods, Raman spectroscopy and lateral flow immunoassay. It analyzed the advantages and disadvantages of these methods, discussed the challenges they face, and explored their future development directions. This review served as a reference for the design of rapid detection methods for steroid hormone residues in food and provided insights and inspiration for relevant researchers.

Key words

steroid hormones / rapid detection / electrochemistry / colorimetric assay / immunochromatography / surface enhanced Raman spectroscopy / fluorescence assay

引用本文

薛耀辉, 李锦花, 马明, 钱四化, 韩超, 王宇辉. 动物源性食品中类固醇激素的快速检测方法研究进展. 食品安全质量检测学报, 2025 , 16 (9) : 159 -171 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250109002

Yao-Hui XUE, Jin-Hua LI, Ming MA, Si-Hua QIAN, Chao HAN, Yu-Hui WANG. Research progress on rapid detection methods for steroid hormones in animal derived foods[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2025 , 16 (9) : 159 -171 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250109002

正文

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0 引言

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在食用动物的养殖中, 类固醇激素主要用于人工繁殖、性别转化及抗炎抗病害^[1-3]。在养殖过程中使用的兽药(如激素、抗生素等)被归类为内分泌干扰化学物质(endocrine-disrupting chemicals, EDCs)^[4-6]。20世纪70—80年代以来, 与食品中残留的合成类固醇相关的内分泌失调报道大量出现。研究表明, 即使残留量极低, 这些残留的激素仍将造成长期危害^[7-11], 传统的废水处理系统无法将它们从水体中清除, 它们留存在环境中, 造成长期环境影响^[12-13]。类固醇激素常在动物的可食用部分(如肌肉、内脏)和奶中检出, 由于类固醇激素残留的危害, 我国自2002年起先后禁止了多种性激素在养殖中用于任何用途, 在所有动物的可食用部分不得检出; 并且对地塞米松等糖皮质激素在动物源性食品中的残留量做出了限制。

科研人员在过去几十年间开发了多种方法来检测不同基质中残留的类固醇激素, 包括气相色谱法(gas chromatography, GC)、液相色谱法(liquid chromatography, LC)、气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)、液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等^[14](图1)。目前应用最广泛的检测技术是高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)技术, 它具有很高的灵敏度^[15]。然而, 由于类固醇类物质的极性和低挥发性, 对类固醇等小分子化合物的分析通常需要柱前衍生^[16-17], 这些预处理过程大多复杂费时, 且处理过程中需要使用大量有机溶剂。如果衍生处理不彻底, 还将导致回收率低和结果不准确等问题^[18-19], 这要求分析操作人员拥有较高的专业素质。

类固醇激素按照其功能可分为性激素和皮质激素, 它们具有共同的甾体母核结构。目前, 对类固醇残留检测的国家标准主要是GB 31660—2019《食品安全国家标准水产品中辛基酚、壬基酚、双酚A、已烯雌酚、雌酮、17α-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇残留量的测定气相色谱-质谱法》, 其中规定了对水产品中雌二醇(estradiol, E2)、雌三醇、醋酸甲地孕酮等性激素的GC-MS检测方法; 以及对动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮的LC-MS检测方法。这些方法虽然检测灵敏度高, 但是柱前衍生等前处理烦琐耗时, 仪器体积大, 对工作环境的要求较高, 无法实现现场快速检测。

近年来, 随着食品工业的多样化发展, 食品检测朝着快速、灵敏、便携、简便且低成本高通量的方向发展。大量快速检测技术被开发出来用于检测类固醇, 主要包括EC^[20]、比色法^[21-22]、荧光/磷光法^[23]、拉曼光谱法^[24-25]和侧流免疫层析法^[26-28]等, 相较于传统LC-MS、GC-MS方法, 它们所需的样品预处理程序较少或无需预处理, 仅需小型便携式仪器或无需仪器^[29], 提高了检测效率, 并且大幅降低了仪器和人力成本。本文综述了近些年类固醇激素快速检测方法的发展及应用, 介绍了它们各自的优势和局限性, 以期为检测食品安全中的类固醇激素的快速检测研究提供借鉴, 促进未来新型检测方法的开发应用。

1 类固醇激素的快速检测技术

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1.1 电化学法

EC检测类固醇类激素具有成本低、灵敏度高、响应速度快、操作简便且可实时监测等优点^[30]。在各种电化学检测技术中, 最常用的电化学检测方法是伏安法, 在测量过程中, 可快速测量氧化还原电位^[31-32], 是一种准确、快速且高灵敏度的方法。在伏安法中, 用于定性和定量检测的技术包括循环伏安法(cyclic voltammetry, CV)、方波伏安法(square wave voltammetry, SWV)、线性扫描伏安法(linear sweep voltammetry, LSV)和差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry, DPV)。这些方法均是以对工作电极施加特定电压, 并检测施加电压范围内的电流变化为基础^[33-34]。

直接电化学检测法早在2009年就被应用于检测类固醇^[35]。然而, 由于类固醇的氧化产物在电极表面结垢等原因, 导致传统电极的性能降低, 使用裸电极难以检测到痕量水平的类固醇激素。为了提高灵敏度, 研究者对工作电极进行了各种修饰以提高其性能^[36-37]。由于良好的导电性、高比表面积和高化学稳定性, 铜、银、钯和金等贵金属纳米粒子被广泛作为电极修饰材料使用^[38]。石墨烯、碳纳米管等作为电化学传感器的修饰材料也受到广泛关注^[39-40]。BACCHU等^[31]开发了基于氮化石墨碳(g-C₃N₄)和导电聚合物3-氨丙基三乙氧基硅烷[(3-aminopropyl)triethoxysilane, APTES]修饰的电化学传感器(图2a)。g-C₃N₄比表面积大、电催化性能高, 能够提高电极的表面电导率和生物传感器的识别能力; APTES可提高电化学传感器稳定性和灵敏度, 可优化生物传感器的催化性能。应用于检测牛奶、家禽肉类和环境水样中的E2, 检出限低至9.9×10^-19 mol/L。此外, 金属有机框架(metal-organic frameworks, MOFs)材料也在电化学分析领域展现出应用潜力。MOFs材料是一种由金属节点与有机配体配位而成的新型结晶纳米多孔材料, 它具有可调节的孔结构和较大的比表面积。为了进一步提升MOFs的电化学传感性能, 将金属纳米颗粒(metal nanoparticles, MNPs)与MOFs偶联已成为有效策略之一。基于此, CHAI等^[41]通过离子交换在Zn-MOF宿主表面覆盖配位金, 随后通过化学还原法转化为尺寸小于5 nm、分散性好的超小型金纳米粒子(gold nanoparticles, AuNPs)。由于将AuNPs的尺寸减小到了5 nm以下, 金氧化物暴露的活性位点密度大幅增加。集成的MNPs可显著提高MOFs的电子传递能力, 还可赋予其更多的活性催化位点。MOFs能防止MNPs因支撑效应或封闭效应而发生聚集, 因此混合体具有更高的电化学传感性能。传感器对激素的检出限低至12.3 nmol/L, 在湖水实际样品中的加标回收率在93.0%~103.5%之间, 表现出优异的分析性能。

将电化学传感器与免疫测定结合构建电化学免疫传感器的方法也备受关注^[42]。作为典型的特异性识别元件分子, 核酸适配体近年来在分析和诊断应用中备受关注。核酸适配体是一种合成的单链核酸序列, 通过折叠成二级结构, 具有与目标分子的高亲和力和高选择性。与传统抗体相比, 核酸适配体具有成本低、化学性质稳定、修饰简单、热稳定性好和易于体外合成等独特优势, 可以更灵活地设计各种类型的传感器。CHANG等^[32]利用拆分为两个片段并分别标记的适配体开发了一种电化学传感器。第一个适配体片段上修饰的金刚烷与β-环糊精(β-cyclodextrin, β-CD)结合而被固定激光划刻石墨烯(laser-scribed graphene, LSG)电极表面; 第二个适配体片段被修饰在AuNPs上作为电化学指示剂使用。当E2存在时, 两个适配体片段在与E2结合的过程中重组, 使AuNPs更接近电极表面, 从而导致电化学信号的变化(图2b), 该方法将检出限进一步降低至0.7 fmol/L。

分子印迹电化学传感器(molecularly imprinted electrochemical sensors, MIECS)近年来也被应用于检测类固醇。分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers, MIP)由聚合物单体和模板分子聚合而成, 洗脱模板分子后, 聚合物表面留有大量可与靶标分子高度特异性结合的空穴^[43]。MIECS可识别MIP与靶标分子结合过程中的电化学信号变化, 具有低成本、高灵敏度和选择性、检测时间短、环境稳定性好及可重复利用等特点, 广泛应用于生物分析等领域^[44]。MANICKAM等^[45]首次开发了使用MIP的用于检测类固醇的电化学传感器。此后, 人们又提出了几种方法用于降低检出限并缩短检测时间。提高电极的有效面积、电导率和电化学稳定性是获得具有良好稳定性和优异传感性能的MIP生物传感器的有效手段, 通过对电极进行纳米材料修饰, 使电极表面具有更好的电子流和能量流, 都有助于提高传感器的检测性能。LIU等^[46]将Ti₃C₂Tₓ型二维碳化钛基材料(Ti₃C₂T_x- transition metal carbide/nitride/carbonitride, Ti₃C₂T_x-MXene)和Gr组成的具有三维多孔结构的MXene/石墨烯复合材料(MXene/graphene composite, MXG)复合材料修饰在玻璃碳电极上, 开发了MIP生物传感器, 首次应用于皮质醇的电化学传感并将其应用于检测人唾液中的皮质醇。MXG复合材料具有高导电性能和较大的电活性表面积, 可提高生物传感器的电导率。在此传感器中, MXG多孔复合材料被用于修饰电极, 使电极的电流响应提高了15倍以上, 具有低至0.4 fmol/L的检出限和1 fmol/L~10 μmol/L较宽的线性范围。

1.2 比色法

在比色检测中, 溶液中物质的微观化学变化可以通过可视的颜色变化得以反映, 故而可以通过测量吸光度的变化而对分析物进行定量检测^[47]。比色法凭借其操作简单、灵敏度高、准确性高和成本低等优势, 近年来在分析化学领域得到了快速发展。可肉眼观察到的颜色变化为高通量筛选提供了便利。

各种比色法中, 基于AuNPs的比色传感器尤其令人关注。AuNPs具有极高的消光系数和等离子激元吸收光学特性, 常被用作灵敏的比色指示剂, 它们呈现出清晰且明显的颜色, 很容易被肉眼观察^[48-50]。PULE等^[51]基于融入了电纺聚苯乙烯纳米纤维的AuNPs开发了一种可应用于现场检测的比色探针, 使用电纺丝技术制造苯乙烯-金聚合物, 合成过程简单稳定。随着E2浓度的增加, 表面等离子共振吸收峰向长波段移动, 可视颜色由粉红色逐渐变为蓝色。用于检测乳制品中的E2时, 目视检出限为100 ng/mL。LIU等^[52]基于非靶向生物识别物“雌激素受体α” (estrogen receptor α, ERα)和AuNPs的比色传感器, 应用于自来水和牛奶样品中的多种非特定的雌激素进行检测。ERα可在无EDCs存在时防止AuNPs聚集, 并可识别多种非特定的雌激素, 可应用于现场高通量筛选, 为初步同时筛选多种EDCs提供了一种可行思路。该传感器的检出限为0.01 nmol/L, 但并非特异性识别单一物质, 仅适用于大批量筛选, 存在较大的局限性。

许多研究将核酸适配体与AuNPs结合开发比色传感器。目前已开发出多种适用于不同目标分子的核酸适配体, 但大多数长序列核酸适配体的灵敏度不佳, 这可能是由于二级结构的形成影响了适配体的灵敏度^[22]。为了提高灵敏度, 科研人员做了大量工作, 包括截短或删除适配体的一部分序列、控制适配体的修饰量^[22,53-55]等。LIU等^[22]首次将E2 76 mer的核酸适配体拆分为两个短的DNA序列以提高灵敏度。ALSAGER等^[53]通过删除适配体序列中多余的侧边核苷酸获得了35 mer和22 mer的适配体片段并用于测试。他们的工作使灵敏度分别提高了10倍和25倍, 结果均表明, 截短的适配体应用于检测可提高传感器的灵敏度。基于他们的研究, 全长适配体对目标结合信号存在抑制作用的可能原因是: 在与目标分子结合后, 结合区域以外的过剩碱基仍吸附在AuNPs上阻止其聚集(图3a^[53])。经过对使用不同长度的适配体体系的对比, 得出了“保留少量的过剩碱基是最佳选择”的结论。SOH等^[54]利用适配体-靶标识别介导适配体功能化的AuNPs的生长开发了一种比色传感器, 根据目标物浓度和AuNPs表面修饰的适配体量的不同, AuNPs将生长为形态各异的结构, 从而产生不同颜色的溶液(图3b^[54]), 即使吸附的适配体数量仅存在细微差别, 金氧化物的生长也将出现明显的形态变化, 从而产生可见的颜色变化, 该传感器对E2的检出限低至0.2 nmol/L, 为提高传感器的灵敏度提供了另外一种思路。

此外, 还有基于过氧化物纳米酶和其他一些纳米材料的比色传感器。例如, Fe₃O₄自2007年被发现具有过氧化物酶的特性, 有大量工作对利用Fe₃O₄代替过氧化物酶进行了研究。相对于辣根过氧化酶(horseradish peroxidase, HRP), Fe₃O₄具有在高pH条件下稳定性高、易制备和储存以及可回收等特点。WEI等^[56]制备了具有磁性及过氧化物酶样活性的Fe₃O₄@mSiO₂磁性介孔纳米粒子, 并用作比色传感器检测E2, 检出限为0.2 mmol/L。GUO等^[57]利用硫磺素T与E2适配体结合后产生强烈荧光信号的特点, 基于硫磺素T与E2竞争适配体结合位点的特性开发了荧光和比色双模式传感器并应用于肉类食品, 检出限分别为0.15 μmol/L和0.27 μmol/L。

1.3 荧光/磷光法

荧光光谱法具有高灵敏、高通量、样品用量少等优势, 是各种光谱法中常用的类固醇检测技术。荧光团的光学性能在荧光检测中至关重要, 直接决定靶标的检测灵敏度。目前, 常见的荧光探针包括有机染料、量子点(quantum dots, QDs)、碳点(carbon dots, CDs)、长余辉纳米材料(persistent luminescence nanoparticles, PLNPs)等, 它们主要是基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理检测类固醇激素^[58-60]。VARRIALE等^[61]基于荧光探针Biotium CF647和多克隆单特异性抗E2抗体合成了E2-半琥珀酸-谷氨酰胺结合蛋白偶联物, 通过竞争性免疫测定的方法对未经处理的牛奶样品中E2进行测定。该方法无需预处理步骤, 检出限低至10 pmol/L。

近年来, QDs被广泛研究, 并在生物传感器的设计中得到了广泛应用。QDs具有独特的光学特性, 其激发光谱窄而对称, 并具有可调的发射光谱。与传统的有机荧光染料相比, 具有高荧光量子产率、优异的光稳定性和良好的水溶性等优势^[62]。WANG等^[63]开发了基于FRET的探针, 首次报道了水溶性低毒β-CD功能化ZnS QDs的合成。环糊精由于特殊的分子结构, 可作为分子宿主与各种客体分子形成聚合物, 中性红分子能以中性形式进入锚定在硫化锌QDs表面的水溶性β-CD空腔, 结合QDs独特的光学特性, 形成FRET探针。用于测定河水中醋酸甲孕酮的浓度, 检出限为0.0083 nmol/L。WEI等^[64]将碳点与磁性Fe₃O₄结合, 开发了一种新型荧光传感器(图4a), 在竞争法的基础上做了部分改变: 在富含羧基的CDs上标记E2适配体, 用同样的方法将互补DNA序列修饰在Fe₃O₄上, E2将阻止适配体与其互补DNA杂交。当使用磁铁分离时, 若无E2存在, 上清液的荧光强度很低, 当E2存在时, E2阻止了复合物的形成, 上清液的荧光强度升高。根据荧光强度的增加程度即可定量E2的浓度。该传感器的检出限低至3.48 pmol/L, 并成功应用于检测牛奶与水样中的E2。

通过金属增强荧光的传感器以达到时间分辨目的的荧光传感器近年来也被开发。采用时间分辨策略, 可有效避免背景荧光的干扰。SAFARIAN等^[65]开发了一种基于游离皮质醇对固定在金表面上的免疫复合物中荧光标记的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)-可的松偶联物的位移对可的松检测。BSA-可的松偶联物被固定在AuNPs上, 与样品中游离的皮质醇发生竞争性交换反应, 一旦荧光标记的BSA-可的松偶联物被游离的可的松取代, 荧光增强将会消失。通过检测加入样品后的荧光强度可对目标分子进行时间分辨检测, 检出限为20 ng/mL。此外, 还有其他基于FRET原理但使用其他荧光团的荧光传感器: 如有机染料^[66-68]、环糊精^[69-70]和上转换纳米粒子^[71-72]等。这些荧光材料都为开发灵敏的荧光传感器提供了多种可能。

由于存在激发光源的影响, 荧光检测会存在背景荧光和散射光的干扰^[73]。长寿命发光或余辉延迟检测技术可以完全避免上述光学干扰, 显著提高检测信噪比或灵敏度, 近年来获得了更多的关注^[74-76]。PLNPs可储存激发能量并在数分钟到数小时内缓慢发射光子, 其作为一种新兴的光学探针, 在高灵敏生化传感分析和生物成像中极具竞争力。基于此, ZHANG等^[67]将核酸适体修饰至PLNPs表面, 以MoS₂纳米片为淬灭剂, 开发了长余辉FRET传感器(图4b), 成功应用于牛奶复杂样品中E2的检测, 在关闭激发光后检测磷光信号, 以避免基质的自发荧光, 检出限低至0.29 ng/mL, 为快速、高特异性且能避免自发荧光的检测提供了可行的检测方法。

1.4 表面增强拉曼光谱检测技术

拉曼光谱技术是鉴定和表征分子化学结构的重要分析工具, 与红外光谱相似, 都属于分子振动光谱。拉曼光谱具有快速、简单、可应用于现场检测等优势^[24,77], 通过检测散射光并进行分析, 可获得样品分子的振动状态信息。由于类固醇的C₁₈骨架结构中O-H的伸缩振动、C-H和O-H的弯曲振动及环变形, 类固醇激素在拉曼光谱中将存在特征峰, 可在光谱中识别。然而, 拉曼散射效应的强度很弱, 且实际样品中的类固醇含量相对较低, 这限制了它在检测中的应用^[78-79]。为了获得较强的拉曼散射信号, 提高信噪比, 研究者开发了表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)检测技术, 以对目标分子实现高灵敏度检测。

SERS基底在SERS检测中至关重要, 可分为胶体基底和固体基底。最常用的胶体基底是金、银和金银核壳纳米粒子胶体^[80-82], 但胶体悬浮液可能不稳定并会发生团聚。固体基底可克服这种缺陷, 但制造较为困难。拉曼信号的放大通常认为是电磁增强和化学增强的协同效应, 在激发光的激发下, 金、银等贵金属纳米粒子的过渡频率高、介电常数大, 它们之间会产生局部表面等离子共振, 从而实现电磁增强^[83]。在各种贵金属纳米粒子中, 银纳米粒子(silver nanoparticles, AgNPs)的SERS活性最好, 价格较AuNPs低, 是优秀的SERS基底之一^[84]。LIU等^[83]使用AgNPs为SERS源, 利用MoS₂的光催化特性实现基底的自清洁, 并在AgNPs外包裹还原氧化石墨烯(reduced graphene oxide, rGO)起到保护作用并吸附目标物(图5a), 缩短目标分子与AgNPs间的距离, 从而增强SERS信号。MoS₂具有很大的比表面积, 可为AgNPs提供规则排列的平台, 同时可为AgNPs提供更高的灵敏度。使用此基底的传感器检出限低至5 pmol/L, 并可应用于养殖废水样本中E2的检测。

利用分子印迹聚合物、核酸适配体的优异分子识别特性, 可以开发高特异、高灵敏的SERS传感器, 获得了研究者的广泛关注^[85-87]。XUE等^[78]较早利用表面印迹核壳AuNPs对双酚A (bisphenol A, BPA)进行检测(图5b), 检出限为0.12 mg/mL。LIU等^[88]利用金硅核壳纳米颗粒(Au@Ag core-shell nanoparticles, Au@Ag CS NPs)基底结合核酸适配体, 开发了一种新型的SERS系统, 利用4-巯基苯甲酸(4-mercaptobenzoic acid, 4-MBA)作为拉曼报告分子, 用于检测复杂水样中的E2。由于系统中的适配体与Au@Ag CS NPs之间的静电作用, Au@Ag CS NPs与4-MBA被分离, 拉曼强度较弱。当E2被添加到系统中时, 它更倾向于与适配体结合并形成复合物, 从而导致纳米颗粒与适配体分离, 报告分子的拉曼散射强度随之恢复, 通过监测添加E2前后的拉曼散射强度变化即可对E2进行定量。该传感器的灵敏度足够高, 可检测到HPLC无法检测到的水样中的痕量E2, 检出限低至0.05 pmol/L, 线性范围为0.1 pmol/L~10 nmol/L, 对E2具有良好的选择性。ZHANG等^[89]将核壳结构的多巴胺分子印迹AuNPs嵌入铁MOFs材料中, 形成了六边形微纺锤结构。通过有机配体与聚多巴胺(polydopamine, PDA)芳香基团间的疏水作用、邻苯二酚基团的鳌合作用及醋酸的引入, AuNP@MIP-PDA被封装在MIL-101晶体中。结合AuNPs的SERS活性、MIPs的特异性识别位点以及MIL-101的吸附和富集能力, 纳米杂化具有高选择性。该传感器可直接应用于牛奶中E2的检测而无需预处理, 检出限为0.195 fmol/L。

1.5 侧流免疫层析技术

侧流免疫层析技术凭借灵敏、低成本、操作简便、适宜现场快速检测等优点, 目前被广泛应用于临床诊断、环境监测和食品安全等诸多领域^[90-91]。基于抗原抗体的免疫识别反应, 对目标物进行特异性检测^[92]。最常用的侧流免疫层析技术是胶体金法, 在食品安全分析中获得了较为广泛的应用^[93]。近年来, 胶体金层析亦被应用于检测食品中类固醇激素。例如YANG等^[94]首次将侧流胶体金免疫分析试纸应用于测定牛奶样品中E2的检测, 并验证了该试纸可进一步用于奶粉中E2残留量的检测, 试纸条的线性范围为37.14~1484.65 pg/mL, 可提供定量结果且无需前处理, 应用于现场检测, 方便快捷。WANG等^[95]开发了针对雌酮、E2和雌三醇的胶体金免疫层试纸, 用于检测牛奶样品中的3种雌激素残留, 该测试方法的视觉检出限低至5 ng/mL。YAO等^[96]在柠檬酸钠的作用下, 通过g-C₃N₄纳米片表面原位还原氯金酸, 开发了石墨类氮化碳AuNPs (g-C₃N₄@Au)复合材料。这种材料具有比AuNPs更深的颜色, 有效增强了信号强度。辅助放大信号的侧流层析试纸将E2的目视检出限提升了3倍, 低至0.5 ng/mL, 并应用于鱼、虾、猪肉和鸡肉4种食品样品中E2的快速检测与筛选。

对于小分子分析物的竞争法检测, 测试线的信号强度与游离的分析物浓度成反比, 这需要存在低浓度抗体的同时, 还需要足够的纳米粒子标记物来提高灵敏度, 以保证测试线的颜色强度。传统的胶体金材料通常无法满足这些要求, 为了解决这些问题, 人们开发了许多新型探针用于抗体标记, 如荧光纳米微球、彩色乳胶微球、普鲁士蓝纳米粒子和氧化石墨烯等^[97]。KIM等^[98]开发了一种基于化学发光的侧流免疫层析平台, 以酶偶联AuNPs作为发光标记, 层析膜含有与皮质醇抗体或HRP偶联的AuNPs探针, 通过为抗皮质醇抗体和HRP提供多个区域, 还能有效增加发光信号。通过夹心法测定血清中的皮质醇, 用于检测人血清中的皮质醇, 检出限为0.343 μg/dL。

近年来, 科研人员也在尝试开发新的信号采集方式和检测策略以提高侧流层析试纸的灵敏度和可靠性。ZHANG等^[99]开发了一种光热侧流免疫层析条带, 首次将BP-Au纳米复合材料用于E2的光热侧流层析检测。光热侧流免疫层析技术的信号采集仅需依赖光源和便携式红外热成像仪, 可降低测试成本; 光热转化效率足够高, 背景信号得到有效去除, 易于实现高灵敏度和高信噪比。抗E2修饰的黑磷-金纳米复合材料作为光热对比信号探针, 用红外摄像机记录测试线的温度(图6a^[99])。黑磷纳米片(black phosphorus nanosheets, BPNs)的带隙可利用厚度变化调整, 这一特点使BPNs可吸收可见光区至中红外区的光线。此外, BPNs的消光系数大, 光热转换效率高, 为光热侧流层析提供了有利条件。以阴性对照的温度为基准, 以T区和C区的温度比值为定量依据, 可有效克服使用环境的温差造成的误差。在最佳检测条件下, 试纸的检出限低至50 pg/mL, 并可应用于水、牛奶和奶粉样本中E2的快速筛选分析。DENG等^[100]利用Ti₃C₂@Au荧光比色探针开发了“关闭”和“开启”双信号侧流层析免疫条带。Ti₃C₂@Au纳米复合材料具有摩尔消光系数高、淬灭能力强、分散性高、生物相容性好等特点, 可在低抗体水平下进行高灵敏度检测, 合成过程无需任何有机试剂或加热反应。时间分辨荧光微球和目标分子的包被原被固定在T线, 在阴性条件下, 探针被T线捕获, 微球的荧光被探针淬灭, 探针在T线显色; 阳性条件下, 探针无法被T线捕获, 微球的荧光恢复, 而探针将不再在T线聚集而无颜色显示(图6b^[100])。通过“关闭”和“开启”模式的结合, 实现了两个信号的相互校准, 有助于提高信号可靠性。用于测定牛奶、牛肉和猪肉中的地塞米松, 检出限分别为0.0013、0.080和0.070 μg/kg。

2 常用快速检测方法的性能比较

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不同快速检测方法检测类固醇激素的优势和局限性见表1, 每种方法都有它们独特的优点和不足, 如何结合这些优缺点以达到扬长避短的效果仍是科研工作者今后的努力方向。上述快速检测方法的典型应用在表2中列出, 可以看出, 在EC、比色法在灵敏度方面的表现较为突出, 但是, 侧流层析和拉曼光谱法的简单性和便携性更胜, 进一步缩短前者的检测时间以及提高后两者的灵敏度或将成为新的研究热点。

3 结束语

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本综述系统总结了包括EC、比色法、荧光/磷光法、拉曼光谱法和侧流层析法等近些年常见的类固醇激素快速检测方法与技术, 综述了这些方法在动物源性食品, 包括乳制品和肉类等食品基质中类固醇激素检测的最新应用研究进展。如今, 内分泌干扰化学物质, 尤其是激素已成为我们难以回避的问题, 类似问题在全球范围内广泛存在, 对人类健康构成严重威胁。特别是近年来, 世界各国食品安全事件频发; 由于市场和贸易的周转需求, 新型检测方法的开发显的尤为迫切, 且将更加注重快速和灵敏, 以期对痕量物质进行即时高灵敏检测。这将主要涉及高灵敏信号探针的选择与设计, 以及识别元件的选择和优化, 包括高特异性抗体的制备、功能配体的筛选等。由于E2是作用最强的类固醇激素, 目前关于类固醇激素的检测主要集中于对E2的检测, 然而其他类固醇激素如甲基睾酮、丙酸睾酮等雄性激素, 地塞米松、倍他米松等糖皮质激素的检测方法研究偏少。类固醇激素的多重识别与同时检测将是今后的重要研究方向, 这需要结合高通量的检测技术(如: 微流控分析、阵列传感等)。此外, 类固醇等内分泌干扰化学物质的原位检测目前仍缺乏有效手段, 如何在食品中建立原位实时的监测技术, 将有利于控制此类物质进入食物链, 这也将成为未来需要关注的研究方向之一。

基金

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宁波市公益性研究计划重点项目(2023S006)
宁波市自然科学基金重点项目(2022J293)

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2025年第16卷第9期

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文章信息

doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250109002

接收时间：2025-01-09
首发时间：2025-07-17
出版时间：2025-05-15

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作者

出版历史

收稿日期：2025-01-09

基金

宁波市公益性研究计划重点项目(2023S006)

宁波市自然科学基金重点项目(2022J293)

作者信息

1.华北理工大学化学工程学院, 唐山 063210

2.宁波海关技术中心, 宁波 315048

3.中国科学院宁波材料技术与工程研究所, 宁波 315201

通讯作者:

^* 韩超(1984—), 男, 副教授, 主要研究方向为有机探针与分析。E-mail: hanchao@ncst.edu.cn

王宇辉(1985—), 男, 副研究员, 主要研究方向为食品安全检测。E-mail: wangyuhui@nimte.ac.cn

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/spaq/CN/10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20250109002

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

方法	优势	局限性
EC	响应快、成本低、灵敏度高, 适用于快速筛选和现场检测	稳定性和重现性相对较差
比色法	低成本、简单、可用于现场分析	肉眼难以识别颜色的微弱变化, 灵敏度偏低
荧光/磷光法	高灵敏度和高选择性	易受干扰, 荧光团可能发生光漂白
拉曼光谱	快速、灵敏、无损、可原位分析	拉曼散射强度较弱, 稳定性和可重复性较差
侧流层析	灵敏度高、成本低、操作简便、可用于现场快速检测	灵敏度和定量能力有限, 有一定概率出现假阳/阴性, 在复杂基质中易受干扰

方法

优势

局限性

响应快、成本低、灵敏度高, 适用于快速筛选和现场检测

稳定性和重现性相对较差

比色法

低成本、简单、可用于现场分析

肉眼难以识别颜色的微弱变化, 灵敏度偏低

荧光/磷光法

高灵敏度和高选择性

易受干扰, 荧光团可能发生光漂白

拉曼光谱

快速、灵敏、无损、可原位分析

拉曼散射强度较弱, 稳定性和可重复性较差

侧流层析

灵敏度高、成本低、操作简便、可用于现场快速检测

灵敏度和定量能力有限, 有一定概率出现假阳/阴性, 在复杂基质中易受干扰

方法	样品	目标分子	检出限	线性范围	回收率/%	分析时间	参考文献
EC	牛奶	BPA	5 nmol/L	0.01~10 pmol/L	105	30 min	[101]
牛奶、肉类	E2	9.9×10^-19mol/L	10^-18~10^-6 mol/L	95.1~104.8	20 min	[31]
比色法	牛奶	E2	13.1 pmol/L	0.05~0.8 nmol/L	100.1~113.0	1.5 h	[55]
BPA	7.60 pmol/L	10~100 pmol/L	96.10~106.5	55 min	[102]
肉类	E2	0.15 μmol/L	0~10 μmol/L	95.70~113.8	40 min	[57]
荧光/磷光法	牛奶	孕酮	0.065 ng/mL	0.25~25 ng/mL	90~105	15 min	[103]
E2	3.48×10^-12 mol/L	10^-11~10^-6 mol/L	82~107	1.5 h	[104]
0.29 ng/mL	0.5~1.2 μg/mL	93.6~102.4	40 min	[67]
拉曼光谱	鸡肉、牛奶	E2	9.58×10^-14 mol/L	10^-12~10^-4mol/L	95.00~98.72	1 h	[87]
牛奶	1.95×10^-16mol/L	10^-14~10^-6mol/L	90.56~109.40	35 min	[89]
侧流层析	水产、牛奶	E2	65 ng/g	75 ng/g	-	7~10 min	[93]
鸡/猪肉	丙酸睾酮	0.32 μg/kg	0.05~0.94 ng/mL	90~110	40 min	[105]
牛奶	地塞米松	0.0013 μg/kg	0.05~0.08 μg/kg	81.1~113.7	20 min	[100]
牛肉	0.08 μg/kg	0.35~1.50 μg/kg	89.2~115.4
猪肉	0.07 μg/kg	0.25~1.00 μg/kg

方法

样品

目标分子

检出限

线性范围

回收率/%

分析时间

参考文献

牛奶

BPA

5 nmol/L

0.01~10 pmol/L

105

30 min

[101]

牛奶、肉类

9.9×10^-19mol/L

10^-18~10^-6 mol/L

95.1~104.8

20 min

[31]

比色法

牛奶

13.1 pmol/L

0.05~0.8 nmol/L

100.1~113.0

1.5 h

[55]

BPA

7.60 pmol/L

10~100 pmol/L

96.10~106.5

55 min

[102]

肉类

0.15 μmol/L

0~10 μmol/L

95.70~113.8

40 min

[57]

荧光/磷光法

牛奶

孕酮

0.065 ng/mL

0.25~25 ng/mL

90~105

15 min

[103]

3.48×10^-12 mol/L

10^-11~10^-6 mol/L

82~107

1.5 h

[104]

0.29 ng/mL

0.5~1.2 μg/mL

93.6~102.4

40 min

[67]

拉曼光谱

鸡肉、牛奶

9.58×10^-14 mol/L

10^-12~10^-4mol/L

95.00~98.72

1 h

[87]

牛奶

1.95×10^-16mol/L

10^-14~10^-6mol/L

90.56~109.40

35 min

[89]

侧流层析

水产、牛奶

65 ng/g

75 ng/g

7~10 min

[93]

鸡/猪肉

丙酸睾酮

0.32 μg/kg

0.05~0.94 ng/mL

90~110

40 min

[105]

牛奶

地塞米松

0.0013 μg/kg

0.05~0.08 μg/kg

81.1~113.7

20 min

[100]

牛肉

0.08 μg/kg

0.35~1.50 μg/kg

89.2~115.4

猪肉

0.07 μg/kg

0.25~1.00 μg/kg