食品安全质量检测学报

环介导等温扩增技术在真菌检测中的应用研究进展

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段吉燕 ¹^,² , 舒平 ² , 郭启新 ² , 徐幸 ²^,^*

食品安全质量检测学报 | 食品安全监管 2025,16(4): 284-290

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食品安全质量检测学报 | 食品安全监管 2025, 16(4): 284-290

环介导等温扩增技术在真菌检测中的应用研究进展

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段吉燕¹^,², 舒平², 郭启新², 徐幸²^,^*

作者信息

1.大理大学公共卫生学院, 大理 671000

2.大理白族自治州检验检测院, 大理 671000

段吉燕(1998—), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为公共卫生。E-mail: 207626148@qq.com

通讯作者:

^* 徐幸(1983—), 女, 博士, 高级工程师, 主要研究方向为食品质量安全检测。E-mail: xuxing1983@163.com

Research progress on the application of loop-mediated isothermal amplification in the detection of fungi

Ji-Yan DUAN¹^,², Ping SHU², Qi-Xin GUO², Xing XU²^,^*

Affiliations

1. School of Public Health, Dali University, Dali 671000, China

2. Dali Bai Autonomous Prefecture Inspection and Testing Institute, Dali 671000, China

出版时间: 2025-02-25 doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20241029007

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摘要

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真菌是日常生活中较为常见的一种微生物, 与我们的生活息息相关、有利有弊。其有害影响体现在多个方面, 例如有些真菌会导致农作物病害而减产, 误食毒蕈会引起食物中毒, 威胁人们的生命安全, 此外致病真菌还会引起真菌感染等疾病危害人们的身体健康, 因此能快速、准确地检测出病原真菌和识别出毒蕈是非常重要的。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是近几年广泛使用的一种核酸扩增技术, 该技术使用DNA聚合酶和特异性引物, 在恒温条件下, 短时间内高效率扩增核酸, 相较于传统的分子生物学方法, 该方法对仪器要求不高, 具有快速、灵敏、简单等特点。目前LAMP已广泛应用于细菌、真菌和病毒等微生物的检测, 本文对LAMP在真菌检测方面的应用进行总结, 以期为相关研究提供参考。

关键词

环介导等温扩增技术 / 真菌 / 核酸扩增

Abstract

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Fungi are one of the more common microorganisms in our daily lives, and are closely related to our lives, with both advantages and disadvantages. Its harmful effects are manifested in a number of ways. For example, some fungi can cause crop diseases and reduce yield, accidental consumption of poisonous mushrooms can cause food poisoning and threaten people's lives, in addition, pathogenic fungi can also cause fungal infections and other diseases that are harmful to people's health, so it is very important to be able to quickly and accurately detect pathogenic fungi and identify poisonous mushrooms. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a nucleic acid amplification technique widely used in recent years, which uses DNA polymerase and specific primers to amplify nucleic acids with high efficiency in a short period of time under constant temperature conditions, compared with traditional molecular biology methods, this method does not require high instrumentation, and is characterized by rapidity, sensitivity and simplicity. At present, LAMP technology has been widely used in the detection of microorganisms such as bacteria, fungi and viruses, and this paper summarised the application of LAMP technology in the detection of fungi to provide a reference for related research.

Key words

loop-mediated isothermal amplification technique / fungi / nucleic acid amplification

引用本文

段吉燕, 舒平, 郭启新, 徐幸. 环介导等温扩增技术在真菌检测中的应用研究进展. 食品安全质量检测学报, 2025 , 16 (4) : 284 -290 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20241029007

Ji-Yan DUAN, Ping SHU, Qi-Xin GUO, Xing XU. Research progress on the application of loop-mediated isothermal amplification in the detection of fungi[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2025 , 16 (4) : 284 -290 . DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20241029007

正文

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0 引言

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真菌是一种真核生物, 广泛存在于自然界中, 包括大型真菌、酵母和霉菌等, 是一类非常重要的植物病原菌, 大部分的植物病害都是由真菌引起的, 较早检测出病原真菌有利于植物真菌病害的及时防治, 能在一定程度上减少经济损失^[1]。而大型真菌是指有肉眼可见子实体的真菌, 具有重要的经济价值和生态功能, 包括蕈菌、蘑菇等, 其中除常见食用菌和药用菌外, 还有一部分的毒蘑菇^[2-3]。有些毒蘑菇与可食用菌相似容易混淆, 极易被误食而导致中毒, 世界各地每年都有毒蘑菇中毒事件的发生, 毒蘑菇中毒已经是全球性的公共卫生问题, 能快速检出毒蘑菇对于预防毒蘑菇中毒事件的发生和中毒病人的及时治疗均有重要意义^[4-6]。此外, 真菌及其毒素通过污染粮食作物, 或者通过皮肤接触、呼吸道等途径对人们的生命健康造成影响^[7], 而相关真菌疾病的临床诊断和治疗的关键之一是及时快速的检测出病原菌^[8]。目前对于细菌、真菌等病原微生物的检测有传统的分离培养法、聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction, PCR)等方法, 但这些方法或所需时间较长或需要昂贵的仪器, 不利于快速检测和基层推广使用。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新型核酸体外扩增技术, 该技术操作简单, 对设备要求不高, 具有简便快捷、灵敏度高、特异性好等优点^[9], 能在短时间内快速高效扩增目标基因。经过不断的研究发展, 目前LAMP在食品安全检测、动植物病害检测、生物医药等多个领域均有广泛应用。

1 LAMP原理及产物检测

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1.1 原理

LAMP由日本学者NOTOMI等^[10]在2000年首次提出, 该技术依赖具有高链置换活性的Bst DNA聚合酶和特异性引物, 包括起始结构形成和循环扩增两个阶段。首先根据靶基因的6个不同区域设计4个特异性引物, 包括1对内引物(FIP、BIP)和1对外引物(F3、B3)。起始结构形成阶段, 在酶的作用下4个引物与模板作用, 最终形成哑铃状结构; 循环扩增阶段, 使用哑铃状的DNA作为模板, 在内引物的参与下循环扩增, 最终的产物为多个反向重复靶序列构成的多环花椰菜状结构DNA。该反应在60~65 ℃恒温条件下反应30~60 min扩增靶序列, 对核酸具有很高的扩增效率, 可达10⁹的指数级扩增。LAMP原理图见图1。

1.2 产物检测

LAMP扩增产物的检测有多种方法可以选择以下方法。

(1)浊度法, 在LAMP反应过程中, Mg²⁺与焦磷酸根离子结合会生成焦磷酸镁白色沉淀, 可直接用肉眼观察是否产生白色沉淀来判断目标基因是否发生扩增, 也可结合浊度仪实时监测, 得到的结果更为准确可靠^[11]。

(2)琼脂糖凝胶电泳法, 是普遍使用的核酸检测方法, 用于LAMP的扩增产物检测时, 由于LAMP的扩增产物是序列大小、长短不一的序列, 所以阳性结果电泳可观察到明显的阶梯状条带^[12], 但该方法需要开盖检测, 极容易造成污染, 因此需小心操作且严格分区。

(3)核酸染料法, SYBR Green I染料灵敏度高, 但因为会影响酶, 所以需要在反应后加入^[13]。樊月圆等^[14]建立了羊源产气荚膜梭菌的LAMP快速检测方法, 在LAMP反应中加入SYBR Green I染料实现可视化, 该染料在紫外照射下, 阳性结果呈绿色荧光, 阴性结果无荧光且呈淡黄色。胡元庆等^[15]基于副溶血性弧菌的tlh基因, 优化了水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法, 产物鉴定使用SYBR Green I染色和2%琼脂糖凝胶电泳对照。

(4)金属染料法, 目前无需开盖的可视化LAMP检测法应用较为广泛, 该方法是在反应开始前, 在LAMP反应体系中加入指示染料, 观察反应后的颜色变化。田卓等^[16]使用钙黄绿素结合LAMP建立了水产品和水体中灿烂弧菌的可视化LAMP快速检测方法, 该方法简单、可靠。此外, 在LAMP检测中使用较多的指示染料还有羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue, HNB), 该指示染料呈紫罗兰色为阴性, 呈天蓝色为阳性。张鹏飞等^[17]使用HNB作为染料, 建立了牛奶中产志贺毒素大肠埃希氏菌的LAMP快速检测方法, 可凭肉眼直接观察结果。欧红玲等^[18]基于LAMP, 加入HNB进行可视化, 建立了志贺菌的快速检测方法, 无需开盖, 30 min即可得到结果。

2 LAMP的特点

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LAMP检测相较于PCR等其他分子生物学检测方法有以下4种优点。

(1)高特异性。尹小毛等^[19]研究报道使用LAMP对7种病原菌进行检测, 特异度均为100%。崔健等^[20]建立了食源性甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)的LAMP检测方法, 分别使用荧光曲线逆转录(reverse transcription, RT)-LAMP和可视化RT-LAMP检测目标样品HAV质粒和GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒等5种非目标样品质粒, 结果显示两种方法都只有HAV发生了阳性扩增。郑如雯等^[21]将LAMP与横向流动层析试纸(lateral flow dipstick, LFD)相结合, 建立了牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)的检测方法, 可以特异的检测出BVDV。

(2)高灵敏性。范阳阳等^[22]建立了牛奶中金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H7的LAMP检测方法, 该方法的灵敏度比常规PCR高10倍。薛晓岩等^[23]使用LAMP和PCR法分别检测禽腺病毒4型, 结果显示LAMP的检出限可达7.5×10^-8 ng/μL的DNA, 灵敏度是PCR法的100倍, 且LAMP的临床样品阳性检出率更高, 因此比PCR法更适用于临床样品检测。赵玥明等^[24]将LAMP用于检测肉中的金黄色葡萄球菌, 发现LAMP的灵敏度是同样是PCR的100倍。从这些研究结果可以看出, LAMP的灵敏度比传统PCR等方法更高。

(3)简单。LAMP反应不需要昂贵、复杂的仪器, 只需要一个简单, 易获得的恒温仪器, 比如水浴锅等, 提高了普及性, 因此该方法有利于在基层等推广使用。

(4)快速。这是LAMP反应的一个明显的优点, 在一般情况下只需1 h左右的时间就能判读结果, 有些在30 min左右就能得到结果^[25], 而实时荧光LAMP所需的反应时间更短, 在20 min左右即可得到结果^[26]。

3 LAMP在真菌检测中的应用

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3.1 LAMP在植物真菌病害检测中的应用

在植物病原真菌检测方面, 建立快速、准确的病原真菌检测方法对植物真菌病害的防治是非常重要的, 可以在早期及时发现、预防植物病害。目前LAMP在造成农业病害的真菌、细菌等病原微生物的快速检测方面已有较为广泛的应用^[27]。王冠华^[28]针对苹果霉心病菌的TUB和En39基因序列, 苹果斑点落叶病菌和苹果红点病菌的aagp基因序列, 苹果腐烂病菌TUB和PMA1基因序列, 以及苹果炭疽病菌TUB基因序列分别设计了特异性引物, 成功建立了这4种苹果真菌病害的LAMP快速检测方法, 在65 ℃下反应60 min即可得到结果。该方法还适用于田间样品的检测, 且这4种致病真菌的LAMP检出率高于PCR检测和传统分离检测方法, 为烟台地区苹果病原真菌的诊断和防治提供了新的技术方法。GHOSH等^[29]基于鹰嘴豆干根腐病真菌的部分ITS和5.8S序列的保守区设计了6条特异性引物, 在63 ℃下反应75 min, 加入SYBR-Green I染料进行LAMP可视化检测, 该方法检出限为10 fg DNA, 能灵敏、快速检测出鹰嘴豆的干根腐病菌。张书亚^[30]建立了稻种中恶苗病菌的LAMP检测体系, 针对NRPS31基因序列设计了4条引物, 优化LAMP反应体系后, 结果显示能检测到低至0.001 ng/μL质量浓度的DNA。此外该学者还分别基于稻曲病菌的RPS基因和稻瘟病菌ALB1基因的保守区域分别设计了4条特异性LAMP引物, 建立了稻曲菌病和稻瘟菌病的q-LAMP检测体系, 灵敏度远远高于q-PCR, 为水稻真菌病害的早期检测提供了技术支持。由此可见, LAMP在植物病原真菌的检测中比PCR法具有更高的灵敏性、特异性, 所需检测时间也更少。

检出植物病原真菌后, 及时进行防治有利于农作物的正常生长, 植物真菌病害常用的防治方法有物理防治、化学防治、生物防治, 其中生物防治对环境友好且不易产生抗性, 主要通过生防真菌、生防细菌、生防放线菌达到防治效果, 目前逐渐被应用于植物真菌病害的防治^[31]。玫烟色棒束孢是一种虫生真菌, 对蚜虫、粉虱的等害虫的生物防治有重要作用, 但如何科学的评价其防治效果是一个难题。刘晓菲等^[32]使用金属离子Calcein作为指示剂, 首次建立了高灵敏度、高特异性的玫烟色棒束孢的LAMP可视化检测体系, 该方法的检出限为10 fg, 灵敏度比常规PCR高100倍, 与其他生物防治菌和病原菌无交叉反应, 且在1 h内就能得到检测结果, 为玫烟色棒束孢菌株的毒力测定与安全性评价提供了新的技术支持, 不仅能更好地对其田间应用进行科学评价, 还能对其他生物防治菌的科学应用提供参考。综上所述, LAMP在植物真菌病害的快速检测中应用较广, 不仅可以在早期检测出引起农作物真菌病害的病原真菌, 还在其生物防治中起到重要作用。

3.2 LAMP在毒蕈检测中的应用

毒蕈也就是毒蘑菇, 在全球范围内已报道1000多种, 误食后会导致中毒, 引起身体功能、器质性损害, 对人们的健康乃至生命造成威胁, 因此建立一种毒蘑菇的快速检测方法是非常重要的^[33-34]。2013年, VAAGT等^[35]基于LAMP, 建立了检测方法, 可以在不同蘑菇混合物中检测出剧毒鹅膏, 这是较早将该技术应用于剧毒鹅膏检测的研究。高洁等^[36]针对疣孢褐盘菌核糖体DNA内部ITS序列设计了特异性LAMP引物, 建立了使用酚红指示剂的可视化LAMP和实时荧光LAMP两种检测方法并相互验证, 30~45 min即可得到结果, LAMP所用的检测时间比PCR法短。且该方法只需少量的DNA即可检测, 检出限可达0.8 ng/μL, 还可以对加工、胃液消化后的蘑菇进行检测, 可用于临床诊断和法医分析。蒋子娟等^[37]建立了基于LAMP的肉褐鳞环柄菇的快速检测方法, 结合HNB染料, 可在1 h内得到检测结果, 检出限为7.56 pg/μL, 可以快速、准确的检测出肉褐鳞环柄菇。何正蜜^[38-39]基于LAMP, 设计了两组通用引物, 一组用来区分鹅膏菌属与非鹅膏菌属, 另一组用于区分剧毒鹅膏和非剧毒鹅膏, 并分别建立了LAMP检测方法; 此外, 还针对不同种的剧毒鹅膏设计了相应的特异性引物, 结合HNB建立了相应的LAMP检测方法, 总而言之, 其所建立的LAMP检测方法能快速、简单、灵敏的检测和鉴定出鹅膏菌属以及剧毒鹅膏。LONG等^[40]使用LAMP建立了亚稀褶红菇的快速检测方法, 采用实时荧光定量系统、凝胶电泳和HNB染料3种方法检测LAMP的扩增产物, 3种方法的灵敏度均为传统PCR的100倍, 且检测时间只需45 min, 少于PCR法, 提高了检测效率。GAO等^[41]通过对黄环鹅膏的ITS序列设计特异性引物, 建立实时荧光LAMP检测方法, 结果显示与41种非目标蘑菇无交叉反应, 说明该方法灵敏度、特异性都较高, 能快速、准确检测出黄环鹅膏。WANG等^[42]建立了大青褶伞的LAMP快检方法, 检出限可达1 pg的DNA, 同时该方法也适用于快速检测煮过和消化后的样品, 在短时间内也可检测出低至1%的大青褶伞。文莉等^[43]也提到基于LAMP可以快速、灵敏的检测出致死性毒蘑菇, 检出限可达到致死剂量的1/10。综上, LAMP在毒蕈的快速检测中发挥重要作用, 不仅缩短了检测时间, 还可以应用于临床诊断, 对野生菌中毒事件的及时处置、中毒患者的及时救治均有积极意义。

3.3 LAMP在人类真菌疾病检测中的应用

当真菌作为一种病原微生物时, 常会引起人类多种疾病的发生, 无论是浅表真菌感染, 还是侵袭性真菌感染都会威胁人们的健康, 且近几年真菌感染的发病呈现上升的趋势^[44-45]。而选择合适治疗方法的关键是及早识别出致病的真菌病原体, 有利于快速准确作出诊断, 为临床治疗用药提供参考。CHOOPARA等^[46]基于LAMP, 设计了ITS1 LAMP引物, 加入HNB染料可视化, 建立了ITS1 LAMP-HNB真菌检测方法, 能检测出食物、血液中的真菌, 说明LAMP检测可用于临床检测。AHMED等^[47]使用LAMP和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)两种方法检测真菌瘤的病原真菌-足菌肿马杜拉分支菌, 结果表明, 这两种方法对真菌DNA的扩增均具有较强的特异性和较高的灵敏度, LAMP检出限为0.47 ng, 这也是首次报道将分子技术应用于检测临床标本中的足菌肿马杜拉分支菌。TATIBANA等^[48]针对副球孢子菌病病原体巴西副球孢子菌的gp43基因的部分序列设计了引物, 建立了副球孢子菌病的LAMP检测方法, 该方法灵敏、快速, 且不会产生交叉反应, 特异性好, 可作为副球孢子菌病的诊断方法之一。LAMP相较于传统的培养法等方法, 检测时间缩短, 灵敏度、特异性也高, 在临床检测方面的应用有着较大的潜力。

4 结束语

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LAMP是一种分子生物学快速检测技术, 有快速、准确, 所需设备简单等优点, 但也存在着引物设计难、易污染, 假阳性等缺点。造成假阳性的原因可能有非特异性扩增、气溶胶污染等, 非特异性扩增可能与引物二聚体的产生等有关, 还需要更多的研究; 而气溶胶污染与LAMP产物检测有关, LAMP灵敏度高, 开盖检测容易造成气溶胶污染, 目前通过改良产物检测方式, 如在反应前提前加入HNB染料可视化等, 能在一定程度上解决气溶胶污染的问题。随着技术的进步, 有望在今后LAMP的相关研究中有效解决这些问题。此外, 还可以将LAMP与其它技术联用: 如将LAMP与微流体芯片结合用于登革病毒的检测, 该方法为设计特异性引物、制备LAMP微流控芯片并检测, 方便灵敏且所需时间短, 还可以用于现场检测, 为蚊媒登革病毒的快速检测和防控提供了新的技术手段^[49]。或者将LAMP与横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)联用, 将LAMP与胶体金免疫层析技术相结合, 建立LAMP-LFD法用于检测沙门菌, 该方法灵敏度高, 临床标本检测结果与荧光PCR法一致, 相较于传统的培养法大大缩短了检验时间, 可在短时间内得到结果, 因此该方法适用于沙门菌的快速筛查^[50]。LAMP适用于现场检测, 为公共卫生事件的应急处置提供了新的思路, 可以用于传染病的监测、预防, 食物中毒的快速检测等, 有利于提升公共卫生应急能力。此外, 还可与纳米金、酶联免疫吸附等技术相结合^[51-52]。技术联用不仅可以有效扩大LAMP的应用范围, 实现高通量检测^[53], 还可以使LAMP更加简便易行。

综上, 建立真菌的LAMP快速检测方法, 用于检测毒蘑菇、植物病原真菌和人类致病真菌等, 可以快速简单的检测出真菌, 有灵敏度高、特异度高、快速等特点, 在植物真菌病害防治、人类真菌病的治疗等方面均有重要意义, 可以为疾病预防、食品安全, 农业发展等提供更有力的技术保障。随着LAMP的不断发展与其他技术的融合, 在未来该技术将更适用于基层检测、现场化检测, 在临床检测、公共卫生事件应急处置、动植物检验检疫等多领域有广阔的应用前景。

基金

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云南省市场监督管理局科技计划项目(2022YSJK01)

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文献

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2025年第16卷第4期

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文章信息

doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20241029007

接收时间：2024-10-29
首发时间：2025-07-21
出版时间：2025-02-25

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作者

出版历史

收稿日期：2024-10-29

基金

云南省市场监督管理局科技计划项目(2022YSJK01)

作者信息

1.大理大学公共卫生学院, 大理 671000

2.大理白族自治州检验检测院, 大理 671000

通讯作者:

^* 徐幸(1983—), 女, 博士, 高级工程师, 主要研究方向为食品质量安全检测。E-mail: xuxing1983@163.com

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/spaq/CN/10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.20241029007

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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