解放军医学杂志

组别	IL-1β	IL-6	IL-18	TNF-α
对照组	42.45±1.98	14.54±0.68	54.76±2.11	213.59±11.58
空载体组	117.19±4.97⁽¹⁾	83.91±4.87⁽¹⁾	187.61±5.64⁽¹⁾	529.67±22.30⁽¹⁾
过表达lncRNA NEAT1组	76.23±5.78⁽²⁾	60.31±4.45⁽²⁾	127.45±5.71⁽²⁾	342.33±9.29⁽²⁾
si-NC组	117.00±5.57⁽¹⁾	85.00±3.00⁽¹⁾	182.67±6.81⁽¹⁾	550.00±39.36⁽¹⁾
敲降lncRNA NEAT1组	159.67±15.50⁽³⁾	118.33±7.64⁽³⁾	215.00±5.00⁽³⁾	734.67±20.53⁽³⁾

组别	IL-1β	IL-6	IL-18	TNF-α
对照组	42.45±1.98	14.54±0.68	54.76±2.11	213.59±11.58
空载体组	117.19±4.97⁽¹⁾	83.91±4.87⁽¹⁾	187.61±5.64⁽¹⁾	529.67±22.30⁽¹⁾
过表达lncRNA NEAT1组	76.23±5.78⁽²⁾	60.31±4.45⁽²⁾	127.45±5.71⁽²⁾	342.33±9.29⁽²⁾
si-NC组	117.00±5.57⁽¹⁾	85.00±3.00⁽¹⁾	182.67±6.81⁽¹⁾	550.00±39.36⁽¹⁾
敲降lncRNA NEAT1组	159.67±15.50⁽³⁾	118.33±7.64⁽³⁾	215.00±5.00⁽³⁾	734.67±20.53⁽³⁾

lncRNA NEAT1激活PI3K/Akt信号通路对Aβ_25-35诱导的PC12细胞凋亡的影响及机制

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翟志恒 , 田杨 , 周玉妮 , 宋玉成

解放军医学杂志 | 论著 2021,46(12): 1188-1195

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解放军医学杂志 | 论著 2021, 46(12): 1188-1195

lncRNA NEAT1激活PI3K/Akt信号通路对Aβ_25-35诱导的PC12细胞凋亡的影响及机制

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翟志恒, 田杨, 周玉妮, 宋玉成

作者信息

济宁医学院济宁市精神病防治院，山东济宁 272051

翟志恒，硕士研究生，主治医师，主要从事阿尔茨海默病发病的分子机制研究

Effect and mechanism of lncRNA NEAT1 activating PI3K/Akt signal pathway on the influence of PC12 cell apoptosis induced by Aβ_25-35

Zhi-Heng Zhai, Yang Tian, Yu-Ni Zhou, Yu-Cheng Song

Affiliations

Jining Psychiatric Hospital of Jining Medical College, Jining, Shandong 272051, China

出版时间: 2021-12-28 doi: 10.11855/j.issn.0577-7402.2021.12.04

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摘要

收起

目的探讨lncRNA NEAT1通过激活PI3K/Akt信号通路对Aβ_25-35诱导的阿尔茨海默病(AD)模型细胞凋亡的影响及可能机制。方法以0、5、10、20 μmol/L Aβ_25-35诱导PC12细胞，构建AD细胞模型。用5 μmol/L Aβ_25-35处理PC12细胞，并于24、48、72 h采用qRT-PCR检测lncRNA NEAT1相对表达水平。取PC12细胞，(1)设置对照组、敲降lncRNA NEAT1组、si-NC组、空载体组及过表达lncRNA NEAT1组，对照组不做任何处理，其余4组分别用含si-lncRNA NEAT1、si-NC、pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-lncRNA NEAT1的Opti-MEM培养基培养并转染8 h，然后使用20 μmol/L Aβ_25-35处理。采用qRT-PCR检测lncRNA NEAT1相对表达水平；CCK-8法检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡情况，并以G₁和G₂期细胞比例反映细胞增殖情况；ELISA法检测细胞上清中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。(2)设置对照组、空载体组及过表达lncRNA NEAT1组，采用Western blotting检测p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达水平。(3)设置对照组、si-NC组、敲降lncRNA NEAT1组、空载体组、过表达lncRNA NEAT1组及过表达lncRNA NEAT1+LY294002组，过表达lncRNA NEAT1+LY294002组细胞转染pcDNA3.1-lncRNA NEAT1后，加入10 μmol/L PI3K通路抑制剂LY294002处理，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果不同浓度的Aβ_25-35均可明显抑制lncRNA NEAT1的表达，且呈浓度依赖性(P=0.001)。与空载体组相比，过表达lncRNA NEAT1组lncRNA NEAT1相对表达水平、细胞增殖率、G₂期细胞比例明显增高，细胞凋亡率、G₁期细胞比例明显降低(P<0.05)；与si-NC组相比，敲降lncRNA NEAT1组lncRNA NEAT1相对表达水平、细胞增殖率、G₂期细胞比例明显降低，细胞凋亡率、G₁期细胞比例明显升高(P<0.05)。ELISA检测结果显示，与空载体组相比，过表达lncRNA NEAT1组细胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明显降低(P<0.05)；与si-NC组相比，敲降lncRNA NEAT1组细胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明显升高(P<0.05)。Western blotting检测结果显示，与空载体组相比，过表达lncRNA NEAT1组信号通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt相对表达水平增高(p-PI3K：0.86±0.05 vs. 0.15±0.02，P=0.003；p-Akt：0.86±0.06 vs. 0.11±0.04，P=0.000)。与过表达lncRNA NEAT1组相比，过表达lncRNA NEAT1+LY294002组细胞凋亡率明显升高(9.00%±0.10% vs. 5.13%±0.21%，P=0.004)。结论 lncRNA NEAT1可通过调控PI3K/Akt通路促进Aβ_25-35诱导的PC12细胞增殖，抑制PC12细胞凋亡。

关键词

阿尔茨海默病 / 长链非编码RNA / 核富集转录本1 / PI3K/Akt

Abstract

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Objective To investigate the effect and mechanism of lncRNA NEAT1 activating PI3K/Akt signaling pathway on the influence of Alzheimer's disease (AD) PC12 model cells apoptosis induced by Aβ_25-35. Methods PC12 cells were induced with Aβ_25-35 of concentrations 0, 5, 10 and 20 μmol/L to construct AD cell model. PC12 cells were treated with 5 μmol/L Aβ_25-35, and the relative expression level of lncRNA NEAT1 was detected by qRT-PCR at the time points 24, 48 and 72 hours,respectively. PC12 cells were divided into: (1) control group, lncRNA NEAT1 knockdown group, si-NC group, empty body group and lncRNA NEAT1 overexpression group. Among them the cells in control group were not treated anyway; in the other four groups were cultured with Opti-MEM medium containing si-lncRNA NEAT1, si-NC, pcDNA3.1-NC and pcDNA3.1-lncRNA NEAT1 and transfected for 8 hours, and then treated with 20 μmol/L Aβ_25-35; qRT-PCR was used to detect the relative expression level of lncRNA NEAT1; CCK-8 was used to detect the cell viability; flow cytometry was used to detect the apoptosis of PC12 cells, and the proliferation of PC12 cells was reflected by the ratio of G₁ to G₂ phase of cell cycle; the inflammatory factors interleukin-1β (IL-1β),IL-6, IL-18, and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in cell supernatant were detected by ELISA. (2) control group, empty body group,and lncRNA NEAT1 overexpression group, Western blotting was used to detect the relative expression levels of p-PI3K and p-Akt.(3) control group, si-NC group, lncRNA NEAT1 knockdown group, empty body group, lncRNA NEAT1 overexpression group, and lncRNA NEAT1 overexpression+LY294002 group. Cells in lncRNA NEAT1 overexpression+LY294002 group were transfected with pcDNA3.1-lncRNA NEAT1, and 10 μmol/L P13K pathway inhibitor LY294002 were added, and then flow cytometry was used to detect the apoptosis of PC12 cells. Results Different concentrations of Aβ_25-35 could significantly inhibit the expression of lncRNA NEAT1 in a concentration-dependent manner (P=0.001). Compared with empty body group, the relative expression level of lncRNA NEAT1, the cell proliferation rate, and the proportion of cells in G₂ phase of lncRNA NEAT1 overexpression group increased, the cell apoptosis rate and the proportion of cells in G₁ phase decreased (P<0.05). Compared with si-NC group, the relative expression level of lncRNA NEAT1, the cell proliferation rate, and the proportion of cells in G₂ phase of lncRNA NEAT1 knockdown group decreased, the cell apoptosis rate and the proportion of cells in G₁ phase increased (P<0.05). ELISA results showed that, compared with empty body group, the levels of inflammatory factors IL-1β, IL-6, IL-18, and TNF-α decreased significantly in lncRNA NEAT1 overexpression group (P<0.05); compared with si-NC group, the levels of inflammatory factors IL-1β, IL-6, IL-18 and TNF-α increased significantly in lncRNA NEAT1 knockdown group (P<0.05). Western blotting results showed that, compared with empty body group, the expression levels of signal pathway related proteins p-PI3K and p-Akt increased in lncRNA NEAT1 overexpression group (p-PI3K: 0.86±0.05 vs. 0.15±0.02, P=0.003; p-Akt: 0.86±0.06 vs. 0.11±0.04, P=0.000). Compared with lncRNA NEAT1 overexpression group, the apoptosis rate in lncRNA NEAT1 overexpression+LY294002 group increased obviously (9.00%±0.10%vs. 5.13%±0.21%, P=0.004). Conclusion lncRNA NEAT1 can promote Aβ_25-35 induced PC12 cell proliferation and inhibit cell apoptosis by regulating PI3K/Akt pathway.

Key words

Alzheimer's disease / long noncoding RNA / nuclear-enriched abundant transcript 1 / PI3K/Akt

引用本文

翟志恒, 田杨, 周玉妮, 宋玉成. lncRNA NEAT1激活PI3K/Akt信号通路对Aβ_25-35诱导的PC12细胞凋亡的影响及机制. 解放军医学杂志, 2021 , 46 (12) : 1188 -1195 . DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2021.12.04

Zhi-Heng Zhai, Yang Tian, Yu-Ni Zhou, Yu-Cheng Song. Effect and mechanism of lncRNA NEAT1 activating PI3K/Akt signal pathway on the influence of PC12 cell apoptosis induced by Aβ_25-35[J]. Medical Journal of Chinese People’s Liberation Army, 2021 , 46 (12) : 1188 -1195 . DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2021.12.04

正文

收起

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，又称老年性痴呆，是一种不可逆的中枢神经系统退行性疾病^[1]，临床主要表现为渐进性记忆障碍等神经精神症状，严重影响患者的社交、工作与生活功能^[2]。目前，AD的具体发病机制尚未明确，尚无有效的治疗方法^[3]。因此，开发潜在的精准AD生物标志物具有重要意义^[4]。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在神经退行性疾病中的作用近年逐渐受到重视^[5]。核富集转录本1(nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1)是一种广泛表达的lncRNA，在神经退行性疾病中的表达发生了明显变化^[6]。Zhang等^[7]发现，在小鼠巨噬细胞中，NEAT1可以激活pro-caspase-1，促进炎性小体NLRP3聚集，稳定cleaved-caspase-1，并提高caspase-1的活性。本研究探讨了lncRNA NEAT1激活PI3K/Akt信号通路对Aβ_25-35诱导的AD模型细胞凋亡的影响及可能机制，以期为开发新的AD生物标志物提供依据。

1 材料与方法

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1.1 主要试剂及仪器

PC12细胞购自中国科学院；胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基、青/链霉素购自美国Invigentech公司；Lipofectamine 2000、质粒孵育培养基Opti-MEM及Aβ_25-35购自美国Sigma公司；胰蛋白酶购自美国Amresco公司；反转录试剂盒、Annexin V-FITC/PI试剂盒、TB Green Premix EX Taq Ⅱ试剂盒、CCK-8检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；兔抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH一抗以及羊抗兔二抗购自武汉菲恩生物科技有限公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒购自日本TaKaRa公司；pcDNA3.1 lncRNA NEAT1质粒及相应空载体购自广州吉赛生物科技股份有限公司；小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)及相应阴性对照(siRNA NC，si-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司；白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-18和肿瘤坏死因子-α(TNF-α) ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；PI3K通路抑制剂LY294002(HY-10108)购自美国MedChemExpress公司。酶标仪(Imark)购自美国伯乐公司；实时荧光定量PCR仪(ABI7700)购自美国ABI公司；流式细胞仪(FACSCalibur)购自美国BD公司；Western blotting检测系统购自美国Molecular Devices公司。

1.2 AD细胞模型构建

PC12细胞于含0.1 ml/ml胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，置于5% CO₂、37 ℃恒温培养箱中培养。取对数生长期细胞接种于96孔板中，加入不同浓度的Aβ_25-35(0、5、10、20 μmol/L)作用24 h，建立AD细胞模型。考虑到Aβ_25-35对P12细胞毒性的影响，选择5 μmol/L Aβ_25-35处理PC12细胞，并于24、48、72 h检测lncRNA NEAT1相对表达水平。

1.3 qRT-PCR检测lncRNA NEAT1相对表达水平

按照Trizol说明书步骤提取总RNA，反转录成cDNA，测定cDNA浓度，利用TB Green Premix EX Taq Ⅱ试剂盒进行qRT-PCR扩增。反应体系(20 μl)：1 μl cDNA、上下游引物各0.5 μl、10 μl SYBR Premix Ex Taq、8 μl ddH₂O。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 34 s，共40个循环。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。lncRNA NEAT1：上游引物5'-GGCAGGTCTAGTTTGGGCAT-3'，下游引物5'-CCTCATCCCTCCCAGTACCA-3'；GAPDH：上游引物5'-CCCTTCATTGACCTCAACTACA-3'，下游引物5'-ATGACAAGCTTCCCGTTCTC-3'。以GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCt法计算lncRNA NEAT1的相对表达水平。实验重复3次，结果取平均值。

1.4 lncRNA NEAT1细胞转染

将5 μl Lipofectamine 2000加入250 μl Opti-MEM培养基中混匀，室温静置5 min；分别取5 μg siRNA-lncRNA (si-lncRNA)NEAT1、si-NC、pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-lncRNA NEAT1加入250 μl Opti-MEM培养基中混匀，室温静置5 min；将含Lipofectamine 2000的Opti-MEM培养基分别与含si-lncRNA NEAT1、si-NC、pcDNA3.1-NC或pcDNA3.1-lncRNA NEAT1的Opti-MEM培养基混匀，室温静置25 min。取PC12细胞接种于96孔板中，设置对照组、敲降lncRNA NEAT1组、si-NC组、空载体组及过表达lncRNA NEAT1组。敲降lncRNA NEAT1组、si-NC组、空载体组及过表达lncRNA NEAT1组每孔加入质粒混合液混匀并于培养箱中培养，转染8 h后更换为新鲜常规培养基继续培养48 h，然后分别加入20 μmol/L Aβ_25-35继续培养24 h后更换为新鲜常规培养基继续培养；对照组不做处理，培养方法同其余各组。

1.4.1 qRT-PCR检测lncRNA NEAT1相对表达水平

按照1.3中的步骤检测各组lncRNA NEAT1相对表达水平。

1.4.2 CCK-8法检测细胞活力

收集各组细胞，接种于96孔板中(5×10³个/孔)，设置3个复孔，培养24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育2 h，采用酶标仪测定各孔450 nm处的吸光度(A₄₅₀)值。

1.4.3 流式细胞术检测细胞周期分布

收集各组细胞，使用胰蛋白酶消化，1000 r/min离心6 min，弃上清；用培养液重悬细胞，并用无水乙醇在-20 ℃条件下过夜固定细胞；去除固定液，用PBS重悬细胞，1000×g离心5 min，重复2次；PBS清洗细胞，用含RNase A的溶液消化1 h；加入PI溶液终止消化并避光染色8 min，采用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.4.4 ELISA检测细胞上清中炎性因子水平

使用IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的水平。将各组细胞接种于96孔板中培养48 h，洗涤4次，加入生物素标记的抗体工作液、酶偶联物，室温孵育30 min；洗涤，加入显色底物显色，采用酶标仪测定各孔450 nm处的吸光度(A₄₅₀)值。实验重复3次，结果取平均值。

1.5 Western blotting检测p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达水平

收集对照组、空载体组及过表达lncRNA NEAT1组细胞，接种于96孔板中(5×10³个/孔)，加入RIPA裂解液，将96孔板于0 ℃振荡30 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清，采用BCA法测定总蛋白浓度。取25 μg蛋白上样，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(90 V 30 min，120 V至溴酚蓝到达凝胶底部)，然后转至PVDF膜上。加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗兔抗p-PI3K(1:1000)、PI3K(1:1000)、Akt(1:1000)、p-Akt(1:1000)及内参GAPDH(1:1000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1:10 000)，室温孵育1 h；TBST洗涤3次，用ECL显色液显色，ImageJ软件对条带进行灰度分析。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡情况

取PC12细胞，以5×10³个/孔的密度接种于无菌96孔板中，设置对照组、si-NC组、敲降lncRNA NEAT1组、空载体组、过表达lncRNA NEAT1组及过表达lncRNA NEAT1+LY294002组，对照组、si-NC组、敲降lncRNA NEAT1组、空载体组、过表达lncRNA NEAT1组处理同1.4，过表达lncRNA NEAT1+LY294002组细胞转染pcDNA3.1-lncRNA NEAT1后，加入10 μmol/L PI3K通路抑制剂LY294002处理。培养48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶对贴壁细胞进行消化并于室温下孵育，制备细胞悬浮液。取5×10⁴个细胞，加入缓冲液悬浮细胞并转移至流式管中，然后加入5 μl Annexin V-FITC混匀，于室温避光条件下孵育15 min，上机前5 min加入5 μl PI进行染色，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次，结果取平均值。

1.7 统计学处理

使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8软件进行统计分析和制图。计量资料经正态性检验，符合正态分布者以$\bar{x}±s$表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布者以M(Q₁，Q₃)表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

收起

2.1 Aβ_25-35对PC12细胞中lncRNA NEAT1表达的影响

qRT-PCR检测结果显示，0、5、10、20 μmol/L Aβ_25-35作用24 h后，PC12细胞中lncRNA NEAT1相对表达水平降低(依次为0.90±0.05、0.67±0.07、0.53±0.03、0.34±0.09)，且呈浓度依赖性(F=110.51，P=0.001，图1A)。与对照组(0.99±0.10)相比，5 μmol/L Aβ_25-35作用PC12细胞24、48、72 h后，lncRNA NEAT1相对表达水平随着时间延长而降低(依次为0.49±0.05、0.27±0.05、0.18±0.05)，差异有统计学意义(F=109.42，P=0.002，图1B)。根据图1A的结果，20 μmol/L Aβ_25-35处理24 h后，lncRNA NEAT1的表达最低，建模效果最好。因此，选择20 μmol/L Aβ_25-35进行后续实验。

2.2 lncRNA NEAT1载体构建效果

qRT-PCR检测结果如图2所示，与对照组(0.93±0.09)相比，空载体组(0.54±0.12)与si-NC组(0.52±0.09)lncRNA NEAT1相对表达水平明显降低(P=0.008，P=0.001)；与空载体组相比，过表达lncRNA NEAT1组lncRNA NEAT1相对表达水平增高(2.21±0.16，P=0.001)；与si-NC组相比，敲降lncRNA NEAT1组lncRNA NEAT1相对表达水平降低(0.23±0.02，P=0.000)，表明lncRNA NEAT1的过表达和敲降载体构建成功，可用于后续实验。

2.3 lncRNA NEAT1对AD模型细胞活力的影响

CCK-8法检测结果显示，与对照组(116.33%±5.51%)相比，Aβ_25-35刺激后，空载体组(53.85%±5.57%)与si-NC组(55.18%±8.50%)细胞增殖率明显降低(P=0.000，P=0.000)；与空载体组相比，过表达lncRNA NEAT1组细胞增殖率明显增高(142.85%±5.00%，P=0.013)；与si-NC组相比，敲降lncRNA NE AT1组细胞增殖率明显降低(21.18%±4.93%，P=0.003，图3)。

2.4 lncRNA NEAT1对AD模型细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，与对照组(4.50%±0.10%)相比，Aβ_25-35刺激后，空载体组(8.10%±0.10%)与si-NC组(7.40%±0.26%)细胞凋亡率明显升高(P=0.001，P=0.001)；与空载体组相比，过表达lncRNA NEAT1组细胞凋亡率降低(5.07%±0.15%，P=0.012)；与si-NC组相比，敲降lncRNA NEAT1组细胞凋亡率明显升高(14.70%±0.20%，P=0.000，图4)。

2.5 lncRNA NEAT1对AD模型细胞周期的影响

流式细胞术检测结果显示，与对照组(G₁期：60.15%±1.00%；G₂期：6.56%±0.95%)相比，Aβ_25-35刺激后，空载体组(G₁期：61.81%±1.53%；G₂期：9.81%±1.53%)与si-NC组(G₁期：60.15%±4.58%；G₂期：10.70%±0.73%)G₁和G₂期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组和空载体组相比，过表达lncRNA NEAT1组G₁期(52.15%±1.00%)细胞比例明显降低(P=0.001，P=0.003)，G₂期(21.15%±1.00%)细胞比例明显升高(P=0.000，P=0.001)；与si-NC组相比，敲降lncRNA NEAT1组G₁期(68.81%±1.53%)细胞比例明显升高(P=0.012)，G₂期(5.48%±1.53%)细胞比例明显降低(P=0.021，图5)。

2.6 lncRNA NEAT1对AD模型细胞上清中炎性因子水平的影响

ELISA检测结果显示，与对照组相比，Aβ_25-35刺激后，空载体组和si-NC组细胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明显升高(P<0.05)；与空载体组相比，过表达lncRNA NEAT1组细胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明显降低(P<0.05)；与si-NC组相比，敲降lncRNA NEAT1组细胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明显升高(P<0.05，表1)。

2.7 lncRNA NEAT1对AD模型细胞中PI3K/Akt信号通路活性的影响

Western blotting检测结果显示，与对照组相比，Aβ_25-35刺激后，空载体组信号通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt相对表达水平明显下降(p-PI3K：0.15±0.02 vs. 1.02±0.05，P=0.005；p-Akt：0.11±0.04 vs. 0.95±0.07，P=0.000)；与空载体组相比，过表达lncRNA NEAT1组(p-PI3K：0.86±0.05；p-Akt：0.86±0.06)信号通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt相对表达水平明显增高(P=0.003，P=0.000，图6)。

2.8 通路抑制剂LY294002对AD模型细胞凋亡的影响

为了证实PI3K/Akt通路与AD模型细胞凋亡的关系，向Aβ_25-35处理的PC12细胞中分别加入pcDNA3.1-lncRNA NEAT1与pcDNA3.1-lncRNA NEAT1+LY294002，使用流式细胞术检测AD模型细胞凋亡情况。结果显示，与对照组相比，Aβ_25-35刺激后，空载体组细胞凋亡率明显升高(8.20%±0.26%vs. 4.4%±0.21%，P=0.002)；与空载体组相比，过表达lncRNA NEAT1组细胞凋亡率明显降低(5.13%±0.21%，P=0.011)；与过表达lncRNA NEAT1组相比，过表达lncRNA NEAT1+LY294002组细胞凋亡率明显升高(9.00%±0.10%，P=0.004，图7)。

3 讨论

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AD是一种不可逆的进行性、持续性神经退行性疾病，影响大脑皮质和海马的广泛区域，也是最常见的痴呆类型(60%~80%)^[8]。Aβ过量产生被认为是AD患者突触和神经元丢失的主要原因。AD的病因非常复杂，目前其分子病理机制尚不清楚^[9]。为此，本研究建立了体外神经细胞损伤模型，为lncRNA NEAT1抑制Aβ_25-35诱导的PC12细胞神经毒性提供了理论依据。

lncRNA NEAT1的表达变化与疾病进展密切相关，有研究发现，其可通过上调成纤维细胞生长因子(FGF9)而促进卵巢癌细胞(OC)增殖和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管生成^[10]。lncRNA NEAT1与细胞凋亡也密切相关。有研究发现，敲除lncRNA NEAT1可显著抑制肝癌细胞的活力，促进细胞凋亡，并抑制细胞的迁移和侵袭^[11]；在脓毒症诱导的急性肺损伤(ALI)中，过表达lncRNA NEAT1可促进WI-38细胞凋亡^[12]。此外，敲低lncRNA NEAT1可减轻脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡^[13]；下调lncRNA NEAT1可抑制表皮生长因子受体(EGFR)的表达，促进肝癌细胞凋亡^[14]。本研究发现，lncRNA NEAT1在Aβ_25-35刺激后的PC12细胞中呈低表达，且过表达lncRNA NEAT1后，AD模型细胞凋亡率明显降低，而敲降lncRNA NEAT1的表达时，AD模型细胞凋亡率升高。另有研究发现，沉默lncRNA NEAT1可导致视网膜母细胞瘤(RB)细胞周期发生停滞，阻止视网膜母细胞瘤的发展^[15]。本研究发现，过表达lncRNA NEAT1可促进AD模型细胞由G₁期快速进入G₂期，激发了细胞周期的进展；而敲降lncRNA NEAT1时，G₁期细胞比例明显高于对照组，G₂期细胞比例明显降低，表明敲降lncRNA NEAT1可使更多的AD模型细胞停留在G₁期，阻止细胞进入G₂期，造成了细胞周期的停滞。

已知lncRNA NEAT1可调控AD细胞的增殖和凋亡，但其具体作用机制尚不明确。有研究发现，在HeLa细胞中，敲降lncRNA NEAT1会抑制p-Akt、p-PI3K的表达^[16]。另有研究发现，lncRNA NEAT1可通过影响miR-211/PI3K/Akt轴调节脓毒症的炎症反应^[17]。由此可见，在疾病发展过程中，lncRNA NEAT1与PI3K/Akt信号通路密切相关。为了进一步验证lncRNA NEAT1对AD模型细胞凋亡的调控机制，本研究将lncRNA NEAT1进行高表达处理，利用Western blotting检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达，结果发现lncRNA NEAT1过表达可增加AD模型细胞中p-PI3K、p-Akt的表达，抑制Aβ_25-35诱导的细胞凋亡，而加入PI3K通路抑制剂后则可逆转上述效果，证实lncRNA NEAT1可通过调控PI3K/Akt信号通路的活性而影响AD模型细胞的凋亡。

综上所述，本研究结果表明，Aβ_25-35刺激后，PC12细胞中lncRNA NEAT1的表达明显降低；而过表达lncRNA NEAT1可明显抑制Aβ_25-35诱导的细胞凋亡和炎症反应，lncRNA NEAT1可能通过激活PI3K/Akt信号通路而激活AD模型细胞的炎症反应，促进AD的进展。但该结论未在动物体内进行验证，后续将建立AD小鼠模型，以进一步探索lncRNA NEAT1对AD发生发展的影响。

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济宁医学院教师科研扶持基金(JYFC2019FKJ032)

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

J Zhang

, Zheng

, Gao

, et al. A 3D densely connected convolution neural network with connection-wise attention mechanism for Alzheimer's disease classification[J]. Magn Reson Imaging, 2021, 78: 119-126.

[2]

Xiao

, Li

, Peng

, et al. The molecular mechanism of autophagy and its research progress in neurodegenerative diseases[J]. Med J Chin PLA, 2019, 44(4): 341-346.

[肖昊翔, 李天, 彭帆, 等. 自噬在神经退行性疾病中的作用研究进展[J]. 解放军医学杂志, 2019, 44(4): 341-346.]

[3]

Yang

, Liu

, Wu

, et al. A review on α-mangostin as a potential multi-target-directed ligand for Alzheimer's disease[J]. Eur J Pharmacol, 2021, 897: 173950.

[4]

Lim

, Kim

, Yang

, et al. Advances in multiplex PCR for Alzheimer's disease diagnostics targeting CDK genes[J]. Neurosci Lett, 2021, 749: 135715.

[5]

, Xu

, Zhao

, et al. Neuro-protective roles of long non-coding RNA MALAT1 in Alzheimer's disease with the involvement of the microRNA-30b/CNR1 network and the following PI3K/Akt activation[J]. Exp Mol Pathol, 2020, 117: 104545.

[6]

, Yang

, et al. Long noncoding RNA NEAT1 aggravates Aβ-induced neuronal damage by targeting miR-107 in Alzheimer's disease[J]. Yonsei Med J, 2019, 60(7): 640-650.

[7]

Zhang

, Cao

, Zhou

, et al. The lncRNA Neat1 promotes activation of inflammasomes in macrophages[J]. Nat Commun, 2019, 10(1): 1495.

[8]

Yepes

. The plasminogen activating system in the pathogenesis of Alzheimer's disease[J]. Neural Regen Res, 2021, 16(10): 1973-1977.

[9]

Ding

, Zhong

, Baldeshwiler

, et al. Protecting P-glycoprotein at the blood-brain barrier from degradation in an Alzheimer's disease mouse model[J]. Fluids Barriers CNS, 2021, 18(1): 10.

[10]

Yuan

, Yi

, Yang

. LncRNA NEAT1 promotes proliferation of ovarian cancer cells and angiogenesis of co-incubated human umbilical vein endothelial cells by regulating FGF9 through sponging miR-365: An experimental study[J]. Medicine(Baltimore), 2021, 100(3): e23423.

[11]

Zhang

, Huang

, Zhu

, et al. lncRNA NEAT1 regulates the proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells by acting as a miR-320a molecular sponge and targeting L antigen family member 3[J]. Int J Oncol, 2020, 57(4): 1001-1012.

[12]

Chen

, Zhang

, Ge

, et al. LncRNA NEAT1 acts as a key regulator of cell apoptosis and inflammatory response by the miR-944/TRIM37 axis in acute lung injury[J]. J Pharmacol Sci, 2021, 145(2): 202-212.

[13]

, Su

, Xia

, et al. Knockdown lncRNA NEAT1 regulates the activation of microglia and reduces Akt signaling and neuronal apoptosis after cerebral ischemic reperfusion[J]. Sci Rep, 2020, 10(1): 19658.

[14]

Kou

, Ma

, Zhu

, et al. LncRNA NEAT1 regulates proliferation, apoptosis and invasion of liver cancer[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2020, 24(8): 4152-4160.

[15]

Chen

, Zhao

, Li

, et al. LncRNA NEAT1 knockdown inhibits retinoblastoma progression by miR-3619-5p/LASP1 axis[J]. Front Genet, 2020, 11: 574145.

[16]

Guo

, Yang

, Zhao

, et al. LncRNA NEAT1 regulates cervical carcinoma proliferation and invasion by targeting Akt/PI3K[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2018, 22(13): 4090-4097.

[17]

Xia

, Yao

, Zhou

, et al. LncRNA NEAT1 reversed the hindering effects of miR-495-3p/STAT3 axis and miR-211/PI3K/Akt axis on sepsis-relevant inflammation[J]. Mol Immunol, 2020, 117: 168-179.

2021年第46卷第12期

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doi: 10.11855/j.issn.0577-7402.2021.12.04

接收时间：2021-06-16
首发时间：2025-12-18
出版时间：2021-12-28

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出版历史

收稿日期：2021-06-16
修回日期：2021-10-09

基金

Supporting Fund for Teachers' Research of Jining Medical College(JYFC2019FKJ032)

济宁医学院教师科研扶持基金(JYFC2019FKJ032)

作者信息

济宁医学院济宁市精神病防治院，山东济宁 272051

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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