解放军医学杂志

项目	正常妊娠组	PE组	P
年龄(岁)	30.8±4.4	28.8±5.5	0.2018
孕周(周)	38.60±1.74	38.03±1.62	0.3290
收缩压(mmHg)	117.50±14.29	154.60±12.05	<0.0001
舒张压(mmHg)	77.24±7.63	103.50±12.29	<0.0001

项目	正常妊娠组	PE组	P
年龄(岁)	30.8±4.4	28.8±5.5	0.2018
孕周(周)	38.60±1.74	38.03±1.62	0.3290
收缩压(mmHg)	117.50±14.29	154.60±12.05	<0.0001
舒张压(mmHg)	77.24±7.63	103.50±12.29	<0.0001

环状RNA BRAF_2在子痫前期胎盘滋养细胞增殖和凋亡中的作用及其机制

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张玉月 ¹^,²^,³ , 朱亚飞 ⁴ , 高丽娜 ¹^,²^,³ , 殷荷 ¹ , 马朝霞 ¹^,²^,³ , 吴玉珠 ¹^,²^,³ , 王艳华 ² , 吴凯 ⁴ , 张慧萍 ²^,³^,^*

解放军医学杂志 | 基础研究 2023,48(4): 374-382

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解放军医学杂志 | 基础研究 2023, 48(4): 374-382

环状RNA BRAF_2在子痫前期胎盘滋养细胞增殖和凋亡中的作用及其机制

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张玉月¹^,²^,³, 朱亚飞⁴, 高丽娜¹^,²^,³, 殷荷¹, 马朝霞¹^,²^,³, 吴玉珠¹^,²^,³, 王艳华², 吴凯⁴, 张慧萍²^,³^,^*

作者信息

¹宁夏医科大学临床医学院，宁夏银川 750004

²宁夏医科大学总医院产前诊断中心，宁夏银川 750004

³国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室/宁夏血管损伤与修复研究重点实验室，宁夏银川 750004

⁴宁夏医科大学基础医学院，宁夏银川 750004

张玉月，硕士研究生，主要从事子痫前期发病机制方面的研究

通讯作者:

张慧萍，E-mail：zhp19760820@163.com

Role and mechanism of circRNA BRAF_2 in proliferation and apoptosis of placental trophoblast cells in preeclampsia

Yu-Yue Zhang¹^,²^,³, Ya-Fei Zhu⁴, Li-Na Gao¹^,²^,³, He Yin¹, Zhao-Xia Ma¹^,²^,³, Yu-Zhu Wu¹^,²^,³, Yan-Hua Wang², Kai Wu⁴, Hui-Ping Zhang²^,³^,^*

Affiliations

¹College of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan, Ningxia 750004, China

²Prenatal Diagnosis Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan, Ningxia 750004, China

³National Health Commission Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Diseases Research/Ningxia Key Lab of Vascular Injury and Repair Research, Yinchuan, Ningxia 750004, China

⁴College of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan, Ningxia 750004, China

出版时间: 2023-04-28 doi: 10.11855/j.issn.0577-7402.2023.04.0374

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摘要

收起

目的探讨环状RNA BRAF_2（circRNA BRAF_2）在子痫前期（PE）胎盘滋养细胞增殖和凋亡中的作用及其机制。方法收集2018年1月-2019年2月宁夏医科大学总医院正常妊娠与PE孕妇的胎盘组织（n=21），采用qRT-PCR检测两组胎盘组织中circRNA BRAF_2的表达水平，并分析circRNA BRAF_2表达水平与血压的相关性。体外培养人源胎盘滋养细胞株（HTR8-S/Vneo）：（1）将细胞分为对照组与缺氧组，采用qRT-PCR检测circRNA BRAF_2的表达；（2）在HTR8-S/Vneo中转染circRNA BRAF_2慢病毒空载体和过表达慢病毒，分为对照组、circRNA BRAF_2阴性对照组及circRNA BRAF_2过表达组，使用qRT-PCR对circRNA BRAF_2进行过表达验证；（3）在circRNA BRAF_2过表达慢病毒转染成功的基础上，将细胞分为对照组、circRNA BRAF_2阴性对照组、circRNA BRAF_2过表达组、缺氧组、缺氧+circRNA BRAF_2阴性对照组与缺氧+circRNA BRAF_2过表达组，采用EdU和CCK-8法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡水平，Western blotting检测凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bcl-2及Bax的表达。采用qRT-PCR检测circRNA BRAF_2在HTR8-S/Vneo细胞质和细胞核中的表达水平，通过生物信息学分析筛选与circRNA BRAF_2可能结合的miRNA并检测其在组织和细胞中的表达水平。结果与正常妊娠组比较，PE组孕妇胎盘组织中circRNA BRAF_2表达水平明显降低（P<0.001），且circRNA BRAF_2表达水平与收缩压、舒张压呈负相关（r=-0.4531，P<0.01；r=-0.4381，P<0.01）。qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，缺氧组circRNA BRAF_2表达水平明显降低（P<0.01）。circRNA BRAF_2阴性对照组circRNA BRAF_2表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；与circRNA BRAF_2阴性对照组比较，circRNA BRAF_2过表达组circRNA BRAF_2表达水平明显升高（P<0.001）。EdU及CCK-8法检测结果显示，与对照组比较，缺氧组EdU阳性细胞百分比明显下降（P<0.001），滋养细胞增殖能力降低（P<0.001）；与缺氧+circRNA BRAF_2阴性对照组比较，缺氧+circRNA BRAF_2过表达组滋养细胞EdU阳性细胞百分比明显升高（P<0.001），滋养细胞增殖能力明显增强（P<0.001）。流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，缺氧组细胞凋亡率明显增高（P<0.001）；与缺氧+circRNA BRAF_2阴性对照组比较，缺氧+circRNA BRAF_2过表达组细胞凋亡率明显降低（P<0.001）。Western blotting检测结果显示，与对照组比较，缺氧组caspase-3、caspase-9及Bax蛋白表达水平升高（P<0.01或P<0.001），Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.01）；与缺氧+circRNA BRAF_2阴性对照组比较，缺氧+circRNA BRAF_2过表达组caspase-3、caspase-9及Bax蛋白表达水平降低（P<0.001或P<0.01），Bcl-2蛋白表达水平升高（P<0.05）。qRT-PCR检测结果显示，circRNA BRAF_2主要在细胞质中表达，生物信息学分析结果显示，circRNA BRAF_2与miR-7855-5p存在结合位点。qRT-PCR检测结果显示，与正常妊娠组比较，miR-7855-5p在PE胎盘组织中高表达（P<0.05）；与对照组细胞比较，缺氧组miR-7855-5p明显高表达（P<0.001）。结论 circRNA BRAF_2可促进PE胎盘滋养细胞增殖并抑制其凋亡，作用机制可能与miR-7855-5p有关。

关键词

子痫前期 / circRNA / 细胞增殖 / 细胞凋亡 / miRNAs

Abstract

收起

Objective To investigate the role and mechanism of circRNA BRAF_2 in proliferation and apoptosis of placental trophoblast cells in preeclampsia (PE). Methods Placental tissues of pregnant women with normal pregnancy and PE were collected (n=21) in the General Hospital of Ningxia Medical University from January 2018 to February 2019. The expression level of circRNA BRAF_2 in placental tissues of the two groups was detected by qRT-PCR, and the correlation between circRNA BRAF_2 expression level and blood pressure was analyzed. Human placental trophoblast cell lines (HTR8-S/Vneo) were cultured in vitro, (1) Cells were divided into control group and hypoxia group, and the expression of circRNA BRAF_2 were detected by qRT-PCR. (2) HTR8-S/Vneo was transfected with circRNA BRAF_2 lentivirus empty vector and circRNA BRAF_2 overexpression lentivirus, and then divided into control group, circRNA BRAF_2 negative control group and circRNA BRAF_2 overexpression group. The overexpression of circRNA BRAF 2 was verified with qRT-PCR. (3) Based on the successful transfection of circRNA BRAF_2 overexpressing lentivirus, the cells were divided into control group, circRNA BRAF_2 negative control group, circRNA BRAF_2 overexpression group, hypoxia group, hypoxia +circRNA BRAF_2 negative control group, and hypoxia +circRNA BRAF_2 overexpression group. EdU and CCK-8 methods were used to detect the proliferation. Flow cytometry was used to detect the changes of apoptosis level. Western blotting was used to detect the expression levels of apoptosis-related proteins caspase-3, caspase-9,Bcl-2 and Bax. qRT-PCR was used to detect the expression levels of circRNA BRAF_2 in HTR8-S/Vneo cytoplasm and nucleus.Bioinformatics analysis was performed to screen out the miRNA that might bind circRNA BRAF_2 and detect their expression levels in tissues and cells. Results Compared with normal pregnancy group, the expression level of circRNA BRAF_2 was significantly decreased in placenta of PE group (P<0.001), and of circRNA BRAF_2 was negatively correlated with systolic pressure and diastolic pressure (r=-0.4531, P<0.01; r=-0.4381, P<0.01). qRT-PCR showed that compared with control group, the expression level of circRNA BRAF_2 in hypoxia group was significantly decreased (P<0.01), and the relative expression level of circRNA BRAF_2 in negative control group showed no significant difference when ompared with control group (P>0.05). Compared with that in circRNA BRAF_2 negative control group, the circRNA BRAF_2 expression level increased significantly in circRNA BRAF_2 overexpression group (P<0.001). The detection results of EdU and CCK-8 showed that, compared with control group, the percentage of positive EdU cells decreased significantly (P<0.001) in hypoxia group, trophoblast proliferation ability decreased (P<0.001); Compared with the hypoxia +circRNA BRAF_2 negative control group, the percentage of EdU positive trophoblast cells increased significantly in hypoxia +circRNA BRAF_2 overexpression group (P<0.001), and the proliferation ability of trophoblast cells was significantly enhanced (P<0.001). The detection results of flow cytometry showed that, compared with control group, the apoptosis rate of hypoxia group increased obviously (P<0.001); Compared with the hypoxia +circRNA BRAF_2 negative control group, the apoptosis rate of the hypoxia + circRNA BRAF_2 overexpression group decreased significantly (P<0.001). Western blotting showed that compared with control group, the relative expressions of caspase-3, caspase-9 and Bax proteins increased (P<0.01 or P<0.001), and of Bcl-2 protein decreased (P<0.01) in hypoxia group; Compared with the hypoxia + circRNA BRAF_2 negative control group, the relative expressions of caspase-3, caspase-9 and Bax proteins decreased (P<0.001 or P<0.01), and of Bcl-2 protein increased (P<0.05) in hypoxia + circRNA BRAF_2 overexpression group. The results of qRT-PCR showed that circRNA BRAF_2 was expressed mainly in cytoplasm, and bioinformatics analysis showed that binding sites existed between circRNA BRAF_2 and miR-7855-5p. and miR-7855-5p was highly expressed in PE placental tissue than that in normal pregnancy group (P<0.05); Compared with control group, miR-7855-5p was obviously highly expressed in hypoxia group (P<0.001). Conclusion circRNA BRAF_2 can promote proliferation and inhibit apoptosis of PE placental trophoblast cells, and the mechanism may be related to miR-7855-5p.

Key words

preeclampsia / circRNA / cell proliferation / cell apoptosis / miRNAs

引用本文

张玉月, 朱亚飞, 高丽娜, 殷荷, 马朝霞, 吴玉珠, 王艳华, 吴凯, 张慧萍. 环状RNA BRAF_2在子痫前期胎盘滋养细胞增殖和凋亡中的作用及其机制. 解放军医学杂志, 2023 , 48 (4) : 374 -382 . DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2023.04.0374

Yu-Yue Zhang, Ya-Fei Zhu, Li-Na Gao, He Yin, Zhao-Xia Ma, Yu-Zhu Wu, Yan-Hua Wang, Kai Wu, Hui-Ping Zhang. Role and mechanism of circRNA BRAF_2 in proliferation and apoptosis of placental trophoblast cells in preeclampsia[J]. Medical Journal of Chinese People’s Liberation Army, 2023 , 48 (4) : 374 -382 . DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2023.04.0374

正文

收起

子痫前期（preeclampsia，PE）是一种妊娠期特发性疾病^[1-2]，全球患病率为3%~5%，目前仍是导致孕产妇发病和死亡的重要原因^[3-4]，但其发病机制尚不清楚。大量研究发现，胎盘结构功能异常在PE的发病中起主要作用^[5-7]。滋养细胞作为胎盘的主要组成成分，其正常的结构和功能对维持胎盘的正常生理功能至关重要^[8]，滋养细胞增殖分化不足、凋亡增加、合胞化异常等可引起子宫螺旋动脉重构障碍，进而导致胎盘发育障碍并诱发PE^[9]。环状RNA（circRNAs）是内源性表达的非编码RNA（ncRNAs）^[10]，与线性RNA比较，环状RNA高度稳定，且不易被RNA酶降解^[11]，可影响细胞增殖、凋亡、自噬、侵袭、迁移等重要的生物学功能^[12-13]，并参与人类多种疾病的发生发展^[14]。PE患者胎盘中存在大量差异表达的circRNAs，但仅少部分被证实^[15]，而circRNA BRAF_2在PE发病机制中的研究尚未见报道。因此，本研究以人胎盘组织及滋养细胞为研究对象，同时制备滋养细胞体外缺氧模型模拟PE发生发展的病理环境，探讨circRNA BRAF_2在PE胎盘滋养细胞增殖和凋亡中的作用及可能机制，旨在为PE的早期诊断及治疗提供新的理论基础。

1 材料与方法

收起

1.1 研究对象

选取2018年1月-2019年2月宁夏医科大学总院收治的PE患者（n=21）和同期正常妊娠剖宫产分娩的健康孕妇（n=21），采集其胎盘组织进行回顾性分析。PE组纳入标准：符合PE诊断标准[妊娠20周后收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg]，并伴有以下任何一种情况：尿蛋白≥0.3 g/24 h或随机尿蛋白≥（+）；或虽无尿蛋白，但合并下列5项中的任何一项[①血小板减少（<100×10⁹）；②肝功能损害（血清转氨酶水平为正常值范围上限2倍以上）；③肾功能损害（血肌酐水平>0.11 mg/L或为正常值范围上限2倍以上）；④肺水肿；⑤新发生的中枢神经系统异常或视觉障碍]^[16]。正常妊娠组纳入标准：同期因胎位不正、瘢痕子宫、高龄孕妇、社会因素等行剖宫产的孕妇。排除标准：（1）多胎妊娠；（2）合并高血压等心血管疾病、糖尿病等代谢性疾病、自身免疫性疾病、肝硬化、胆汁淤积、血液系统疾病及继发性高血压等。本研究获宁夏医科大学总医院伦理委员会审查批准（2017-069）。收集胎盘组织标本前征得所有孕产妇同意并签署知情同意书。

1.2 细胞及主要试剂

人绒毛膜滋养层细胞（HTR8-S/Vneo）购自上海复旦细胞库。胎牛血清、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司，青链霉素及胰蛋白酶消化液购自北京Solarbio公司，总蛋白提取试剂盒购自上海贝博公司，兔抗胱天蛋白酶-9（caspase-9）抗体购自武汉赛维尔生物科技有限公司，兔抗Bcl-2抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗caspase-3抗体购自美国CST公司，兔抗Bax抗体购自美国Affinity公司，总RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，CCK-8检测试剂盒购自北京兰博利德生物技术有限公司。miR-7855-5p和U6引物由广州锐博公司（该公司不提供引物序列）合成。circRNA BRAF_2引物：上游TTGCACGACAGACTGCACAG，下游TGAGGATCGGTCTCGTTGCC；人ACTB（内参）引物：上游CCTGGCACCCAGCACAAT，下游GGGCCGGACTCGTCATAC。引物序列由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 患者资料收集及胎盘组织采集

收集研究对象的临床资料，并分析胎盘组织中circRNA BRAF_2表达水平与血压的相关性。采集正常妊娠及PE组孕妇剖宫产后母面胎盘组织，避开肉眼可见的钙化灶和坏死区域，以脐带为中心2 cm处向下1 cm，分3处取样，切取大小为1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm的胎盘组织3块，将3块胎盘组织分别放入3个冻存管中，标注姓名和住院号，冻存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 细胞培养

培养HTR8-S/Vneo细胞，分为常氧培养和缺氧培养两种培养方法。常氧培养方法：在37 ℃、5% CO₂培养箱中，使用含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养基培养滋养细胞，细胞生长融合至90%时用胰蛋白酶消化传代，每1~2 d换一次培养液。缺氧培养方法：细胞在培养箱中以37 ℃、1%O₂和5%CO₂的条件培养，48 h后收取细胞进行后续实验。

1.3.3 细胞转染

培养滋养细胞至对数生长期，消化后接种于6孔板中继续培养，待细胞生长融合至60%~70%时采用过表达慢病毒颗粒试剂盒转染，培养4~6 h弃原培养基，更换新的培养基继续培养24 h，加入含有最小致死浓度嘌呤霉素的培养液，筛选稳定转染的细胞群，收取细胞进行后续实验。

1.3.4 CCK-8法检测细胞增殖能力

将细胞分为对照组、circRNA BRAF_2阴性对照组、circRNA BRAF_2过表达组、缺氧组、缺氧+circRNA BRAF_2阴性对照组、缺氧+circRNA BRAF_2过表达组，培养各组细胞至对数生长期，胰酶消化后将各组细胞接种至96孔板中，约每孔3×10³个细胞，培养24 h后换液，48 h后每孔加入10 μl CCK-8试剂，混匀继续培养2 h后，酶标仪检测450 nm处各孔吸光度值。

1.3.5 EdU染色检测细胞增殖能力

细胞分组同1.3.4，培养各组细胞至对数生长期，胰酶消化后将各组细胞接种至激光共聚焦小皿中，每皿约2×10⁴~1×10⁶个细胞，48 h后，用含血清培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备50 μmol/L的EdU培养基，每个小皿中加入50 μmol/L EdU培养基500 μl孵育2 h，PBS清洗细胞5 min×2次。依次加入固定液（含4%多聚甲醛的PBS）、甘氨酸、渗透剂进行孵育，PBS清洗5 min，然后加入500 μl染色反应液孵育30 min，弃染色反应液，加入500 μl渗透剂脱色，摇床清洗10 min×2次，弃渗透剂。每个小皿加入500 μl 1×Hoechst 33342反应液孵育30 min后PBS清洗5 min×3次。染色完成后立即在荧光显微镜下观察。

1.3.6 流式细胞术检测细胞凋亡情况

细胞分组同1.3.4，收集各组细胞，用PBS洗5 min×2次，加入1 ml不含酚红和EDTA的胰酶消化1 min，弃胰酶，加入1 ml PBS轻柔吹落细胞，并转移至1.5 ml离心管中，1000 r/min离心5 min，弃上清，再加入1 ml PBS离心5 min，弃上清。重复以上步骤2次。避光放置，每管先加入100 μl结合液，吹匀后先加入5 μl 7-氨基放线菌素D（7-AAD），再加5 μl藻红蛋白（PE），混匀，静置15 min，加入400 μl结合液，吹匀，用滤膜过滤后上机。在流式细胞仪上用空白对照管调节前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）和荧光通道电压后进行检测。

1.3.7 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达水平

细胞分组同1.3.4，收集各组细胞，按照全蛋白提取试剂盒提取总蛋白；采用BCA蛋白定量法检测蛋白浓度，经SDS-PAGE后，以300 mA恒流电转80 min至PVDF膜。经50 g/L脱脂牛奶封闭2 h；加入兔抗Bax抗体（1:3000）、兔抗Bcl-2抗体（1:500）、兔抗caspase-3抗体（1:1000）、兔抗caspase-9抗体（1:1000）、兔抗β-actin抗体（1:5000），4 ℃孵育过夜；PBST浸洗10 min×3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1:5000），室温孵育2 h；PBST浸洗10 min×3次，ECL化学发光显色，应用Image Lab软件对检测结果的吸光度值进行分析。以目的蛋白/β-actin的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.3.8 qRT-PCR检测circRNA BRAF_2及miR-7855-5p相对表达水平

（1）取正常妊娠组与PE组胎盘组织，检测circRNA BRAF_2和miR-7855-5p相对表达水平；（2）收集对照组与缺氧组细胞，检测circRNA BRAF_2和miR-7855-5p相对表达水平；（3）为了验证滋养细胞circRNA BRAF_2过表达慢病毒转染成功，收集对照组、circRNA BRAF_2阴性对照组、circRNA BRAF_2过表达组细胞，检测circRNA BRAF_2相对表达水平；（4）按照细胞质/细胞核RNA分离试剂盒说明书提取滋养细胞细胞质/细胞核的RNA，检测circRNA BRAF_2相对表达水平。提取所需组别细胞总RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA，并根据qRT-PCR说明书步骤进行扩增。circRNA BRAF_2扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火及延伸30 s，共40个循环。miR-7855-5p扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火及延伸30 s，共40个循环。设置空白对照和内参（miR-7855-5p内参为U6；circRNA BRAF_2内参为人ACTB）对照同体系扩增。反应结束后，根据扩增曲线计算circRNA BRAF_2及miR-7855-5p的相对表达水平。

1.4 统计学处理

采用Prism 7.0软件进行统计分析。所有数据均以$\bar{x}±s$表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey检验；circRNA BRAF_2与患者血压的关系采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

收起

2.1 正常妊娠组与PE组临床资料比较

与正常妊娠组比较，PE组年龄和孕周差异无统计学意义（P>0.05），但收缩压和舒张压均明显增高（P<0.0001）（表1）。

2.2 circRNA BRAF_2在正常妊娠组及PE组胎盘组织中的表达

qRT-PCR检测结果显示，PE组circRNA BRAF_2的表达水平明显低于正常妊娠组（0.2132±0.1187 vs. 0.3940±0.1908，P<0.001）。

2.3 circRNA BRAF_2表达水平与PE患者血压的相关性分析

Pearson相关分析结果显示，circRNA BRAF_2的表达水平与收缩压和舒张压均呈负相关（r=-0.4531，P<0.01；r=-0.4381，P<0.01，图1）。

2.4 circRNA BRAF_2在缺氧诱导HTR8-S/Vneo细胞中的表达

HTR8-S/Vneo经缺氧处理48 h后，与对照组比较，缺氧组中的circRNA BRAF_2表达降低（0.0210±0.0081 vs. 0.1625±0.0430，P<0.01）。

2.5 滋养细胞circRNA BRAF_2过表达慢病毒转染验证

将circRNA BRAF_2过表达慢病毒转染至滋养细胞后，qRT-PCR检测结果显示，circRNA BRAF_2阴性对照组circRNA BRAF_2相对表达水平与对照组比较差异无统计学意义（0.0338±0.0072 vs. 0.0363±0.0061，P>0.05）；与circRNA BRAF_2阴性对照组比较，circRNA BRAF_2过表达组circRNA BRAF_2相对表达水平（0.2456±0.0552）明显升高（P<0.001），提示成功构建了circRNA BRAF_2过表达细胞系，可用于后续实验。

2.6 circRNA BRAF_2过表达对胎盘滋养细胞增殖能力的影响

EdU染色结果显示，缺氧组EdU阳性细胞百分比较对照组明显降低（P<0.001）；与缺氧+circRNA BRAF_2阴性对照组比较，缺氧+circRNA BRAF_2过表达组阳性细胞百分比明显增高（P<0.001）（图2A、B）。CCK-8法检测结果显示，与对照组比较，缺氧组滋养细胞增殖活力下降（P<0.001），缺氧+circRNA BRAF_2过表达组细胞增殖活力较缺氧+circRNA BRAF_2阴性对照组明显增强（P<0.001）（图2C）。

2.7 circRNA BRAF_2过表达对胎盘滋养细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示，缺氧组细胞凋亡率较对照组明显增高（P<0.001）；与缺氧+circRNA BRAF_2阴性对照组比较，缺氧+circRNA BRAF_2过表达组细胞凋亡率明显降低（P<0.001，图3A）。Western blotting检测结果显示，缺氧组细胞中caspase-3、caspase-9和Bax蛋白表达水平较对照组明显升高（P<0.01或P<0.001），而Bcl-2表达水平明显降低（P<0.01）；与缺氧+circRNA BRAF_2阴性对照组比较，缺氧+circRNA BRAF_2过表达组caspase-3、caspase-9、Bax的表达水平明显降低（P<0.001或P<0.01），而Bcl-2表达水平升高（P<0.05，图3B）。

2.8 circRNA BRAF_2的定位分析结果

qRT-PCR检测结果显示，circRNA BRAF_2在细胞质和细胞核中均有表达，但主要在细胞质中表达（占比为96.34%），细胞核中占比仅为3.66%。

2.9 生物信息学分析结果

RNA hybrid生物信息学软件分析发现，circRNA BRAF_2与miR-7855-5p存在互补配对序列（图4A）。qRT-PCR检测结果显示，与正常妊娠组比较，PE组胎盘组织中miR-7855-5p表达水平明显升高（P<0.05，图4B），且HTR8-S/Vneo经缺氧处理48 h后，与对照组比较，缺氧组中的miR-7855-5p表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.001，图4C）。

3 讨论

收起

PE是指妊娠20周后出现的高血压，伴有蛋白尿或其他终末器官损伤，严重危害孕产妇的身体健康。尽管大量研究致力于明确PE的预防及治疗措施，但在过去几十年中，该病的发病率并未明显改变，这可能是由于PE潜在的病理生理机制尚未完全阐明^[17]。有研究发现，在妊娠早期胎盘滋养细胞发生增殖及侵袭迁移，可促进子宫螺旋动脉重塑，从而维持胎盘的正常功能；而PE患者的滋养细胞增殖减少、凋亡增加^[18]，子宫螺旋动脉重塑异常及胎盘持续缺氧，从而引起胎盘功能障碍，提示滋养细胞功能改变可能是PE发病的关键环节^[19-21]。

circRNAs是一种新型的非编码RNA^[22]，可参与各种疾病的发生发展，在细胞周期、细胞凋亡、细胞侵袭、细胞迁移等多种生物过程中起关键作用^[23]。孙文思等^[24]发现，circ_0000267在急性淋巴细胞白血病患者中表达上调，抑制circ_0000267的表达可抑制KOCL44细胞增殖并促进其凋亡。Li等^[25]发现，circ_0001438在PE胎盘组织中呈高表达，而敲低circ_0001438则可促进胎盘滋养细胞增殖，抑制其凋亡。本课题组前期在临床收集了正常妊娠孕妇和PE患者胎盘组织各10例并进行测序，结果发现circRNAs表达谱在不同组织中存在明显差异，且circRNA BRAF_2在PE胎盘组织中表达明显降低（未发表）；本研究在正常妊娠孕妇及PE患者各21例胎盘组织中进一步验证发现，circRNA BRAF_2在PE胎盘组织中的表达降低，与测序结果一致，提示circRNA BRAF_2可能参与了PE的发生发展。此外，本研究还发现，circRNA BRAF_2的表达水平与孕妇的收缩压、舒张压呈负相关，提示circRNA BRAF_2参与了PE的发生发展，且其表达水平可能与PE病情严重程度呈负相关。因此，本研究进一步采用体外缺氧处理滋养细胞模拟PE发病的微环境，发现circRNA BRAF_2在缺氧处理滋养细胞中的表达水平明显降低，在细胞水平验证了其可参与PE的发生发展。随后，本研究通过多种实验探究circRNA BRAF_2在胎盘滋养细胞增殖及凋亡中的作用，CCK-8和EdU实验结果显示，缺氧可抑制滋养细胞增殖，但缺氧并过表达circRNA BRAF_2后细胞增殖活性明显增强，提示过表达circRNA BRAF_2可缓解由缺氧诱导的滋养细胞增殖能力下降。

目前，细胞凋亡主要的途径有死亡受体介导的外部凋亡途径、线粒体途径、B粒酶介导的细胞凋亡途径及内质网应激途径^[26-27]，其中，线粒体途径是主要的细胞凋亡途径^[28]。线粒体途径主要调控Bcl-2蛋白家族促凋亡成员（Bax）和抗凋亡成员（Bcl-2）之间的平衡，若两者失衡可导致线粒体膜的通透性改变，继而释放细胞色素C激活caspase-9，活化的caspase-9进一步激活caspase-3，最终引起细胞凋亡^[29]。本研究发现，与对照组比较，缺氧组caspase-3、caspase-9、Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低，而滋养细胞缺氧并过表达circRNA BRAF_2后，caspase-3、caspase-9、Bax表达水平降低，Bcl-2表达水平升高，提示circRNA BRAF_2可能通过抑制线粒体凋亡途径而减少缺氧诱导的滋养细胞凋亡。

有研究证实，竞争性内源RNA（ceRNA）机制是circRNAs调控基因表达的重要机制之一^[30]，circRNAs中富含miRNAs应答元件，可竞争性地与miRNAs结合，解除miRNAs对其靶基因的抑制，上调靶基因的表达^[31]。研究发现，circ0011460在PE胎盘中表达上调，而circ0011460与miR-762结合后可上调HTRA1的表达，提示circ0011460可通过靶向结合miR-762影响滋养细胞的生物学功能^[32]。本研究发现，circRNA BRAF_2主要在细胞质表达，随后通过生物信息学分析发现circRNA BRAF_2可能结合miR-7855-5p，而qRT-PCR实验证实，miR-7855-5p在PE胎盘组织和缺氧诱导的滋养细胞中的表达均上调，提示circRNA BRAF_2可能通过结合miR-7855-5p来调节胎盘滋养细胞的增殖与凋亡。

综上所述，circRNA BRAF_2可能通过与miR-7855-5p结合来影响胎盘滋养细胞的增殖与凋亡，为研究PE的发病机制提供了新的方向，为进一步深入探讨circRNAs在PE胎盘滋养细胞增殖和凋亡过程中的调控作用提供了新的线索。此外，考虑到circRNA具有稳定性及组织特异性等特点，circRNA BRAF_2有望成为PE早期风险评估及预防、诊断的分子标记物。但是，目前本研究还存在一定的局限性，如缺乏PE的动物模型，无法通过体内实验探究circRNA BRAF_2的作用机制，且对于circRNA BRAF_2与miR-7855-5p的直接结合及其下游机制研究不够充分。因此，circRNA BRAF_2如何在机体内调节滋养细胞增殖、凋亡及相关的调控机制是未来进一步研究的方向，可为PE的发病机制提供新的理论依据。

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宁夏自然科学基金重点项目(2020AAC02038)
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2023年第48卷第4期

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接收时间：2022-01-05
首发时间：2025-12-03
出版时间：2023-04-28

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收稿日期：2022-01-05
录用日期：2022-04-10

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宁夏回族自治区重点研发计划重点项目(2021BEG02028)

作者信息

¹宁夏医科大学临床医学院，宁夏银川 750004

²宁夏医科大学总医院产前诊断中心，宁夏银川 750004

³国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室/宁夏血管损伤与修复研究重点实验室，宁夏银川 750004

⁴宁夏医科大学基础医学院，宁夏银川 750004

通讯作者:

张慧萍，E-mail：zhp19760820@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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