解放军医学杂志

基因	引物序列(5'-3')
circAPLP2	正义：TGCCGGAGGGACAAAAAGCA
反义：TGAGGCTCAGCAACAGCAAAT
miR-497-5p	正义：AGCGAAGTTTTGAGCCGATCGGGC
反义：GCCGTGAGTCAGAGGTGGT
FGFR1	正义：AACCTGACCACAGAATTGGAGGCT
反义：ATGCTGCCGTACTCATTCTCCACA
U6	正义：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT
反义：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC
GAPDH	正义：CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC
反义：ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC

基因	引物序列(5'-3')
circAPLP2	正义：TGCCGGAGGGACAAAAAGCA
反义：TGAGGCTCAGCAACAGCAAAT
miR-497-5p	正义：AGCGAAGTTTTGAGCCGATCGGGC
反义：GCCGTGAGTCAGAGGTGGT
FGFR1	正义：AACCTGACCACAGAATTGGAGGCT
反义：ATGCTGCCGTACTCATTCTCCACA
U6	正义：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT
反义：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC
GAPDH	正义：CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC
反义：ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC

circAPLP2对结直肠癌细胞SW480侵袭与转移的影响及其机制

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张鲁青 , 项利迪 , 缪淳迪 , 柯孔亮 ^*

解放军医学杂志 | 基础研究 2023,48(5): 577-586

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解放军医学杂志 | 基础研究 2023, 48(5): 577-586

circAPLP2对结直肠癌细胞SW480侵袭与转移的影响及其机制

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张鲁青, 项利迪, 缪淳迪, 柯孔亮^*

作者信息

宁波市杭州湾医院普外科，浙江慈溪 315300

张鲁青，硕士研究生，主治医师，主要从事结直肠肿瘤及肛周疾病的诊断与治疗研究

通讯作者:

柯孔亮，E-mail：kekongliang1998@163.com

Effect and molecular mechanism of circAPLP2 on invasion and metastasis of colorectal cancer cell SW480

Lu-Qing Zhang, Li-Di Xiang, Chun-Di Miao, Kong-Liang Ke^*

Affiliations

Department of General Surgery, Ningbo Hangzhou Bay Hospital, Cixi, Zhejiang 315300, China

出版时间: 2023-05-28 doi: 10.11855/j.issn.0577-7402.2023.05.0577

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摘要

收起

目的探讨circAPLP2对结直肠癌细胞SW480侵袭与转移的调控作用及其分子机制。方法采用在线数据库Starbase预测circAPLP2与miR-497-5p的结合位点，TargetScan预测miR-497-5p与FGFR1的结合位点。采用qRT-PCR检测LoVo、DLD1、SW480、SW620、Caco-2、HCoEpiC细胞中circAPLP2、miR-497-5p的相对表达水平，Western blotting检测FGFR1蛋白的相对表达水平。取SW480细胞，设置：（1）siNC组（转染siControl）与sicircAPLP2组（转染sicircAPLP2），采用qRT-PCR检测circAPLP2、miR-497-5p、FGFR1 mRNA的相对表达水平，Western blotting检测FGFR1蛋白的表达；（2）Vector组（转染对照空载质粒）与circAPLP2组（转染circAPLP2过表达质粒），采用qRT-PCR检测miR-497-5p、FGFR1 mRNA的相对表达水平，Western blotting检测FGFR1蛋白的相对表达水平；（3）siNC组（转染阴性对照）、sicircAPLP2组（转染sicircAPLP2）与sicircAPLP2+miR-497-5p inhibitor组（转染sicircAPLP2），采用Transwell实验检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力，Western blotting检测上皮-间质转化（EMT）标志蛋白（E-cadherin、Twist1、N-cadherin、Vimentin）的表达；（4）NC-miRNA组（转染NC-miRNA）、miR-497-5p mimics组（转染miR-497-5p mimics）与NC-inhibitor组（转染NC-inhibitor）、miR-497-5p inhibitor组（转染miR-497-5p inhibitor），采用qRT-PCR和Western blotting检测FGFR1的表达；（5）pcDNA-Control组（转染pcDNA-Control）与pcDNA-FGFR1组（转染pcDNA-FGFR1），采用Western blotting检测FGFR1蛋白的相对表达水平；（6）NC-miRNA组（转染阴性对照）、miR-497-5p mimics组（转染miR-497-5p mimics）与miR-497-5p mimics+pcDNA-FGFR1组（共转染miR-497-5p mimics和pcDNA-FGFR1），采用Transwell实验检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力，Western blotting检测FGFR1和EMT标志蛋白（E-cadherin、Twist1、N-cadherin、Vimentin）的表达。将circAPLP2-WT或circAPLP2-MT报告质粒、FGFR1-WT或FGFR1-MT报告质粒分别与miR-497-5p mimics和circAPLP2共转染SW480细胞48 h，采用荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的活性。结果在线数据库Starbase、TargetScan分析结果显示，circAPLP2与miR-497-5p、miR-497-5p与FGFR1存在结合的位点。与人结肠上皮细胞HCoEpiC比较，结直肠癌细胞LoVo、DLD1、SW480、SW620、Caco-2中circAPLP2相对表达水平明显升高，miR-497-5p相对表达水平明显降低，FGFR1蛋白相对表达水平明显升高（P<0.05）。敲低circAPLP2的表达后，与siNC组比较，sicircAPLP2组侵袭细胞数减少（P<0.001），划痕愈合率降低（P<0.001），E-cadherin蛋白表达增加，Twist1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低（P<0.05）。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-497-5p mimics明显降低了circAPLP2-MT荧光素酶的活性（P<0.001）。miR-497-5p inhibitor可逆转sicircAPLP2对结直肠癌细胞EMT、迁移和侵袭的抑制作用，表现为侵袭细胞数增多（P<0.001），划痕愈合率升高（P<0.01），E-cadherin表达降低，Twist1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达增加（P<0.05）。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-497-5p mimics明显降低了FGFR1-MT荧光素酶的活性（P<0.001）。过表达FGFR1可逆转miR-497-5p过表达对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用，表现为侵袭细胞数增多（P<0.001），划痕愈合率升高（P<0.01），E-cadherin表达降低，Twist1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达增加（P<0.05）。结论 circAPLP2在结直肠癌细胞中表达水平升高，可能通过竞争性结合miR-497-5p促进FGFR1的表达，从而促进结直肠癌细胞的EMT、侵袭和迁移。

关键词

结直肠癌 / circAPLP2 / miR-497-5p / 成纤维细胞生长因子受体1 / 侵袭转移

Abstract

收起

Objective To investigate the regulatory effect and molecular mechanism of circAPLP2 on invasion and metastasis of colorectal cancer cell SW480. Methods The online database Starbase was used to predict the binding sites of circAPLP2 and miR-497-5p, and TargetScan was used to predict the binding sites of miR-497-5p and FGFR1. The relative expression levels of circAPLP2 and miR-497-5p in LoVo, DLD1, SW480, SW620, Caco-2 and HCoEpiC cells were detected by qRT-PCR, and the relative expression level of FGFR1 protein was detected by Western blotting. SW480 cells were taken and set up as follows:(1) siNC group (transfected with siControl) and sicircAPLP2 group (transfected with sicircAPLP2), the expressions of circAPLP2, miR-497-5p, FGFR1 mRNA were detected by qRT-PCR, and the expression of FGFR1 protein was detected by Western blotting.(2) Vector group (transfected with empty plasmid) and circAPLP2 group (transfected with circAPLP2 overexpression plasmid), the expressions of miR-497-5p and FGFR1 mRNA were detected by qRT-PCR, and the expression of FGFR1 protein was detected by Western blotting. (3) siNC group (transfected with siControl), sicircAPLP2 group (transfected with sicircAPLP2) and sicircAPLP2+miR-497-5p inhibitor group (transfected with sicircAPLP2 and miR-497-5p inhibitor), the cell invasion was detected by Transwell, the cell migration was detected by scratch test, and the expressions of EMT marker proteins (E-cadherin, Twist1, N-cadherin and Vimentin) were detected by Western blotting. (4) NC miRNA group (transfected with NC-miRNA) and miR-497-5p mimics group (transfected with miR-497-5p mimics), or NC-inhibitor group (transfected with NC-inhibitor) and miR-497-5p inhibitor group (transfected with miR-497-5p inhibitor), the expression of FGFR1 was detected by qRT-PCR and Western blotting.(5) pcDNA-Control group (transfected with pcDNA-Control) and pcDNA-FGFR1 group (transfected with pcDNA-FGFR1), the expression of FGFR1 protein was detected by Western blotting. (6) NC-miRNA group (transfected with negative control), miR-497-5p mimics group (transfected with miR-497-5p mimics) and miR-497-5p mimics+pcDNA-FGFR1 group (co transfected with miR-497-5p mimics and pcDNA-FGFR1), the cell invasion, migration and the expression of FGFR1 and EMT marker proteins(E-cadherin, Twist1, N-cadherin, Vimentin) were detected by Transwell, scratch test or Western blotting. The circAPLP2-WT or circAPLP2-MT report plasmid was co-transfected with NC-miRNA or miR-497-5p mimics respectively for 48 h in SW480 cells, and the FGFR1-WT or FGFR1-MT report plasmid was co-transfected with miR-497-5p mimics and circAPLP2 respectively for 48 h in SW480 cells, and the luciferase activity was detected by the luciferase reporter gene detection system. Results The analysis results by Starbase and TargetScan showed that binding sites existed between circAPLP2 and miR-497-5p, and between miR-497-5p and FGFR1. Compared with human colon epithelial cell HCoEpiC, the relative expression level of circAPLP2 in colorectal cancer cells LoVo, DLD1, SW480, SW620 and Caco-2 increased significantly, while of miR-497-5p significantly decreased, and the relative expression level of FGFR1 protein significantly increased (P<0.05). After knocking down the expression of circAPLP2, compared with siCN group, the number of invasive cells in sicircAPLP2 group decreased (P<0.001), and the cell healing rate of scratches decreased (P<0.001), the expression of E-cadherin protein increased, and the protein expressions of Twist1, N-cadherin and Vimentin decreased (P<0.05). The results of dual luciferase reporter assay showed that miR-497-5p mimics decreased circAPLP2-MT luciferase activity significantly (P<0.001); MiR-497-5p inhibitor reverses the inhibitory effect of sicircAPLP2 on EMT, migration and invasion of colorectal cancer cells, as the number of invasive cells increased (P<0.001), the scratch healing rate increased (P<0.01), the expression of E-cadherin protein decreased, and the expression of Twist1, N-cadherin, and Vimentin protein increased (P<0.05). Dual luciferase reporter assay results showed that miR-497-5p mimics significantly reduced FGFR1-MT luciferase activity (P<0.001). Over-expression of FGFR1 reversed the inhibition of miR-497-5p overexpression on colorectal cancer cell migration and invasion, manifested as increased number of invasive cells (P<0.001), increased scratch healing rate (P<0.01), decreased expression of E-cadherin, increased expressions of N-cadherin, Twist1 and Vimentin (P<0.05). Conclusion The expression level of circAPLP2 increases in colorectal cancer cells, it may promote the expression of FGFR1 through competitive combination with miR-497-5p, thus promoting EMT, invasion and migration of colorectal cancer cells.

Key words

colorectal cancer / circAPLP2 / miR-497-5p / fibroblast growth factor receptor 1 / invasion and metastasis

引用本文

张鲁青, 项利迪, 缪淳迪, 柯孔亮. circAPLP2对结直肠癌细胞SW480侵袭与转移的影响及其机制. 解放军医学杂志, 2023 , 48 (5) : 577 -586 . DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2023.05.0577

Lu-Qing Zhang, Li-Di Xiang, Chun-Di Miao, Kong-Liang Ke. Effect and molecular mechanism of circAPLP2 on invasion and metastasis of colorectal cancer cell SW480[J]. Medical Journal of Chinese People’s Liberation Army, 2023 , 48 (5) : 577 -586 . DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2023.05.0577

正文

收起

结直肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中居第4位，病死率居第2位，严重威胁人类的健康^[1]。近年来，手术切除联合化疗、放疗的临床治疗方案在一定程度上改善了结直肠癌患者的生存质量，但病死率仍高达10.2%，而结直肠癌侵袭、转移是导致患者死亡的主要原因^[2-3]。侵袭、转移作为肿瘤发生发展中的恶性生物学行为，严重影响患者的预后，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤发生侵袭、转移的前提^[4]，深入阐明结直肠癌EMT、侵袭、转移的发生机制是延长患者生存期的关键。近年来，RNA组学成为生命科学关注的热点。在人类基因组中超过95%的基因不编码蛋白质，被称为非编码RNA^[5]，其中环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA，也是RNA领域最新的研究热点^[6]。circRNA因其组织特异性、稳定性和高度保守性，已成为肿瘤诊断及预后预测的重要标志物^[7]。既往研究发现，在结直肠癌中下调miR-497-5p表达，可导致成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)表达增加，从而促进癌细胞增殖^[8]。本研究探讨了circAPLP2竞争性结合miR-497-5p上调FGFR1在结直肠癌细胞中的作用，以期为结直肠癌靶向药物研发提供新的思路。

1 材料与方法

收起

1.1 主要试剂及仪器

Trizol试剂、Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；Gibco胎牛血清、cDNA反转录试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒和TaqMan miRNA测定试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；circAPLP2小干扰RNA(sicircAPLP2)及其阴性对照(siControl)、miR-497-5p mimics及其阴性对照(NC-miRNA)、miR-497-5p inhibitor及其阴性对照(inhibitor-NC)、慢病毒质粒pLVX-circAPLP2(circAPLP2)及其阴性对照(pLVX)、pcDNA-FGFR1过表达质粒(pcDNA-FGFR1)及其阴性对照(pcDNA-Control)由上海锐博生物科技有限公司提供；E-cadherin(#14472)、Twist1(#69366)、N-cadherin(#13116)、Vimentin(#5741)、FGFR1(#9740)和GAPDH(#5174)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。ABI 7300系统购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 miR-497-5p与FGFR1、circAPLP2的结合位点预测

采用在线数据库Starbase预测circAPLP2与miR-497-5p的结合位点，在线数据库TargetScan预测miR-497-5p与FGFR1的结合位点。

1.3 细胞培养及分组

结直肠癌细胞系LoVo、DLD1、SW480、SW620、Caco-2及人正常结肠上皮细胞HCoEpiC由中科院上海细胞研究所提供，置于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。

(1)取LoVo、DLD1、SW480、SW620、Caco-2、HCoEpiC细胞，接种于96孔板中，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测circAPLP2、miR-497-5p的相对表达水平，Western blotting检测FGFR1蛋白的相对表达水平。(2)取SW480细胞，设置siNC组(转染50 nmol/L siControl)、sicircAPLP2组(转染50 nmol/L sicircAPLP2)，转染48 h后，采用qRT-PCR检测circAPLP2、miR-497-5p及FGFR1 mRNA的相对表达水平，Western blotting检测FGFR1蛋白的相对表达水平。(3)取SW480细胞，设置Vector组(转染2 μg对照空载质粒)、circAPLP2组(转染2 μg circAPLP2过表达质粒)，转染48 h后，采用qRT-PCR检测miR-497-5p及FGFR1 mRNA的相对表达水平，Western blotting检测FGFR1蛋白的相对表达水平。(4)取SW480细胞，设置siNC组(转染50 nmol/L阴性对照)、sicircAPLP2组(转染50 nmol/L sicircAPLP2)与sicircAPLP2+miR-497-5p inhibitor组(转染50 nmol/L sicircAPLP2和50 nmol/L miR-497-5p inhibitor)，转染48 h后，采用Transwell实验检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力，Western blotting检测EMT标志蛋白(E-cadherin、Twist1、N-cadherin、Vimentin)的表达。(5)取SW480细胞，设置NC-miRNA组(转染50 nmol/L NC-miRNA)、miR-497-5p mimics组(转染50 nmol/L miR-497-5p mimics)与NC-inhibitor组(转染50 nmol/L NC-inhibitor)、miR-497-5p inhibitor组(转染50 nmol/L miR-497-5p inhibitor)，转染48 h后，采用qRT-PCR和Western blotting检测FGFR1的表达。(6)取SW480细胞，设置pcDNA-Control组(转染2 μg pcDNA-Control)、pcDNA-FGFR1组(转染2 μg pcDNA-FGFR1)，采用Western blotting检测FGFR1蛋白的相对表达水平。(7)取SW480细胞，设置NC-miRNA组(转染阴性对照)、miR-497-5p mimics组(转染50 nmol/L miR-497-5p mimics)与miR-497-5p mimics+pcDNA-FGFR1组(转染50 nmol/L miR-497-5p mimics和2 μg pcDNA-FGFR1)，采用Transwell实验检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力，Western blotting检测FGFR1和EMT标志蛋白(E-cadherin、Twist1、N-cadherin、Vimentin)的表达。

1.3.1 qRT-PCR检测circAPLP2、miR-497-5p及FGFR1 mRNA的相对表达水平

采用Trizol试剂提取细胞总RNA，使用cDNA反转录试剂盒反转录成cDNA。采用ABI 7300系统通过SYBR Green PCR试剂盒测定circAPLP2及FGFR1 mRNA的相对表达水平，TaqMan miRNA法测定miR-497-5p的相对表达水平。反应体系(25 μl)：12.5 μl SYBR Premix Ex Taq(2×)，0.5 μl Primer F，0.5 μl Primer R，2 μl RT产物，9.5 μl ddH₂O。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，70 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以GAPDH或U6作为内参，采用2^–ΔΔCt法计算circAPLP2、miR-497-5p及FGFR1 miRNA的相对表达水平。引物序列如表1所示。

1.3.2 划痕实验检测细胞迁移能力

将结直肠癌细胞接种在含DMEM(加入10% FBS)培养基的6孔板中，当细胞生长至80%密度时，用无菌200 μl枪头尖端垂直划痕；PBS洗涤去除漂浮细胞，加入不含血清的培养基培养48 h。使用NIS-Elements AR 3.1软件(日本Nikon公司)检测细胞迁移能力。

1.3.3 Transwell实验检测细胞侵袭能力

使用24孔Matrigel涂层Millicell系统(BD Biosciences)检测细胞的侵袭能力。将2×10⁴个SW480细胞接种到24孔Transwell室(Corning)中，上室加入200 μl无血清DMEM，下室加入含10% FBS的DMEM，孵育24 h；去除表面未侵入的细胞，并将底部的细胞固定在100%甲醇中，加入0.5%结晶紫溶液染色，于显微镜下观察拍照，每个腔室随机选取5个区域计算侵袭细胞数，取平均值。

1.3.4 Western blotting检测FGFR1和EMT标志蛋白的表达

用含蛋白酶抑制剂混合物的冷RIPA缓冲液裂解细胞。使用10% SDS-PAGE分离蛋白质样品，并转移到PVDF膜上，加入特异性一抗E-cadherin(1:1000)、Twist1(1:1000)、N-cadherin(1:1000)、Vimentin(1:1000)、FGFR1(1:1000)和GAPDH(1:1000)，4 ℃孵育12 h；加入辣根过氧化物酶，用二抗室温孵育2 h；加入SuperPico化学发光底物用于可视化信号。采用ImageJ软件分析目的蛋白的相对表达水平。

1.4 双荧光素酶报告实验测定miR-497-5p与FGFR1及circAPLP2的结合作用

通过PCR扩增circAPLP2或FGFR1中与miR-497-3p结合的位点序列片段，然后亚克隆到pmirGLO质粒中。将2 μg circAPLP2-WT或2 μg circAPLP2-MT报告质粒分别与50 nmol/L NC-miRNA或50 nmol/L miR-497-5p mimics利用Lipofectamine 3000共转染SW480细胞中；将2 μg FGFR1-WT或2 μg FGFR1-MT报告质粒分别与50 nmol/L NC-miRNA或50 nmol/L miR-497-5p mimics利用Lipofectamine 3000共转染SW480细胞中；将50 pmol/孔miR-497-5p mimics和800 ng/孔荧光素酶报告质粒利用Lipofectamine 3000共转染到SW480细胞中。转染48 h后，采用荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以$\bar{x}±s$表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

收起

2.1 circAPLP2及miR-497-5p在结直肠癌细胞中的表达情况

qRT-PCR检测结果显示，与结肠上皮细胞HCoEpiC比较，结直肠癌细胞LoVo、DLD1、SW480、SW620、Caco-2中circAPLP2相对表达水平升高(P<0.05，图1A)，miR-497-5p相对表达水平下降(P<0.05，图1B)，SW480细胞circAPLP2相对表达水平最高、miR-497-5p相对表达水平最低，选择该细胞进行后续实验。

2.2 上调或下调circAPLP2对结直肠癌细胞中miR-497-5p表达的影响

在线数据库Starbase预测结果显示，circAPLP2与miR-497-5p存在结合位点(图2A)。

与siNC组比较，sicircAPLP2组结直肠癌细胞SW480中circAPLP2相对表达水平明显降低(P<0.001，图2B)，表明转染成功。

与siNC组比较，敲低circAPLP2后，结直肠癌细胞SW480中miR-497-5p相对表达水平明显升高(P<0.001，图2C)；过表达circAPLP2后，结直肠癌细胞SW480中miR-497-5p相对表达水平明显降低(P<0.001，图2D)。双荧光素酶报告实验结果显示，与NC-miRNA组比较，miR-497-5p mimics组circAPLP2-WT荧光素酶活性明显降低(P<0.001)，但circAPLP2-MT荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05，图2E)。

2.3 circAPLP2调控miR-497-5p对结直肠癌侵袭、迁移及EMT的影响

Transwell实验、划痕实验和Western blotting检测结果显示，与siNC组比较，sicircAPLP2组侵袭细胞数减少(P<0.001)，划痕愈合率降低(P<0.001)，E-cadherin蛋白相对表达水平增高(P<0.001)，Twist1、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平降低(P<0.001)；与sicircAPLP2组比较，sicircAPLP2+miR-497-5p inhibitor组侵袭细胞数增多(P<0.001)，划痕愈合率升高(P<0.01)，E-cadherin蛋白相对表达水平降低(P<0.01)，Twist1、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平增高(P<0.05) (图3)。

2.4 上调或下调miR-497-5p对结直肠癌细胞中FGFR1表达的影响

TargetScan在线数据库分析结果显示，FGFR1是miR-497-5p的潜在靶基因(图4A)。

Western blotting检测结果显示，与结肠上皮细胞HCoEpiC比较，结直肠癌细胞LoVo、DLD1、SW480、SW620、Caco-2中FGFR1蛋白相对表达水平增高(P<0.01，图4B)。转染miR-497-5p mimics后，结直肠癌细胞SW480中FGFR1 mRNA和蛋白相对表达水平降低(P<0.001，图4C)；转染miR-497-5p inhibitor后，结直肠癌细胞SW480中FGFR1 mRNA和蛋白相对表达水平增高(P<0.001，图4D)。

双荧光素酶报告实验结果显示，与NC-miRNA组比较，miR-497-5p mimics组FGFR1-WT荧光素酶活性明显降低(P<0.001)，但FGFR1-MT荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05，图4E)。

2.5 miR-497-5p靶向抑制FGFR1对结直肠癌侵袭、迁移及EMT的影响

转染FGFR1过表达质粒后，结直肠癌细胞中FGFR1蛋白相对表达水平明显增高(P<0.001，图5A)，表明转染成功。

Transwell实验、划痕实验和Western blotting检测结果显示，与NC-miRNA组比较，miR-497-5p mimics组侵袭细胞数减少(P<0.001)，划痕愈合率降低(P<0.001)，E-cadherin蛋白相对表达水平增高(P<0.001)，Twist1、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平降低(P<0.001)；与miR-497-5p mimics组比较，miR-497-5p mimics+pcDNA-FGFR1组侵袭细胞数增多(P<0.001)，划痕愈合率升高(P<0.01)，E-cadherin蛋白相对表达水平降低(P<0.01)，Twist1、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平增高(P<0.05，图5B－D)。

2.6 上调或下调circAPLP2对结直肠癌细胞中FGFR1表达的影响

过表达circAPLP2后，结直肠癌细胞中FGFR1 mRNA和蛋白相对表达水平明显上调(P<0.001，图6A)；敲低circAPLP2的表达后，结直肠癌细胞中FGFR1 mRNA和蛋白相对表达水平明显下调(P<0.001，图6B)。

双荧光素酶报告实验结果显示，与NC-miRNA组比较，miR-497-5p mimics组FGFR1-WT荧光素酶活性明显降低(P<0.001)；与miR-497-5p mimics组比较，miR-497-5p mimics+circAPLP2组FGFR1-WT荧光素酶活性明显升高(P<0.001，图6C)。

Western blotting检测结果显示，转染miR-497-5p mimics后，结直肠癌细胞中FGFR1蛋白相对表达水平降低(P<0.001)；在此基础上过表达circAPLP2后，FGFR1蛋白相对表达水平增高(P<0.05，图6D)。

3 讨论

收起

结直肠癌是我国癌症相关死亡的第五大原因，尽管随着治疗方法的不断进步，结直肠癌患者5年生存率有所提高，但术后复发和远处转移仍是患者死亡的主要原因^[9]。EMT是肿瘤增殖和转移的重要组成部分，在其发生过程中，上皮细胞由上皮类型转变为间质类型，失去细胞间连接及极性，获得间质细胞形态，增强了细胞的迁移和侵袭能力^[10]。研究发现，结直肠癌肝转移患者癌组织中上皮细胞标志物E-cadherin表达降低^[11]；结直肠癌细胞发生EMT后，间质细胞标志物Twist1表达增加，细胞侵袭与迁移能力增强^[12]。因此探究结直肠癌细胞EMT、增殖和转移能力的调控机制，对制订结直肠癌的治疗策略尤为重要。

circRNAs作为机体非编码RNA的重要组成部分，在肿瘤的发展中发挥了关键作用。已有研究证实，在结直肠癌中circPTK2、circCAMSAP1、circHIPK3等多种circRNA表达水平异常，是患者预后不良的重要预测指标^[13-14]。circRNA参与调控肿瘤EMT、侵袭、转移等过程，如circLMNB1可抑制E-cadherin的表达，上调N-cadherin的表达，促进结直肠癌细胞发生EMT和体内转移^[15]。敲低hsa_circ_0005273可抑制结直肠癌细胞的EMT进程，从而抑制结直肠癌的侵袭、转移^[16]。circAPLP2(hsa_circ_0000372)位于11号染色体q24.3，在结直肠癌肝转移患者中表达水平明显升高^[17]。Liu等^[18]研究发现，敲低结直肠癌细胞SW480中circAPLP2的表达，可上调E-cadherin的表达，下调Vimentin的表达，本研究结果与之一致。Wu等^[19]研究发现，circAPLP2竞争性结合miR-101可促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移。本研究发现，在结直肠癌细胞中circAPLP2表达水平升高，敲低circAPLP2可抑制结直肠癌细胞的EMT、侵袭和迁移，提示circAPLP2在结直肠癌中发挥了促癌作用。

circRNA通过相同的miRNA识别元件(MRE)竞争性结合miRNA，参与miRNA调控，在肿瘤中发挥作用^[20-21]。例如，circ_0001666竞争性结合miR-576-5p可抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭^[22]，circ_100876竞争性结合miR-516b可促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和EMT过程^[23]。本研究发现，circAPLP2竞争性结合miR-497-5p可促进结直肠癌细胞的EMT、侵袭和迁移。miRNA可通过与靶基因3'-UTR MRE配对，调控靶基因的表达水平。FGFR1是一种跨膜蛋白，属于受体酪氨酸激酶，与配体成纤维细胞生长因子(FGF)结合后，可激活下游MAPK/PI3K/Akt、RAS/ERK、STAT3等多条信号通路，调控血管生成、细胞增殖和分化等过程^[24]。有研究发现，肿瘤中FGFR1信号通路被异常激活，非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种癌症中FGFR1表达水平均升高^[25]；FGFR1信号通路持续激活导致前列腺癌发生侵袭、转移，同时体内、体外实验均观察到明显的EMT改变^[26]。FGFR1可激活ERK1/2-SOX2通路，促进肺癌细胞的EMT、侵袭和迁移^[27]。在肺癌中miR-214-3p可通过与FGFR1 3'-UTR MRE配对，抑制FGFR1的表达^[28]。在结直肠癌中miR-214水平与FGFR1水平呈负相关，可抑制FGFR1 mRNA和蛋白的表达，促进结直肠癌肝转移^[29]。本研究发现，在结直肠癌细胞中FGFR1表达增加，miR-497-5p靶向抑制FGFR1的表达可促进结直肠癌的EMT、侵袭和迁移，此外circAPLP2竞争性结合miR-497-5p可促进FGFR1的表达。

综上所述，本研究结果表明，circAPLP2在结直肠癌细胞中呈高表达，可通过竞争性结合miR-497-5p促进FGFR1的表达，从而促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移，这为结直肠癌靶向药物的研发提供了理论依据。但由于缺乏相关动物实验支持，circAPLP2竞争性结合miR-497-5p促进FGFR1表达在结直肠癌荷瘤小鼠中的作用尚不明确，因此，circAPLP2是否可作为结直肠癌的诊断标志物仍需进一步研究。

基金

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宁波市自然科学基金(202003N4068)

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2023年第48卷第5期

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doi: 10.11855/j.issn.0577-7402.2023.05.0577

接收时间：2022-04-19
首发时间：2025-12-03
出版时间：2023-05-28

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收稿日期：2022-04-19
录用日期：2022-06-28

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宁波市自然科学基金(202003N4068)

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宁波市杭州湾医院普外科，浙江慈溪 315300

通讯作者:

柯孔亮，E-mail：kekongliang1998@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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