解放军医学杂志

miR-15b-5p靶向FOXO1对缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤的调控作用及其机制

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李华锋 , 张鸿毅 , 肖克兵 , 杨辉 , 李子峰 , 赵刚刚 ^*

解放军医学杂志 | 基础研究 2024,49(11): 1311-1318

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解放军医学杂志 | 基础研究 2024, 49(11): 1311-1318

miR-15b-5p靶向FOXO1对缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤的调控作用及其机制

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李华锋, 张鸿毅, 肖克兵, 杨辉, 李子峰, 赵刚刚^*

作者信息

西安医学院第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710077

李华锋，硕士研究生，主治医师，主要从事泌尿系肿瘤和肾损伤疾病诊治方面的研究

通讯作者:

赵刚刚，E-mail：mr_zgg8@163.com

MiR-15b-5p alleviates hypoxia/reoxygenation-induced human renal tubular epithelial cell HK-2 injury by targeting FOXO1

Hua-Feng Li, Hong-Yi Zhang, Ke-Bing Xiao, Hui Yang, Zi-Feng Li, Gang-Gang Zhao^*

Affiliations

Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Xi'an Medical College, Xi'an, Shaanxi 710077, China

出版时间: 2024-11-28 doi: 10.11855/j.issn.0577-7402.1100.2024.0204

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摘要

收起

目的探讨miR-15b-5p靶向叉头框蛋白O1(FOXO1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的调控作用及其机制。方法取对数生长期HK-2细胞，设置：(1)对照组(正常培养)与H/R组(H/R诱导培养)。倒置显微镜下观察HK-2细胞形态，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测mi-15b-5p、FOXO1 mRNA的表达，Western blotting检测FOXO1蛋白的表达。(2)对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+mimic对照组(转染mimic对照质粒后H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic+OE-NC组(共转染miR-15b-5p mimic和OE-NC质粒后H/R诱导培养)与H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和FOXO1过表达质粒后H/R诱导培养)。采用qRT-PCR检测mi-15b-5p的表达，Western blotting检测FOXO1、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达，CCK-8法检测细胞活力，TUNEL染色检测细胞凋亡情况。(3)对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后H/R诱导培养)与H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和OE-FOXO1后H/R诱导培养)。采用Western blotting检测LC3、p62、Beclin-1蛋白的表达，LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。双荧光素酶报告实验检测miR-15b-5p与FOXO1之间的靶向关系。结果倒置显微镜下观察显示，对照组细胞数量较多，细胞大多呈典型鹅卵石形态，铺路石状生长；H/R组大部分细胞收缩变圆，贴壁细胞数量明显减少。与对照组比较，H/R组miR-15b-5p表达水平明显降低，FOXO1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。荧光素酶报告实验结果显示miR-15b-5p直接靶向作用于FOXO1的3'-UTR。miR-15b-5p过表达抑制H/R诱导的HK-2细胞活力，降低细胞凋亡，抑制细胞自噬(P<0.05)。与H/R+miR-15b-5p mimic组相比，H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组HK-2细胞存活率降低，细胞凋亡和自噬水平增高(P<0.05)。结论 miR-15b-5p通过靶向抑制FOXO1降低细胞自噬减缓H/R诱导的HK-2细胞损伤。

关键词

miR-15b-5p / 叉头框蛋白O1 / 人肾小管上皮细胞 / 缺氧/复氧 / 自噬

Abstract

收起

Objective To investigate the role and underlying mechanism of miR-15b-5p on hypoxia/reoxygenation (H/R) induced human renal tubular epithelial cell (HK-2) injury by targeting forkhead box O1 (FOXO1). Methods HK-2 cells in the log growth phase were set up as follows: (1) control group (normal culture) and H/R group (H/R induced culture). The expressions of miR-15b-5p and FOXO1 mRNA were detected using qRT-PCR, and the protein expression of FOXO1 was detected using Western blotting. (2) Control group (normal culture), H/R group (H/R induced culture), H/R+mimic control group (cells transfected with mimic control then induced by H/R), H/R+miR-15b-5p mimic group (cells transfected with miR-15b-5p mimic then induced by H/R), H/R+miR-15b-5p mimic+OE-NC group (cells co-transfected with miR-15b-5p mimic and OE-NC plasmid, then induced by H/R), and H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1 group (cells co-transfected with miR-15b-5p mimic and FOXO1 overexpression plasmid, then induced by H/R). The expression of miR-15b-5p was detected using qRT-PCR, and the protein expressions of FOXO1, cleaved caspase-3, Bax, and Bcl-2 were detected using Western blotting. CCK-8 assay was used to detect cell viability. Cell apoptosis was measured by the TUNEL method. (3) Control group (normal culture), H/R group (H/R induced culture), H/R+miR-15b-5p mimic group (cells transfected with miR-15b-5p mimic then induced by H/R), and H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1 group (cells co-transfected with miR-15b-5p mimic and FOXO1 overexpression plasmid, then induced by H/R). The protein expressions of LC3, p62 and Beclin1 were detected using Western blotting. LC3 immunofluorescence was used to detect the cell autophagy. The target reaction between miR-15b-5p and FOXO1 was assessed using dual luciferase reporting assay. Results Under an inverted microscope, it was observed that the control group had a higher number of cells, most of which were in a typical cobblestone shape and grew in a cobblestone-like manner; most of the cells in the H/R group contracted and became round, with a significant decrease in the number of adherent cells. In H/R-induced HK-2 cells, miR-15b-5p was significantly down-regulated, while miRNA and protein expression of FOXO1 was up-regulated (P<0.05). Luciferase assay results showed that miR-15b-5p directly targeted the 3'-UTR of FOXO1. Overexpression of miR-15b-5p increased cell viability, reduced cell apoptosis, and decreased autophagy in H/R-induced HK-2 cells (P<0.05). Compared with H/R+miR-15b-5p mimic group, the viability of HK-2 cells was decreased, the apoptosis and autophagy level were increased in H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1 group (P<0.05). Conclusion miR-15b-5p inhibited autophagy and alleviated H/R-induced HK-2 cell injury by targeting FOXO1.

Key words

miR-15b-5p / forkhead box O1 / human renal tubular epithelial cells / hypoxia/reoxygenation / autophagy

引用本文

李华锋, 张鸿毅, 肖克兵, 杨辉, 李子峰, 赵刚刚. miR-15b-5p靶向FOXO1对缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤的调控作用及其机制. 解放军医学杂志, 2024 , 49 (11) : 1311 -1318 . DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.1100.2024.0204

Hua-Feng Li, Hong-Yi Zhang, Ke-Bing Xiao, Hui Yang, Zi-Feng Li, Gang-Gang Zhao. MiR-15b-5p alleviates hypoxia/reoxygenation-induced human renal tubular epithelial cell HK-2 injury by targeting FOXO1[J]. Medical Journal of Chinese People’s Liberation Army, 2024 , 49 (11) : 1311 -1318 . DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.1100.2024.0204

正文

收起

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是威胁人类健康的危重疾病，其主要特征为肾功能急剧下降和肾脏损伤^[1]。肾脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是导致AKI的主要原因之一^[2]。目前临床上尚缺少防治IRI发生的有效药物，因此探索IRI的发病机制、寻找新型治疗靶点具有重要的临床意义。叉头框蛋白O1(forkhead box O1，FOXO1)是FOXOs转录因子蛋白家族的一个亚型。作为FOXOs家族中最早被发现的成员，FOXO1可与细胞核内DNA上的反应元件相结合，参与细胞代谢、分化、凋亡等信号转导的调节^[3]。既往研究发现，FOXO1在肾纤维化、糖尿病肾病、肾炎等多种肾脏疾病中发挥作用^[4]，且在肾脏IRI中呈高表达，抑制FOXO1可通过抑制自噬缓解I/R损伤^[5]。有研究发现，多种微小RNA(microRNA，miRNA)可通过靶向调节FOXO1参与不同疾病的调节^[6]。miR-15b-5p在慢性肾病和糖尿病肾病患者血清中的表达明显降低，但在缺氧再灌注引起的肾损伤中的作用及其机制尚不明确^[7-8]。本研究以人肾小管上皮细胞HK-2为研究对象，建立缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)诱导的HK-2细胞损伤模型，探讨miR-15b-5p通过靶向FOXO1对H/R诱导的HK-2细胞损伤的调控作用及其机制。

1 材料与方法

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1.1 材料及试剂

人肾小管上皮细胞株HK-2购自武汉普诺赛生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM、F12培养基购自美国Gibco公司；Trizol试剂购自美国Life Technology公司；PCR引物、miR-15b-5p模拟物(miR-15b-5p mimic)、pcDNA3.1质粒购自上海生工生物工程有限公司；抗FOXO1、活化胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、Bax、Bcl-2、LC3、p62、Beclin-1、β-肌动蛋白(β-actin)抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自英国Abcam公司；双荧光素酶报告基因试剂盒、pGL3荧光素酶载体购自美国Promega公司；Lipofectamine^TM 3000购自美国Invitrogen公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HK-2细胞H/R模型建立及实验分组

HK-2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。每2~3 d，当细胞贴壁密度达到85%左右时传代1次。

(1)取对数生长期HK-2细胞，设置对照组与H/R组。对照组细胞正常培养，H/R组细胞进行H/R诱导培养，即将细胞置于含有95% N₂+5% CO₂的密闭容器中缺氧培养4 h，随后于含5% CO₂的常规细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察HK-2细胞形态，并拍片；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测mi-15b-5p、FOXO1 mRNA的表达，Western blotting检测FOXO1蛋白的表达。

(2)取对数生长期HK-2细胞，随机分为6组：对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+mimic对照组(转染mimic对照后进行H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后进行H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic+OE-NC组(共转染miR-15b-5p和OE-NC质粒后进行H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和OE-FOXO1后进行H/R诱导培养)。细胞转染过程按照Lipofectamine^TM 3000说明书步骤，按照分组分别在HK-2细胞中转染100 nmol的mimic对照、miR-15b-5p mimic、空载质粒pcDNA3.1(OE-NC)或FOXO1过表达质粒pcDNA3.1-FOXO1(OE-FOXO1)。采用qRT-PCR检测mi-15b-5p的表达，Western blotting检测FOXO1、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达，CCK-8法检测细胞活力，TUNEL检测细胞凋亡情况。

(3)取对数生长期HK-2细胞，随机分为4组：对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后进行H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和OE-FOXO1后进行H/R诱导培养)。采用Western blotting检测LC3、p62、Beclin-1蛋白的表达，LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。

1.2.2 qRT-PCR检测FOXO1 mRNA和mi-15b-5p的表达

采用Trizol试剂提取HK-2细胞总RNA，并反转录成模板cDNA。采用SYBR Green进行qRT-PCR。反应体系(20 μl)：SYBR Green Mix 10 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、模版cDNA 1 μl和ddH₂O 8 μl。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，54 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。引物序列：FOXO1上游5'-CAGCAAATCAAGTTATGGAGGA-3'，下游5'-TATCATTGTGGGGAGGAGAGTC-3'；β‑actin上游5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，下游5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'；miR-15b-5p上游5'-ATGAACTTTCTCTGTCTTGG-3'，下游5'-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3'；U6上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。所用引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。以β-actin和U6为内参，采用2^-ΔΔCt法分别计算FOXO1 mRNA和miR-15b-5p的表达量。

1.2.3 Western blotting检测相关蛋白的表达

采用RIPA细胞蛋白裂解液裂解HK-2细胞，提取细胞总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。同等量蛋白经SDS-PAGE电泳后，进行电转膜，随后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。分别加入FOXO1(1:1000)、cleaved caspase-3(1:500)、Bax(1:1000)、Bcl-2(1:2000)、LC3(1:2000)、p62(1:10 000)、Beclin-1(1:1000)、β-actin (1:5000)蛋白一抗于4 ℃孵育过夜，漂洗后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育1 h。滴加ECL化学发光液，凝胶成像分析系统成像，结果采用ImageJ图像处理软件分析，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达水平。

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力

在各组HK-2细胞中加入CCK-8试剂与细胞培养基的培养液(1:10)，设置只含培养基而无细胞的空白组，37 °C孵育4 h，用酶标仪检测490 nm波长处的吸光度(A)值，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(A_实验组－A_空白组)/(A_对照组－A_空白组)×100%。

1.2.5 TUNEL染色检测细胞凋亡情况

取各组HK-2细胞，用4%多聚甲醛溶液室温下固定30 min；加入蛋白酶K在37 ℃下消化10 min；TBS清洗后，加入末端脱氧核糖核酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)和生物素标记的脱氧尿苷三磷酸(biotin-dTUP，BIO-dUTP)标记2 h；加入链霉亲和素(streptavidin-biotin complex，SABC)稀释液在37 ℃下反应30 min，随后用DAPI染色液复染。最后于荧光显微镜下观察并拍片。

1.2.6 LC3免疫荧光检测细胞自噬水平

取各组HK-2细胞，加入多聚甲醛溶液固定15 min；加入5%胎牛血清后室温封闭1 h，按说明加入稀释的LC3蛋白一抗(稀释倍数1:100) 4 ℃孵育过夜；加入二抗室温孵育1 h；滴加DAPI避光孵育5 min染核，清洗后在荧光显微镜下观察并记录细胞的荧光强度。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验

采用TargetScan在线软件(https://www.targetscan.org/vert_72/)预测FOXO1与miR-15b-5p的靶向结合位点。根据预测结果，对FOXO1的3'-UTR区与miR-15b-5p的靶向结合序列进行序列突变。将FOXO1的野生(WT)序列和突变(MUT)序列克隆到荧光素酶报告载体pGL3中，构建FOXO1-WT和FOXO1-MUT表达质粒。将对数期生长的HK-2细胞接种于24孔板中，接种密度为1×10⁶个/ml，采用Lipofectamine^TM 3000将FOXO1-WT或FOXO1-MUT与miR-15b-5p mimic或mimic对照共转染HK-2细胞。培养48 h后用双荧光酶检测系统测定荧光素酶活性。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 7.01软件进行统计分析。所有实验数据均以$\bar{x}±s$表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，进一步两两比较采用Bonferroni检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

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2.1 H/R诱导的HK-2细胞形态

倒置显微镜下观察显示，对照组细胞数量较多，细胞大多呈典型鹅卵石形态，铺路石状生长；H/R组大部分细胞收缩变圆，贴壁细胞数量明显减少(图1)。

2.2 miR-15b-5p、FOXO1在H/R诱导的HK-2细胞中的表达情况

与对照组比较，H/R组HK-2细胞中miR-15b-5p表达水平明显降低(P<0.05，图2A)，FOXO1 mRNA和FOXO1蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，图2B、C)。

2.3 miR-15b-5p与FOXO1靶向结合

TargetScan在线软件预测结果显示，miR-15b-5p与FOXO1的3'-UTR区有靶向结合的位点(图3A)。双荧光素酶报告实验检测结果显示，miR-15b-5p mimic可明显降低共转染FOXO1-WT的HK-2细胞的荧光素酶活性(P<0.05)，而miR-15b-5p mimic与FOXO1-MUT共转染的HK-2细胞荧光素酶活性未见明显变化(P>0.05，图3B)。

2.4 miR-15b-5p对H/R诱导的HK-2细胞活性的影响

与对照组比较，H/R组细胞中miR-15b-5p表达水平明显降低，FOXO1蛋白表达水平明显升高，细胞存活率明显降低(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+miR-15b-5p mimic组HK-2细胞中miR-15b-5p表达水平明显升高，FOXO1蛋白表达水平明显降低，细胞存活率明显升高(P<0.05)；与H/R+miR-15b-5p mimic组比较，H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组HK-2细胞中FOXO1蛋白表达水平明显升高，细胞存活率明显降低(P<0.05，图4)。

2.5 miR-15b-5p对H/R诱导的HK-2细胞凋亡的影响

TUNEL和Western blotting检测结果显示，与对照组比较，H/R组细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白cleaved caspase 3、Bax表达水平明显升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显降低(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+miR-15b-5p mimic组细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白cleaved caspase 3、Bax表达水平降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平升高(P<0.05)；与H/R+miR-15b-5p mimic组比较，H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白cleaved caspase 3、Bax表达水平升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低(P<0.05，图5)。

2.6 miR-15b-5p对H/R诱导的HK-2细胞自噬的影响

与对照组比较，H/R组HK-2细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表达水平明显增高，p62蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+miR-15b-5p mimic组HK-2细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，p62蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与H/R+miR-15b-5p mimic组比较，H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组HK-2细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表达水平明显增高(P<0.05)，p62蛋白表达水平明显降低(P<0.05)(图6A)。

LC3免疫荧光检测结果显示，对照组HK-2细胞中绿色荧光斑点较少，H/R组HK-2细胞中绿色荧光斑点明显聚集。与H/R组比较，H/R+miR-15b-5p mimic组中荧光斑点减少。与H/R+miR-15b-5p mimic组比较，H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组中绿色荧光斑点增多(图6B)。

3 讨论

收起

肾脏IRI可引起代谢失衡、系统炎症及细胞凋亡等，继而导致AKI^[9]。探索IRI发生发展的分子机制是预防和治疗AKI的工作重点。肾小管上皮细胞分化良好、代谢旺盛，对缺血和缺氧高度敏感^[10]。在肾功能损伤时肾小管是较早出现损伤的部位，因此本研究选用肾小管上皮细胞构建H/R模型，研究miR-15b-5p对H/R诱导HK-2细胞损伤的作用，探讨miR-15b-5p参与IRI发生发展的机制。

有研究发现，miRNA参与糖尿病肾病、肾移植损伤、肾纤维化、AKI等多种肾脏疾病的调控^[11]。近年来研究表明，miRNA广泛参与IRI的发生和发展。在缺血再灌注诱导的AKI小鼠模型中，上调miR-20b-5p可通过抑制铁死亡、减轻炎症及肾纤维化，从而延缓IRI的进展^[12]。miR-6198-5p可通过抑制肾小管上皮细胞凋亡，减缓缺血再灌注引起的肾损伤^[13]。罗庆琳等^[14]报道，miR-141-3p能够通过促进肾小管上皮细胞焦亡而减缓小鼠IRI损伤。miRNA是一类高度保守的非编码单链RNA，不直接参与基因的转录和翻译过程，而是通过与下游目标靶基因3'-UTR区特异性结合，阻止或抑制靶基因mRNA的蛋白翻译过程^[15]。FOXO1作为转录因子参与多种肾脏疾病的病理机制，在肾脏IRI中也可发挥重要作用^[16]。本研究探讨miR-15b-5p/FOXO1调节轴在IRI中的作用，发现FOXO1在肾小管上皮细胞HK-2 H/R模型中表达上调，与既往研究一致^[5]。同时miR-15b-5p在H/R诱导的HK-2细胞中表达下调。双荧光素酶报告实验结果显示miR-15b-5p能够靶向结合到FOXO1的3'-UTR区。以上结果提示miR-15b-5p可能参与肾脏IRI的调控。

本研究发现，在H/R诱导下肾小管上皮细胞HK-2的细胞存活率下降，同时细胞凋亡率明显升高，凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，表明细胞活力降低和过度凋亡是H/R导致肾小管上皮细胞损伤的作用机制之一。miR-15b-5p的过表达可明显提升H/R诱导的细胞活力，降低细胞凋亡率，提示miR-15b-5p可缓解H/R刺激对HK-2细胞的损伤，且FOXO1过表达实验结果提示miR-15b-5p对HK-2细胞损伤的调节作用是通过靶向抑制FOXO1表达产生的。

细胞自噬是程序性细胞死亡的一种，是真核细胞通过溶酶体吞噬异常状态的细胞器、蛋白质等造成细胞死亡而进行自我降解的过程；该过程广泛存在于多种疾病的病理进程中，在肾脏IRI中也发挥重要作用^[17-18]。有研究发现，FOXO1在心肌病、糖尿病、脑IRI等疾病中对细胞自噬具有调控作用^[19-21]；在缺血再灌注肾损伤大鼠中高表达的FOXO1可促进细胞自噬^[5]。自噬过程中Ⅰ型LC3蛋白在经过泛素样修饰后，结合磷脂酰乙醇胺形成脂溶性的Ⅱ型LC3蛋白，促进自噬泡膜的延伸和自噬体的成熟^[22]。p62衔接蛋白与LC3结合，转移至自噬体后降解，与自噬的活性呈负相关^[23]。Beclin-1是自噬调节的关键因子之一，可通过招募其他相关蛋白促进自噬前体的形成^[24]。本研究发现，过表达miR-15b-5p可提升H/R诱导的HK-2细胞中LC3-Ⅰ、p62的表达，抑制LC3-Ⅱ、Belin-1的表达。进一步通过免疫荧光法检测发现miR-15b-5p过表达可明显抑制H/R诱导的HK-2细胞自噬，该结果与miR-15b-5p在骨质疏松动物模型中对自噬的抑制作用一致^[25]。同时，FOXO1过表达质粒的共转染促进了HK-2细胞的自噬，提示miR-15b-5p是通过抑制FOXO1而降低H/R诱导的HK-2细胞自噬。

综上所述，本研究发现，miR-15b-5p可通过靶向FOXO1抑制细胞自噬，减缓H/R诱导的肾小管上皮细胞损伤，为肾脏IRI及AKI的有效防治提供了目标靶点与理论基础。但本研究仅在细胞模型中探讨了miR-15b-5p对H/R诱导自噬的作用，未来仍需进一步在动物模型中进行验证，并探讨miR-15b-5p对肾脏IRI中炎症、能量代谢等机制的作用。

参考文献

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文献

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排序方式：

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2024年第49卷第11期

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doi: 10.11855/j.issn.0577-7402.1100.2024.0204

接收时间：2023-08-16
首发时间：2025-11-20
出版时间：2024-11-28

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出版历史

收稿日期：2023-08-16
录用日期：2023-10-07

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西安医学院第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710077

通讯作者:

赵刚刚，E-mail：mr_zgg8@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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