中国新药与临床杂志

组别	ALT /U·L^-1	AST /U·L^-1	ALP /U·L^-1	IL-1β/pg·mg^-1	IL-6/pg·mg^-1	IL-10/pg·mg^-1
sham	98.75±7.19	117.42±4.49	300.02±20.25	19.63±1.75	18.9±2.23	50.24±7.17
PM	550.20±35.05^b	1 018.22±68.22^b	595.68±55.30^b	39.25±3.73^b	79.49±6.14^b	26.53±2.52^b
PM+NS	586.35±85.97^b	1 018.54±46.46^b	574.78±27.69^b	38.00±4.11^b	82.17±4.27^b	25.39±1.44^b
PM+BBR	210.51±22.55^e	646.85±52.54^e	429.12±14.27^e	29.46±2.87^e	33.57±2.51^e	36.25±1.32^e

组别	ALT /U·L^-1	AST /U·L^-1	ALP /U·L^-1	IL-1β/pg·mg^-1	IL-6/pg·mg^-1	IL-10/pg·mg^-1
sham	98.75±7.19	117.42±4.49	300.02±20.25	19.63±1.75	18.9±2.23	50.24±7.17
PM	550.20±35.05^b	1 018.22±68.22^b	595.68±55.30^b	39.25±3.73^b	79.49±6.14^b	26.53±2.52^b
PM+NS	586.35±85.97^b	1 018.54±46.46^b	574.78±27.69^b	38.00±4.11^b	82.17±4.27^b	25.39±1.44^b
PM+BBR	210.51±22.55^e	646.85±52.54^e	429.12±14.27^e	29.46±2.87^e	33.57±2.51^e	36.25±1.32^e

组别	ALT/U·L^-1	AST/U·L^-1	ALP/U·L^-1	IL-1β/pg·mg^-1	IL-6/pg·mg^-1	IL-10/pg·mg^-1
PM+BBR+sh-NC	217.26±17.42	692.63±51.57	439.21±30.63	30.51±2.60	34.18±3.19	37.27±1.80
PM+BBR+sh-PPAR-γ	363.01±45.58^b	783.47±49.45^b	509.82±8.08^b	35.26±3.79^b	55.81±2.05^b	28.14±1.80^b

组别	ALT/U·L^-1	AST/U·L^-1	ALP/U·L^-1	IL-1β/pg·mg^-1	IL-6/pg·mg^-1	IL-10/pg·mg^-1
PM+BBR+sh-NC	217.26±17.42	692.63±51.57	439.21±30.63	30.51±2.60	34.18±3.19	37.27±1.80
PM+BBR+sh-PPAR-γ	363.01±45.58^b	783.47±49.45^b	509.82±8.08^b	35.26±3.79^b	55.81±2.05^b	28.14±1.80^b

小檗碱对何首乌致药物性肝损伤的保护作用

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武冰 ^a , 田晓鹏 ^b , 景绍君 ^c

中国新药与临床杂志 | 论著 2024,43(7): 547-551

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中国新药与临床杂志 | 论著 2024, 43(7): 547-551

小檗碱对何首乌致药物性肝损伤的保护作用

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武冰^a, 田晓鹏^b, 景绍君^c

作者信息

^a.邢台市人民医院肝病科，河北邢台　054000

^b.邢台市人民医院消化科，河北邢台　054000

^c.邢台市人民医院药剂科，河北邢台　054000

武冰，女，主治医师，硕士，主要从事肝病方面的研究，E-mail：vwt74357064@21cn.com

Protective effect of berberine against drug-induced hepatic injury caused by Polygonum multiflorum thunb.

Bing WU^a, Xiao-peng TIAN^b, Shao-jun JING^c

Affiliations

^a.Department of Hepatology, Xingtai People’s Hospital, Xingtai HEBEI 054000, China

^b.Department of Gastroenterology, Xingtai People’s Hospital, Xingtai HEBEI 054000, China

^c.Department of Pharmacy, Xingtai People’s Hospital, Xingtai HEBEI 054000, China

出版时间: 2024-07-25 doi: 10.14109/j.cnki.xyylc.2024.07.12

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摘要

收起

目的

探究小檗碱对何首乌致药物性肝损伤的保护作用机制。

方法

SD大鼠随机分为sham（假手术）组、PM（何首乌40 g·kg^-1）组、PM+NS（生理盐水1 mL）组和PM+BBR（小檗碱50 mg·kg^-1）组（均n=12）；另选24只大鼠均分为PM+BBR+sh-PPAR-γ组和PM+BBR+sh-NC组，分别尾静脉注射shRNA-PPAR-γ 100 μL和shRNA-NC 100 μL，持续给药8周。HE染色观察肝组织病理学变化，ELISA法检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）水平及肝组织白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10水平。通过RT-qPCR及Western blot法检测大鼠肝组织PPAR-γ表达水平。

结果

与sham组相比，PM组和PM+NS组血清ALT、AST、ALP水平均显著升高，肝组织IL-1β、IL-6水平显著增加，IL-10水平显著降低，PPAR-γ表达显著下调（均P<0.05）。与PM+NS组相比，PM+BBR组血清ALT、AST、ALP水平显著降低，IL-1β、IL-6水平显著下降，IL-10水平显著上升，PPAR-γ表达显著增加（均P<0.05）。与PM+BBR+sh-NC组相比，PM+BBR+sh-PPAR-γ组PPAR-γ表达显著降低（P<0.05），血清ALT、AST、ALP水平以及肝组织IL-1β、IL-6水平显著增加（P<0.05），IL-10水平显著降低（P<0.05）。

结论

小檗碱可能通过上调PPAR-γ的表达减轻何首乌诱发的大鼠肝损伤。

关键词

化学性与药物性肝损伤 / 小檗碱 / PPARγ / 炎症

Abstract

收起

AIM

To investigate the protective mechanism of berberine against Polygonum multiflorum thunb.induced liver injury.

METHODS

SD rats were randomly divided into sham group, PM (Polygonum multiflorum thunb. 40 g·kg^-1) group, PM+NS (saline 1 mL) group, PM+BBR (berberine 50 mg·kg^-1) group (n=12 in each group). Another 24 rats were divided into PM+BBR+sh-PPAR-γ group and PM+BBR+sh-NC group, which were injected with 100 μL of shRNA-PPAR-γ and 100 μL of shRNA-NC into the tail vein. The administration of each group lasted for 8 weeks. HE staining was used to observe the pathological changes in liver tissue, and serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP) levels and the levels of IL-1β, IL-6 and IL-10 in liver tissues were detected by ELISA. PPAR-γ expression was knockdown by transfecting shRNA-PPARγ into rats. The expression levels of PPAR-γ in rat liver tissues was detected by RT-qPCR and Western blot.

RESULTS

Compared with the sham group, the levels of serum ALT, AST, ALP were significantly increased, the levels of IL-1β, IL-6 in liver tissue were increased and IL-10 level was decreased, and PPAR-γ expression was significantly downregulated in the PM group and PM+NS group (all P<0.05). Compared with the PM+NS group, serum ALT, AST, ALP levels were significantly decreased, IL-1β and IL-6 levels were significantly decreased, IL-10 level was significantly increased, and PPAR-γ expression was significantly increased in the PM+BBR group (all P<0.05). Compared with the PM+BBR+sh-NC group, PPAR-γ expression was significantly decreased, serum ALT, AST, ALP levels were significantly increased, IL-1β and IL-6 levels were significantly increased, IL-10 level was significantly decreased in the PM+BBR+sh-PPAR-γ group (all P<0.05).

CONCLUSION

Berberine may alleviate hepatic injury induced by Polygonum multiflorum thunb. by up-regulating PPAR-γ expression.

Key words

chemical and drug induced liver injury / berberine / PPAR gamma / inflammation

引用本文

武冰, 田晓鹏, 景绍君. 小檗碱对何首乌致药物性肝损伤的保护作用. 中国新药与临床杂志, 2024 , 43 (7) : 547 -551 . DOI: 10.14109/j.cnki.xyylc.2024.07.12

Bing WU, Xiao-peng TIAN, Shao-jun JING. Protective effect of berberine against drug-induced hepatic injury caused by Polygonum multiflorum thunb.[J]. Chinese Journal of New Drugs and Clinical Remedies, 2024 , 43 (7) : 547 -551 . DOI: 10.14109/j.cnki.xyylc.2024.07.12

正文

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蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum thunb.）的干燥块根加工产品为驰名中草药，已在中国和东亚许多国家使用长达一千多年。传统上，生的何首乌产品用于解毒、润肠、通便，而加工的何首乌产品则用作滋补剂和抗衰老剂，治疗高脂血症、炎症、学习记忆功能障碍、动脉粥样硬化和免疫功能障碍等^[1,2]，但何首乌引起的肝损伤日益受到关注。

小檗碱（berberine）是一种植物生物碱，存在于小檗科、罂粟科、毛茛科、芸香科和酸浆科植物中^[3]，具有价格低廉、副作用小、来源多样的优势^[4]。小檗碱具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、保护心脏和降血糖等药理作用，它还具有调节脂质代谢和免疫功能，以及保护中枢神经系统的作用^[5,6]。小檗碱能缓解多柔比星和环磷酰胺在小鼠中引起的肝毒性，具有抗氧化和抗炎作用^[7]，还可激活核因子E2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）通路和过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）γ，减轻甲氨蝶呤诱导的大鼠肝损伤^[8]。PPAR是核激素受体超家族的一部分，可分为PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，都具有特定的功能特征来控制肝脏中的一系列生理功能，包括氧化应激、脂质和葡萄糖代谢、炎症反应、再生机制以及细胞分化和增殖^[9]。本研究探讨小檗碱对何首乌致大鼠药物性肝损伤的保护作用机制。

材料与方法

收起

药物

何首乌饮片（3年生，贵州省遵义市湄潭县西河镇万兴村，批号：20180202），为蓼科植物何首乌的干燥块根。何首乌水提物的制备：何首乌饮片磨成粉末（过4号筛），将30 g粉末于10倍体积的水中煎煮2 h后，再在8倍体积的水中煎煮1.5 h。将提取物合并在一起并使用旋转蒸发仪浓缩，-80℃下冷冻并使用真空冷冻干燥箱冻干，配置5.0 g·mL^-1何首乌水溶液。小檗碱购自美国Sigma公司，纯度≥98%，制成浓度为1 mg·mL^-1的溶液。

试剂与仪器

ELISA试剂盒购自上海通蔚生物科技有限公司，RIPA裂解缓冲液中购自上海碧云天生物技术有限公司，BCA法蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific, Inc.），兔单抗anti-PPAR-γ、兔多抗GAPDH、山羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司，增强化学发光检测试剂购自美国EMD Millipore公司，shRNA-PPAR-γ（1×10⁸ pfu·200 μL^-1）和空对照载体shRNA-NC购自苏州吉玛基因股份有限公司。全自动生化分析仪（HITA-CHI7600，HITACHI公司，日本），切片机（KD-2258，金华市KEDEE公司），实时荧光定量PCR（RT-qPCR）仪（FX300，美国Bio-rad公司）。

分组、造模及给药

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（200±10 g）购自谱尼生物医药科技（上海）有限公司［使用许可SYXK（沪）2022-0005］。适应性饲养一周后，按随机数法随机分为：（1）sham组，每日灌胃给予1 mL生理盐水，（2）PM组，每日灌胃给予何首乌40 g·kg^-1构建肝损伤模型，（3）PM+BBR组，每日灌胃给予何首乌40 g·kg^-1和小檗碱50 mg·kg^-1，（4）PM+NS组，每日灌胃给予何首乌40 g·kg^-1和生理盐水1 mL，均n=12。另选24只大鼠均分为PM+BBR+sh-PPAR-γ组和PM+BBR+sh-NC组，分别尾静脉注射shRNA-PPAR-γ 100 μL（1×10⁸ pfu·200 μL^-1）或shRNA-NC 100 μL，每日灌胃给予PM 40 g·kg^-1和小檗碱50 mg·kg^-1。给药持续8周。

治疗结束后，使用1%戊巴比妥50 mg·kg^-1麻醉大鼠，通过心脏穿刺抽取5 mL血液入肝素管，储存在-80℃冰箱中，直到进一步分析生化参数。采血后立即用过量戊巴比妥（200 mg·kg^-1，ip）处死动物，迅速取出肝脏，称重，每组各取6只大鼠肝脏脱水后用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋进行HE染色观察肝脏组织病理学，另取6只大鼠肝脏匀浆后用于RT-qPCR、Western blot检测。所有与动物相关的实验程序均并经本院动物伦理委员会批准。

肝功能及炎症指标

将血液1.5 mL置于无菌EP管中，使血液静置10 min并在凝固后离心10 min（1 000×g，4 ℃）。根据ELISA试剂盒说明书测定大鼠血清中的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）水平。

取大鼠肝组织匀浆，根据ELISA检测试剂盒说明书检测炎症因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10水平。

PPAR-γ蛋白表达

采用Western blot法。上述各组大鼠肝组织匀浆，置于冰预冷的RIPA裂解缓冲液中30 min，随后在4 ℃环境下12 000×g离心10 min，取上清液用于分析。测定总蛋白质浓度，通过8% SDS-PAGE电泳分离，并通过电印迹转移到聚偏二氟乙烯膜上。随后，将膜与5%脱脂奶粉在37 ℃下封闭3 h，然后在4 ℃下与兔抗anti-PPAR-γ（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）过夜孵育，洗膜后在37℃下与过山羊抗兔二抗孵育。增强化学发光用于检测免疫反应条带，GAPDH作为内参。使用Image Lab软件4.0版对条带进行光密度分析。

统计学分析

采用GraphPad Prism 8.01（GraphPad Software Inc）和SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析和作图，实验数据以均数±标准差表示，2组之间的比较采用独立样本t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析，事后检验采用Tukey’s检验进行组间差异分析。P为双侧检验，以P<0.05为有显著差异。

结果

收起

肝脏的组织病理学及肝功能变化

如图1所示，sham组大鼠肝组织细胞排列整齐，连接紧密，门区结构清晰，肝组织结构完整；而PM组和PM+NS组大鼠肝组织整体结构异常，肝细胞结构疏松，组织内可见大量充血，炎性浸润严重；与PM+NS组相比，PM+BBR组细胞结构疏松及充血得到改善。与sham组相比，PM组和PM+NS组血清ALT、AST、ALP水平均有显著升高；与PM+NS组相比，PM+BBR组血清ALT、AST、ALP水平显著降低（P<0.05）。见表1。

炎症因子

与sham组相比，PM组和PM+NS组肝组织IL-1β、IL-6水平显著增加（P<0.05），IL-10水平显著降低（P<0.05）。与PM+NS组比较，PM+BBR组IL-1β、IL-6水平显著下降（P<0.05），IL-10水平显著上升（P<0.05）。见表1。

PPAR-γ表达水平

与sham组（1.10±0.12）相比，PM组（0.42±0.03）和PM+NS组（0.41±0.04）PPAR-γ表达显著下调，PM+BBR组PPAR-γ表达（0.65±0.05）显著高于PM+NS组，见图2。

PPAR-γ相关作用机制

与PM+BBR+sh-NC组相比，PM+BBR+sh-PPAR-γ组PPAR-γ表达显著降低（P<0.05），血清ALT、AST、ALP水平以及肝组织IL-1β、IL-6水平显著增加（P<0.05），IL-10水平显著降低（P<0.05），见图3、表3。

讨论

收起

近年来，随着草药和膳食补充剂在全球范围内的广泛使用，引起的肝损伤变得更加突出^[10]。何首乌引起肝损伤的机制尚不清楚，根据目前的文献报道，何首乌引起的肝损伤包括内在性肝损伤和特异性肝损伤，且在临床应用中存在明显的个体差异^[11]。本研究选择灌胃给予大鼠何首乌40 g·kg^-1持续8周建立药物性肝损伤模型^[12]。结果显示，PM组和PM+NS组大鼠血清ALT、AST、ALP水平均显著升高，说明大鼠受何首乌刺激后出现肝功能损伤，造模成功。本研究发现给予小檗碱治疗后，药物性肝损伤模型大鼠血清ALT、AST、ALP水平明显下降，肝损伤程度减轻，说明小檗碱可在一定程度上缓解何首乌诱导的肝损伤。作为一种长期用于治疗炎症性疾病的草药活性化合物，小檗碱已被充分证明具有强大的抗炎特性。小檗碱可以调节由LPS诱导的乳腺炎模型小鼠的炎症反应，使得乳腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著下降^[13]。KE等^[14]研究发现，小檗碱可缓解酒精性肝损伤大鼠的炎症因子、血脂、ALT和AST等因素异常，显著逆转了酒精对肝产生的负面影响。在本研究中，同样观察到小檗碱对大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6的抑制。

PPAR-γ可抑制氧化应激引起的炎症，具有抑制炎症反应的作用^[15]。有研究报道，对乙酰氨基酚引起的肝毒性诱导PPAR-γ表达下降^[16]。本研究中，PM组PPAR-γ的表达显著下降，而给予小檗碱可以逆转PPAR-γ表达的下降。为了进一步探究PPAR-γ在肝损伤中的作用，本研究通过给大鼠尾静脉注射shRNA-PPAR-γ敲低肝损伤大鼠体内的PPAR-γ表达，结果显示敲低PPAR-γ表达水平后，小檗碱对大鼠药物性肝损伤的治疗效果均下降，提示小檗碱是通过上调PPAR-γ表达减缓何首乌导致的药物肝损伤。

综上所述，小檗碱可以改善何首乌导致的药物性肝损伤，其机制可能是通过上调PPAR-γ表达实现的。

基金

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2020年度河北省医学科研课题计划(20201576)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

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2024年第43卷第7期

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doi: 10.14109/j.cnki.xyylc.2024.07.12

接收时间：2022-09-20
首发时间：2026-03-13
出版时间：2024-07-25

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收稿日期：2022-09-20
录用日期：2024-03-25

基金

2020年度河北省医学科研课题计划(20201576)

作者信息

^a.邢台市人民医院肝病科，河北邢台　054000

^b.邢台市人民医院消化科，河北邢台　054000

^c.邢台市人民医院药剂科，河北邢台　054000

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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