中国公共卫生

线粒体自噬在铝暴露大鼠认知障碍中的作用

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张晓宇 ¹ , 刘衍 ² , 胥超群 ² , 袁峡 ² , 谭凯文 ² , 周珈铖 ² , 王彬鸿 ² , 陈薪茹 ² , 姜斌 ² , 陈欢 ² , 林立 ¹^,² , 张璟 ¹^,²^,^*^,^* , 李欢 ²^,^*^,^*

中国公共卫生 | 实验研究 2025,41(4): 438-442

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中国公共卫生 |实验研究 2025 , 41 (4) : 438 -442

线粒体自噬在铝暴露大鼠认知障碍中的作用

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张晓宇¹, 刘衍², 胥超群², 袁峡², 谭凯文², 周珈铖², 王彬鸿², 陈薪茹², 姜斌², 陈欢², 林立¹^,², 张璟¹^,²^,^*^,^*, 李欢²^,^*^,^*

作者信息

¹山东第一医科大学（山东省医学科学院）公共卫生与健康管理学院，济南 250117

²济宁医学院公共卫生学院，济宁 272000

通讯作者:

张璟，E-mall：zhangj1976@163.com

李欢，E-mall：lixiuhuan557@163.com

作者简介:

张晓宇（1998—），硕士，研究方向：劳动卫生与环境卫生学

The role of mitophagy in cognitive impairment in aluminum-exposed rats

Xiaoyu ZHANG¹, Yan LIU², Chaoqun XU², Xia YUAN², Kaiwen TAN², Jiacheng ZHOU², Binhong WANG², Xinru CHEN², Bin JIANG², Huan CHEN², Li LIN¹^,², Jing ZHANG¹^,², Huan LI²

Affiliations

¹School of Public Health, Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250117, China

²School of Public Health, Jining Medical University, Jining 272000, China

Corresponding Author:

ZHANG Jing, E-mail: zhangj1976@163.com

LI Huan, E-mail: lixiuhuan557@163.com

出版时间: 2025-04-10 doi: 10.11847/zgggws1143914

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摘要

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目的

观察亚慢性铝暴露对大鼠海马线粒体自噬PTEN诱导激酶（PINK1）/E3泛素连接酶（Parkin）途径微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）、选择性自噬接头蛋白62（P62）和细胞色素c氧化酶IV（COXIV）表达的影响，探讨铝暴露是否通过线粒体自噬PINK1/Parkin途径LC3B/P62/COXIV通路影响认知障碍的具体机制。

方法

选取32只6周龄 SPF级的健康雄性SD大鼠，体重（190±20）g，按照体重随机分为4组：对照、低剂量（10 µmol/kg）、中剂量（20 µmol/kg）和高剂量组（40 µmol/kg），每组8只。动物染毒模型采用麦芽酚铝腹腔注射90 d。染毒完毕后，通过Morris水迷宫行为学实验测定大鼠学习记忆能力，通过冰冻切片测定大鼠大脑皮层活性氧（ROS）表达水平，通过免疫印迹法（WB）检测大鼠海马组织中PINK1、Parkin、LC3B、P62、COXIV蛋白的表达。

结果

Morris水迷宫定位巡航实验的第3、4、5天，各组大鼠逃避潜伏期随着染毒剂量的增加逐渐延长（P<0.05），第6天，高剂量组较对照组和低中剂量组穿越平台及平台象限的次数均有所减少（P<0.05）。各组随着染毒剂量的升高，大鼠大脑皮层ROS水平逐渐增加（P<0.05），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量逐渐减少（P<0.05）。各组大鼠大脑海马组织中PINK1、Parkin、LC3B的相对表达水平随着染毒剂量的增加逐渐上升（P<0.05），P62、COXIV的相对表达水平随着染毒剂量的增加逐渐下降（P<0.05）。

结论

亚慢性铝暴露可以损伤大鼠的学习记忆功能，并激活PINK1/Parkin途径LC3B/P62/COXIV通路，诱导线粒体自噬。

关键词

铝 / 线粒体自噬 / PTEN诱导激酶1 / 认知障碍

Abstract

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Objective

To observe the effects of subchronic aluminum exposure on the expression of PTEN-induced kinase 1 (PINK1)/E3 ubiquitin ligase (Parkin) pathway microtubule-associated protein 1 light chain 3B (LC3B), selective autophagy receptor protein 62 (P62), and cytochrome c oxidase IV (COXIV) in rat hippocampal mitochondria, and to explore the specific mechanism by which aluminum exposure affects cognitive impairment through the mitophagy PINK1/Parkin pathway LC3B/P62/COXIV pathway.

Methods

Thirty-two 6-week-old healthy male Sprague-Dawley (SD) rats of SPF grade, weighing (190±20) g, were randomly divided into four groups according to their body weight: control, low-dose (10 µmol/kg), medium-dose (20 µmol/kg), and high-dose (40 µmol/kg) groups, with 8 rats in each group. The animal intoxication model was established by intraperitoneal injection of aluminum maltolate for 90 days. After the exposure, the learning and memory abilities of the rats were measured by the Morris water maze behavioral test, the expression level of reactive oxygen species (ROS) in the cerebral cortex was measured by frozen sections, and the expression of PINK1, Parkin, LC3B, P62, and COXIV proteins in the hippocampal tissue was detected by Western blotting (WB).

Results

On days 3, 4, and 5 of the Morris water maze place navigation test, the escape latency of rats in each group gradually increased with the increase of the exposure dose (P<0.05). On day 6, the number of times the rats in the high-dose group crossed the platform and the platform quadrant decreased compared with the control group and the low- and medium-dose groups (P<0.05). With the increase of the exposure dose in each group, the ROS level in the cerebral cortex of rats gradually increased (P<0.05), and the content of glutathione peroxidase (GSH-Px) gradually decreased (P<0.05). The relative expression levels of PINK1, Parkin, and LC3B in the hippocampal tissue of rats in each group gradually increased with the increase of the exposure dose (P<0.05), while the relative expression levels of P62 and COXIV gradually decreased with the increase of the exposure dose (P<0.05).

Conclusions

Subchronic aluminum exposure can impair learning and memory function in rats, activate the PINK1/Parkin pathway LC3B/P62/COXIV pathway, and induce mitophagy.

Key words

aluminum / mitophagy / PTEN-induced putative kinase 1 / cognitive impairment

引用本文

张晓宇, 刘衍, 胥超群, 袁峡, 谭凯文, 周珈铖, 王彬鸿, 陈薪茹, 姜斌, 陈欢, 林立, 张璟, 李欢. 线粒体自噬在铝暴露大鼠认知障碍中的作用. 中国公共卫生, 2025 , 41 (4) : 438 -442 . DOI: 10.11847/zgggws1143914

Xiaoyu ZHANG, Yan LIU, Chaoqun XU, Xia YUAN, Kaiwen TAN, Jiacheng ZHOU, Binhong WANG, Xinru CHEN, Bin JIANG, Huan CHEN, Li LIN, Jing ZHANG, Huan LI. The role of mitophagy in cognitive impairment in aluminum-exposed rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2025 , 41 (4) : 438 -442 . DOI: 10.11847/zgggws1143914

正文

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铝（aluminum，Al）是地壳中含量最高的金属，主要蓄积在人类神经系统，长期积累会造成认知功能障碍，表现为明显的学习记忆受损，与多种神经退行性疾病有很大的关系^[1]。线粒体自噬在生理上负责线粒体质量控制和线粒体活性氧（reactive oxygen species, ROS）平衡，在受损时去除线粒体，其中PINK1/Parkin途径是较常见的经典机制^[2–3]。但线粒体自噬与铝致认知功能障碍的关系并不十分清晰，本研究通过建立亚慢性麦芽酚铝暴露大鼠模型，观察麦芽酚铝暴露对大鼠线粒体自噬PINK1/Parkin途径LC3B，P62，COXIV表达的影响，探讨铝暴露是否通过线粒体自噬PINK1/Parkin途径LC3B/P62/COXIV通路影响认知障碍的具体机制。

1　材料与方法

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1.1　主要试剂与仪器

三氯化铝（分子式：AlCl₃·6H₂O，结晶型）（天津市风船化学试剂科技有限公司）；麦芽酚（分析纯，纯度99.0%，美国Sigma-Aldrich公司）；Morris 水迷宫及视频轨迹跟踪分析系统（江苏赛昂斯生物科技有限公司）；高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；脱色摇床、电泳仪（北京市六一仪器厂）；大鼠（Rat）谷胱甘肽过氧化酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）ELISA 检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit）、高灵敏度化学发光检测试剂盒（eECL Western Blot Kit）（北京康为世纪生物科技有限公司）；兔抗Anti-GAPDH抗体[EPR16891]、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠Goat Anti-Mouse IgG H&L（HRP）[ab205719]和山羊抗兔Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）[ab205718]；鼠抗PINK1抗体[N14/15]（ab186303）；鼠抗Parkin抗体[PRK8]（ab77924）；兔抗LC3B抗体[EPR18709]；兔抗P62抗体[EPR4844]；兔抗COXIV抗体[EPR9442（ABC）]（均为英国Abcam公司）。

1.2　动物分组与处理

32只6周龄SPF级健康雄性SD大鼠（购置于济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号：SCXK（鲁）20220006，动物质量合格证号：No.37072623110292474，动物实验单位：济宁医学院，实验单位使用许可证编号：SYXK（鲁）201210030，实验动物伦理委员会批准编号JNMC-2021-DW-013），体重（190±20）g，动物房饲养，温度保持22～26 ℃，黑暗-光照循环12 h（8:00～20:00），普通饲料喂养，自由摄食和饮水。5 d适应性喂养后，按重量随机分4组：生理盐水对照组（CG）、麦芽酚铝低、中、高剂量组（LG、MG、HG），低、中、高染毒剂量分别为10、20和40 μmol/kg。周一～周五进行腹腔注射，按照1 mL/kg给药，连续90 d。每周一对大鼠称重记录，每天观察大鼠精神状态和生长情况以及腹腔注射的针口愈合程度。本研究通过济宁医学院伦理委员会审核批准。

1.3　实验方法

1.3.1　Morris水迷宫训练与测试

染毒结束后，按照实验方法参考文献[4]，让大鼠进行定位巡航和空间探索实验，测定大鼠在2 min以内找到平台所需要的时间作为逃避潜伏期和120 s内穿越平台位置和平台象限的次数。

1.3.2　冰冻切片检测活性氧（ROS）

染毒结束后取大鼠大脑皮层，按照实验方法参考文献[5]制备冰冻切片，在荧光显微镜下观察和采集图像。（二氨基联苯吲哚DAPI紫外激发波长330～380 nm，发射波长420 nm，发蓝光；CY3激发波长510～560 nm，发射波长590 nm，发红光）。

1.3.3　谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测

染毒结束后取大鼠海马组织，称重后加适量预冷的PBS，在冰上充分磨碎后离心取上清，严格按照试剂盒使用说明检测海马组织GSH-Px含量。

1.3.4　免疫印迹法（western blot，WB）检测大鼠海马组织中 PINK1、Parkin、LC3B、P62和COXIV蛋白的表达

染毒结束后取大鼠海马组织，按照实验方法参考文献[6]制备蛋白匀浆，测定相应蛋白的表达水平。

1.4　统计分析

采用SPSS 25.0对实验数据进行分析，图像制作用GraphPad Prism 10.1.2，结果用

$ \overline{x} $

±s表示，多组间对比用方差分析one-way ANOVA，各组之间两两比较，方差齐用LSD检验，方差不齐用 Dunnett-T3检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

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2.1　Morris水迷宫测试对大鼠空间学习和记忆能力影响（图1）

根据定位巡航实验，第1、3天麦芽酚铝暴露的高剂量组大鼠，逃避潜伏期超过对照组（P<0.05），尤其第3天，染铝组大鼠的逃避潜伏期均大于对照组（P<0.05）。第2天各组大鼠的平均逃避潜伏期相差无明显差异（P>0.05）。在第4、5天数据差异较明显，高剂量组大鼠的逃避潜伏期均显著超过对照组和低剂量组（P<0.05）（图1A）。第6天空间探索试验，高剂量组与对照组、低剂量组和中剂量组比较，穿越平台和平台象限的次数均显著减少（P<0.05）（图1B和图1C）。

2.2　ROS表达升高和GSH-Px表达下降（图2）

4组大鼠大脑皮层中的红色荧光强度均随着染毒剂量的升高逐渐增强，表明ROS水平逐渐增加，而且与对照组相比，染毒的低、中、高剂量组ROS水平均明显增加（P<0.05）（图2A和图2B）。4组大鼠海马中GSH-Px的含量也随染毒剂量的增加逐渐下降，高剂量组与对照组和低剂量组相比，海马中GSH-Px含量明显下降（P<0.05）（图2C）。

2.3　各组大鼠的海马组织中 PINK1、Parkin、LC3B、P62、COXIV的表达（图3）

随着铝暴露剂量增加，各组大鼠大脑海马组织中PINK1、Parkin、LC3B的相对表达水平逐渐上升（P<0.05）；P62、COXIV的相对表达水平逐渐下降（P<0.05）。大鼠海马组织中PINK1、Parkin、LC3B蛋白相对表达量在中高剂量染毒组均显著大于对照组（P<0.05），其中高剂量组PINK1和Parkin蛋白相对表达量显著大于低剂量组（P<0.05）；中高剂量染毒组P62和COXIV蛋白相对表达量均显著小于对照组（P<0.05），高剂量组小于低剂量组（P<0.05）。

3　讨　论

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铝是一种慢行蓄积性神经毒物，流行病学研究结果证实，长期职业暴露会导致人出现神经毒性，表现为认知障碍^[7]。铝的神经毒性在体内和体外实验均得到证实，亚慢性铝暴露可以降低大鼠模型的学习和记忆能力^[8]。本研究结果也显示,随着染毒剂量增加,大鼠的逃避潜伏期明显延长,穿越平台和平台象限次数明显减少，表明亚慢性铝暴露对大鼠空间学习记忆能力产生明显损害作用，与之前的研究结果相似^[4]。

健康的线粒体是健康大脑的重要内核，神经元中的线粒体功能障碍是所有神经退行性疾病的重要因素^[9]。线粒体损伤导致能量产生不足，ROS过度产生，氧化应激增加，引起神经元损伤，造成神经毒性^[10–11]。氧化应激是机体被刺激后产生过多的ROS，超过自身清除能力，机体氧化还原系统失衡，进而出现细胞损伤和组织凋亡^[12]。线粒体是细胞内ROS的主要来源，在生理状态下，细胞维持了一定水平的ROS以保持稳态，调节生命活动，当机体受到刺激产生应激反应时，可刺激ROS过量生成^[13]。GSH-Px是体内广泛存在的抗氧化酶，主要作用是减少氧化应激损伤，维持ROS动态平衡^[12]。本研究结果中，染毒后大鼠ROS含量明显升高，GSH-Px含量降低。证明铝暴露会刺激大脑ROS过度产生，导致线粒体损伤、氧化应激和大脑抗氧化系统失衡。

线粒体功能障碍与不良神经结局密切相关。线粒体自噬可将有缺陷的线粒体去除，防止细胞内功能受损的细胞器造成有害影响^[14]。线粒体氧化应激调节PINK1/Parkin途径线粒体自噬，而PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬又参与调节线粒体功能障碍^[15]。PINK1/parkin介导的线粒体自噬途径也是神经退行性疾病PD从机制到治疗的重要过程^[16]。自噬过程中，自噬受体通过LC3相互作用区（LIR）基序与ATG8家族蛋白结合，将多聚泛素化的线粒体外膜链接至自噬体膜^[17]。此外，线粒体与自噬装置之间相互作用还需要线粒体外膜的多聚泛素化蛋白P62，P62的功能性降低，使受损线粒体的清除降低，ROS稳态失衡^[18]。COXIV是细胞色素c氧化酶COX的重要调节亚基，是线粒体呼吸链中的复合物，COXIV是保护神经元免受线粒体氧化损伤的潜在机制^[19]。本研究结果中，染铝组PINK1，Parkin，LC3B表达水平均随着染毒剂量增多，而P62和COXIV表达水平则降低。提示亚慢性铝暴露可能通过PINK1/Parkin途径的线粒体自噬，影响大鼠神经系统的氧化应激状态，进而造成氧化损伤，产生神经毒性。但PINK1/Parkin途径介导线粒体自噬并不能彻底改善大脑海马区的受损情况，对于损伤线粒体的清除程度和持久性也并不清晰，所以完全依靠线粒体自噬探索铝神经毒性仍有较大的空间。综上，亚慢性铝暴露可以激活线粒体自噬PINK1/Parkin途径LC3B/P62/COXIV通路，诱导线粒体自噬，损伤大鼠的学习记忆功能，导致认知障碍。

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2025年第41卷第4期

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doi: 10.11847/zgggws1143914

接收时间：2024-08-21
首发时间：2026-10-25
出版时间：2025-04-10

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收稿日期：2024-08-21
修回日期：2024-09-17
录用日期：2025-02-21

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¹山东第一医科大学（山东省医学科学院）公共卫生与健康管理学院，济南 250117

²济宁医学院公共卫生学院，济宁 272000

通讯作者:

张璟，E-mall：zhangj1976@163.com

李欢，E-mall：lixiuhuan557@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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